專利名稱：：穩(wěn)定的蛋白酶組合物的制作方法穩(wěn)定的蛋白酶組合物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種酶組合物，其中通過(guò)在本發(fā)明的組合物中的一些添加物穩(wěn)定該酶。更具體地，本發(fā)明涉及一種絲氨酸蛋白酶組合物,包含絲氨酸蛋白酶的可逆抑制劑和如下定義的附加的穩(wěn)定劑M。技術(shù)背景絲氨酸蛋白酶是一類蛋白水解酶，其特征在于在它們的活性位點(diǎn)上具有絲氨酸和組氨酸殘基。很多眾所周知的酶都屬于此類，例如胰蛋白酶、激肽釋放酶、凝血酶和纖溶酶。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們中的一些的實(shí)際應(yīng)用。胰蛋白酶用于皮革工業(yè)。凝血酶用作止血?jiǎng)┮宰柚箓诔鲅Ａ硗鈨煞N絲氨酸蛋白酶一尿激酶和組織纖維蛋白溶酶原激活劑在臨床上用作血栓溶解劑，用于治療急性心肌梗塞。很多這樣的酶已經(jīng)廣泛地用作研究工具，例如在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)確定中。此外，這些酶可以在很多診斷試劑盒中使用。對(duì)于大多數(shù)的絲氨酸蛋白酶，它們?cè)谌芤褐械姆€(wěn)定非常有限，這主要是由于當(dāng)保留在溶液中時(shí)它們由于蛋白酶的性質(zhì)會(huì)發(fā)生自降解。當(dāng)必須要把材料貯存在溶液中時(shí)，有限的穩(wěn)定就是一個(gè)問(wèn)題?，F(xiàn)在可用的商業(yè)絲氨酸蛋白酶制劑主要都是冷凍溶液或凍干粉末，它們具有顯而易見(jiàn)的缺點(diǎn)。溶解粉末或?qū)⒗鋬鋈芤喝诨吝m當(dāng)?shù)臏囟人璧念~外時(shí)間是最重要的問(wèn)題。但是，這些制劑還有其他的問(wèn)題。對(duì)于冷凍溶液，在制造和運(yùn)輸?shù)劫A存的所有步驟中都需要控制溫度(-2(TC)。對(duì)于凍干粉末，需要重新生成的溶液具有可接受級(jí)別的純度和穩(wěn)定。同時(shí)，該材料通常需要在非可控(例如嚴(yán)酷天氣或缺少清潔水供應(yīng))的環(huán)境中無(wú)菌制備(通過(guò)將這兩部分混合)，需要檢驗(yàn)粉末是否已經(jīng)適當(dāng)混合。這些都是當(dāng)前可用的產(chǎn)品的主要缺點(diǎn)，另外它們使用復(fù)雜并且成本較高。對(duì)于優(yōu)選在阻止出血中必須立即使用的凝血酶，穩(wěn)定問(wèn)題迫使生產(chǎn)商必須使用凍干的凝血酶或深度冷凍的溶液。然后，需要一定的時(shí)間制備才能進(jìn)行使用。兩種血栓溶解劑一尿激酶和組織纖維蛋白溶酶原激活劑都是以凍干制劑的形式出售，它們必須在使用前溶解。由于必須在梗塞開(kāi)始后盡可能早地開(kāi)始急性心肌梗塞的血栓溶解治療，這些制劑產(chǎn)生的任何時(shí)間延遲都會(huì)成為問(wèn)題。已經(jīng)做出很多的努力來(lái)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定各種絲氨酸蛋白酶的方法。對(duì)于會(huì)相當(dāng)快地自降解的胰蛋白酶，一種簡(jiǎn)單和有效的穩(wěn)定劑是鈣離子(SiposT和MerkelJ，Biochemistry9:2766(1970))。將pH降低到4以下也是處理一些酶例如胰蛋白酶和纖溶酶的方法，但不適用于凝血酶，這是因?yàn)樗趐H小于5時(shí)會(huì)不可逆地失活?？梢允褂每赡娴牡鞍酌敢种苿?，但是并不通行，因?yàn)楫?dāng)使用它們本身時(shí)，它們會(huì)以有害的方式干擾酶的作用(見(jiàn)下文)。為了穩(wěn)定組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)，一般使用的方法是加入氨基酸一精氨酸?，F(xiàn)在臨床使用的tPA材料包含精氨酸作為穩(wěn)定劑。同時(shí)，做了很多努力來(lái)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定凝血酶溶液的方法。作為穩(wěn)定添加物的例子，建議了下列的材料高濃度的羧酸、EDTA、各種氨基酸、白蛋白、聚合物例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇、甘油、各種無(wú)機(jī)鹽、糖類、明膠、膠原。日本專利申請(qǐng)JP2004191367描迷了包含試驗(yàn)試劑的穩(wěn)定的凝血酶，用于試驗(yàn)血凝結(jié)能力。該試驗(yàn)試劑包含凝血酶和凝血酶抑制劑，也可以包含一種或多種穩(wěn)定凝血酶的化合物，選自釣離子、有機(jī)酸、表面活性劑和蛋白質(zhì)。W002/100830、W002/22575、W000/20394、W099/11658、W002/37937和US5,409,927都描述了不同的絲氨酸蛋白酶抑制劑化合物及它們?cè)谥苽渲委煾鞣N疾病情況，例如血栓形成中的應(yīng)用，其中指出了抑制相應(yīng)的絲氨酸蛋白酶。Nakamura等人(/.C力層.A1009,(2003)，133-139)描述了固定的蛋白酶抑制劑在胰蛋白酶-樣蛋白酶的親和色語(yǔ)中的應(yīng)用。Turner等人Cff/oc/e/z//"/r，25,(1986)，4929-4935)描述了三種對(duì)-脒基苯基酯，它們不可逆地抑制人的因子IXa。TsungFuYang等人("/謹(jǐn)cr婦/ecw/es,25，(2004),1926-1932)描述了陽(yáng)離子型聚合物N，N-二乙基乙二胺聚氨酯的合成，該聚合物可以用于基因遞送。US專利申請(qǐng)2001/0033837(對(duì)應(yīng)于EP1136084Al)描述了一種凝血酶制劑，包含非共價(jià)結(jié)合的抑制劑作為穩(wěn)定劑。此外，該抑制劑與其他穩(wěn)定添加物例如糖或羧酸組合，以前在專利和其他出版物中已經(jīng)描述了這些穩(wěn)定添加物。JP200030025Q描述了凝血酶溶液的穩(wěn)定，包括在不同的緩沖溶液中加入聚乙烯醇、明膠或聚乙烯吡咯烷酮。在GB1354761中，通過(guò)很多的材料，例如脂肪醇、羧酸、包含幾基的雜環(huán)化合物和脂肪或脂環(huán)胺可以不同程度地穩(wěn)定蛋白酶和淀粉酶o這樣，已經(jīng)描述了使用抑制劑來(lái)穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶(例如US2001/0033837和JP2004191367,J:義)。該方法的問(wèn)題在于，如果在使用該制品前不除去，那么抑制劑就會(huì)強(qiáng)烈地減弱酶的效果。如果使用有效的抑制劑，大多數(shù)的酶活性都會(huì)喪失。一種較好的方法是使用中等強(qiáng)度的可逆抑制劑。但是，甚至在該情況下，相當(dāng)部分的酶起始活性仍然會(huì)喪失，因?yàn)樾枰岣咭种苿┑臐舛纫缘玫搅己玫姆€(wěn)定效果。
發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明的一個(gè)目的是完成一種絲氨酸蛋白酶組合物，它在溶液中是穩(wěn)定的，并且保持酶活性至足以實(shí)際使用該組合物的程度。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種絲氨酸蛋白酶組合物，它能夠直接使用而不需要由深度冷凍或凍干材料制備的前步驟。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的目的是通過(guò)提供其他的穩(wěn)定組分使得絲氨酸蛋白酶的可逆抑制劑就穩(wěn)定目的而言的實(shí)際使用成為可能。通過(guò)所要求保護(hù)的本發(fā)明的不同方面可以實(shí)現(xiàn)本文中顯而易見(jiàn)的這些和其他目的。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種穩(wěn)定的絲氨酸蛋白酶組合物，包含a)絲氨酸蛋白酶；b)所述絲氨酸蛋白酶的可逆抑制劑；和c)具有式I的穩(wěn)定劑M:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>選自H，-CH廣R6，-CH廣O-R6，-CH廠S-R6，-C0-NH-R6，-CH廣NH-C0-R6,-CH2-0-CO-R6，-CH2-NH-C0-0R6，-CH2-NH-CS-NHR6和其中n是0，1或2;X是0，N或CH2;R1-114相同或不同-CH廣NH-R6，-CO-O-R6，-CH廣NH-CO-NHR6,-CH2-0-CO-NHR6;R5是RLR4或P-Q;P選自-(CH2)f和-(CH上-Y-(CH2)m-，其中m是l-6且Y是0，NH或S;Q選自H，-S03，-COOH，-NH2,—OH和-CONHs;R6各自獨(dú)立地選自H，取代或未取代的低級(jí)烷基，取代或未取代的環(huán)烷基，取代或未取代的苯曱基，取代或未取代的芳基或單-，二-，或三環(huán)的具有一個(gè)或多個(gè)雜原子的未取代或取代的雜芳環(huán)和非芳香雜環(huán)，所述取代的基團(tuán)的取代基選自低級(jí)烷基、閨素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜-芳香化合物、非芳香雜環(huán)、烷氧基、烷氨基；或其藥學(xué)可接受的鹽。本發(fā)明最初起源于對(duì)凝血酶穩(wěn)定性的研究，其中令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該酶的可逆抑制劑和如上定義的本發(fā)明的穩(wěn)定劑M的組合對(duì)于溶液中的酶具有強(qiáng)烈的穩(wěn)定作用。凝血酶抑制劑和穩(wěn)定劑M單獨(dú)使用時(shí)對(duì)凝血酶都具有穩(wěn)定作用，但是組合要比它們中的任一種都好數(shù)倍(見(jiàn)實(shí)施例l)。因此，當(dāng)?shù)蜐舛鹊拿敢种苿┡c嗎啉、MOPS或相關(guān)的化合物組合時(shí)，獲得了對(duì)酶非常強(qiáng)的穩(wěn)定作用。一些受試組合物是穩(wěn)定的，如所示，當(dāng)在37'C下2個(gè)月以上時(shí)，活性只降低了不到30%。根據(jù)先有文獻(xiàn)和本發(fā)明人證實(shí)的數(shù)據(jù)，在室溫下對(duì)應(yīng)地是6個(gè)月，或在冷藏溫度下是2.5年。初期研究的結(jié)果可以擴(kuò)展到包括其他絲氨酸蛋白酶的試驗(yàn)，在這些試驗(yàn)中，也觀測(cè)到了令人驚奇的穩(wěn)定作用。如下所例舉，與不含本發(fā)明的成分b)和c)的組合的酶組合物相比，根據(jù)本發(fā)明的組合物顯示了極大改善的穩(wěn)定性。當(dāng)使用本發(fā)明的方法時(shí)，可以使用低濃度的絲氨酸蛋白酶抑制劑，獲得的穩(wěn)定仍然達(dá)到了令人滿意的程度。例如，抑制劑的濃度可以低于先前例如US2001/0033837中所建議的濃度。當(dāng)使用如此低濃度的抑制劑時(shí)，在穩(wěn)定的酶溶液中保持了大得多的酶活性。應(yīng)當(dāng)注意的是，由可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑和穩(wěn)定劑M的組合導(dǎo)致的使穩(wěn)定增強(qiáng)不應(yīng)當(dāng)被視為是M所提供的附加的抑制作用。實(shí)際上，如在說(shuō)明性實(shí)施例A中所述，M缺乏對(duì)任何絲氨酸蛋白酶的抑制能力。不希望受到理論的束縛，本發(fā)明人相信，所觀測(cè)到的令人驚奇的穩(wěn)定作用增強(qiáng)是通過(guò)本發(fā)明的組合物中可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑和穩(wěn)定劑M之間有利的協(xié)同作用而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供了在穩(wěn)定的絲氨酸蛋白酶組合物中可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑和穩(wěn)定劑M的組合，及該組合在穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶組合物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物中的絲氨酸蛋白酶選自胰蛋白酶、激肽釋放酶、凝血酶、纖溶酶、尿激酶、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、IX因子的活化形式、X因子的活化形式和XI因子的活化形式。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶是凝血酶。在另一具體的實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶是纖溶酶。在另一具體的實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶是胰蛋白酶。絲氨酸蛋白酶的可逆抑制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，優(yōu)選使用的抑制劑根據(jù)所使用的具體絲氨酸蛋白酶而各異。一般地，對(duì)于所期望的效果，重要的是抑制劑強(qiáng)度不大。換句話說(shuō)，抑制作用必須足夠適度，以使酶活性有效地保持在高水平。作為指導(dǎo)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在根據(jù)本發(fā)明的組合物中使用時(shí)抑制劑的Ki為0.01mM到2mM是適當(dāng)?shù)?，?yōu)選的范圍是0.04mM到0.5mM。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制劑可以選自N-(2'-苯氧基)-4-氨基吡啶及其衍生物、苯曱脒、N，N-二乙基乙二胺、氨基苯曱脒、脒基吡啶和叔丁基脒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制劑選自N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶及其衍生物、N，N-二乙基乙二胺、脒基吡啶和叔丁基脒。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制劑是N-(2'-苯氧基)-4-氨基吡啶或其衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中絲氨酸蛋白酶是纖溶酶，可逆抑制劑選自N，N-二乙基乙二胺、氨基苯曱脒和苯甲脒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中絲氨酸蛋白酶是胰蛋白酶，可逆抑制劑選自氨基苯曱脒和苯甲脒。這些酶和抑制劑的組合都是示例性的例子，并不能解釋為限制。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，式I中n的值是1或2。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，式I中n是l。根據(jù)本發(fā)明的組合物包含具有上述通式I的穩(wěn)定劑M。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑M是式II的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(II)其中或S;RLr4相同或不同，選自h、-ch-R6;f是IH或P-Q;P選自-(CH丄-和-(CH2)m-Y-(CH2)-，其中m是l-6且Y是0、NHQ選自H、-S03、-C00H、-NH2、-OH和-C0NH2;R6各自獨(dú)立地選自H、取代或未取代的低級(jí)烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的苯曱基、取代或未取代的芳基或單-、二-、或三環(huán)的具有一個(gè)或多個(gè)雜原子的未取代或取代的雜芳環(huán)和非芳香雜環(huán)，所述取代的基團(tuán)的取代基選自低級(jí)烷基、卣素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜-芳香化合物、非芳香雜環(huán)、烷氧基、烷氨基；或其藥學(xué)可接受的鹽。因此，在一些實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑M是式III的化合物r^、SA5an)其中R5是-CH廣R6或P-Q;P選自-(CH丄-或-(CH2h-Y-(CH上-，其中m是l-6且Y是0、NH或S;Q選自H、-S03、-COOH、-NH2、-OH和-C0冊(cè)2。R6各自獨(dú)立地選自取代或未取代的低級(jí)烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的苯甲基、取代或未取代的芳基、所述取代的基團(tuán)的取代基選自低級(jí)烷基、囟素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜-芳香化合物、非芳香雜環(huán)、烷氧基、烷氨基；或其藥學(xué)可接受的鹽。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑M選自嗎啉，3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)，嗎啉代丁基磺酸，嗎啉代丙基羧酸，嗎啉代乙基醇和嗎啉代乙基磺酸。因此，在本發(fā)明的這個(gè)方面的組合物中使用的化合物M的例子是嗎啉和3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑M是嗎啉。根據(jù)本發(fā)明顯示穩(wěn)定作用的組合物是，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制劑是N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶，穩(wěn)定劑M是嗎啉。根據(jù)本發(fā)明顯示穩(wěn)定作用的另一組合物是，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制劑是N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶，穩(wěn)定劑M是3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)。根據(jù)本發(fā)明顯示穩(wěn)定作用的另一組合物是，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制劑是氨基苯曱脒，穩(wěn)定劑M是嗎啉。根據(jù)本發(fā)明顯示穩(wěn)定作用的另一組合物是，其中絲氨酸蛋白酶是纖溶酶，可逆抑制劑是N，N-二乙基乙二胺，穩(wěn)定劑M是嗎啉。根據(jù)本發(fā)明顯示穩(wěn)定作用的另一組合物是，其中絲氨酸蛋白酶是纖溶酶，可逆抑制劑是氨基苯甲脒，穩(wěn)定劑M是嗎啉。在局部例如在創(chuàng)傷位點(diǎn)給藥的絲氨酸蛋白酶組合物中，現(xiàn)有的問(wèn)題在于，該組合物容易流動(dòng)或從所使用的位點(diǎn)沖洗走。為了解決這個(gè)問(wèn)題，可以向該酶組合物中加入粘附性聚合物，這樣就達(dá)到了使該組合物對(duì)皮膚或創(chuàng)傷位點(diǎn)更有粘性和粘附性的目的。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，向本發(fā)明的組合物中加入粘附性聚合物對(duì)其穩(wěn)定具有額外的預(yù)料不到和有益的效果。這樣，加入聚合物就達(dá)到了雙重的目的，既增強(qiáng)了組合物的粘性和粘附性，同時(shí)甚至進(jìn)一步有助于酶的穩(wěn)定。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含選自多糖和明膠的粘性和粘附性聚合物。這樣，該聚合物可以例如是多糖，例如選自淀粉，其衍生物，纖維素，其衍生物及其混合物。具體地，可以在根據(jù)本發(fā)明的組合物中用做添加物的淀粉的非限制性例子包括玉米淀粉和馬鈴薯淀粉及其混合物，而有用的纖維素衍生物非限制性例子是羧甲基纖維素和乙基羥乙基纖維素及其混合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，多糖是羧甲基殼聚糖。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述多糖的濃度是Q.1-5%。但是，還設(shè)想該聚合物是明膠，例如來(lái)自冷水魚(yú)的明膠。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述明膠的濃度是0.5-20%。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述絲氨酸蛋白酶的濃度是0.001-2mg/ral。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述絲氨酸蛋白酶的濃度是0.01-1rag/ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶，凝血酶的濃度是5-3500活性單位/ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶，凝1血酶的濃度是200-1000活性單位/ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶，凝血酶的濃度是5-20活性單位/ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述絲氨酸蛋白酶的可逆抑制劑的濃度是0.1-10mM。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述絲氨酸蛋白酶的可逆抑制劑的濃度是0.5-2mM。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定劑M的濃度是0.02-0.5M。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定劑M的濃度是0.1-0.3M。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供如上所述的組合物作為藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面關(guān)注其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶的所述組合物在制備實(shí)現(xiàn)給出血患者止血的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明一個(gè)相關(guān)的方面提供一種實(shí)現(xiàn)給出血患者止血的方法，包括以足以減少或停止所述出血的量在出血位點(diǎn)上使用本發(fā)明的組合物，其中該組合物中絲氨酸蛋白酶是凝血酶。在使用根據(jù)本發(fā)明的凝血酶組合物作為藥物的應(yīng)用或方法方面，本發(fā)明的組合物的穩(wěn)定性在其所使用的條件下提供了益處。通常，凝血酶組合物是在急診的情況中使用，其中關(guān)鍵是阻止患者出血。在相同的情況中，使用常規(guī)的止血凝血酶制劑是極為困難的，因?yàn)樗鼈兺ǔＰ枰闊┖拖臅r(shí)間的步驟，即融化(如果是冷凍)和/或溶解(如果是凍干)。本發(fā)明能夠生產(chǎn)溶液形式的止血?jiǎng)鼈兊姆€(wěn)定使得它們?cè)谳^長(zhǎng)的時(shí)間里例如在救護(hù)車或急診的直升飛機(jī)中易于貯存，直至在事故或類似問(wèn)題發(fā)生的位點(diǎn)需要時(shí)使用。在該時(shí)間點(diǎn)，可以直接使用它們，而不會(huì)由于制備有任何延遲。用于阻止出血的常規(guī)制劑包含相當(dāng)高濃度的凝血酶，為200-1000活性單位/ml。在整形外科使用時(shí)，可以看到會(huì)有瘢痕形成增加的危險(xiǎn)。目前在臨床上通過(guò)稀釋濃凝血酶溶液來(lái)制備低濃度的凝血酶溶液。還沒(méi)有即開(kāi)即用的制劑。因此，在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的凝血酶組合物，其具有顯著較低濃度的凝血酶，為5-20活性單位/ml，和其在整形外科中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面是利用纖溶酶，尿激酶或tPA作為血栓溶解劑的已知性質(zhì)。因此，本發(fā)明提供上述組合物在制備用于血栓溶解治療的藥物中的應(yīng)用，其中絲氨酸蛋白酶選自纖溶酶，尿激酶和組織纖維蛋白溶酶原激活劑。一個(gè)相關(guān)的方面提供一種在需要的患者中進(jìn)行血栓溶解治療的方法，包括以足以進(jìn)行所述治療的量給患者施用上述的組合物，其中該組合物中絲氨酸蛋白酶選自纖溶酶，尿激酶和組織纖維蛋白溶酶原激活劑。在這兩個(gè)相關(guān)的方面，所述的血栓溶解治療的非限制性的例子是，為了治療心肌梗塞或?yàn)榱酥委熤酗L(fēng)。如在本發(fā)明的組合物方面所述，由可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑和穩(wěn)定劑M導(dǎo)致的穩(wěn)定增強(qiáng)不應(yīng)當(dāng)被視為M所提供的附加的抑制作用。實(shí)際上，如在說(shuō)明性的實(shí)施例A中所述，M缺乏對(duì)任何絲氨酸蛋白酶的抑制能力。不希望受到理論的束縛，本發(fā)明人相信，所觀測(cè)到的令人驚奇的穩(wěn)定作用增強(qiáng)是通過(guò)本發(fā)明的組合物中可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑和穩(wěn)定劑M之間有利的協(xié)同作用而實(shí)現(xiàn)的。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供a)可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑和b)式I的穩(wěn)定劑M:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中n是0、1或2;X是0、N或CH2;W-R4相同或不同-CH廣NH-R6、-CO-O-R6，-CH廣NH-CO-腿6、-CH廣O-CO-NHR6;R5是R1-R"或P-Q;P選自-(CH丄-和-(CH2)m-Y-(CH丄-、其中m是l-6且Y是0、NH或S;選自H、-CH廣R6、—CH2-0—R6、-CH廣S-R6、-C0-NH-R6、-CH2-NH-CO-R6、-CH廣O-CO-R6、-CH2-NH-C0-0R6、-CH廠NH-CS-NHR6和Q選自H、-S03、-C00H、-NH2、-OH和-C0冊(cè)2;R6各自獨(dú)立地選自H、取代或未取代的低級(jí)烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的苯甲基、取代或未取代的芳基或單-、二-、或三環(huán)的具有一個(gè)或多個(gè)雜原子的未取代或取代的雜芳環(huán)和非芳香雜環(huán)、所述取代的基團(tuán)的取代基選自低級(jí)烷基、囟素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜-芳香化合物、非芳香雜環(huán)、烷氧基、烷氨基；的組合在穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶組合物中的應(yīng)用，其中可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑和穩(wěn)定劑M發(fā)揮協(xié)同作用以產(chǎn)生穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶的作用。在本發(fā)明的可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑和穩(wěn)定劑組合在穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶組合物中的應(yīng)用中，可以使用的具體組分和化合物M的取代基的選擇如上述在本發(fā)明的組合物方面所討論。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶的方法，包括將絲氨酸蛋白酶與a)所述絲氨酸蛋白酶的可逆抑制劑；和b)式I的穩(wěn)定劑M:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(I)其中n是0、1或2;X是O、N或CH2;W-R4相同或不同、選自H、-CH廣R6、-CH廣O-R6、-CH廣S-R6、-CH廣NH-R6、-CO-O-R6、-CO-NH-R6、-CH廣NH-CO-R6、-CH廣O-CO-R6、-CH廣NH-CO-NHR6、-CH2-NH-CO-OR6、-CH廣NH-CS-NHR6和-CH廣0-C0-匿6;R5是R1-W或P-Q;P選自-(CH丄-和-(CH2)m-Y-(CH2)m-、其中m是l-6且Y是0、NH或S;Q選自H、-S03、-C00H、-NH2、-OH和-C0冊(cè)2;R6各自獨(dú)立地選自H、取代或未取代的低級(jí)烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的苯甲基、取代或未取代的芳基或單-、二-、或三環(huán)的具有一個(gè)或多個(gè)雜原子的未取代或取代的雜芳環(huán)和非芳香雜環(huán)、所述取代的基團(tuán)的取代基選自低級(jí)烷基、卣素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜-芳香化合物、非芳香雜環(huán)、烷氧基、烷氨基；或其藥學(xué)可接受的鹽混合。在本發(fā)明的這種穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶組合物的方法中，可以使用的具體組分和化合物M的取代基的選擇如上述在本發(fā)明的組合物方面所討論。本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步的方面涉及的是上述的組合物在吸附到固狀物體中的應(yīng)用，以使該固狀物體可以提供所述的酶活性。具體地，在很多外科應(yīng)用中令人感興趣的是，進(jìn)入和特別地從動(dòng)脈中出來(lái)，同時(shí)對(duì)于出血只有盡可能小的傷害。為了阻止動(dòng)脈出血，先前建議使用"動(dòng)脈塞"(該物體也稱作動(dòng)脈封口裝置、股接入封閉裝置(當(dāng)使用股動(dòng)脈來(lái)進(jìn)入，例如在血管造影術(shù)中)，血管止血裝置和穿刺封閉裝置)的形式，例如由膠原或其他生物可降解的材料制備而成。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，有利地可以用根據(jù)本發(fā)明的組合物涂敷該塞，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶。該塞可以更迅速地封閉動(dòng)脈的開(kāi)口，其中該組合物中的凝血酶是為了使塞周圍的血液凝固。因此，在這個(gè)方面，本發(fā)明提供了一定量的根據(jù)本發(fā)明的組合物吸附于其上的血管止血裝置，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶。該血管止血裝置優(yōu)選是用生物可降解的固體或半固體材料例如例如膠原、殼聚糖或其他生物學(xué)聚合物制成的。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及新鑒別出N，N-二乙基乙二胺作為絲氨酸蛋白酶抑制劑。因此，在這個(gè)方面，本發(fā)明提供N，N-二乙基乙二胺作為絲氨酸蛋白酶的抑制劑的應(yīng)用，以及一種抑制絲氨酸蛋白酶的方法，包括將其用抑制量的N，N-二乙基乙二胺混合。在本發(fā)明的該方面的一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶是纖溶酶。在本發(fā)明的該方面的另一些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶是凝血酶。為了達(dá)到本發(fā)明不同方面的所有優(yōu)點(diǎn)，一般優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的組合物是選自溶液和凝膠的形式。在這個(gè)方面，更優(yōu)選水性溶液和水性凝膠。定義本文使用的術(shù)語(yǔ)"低級(jí)烷基"是指無(wú)支鏈或支鏈的，環(huán)狀，飽和或不飽和(烯基或炔基)的烴基，其可以是取代的或未取代的。當(dāng)為環(huán)狀時(shí)，烷基優(yōu)選是C3-C12，更優(yōu)選C5-C10,最優(yōu)選C5-C7。當(dāng)為非環(huán)狀時(shí)，烷基優(yōu)選是Cl-CIO，更優(yōu)選C1-C6，更優(yōu)選曱基，乙基，丙基(正丙基，異丙基)，丁基(支鏈或無(wú)支鏈)或戊基，最優(yōu)選甲基。本文使用的術(shù)語(yǔ)"芳基"是指芳香基團(tuán)，例如苯基或萘基，或包含一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選選自N，0和S雜原子的單-、二-或三環(huán)雜芳基，例如吡咬基，吡咯基，奮啉基，呋喃基，噻吩基，噁二唑基，噻二唑基，噻唑基，噁唑基，吡唑基，三唑基，四唑基，異噁唑基，異噻唑基，咪唑基，嘧啶基，吲哚基，吡嗪基，吲唑基，嘧啶基，噻吩基，吡喃基，咔唑基，吖啶基，喹啉基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，嘌呤基，噌啉基，蝶啶基。本文使用的術(shù)語(yǔ)"官能團(tuán)"在未保護(hù)的情況下是指羥基-，硫醇基-，氛基官能團(tuán)，羧酸，以及在保護(hù)的情況下是低級(jí)烷氧基，N-，0-，S-乙?；?，羧酸酯。本文使用的術(shù)語(yǔ)"雜芳基"是指包含一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選自N，O和S的雜原子的芳基，例如吡啶基，吡咯基，喹啉基，呋喃基，噻吩基，噁二唑基，噻二唑基，噻唑基，噁唑基，吡唑基，三唑基，咪唑基，嘧啶基，吲咮基，吡嚷基或吲唑基。本文使用的術(shù)語(yǔ)"非芳香雜環(huán)"是指包含一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選選自N,0和S的雜原子的非芳香環(huán)狀基團(tuán)，例如環(huán)氨基，例如吡咯烷基，哌啶基，哌溱基，嗎啉基或環(huán)醚例如四氫呋喃基，單糖。本文使用的術(shù)語(yǔ)"鹵素"是指氟，氯，溴或碘。本文使用的術(shù)語(yǔ)"取代的"是指所涉及的基團(tuán)被官能團(tuán)例如羥基,氨基，硫(sulfide)，曱硅烷基，芳基等取代。用于本發(fā)明的組合物的藥學(xué)可接受的加成鹽的例子包括由無(wú)機(jī)酸例如鹽酸，氫溴酸，磷酸，偏辨酸，硝酸和疏酸及由有機(jī)酸例如酒石酸，醋酸，檸檬酸，蘋(píng)果酸，乳酸，富馬酸，苯甲酸，羥乙酸，葡糖酸，琥珀酸和芳基磺酸衍生的那些。本文所述的藥學(xué)可接受的賦形劑例如媒介物、輔助劑、載體或稀釋劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且易于公開(kāi)購(gòu)買(mǎi)到。藥學(xué)可接受的載體可以是對(duì)活性化合物為化學(xué)惰性并且在使用條件下沒(méi)有有害的副作用或毒性的那些?？梢詮睦鏡emington:TheScience和PracticeofPharmacy,19thedition,MackPrintingCompany,Easton，Pennsylvania(1995)找到藥物制作為本發(fā)明的詳述，在根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法中使用的抑制劑的可能選擇是"N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶及其衍生物"。這是指具有式IV的化合物其中R'選自H、Cl-C6-烷基、C3-C7-環(huán)烷基、苯基、苯曱基乙?；捅綍貂；?；X選自氧、氮和硫；f和f分別獨(dú)立地選自H、卣素、羥基、C1-C6-烷基、C3-C7-環(huán)烷基、CI-C6-烷基氧；和f選自H、C1-C6-烷基、芳基烷基和?；?。優(yōu)選該抑制劑具有式V:其中W選自Cl-C6-烷基、C3-C7-環(huán)烷基、苯基和苯曱基；112和113分別獨(dú)立地選自H、卣素、羥基、Cl-C6-烷基、C3-C7-環(huán)烷基和Cl-C6-烷基氧。實(shí)施例下面的實(shí)施例是用于解釋本發(fā)明，而不應(yīng)解釋為限制。在下面對(duì)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的描述中，使用達(dá)到初始活性70%所花費(fèi)的時(shí)間作為酶溶液的穩(wěn)定的數(shù)值。選擇該值標(biāo)記為"T70%"，原因是它對(duì)應(yīng)于在商業(yè)產(chǎn)品的壽命中可以接受的活性最大可允許的喪失。在實(shí)驗(yàn)研究中，使用高溫(37C)，及高濃度的酶。這是為了在合理的較短時(shí)間內(nèi)得到穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，而無(wú)需等待幾月或幾年。已經(jīng)研究了穩(wěn)定性對(duì)溫度的依賴度，結(jié)果在實(shí)施例l中給出。該研究表明，與在實(shí)際測(cè)定的過(guò)程(37x:)相比，在室溫下滅活過(guò)程減慢了約3倍，在冷藏溫度下減慢了約20倍。此外，滅活過(guò)程是濃度依賴性的，在較高濃度的酶的情況下滅活更為迅速。在實(shí)施例1中使用的凝血酶的濃度是lmg/ml(或3300單位/ml)，即高于在當(dāng)前商業(yè)可購(gòu)的制品和/或裝置中使用的0.1-0.3mg/ml濃度。濃度依賴性的研究表明，在這些濃度下滅活過(guò)程比實(shí)施例1中使用的濃度下慢3-4倍。將此綜合給出10-12之間的因子，將其乘以T70%值，以得到與包含絲氨酸蛋白酶的商業(yè)產(chǎn)品例如包含凝血酶的止血制劑的室溫貯存條件相對(duì)應(yīng)的值。在表1中，具有N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶和MOPS的組合物的T70%為120天。這與0.1-0.3mg/ml產(chǎn)品在室溫條件下超過(guò)1200天，即超過(guò)3年的值相對(duì)應(yīng)。在溶液中凝血酶的穩(wěn)定性方面，這明顯超過(guò)了先前得到的任何材料。-乂凝j&雜^潛;t為了確定凝血酶溶液的促凝活性，測(cè)定在加入特定的人凝血酶(來(lái)自血漿，3300單位/mg，BiovitrumAB,Sweden)溶液的不同稀釋液后纖維蛋白原溶液(1.3mg/ml)的凝固時(shí)間。用AmelungenKc1血凝計(jì)(Amelungen，Germany)測(cè)定凝固時(shí)間。為了研究含不同添加物的凝血酶溶液的穩(wěn)定，將樣品在保持溫度為37C的恒溫室中溫育。以不同時(shí)間間隔取出等份液，測(cè)定在這些等份液中保留的凝血酶活性?？梢杂伤@得的值構(gòu)建活性衰減曲線。在10mMHEPES，0.13MNaCl緩沖液，pH7.4中，1mg/ml的凝血酶溶液的活性衰減曲線表明，在37t:T70%值為大約1.6天。在室溫(大約21'C)下的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明T70%值為5.4天，而在冷藏貯存(約5'C左右)后，T70。/。值為36天。這樣，如所期望的那樣，具有強(qiáng)烈的溫度依賴性。將具有指定的穩(wěn)定添加物的在10mMHEPES和pH7.4的0.13MNaCl緩沖液中包含1mg/ml的凝血酶的溶液置于恒溫室中，確定它們的活性衰減曲線。所得到的結(jié)果如表l所示。包括不包含添加物的相應(yīng)的1mg/ml凝血酶溶液的數(shù)據(jù)以用于比較。表1凝血酶的穩(wěn)定<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>顯然，受試化合物都具有穩(wěn)定作用，但是，如用這些組合所得到的良好結(jié)果所證明的那樣，根據(jù)本發(fā)明的抑制劑和包含嗎啉的化合物的組合具有協(xié)同作用。如上表所示，單獨(dú)加入0.20MM0PS穩(wěn)定增強(qiáng)，因子為4.7,加入0.5mM的可逆凝血酶抑制劑氨基苯曱脒，穩(wěn)定增強(qiáng)，因子為12.5。但是，本發(fā)明的組合好得多地穩(wěn)定了該凝血酶組合物，因子為42.5。本發(fā)明的MOPS和N，N-二乙基乙二胺的組合在穩(wěn)定酶方面也比單獨(dú)的組分更好。類似地，0.20MMOPS和1.9mMN-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶的組合能夠非常高地增強(qiáng)穩(wěn)定，因子為75，而單獨(dú)組分增強(qiáng)穩(wěn)定的因子分別為4.7和22。在該研究中使用的凝血酶是來(lái)自血漿的人凝血酶。也已經(jīng)研究了重組人凝血酶，其基本上顯示了相同的特性。,滋辦2-乎凝J&雜的潛定研究了牛凝血酶的穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)程序與實(shí)施例l相同，但是所使用的牛凝血酶(Baxter)的濃度是0.4mg/ml。在37。C下貯存時(shí)，HEPES緩沖液中的凝血酶溶液顯示的T70%值是1.3天。在HEPES緩沖液加3.0mMN-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶和0.20MMOPS中的凝血酶溶液顯示的T70%值是54天。所得到的結(jié)果表明，牛凝血酶比所研究的人凝血酶制品多少更不穩(wěn)定，但是通過(guò)本發(fā)明的組合得到了非常良好的穩(wěn)定作用。研究了包含低濃度的凝血酶的組合物中凝血酶的穩(wěn)定作用。根據(jù)HEPES緩沖液，pH7.4中15.0活性單位/ml的人凝血酶(來(lái)自血漿，3300單位/mg，BiovitrumAB,Sweden)的溶液顯示的T70%值是23天。HEPES緩沖液，pH7.4加2.GmMN-(2，-苯氧基)-4-氨基吡，定和0.20MMOPS中的對(duì)應(yīng)溶液顯示的T70%值是92天?！妒┺k4測(cè)定根據(jù)本發(fā)明的纖溶酶的溶液的穩(wěn)定作用。用發(fā)色肽底物ChromozymTH(Pentapharm，Switzerland),在分光光度計(jì)中在405nm處測(cè)定吸收的改變確定纖溶酶的活性。將包含在10mMHEPES和0.13MNaCl，pH7.4中的100pg/ml的纖溶酶(比活性3.2單位/mg，Sigma-Aldrich)以及如下表2所示的穩(wěn)定劑的溶液在37。C下溫育，以不同的時(shí)間間隔取樣以用于活性確定。所得到的結(jié)果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>這些結(jié)果證明了，用根據(jù)本發(fā)明的組合獲得了非常強(qiáng)的穩(wěn)定作用。0.20M嗎啉增強(qiáng)纖溶酶組合物穩(wěn)定性的因子為4，0.13MN，N-二乙基乙二胺的因子為2.7，1.3mM氨基苯甲脒的因子為17。但是，嗎啉和N，N-二乙基乙二胺的組合增強(qiáng)纖溶酶組合物穩(wěn)定性的因子為7.3,嗎啉和氨基苯曱脒的組合增強(qiáng)穩(wěn)定的因子為72。《滋辦J-腐蛋^癉^裙定測(cè)定根據(jù)本發(fā)明的胰蛋白酶的溶液的穩(wěn)定。用甲苯磺酰精氨酸甲酯(TAME)作為底物并在分光光度計(jì)中在247nm處測(cè)定吸收的改變確定纖溶酶的活性。將包含在10mMHEPES和0.13MNaCl,pH7.4中的100ng/ml的胰蛋白酶(TPCK-treated，Sigma-Aldrich)以及如下表3所示的穩(wěn)定劑的溶液在37。C下溫育，以不同的時(shí)間間隔取樣以用于活性確定。所得到的結(jié)果如表3所示。表3胰蛋白酶的穩(wěn)定<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>同樣，根據(jù)本發(fā)明的組合物的穩(wěn)定作用是最大的。因此，單用0.5M嗎啉增強(qiáng)纖溶酶組合物穩(wěn)定性的因子為13，單用1mM苯甲脒增強(qiáng)穩(wěn)定的因子為72。另一方面，本發(fā)明的組合增強(qiáng)穩(wěn)定性的因子為147。-舍0^凝羞雜^籍定1^^包含1.0至2.0%羧曱基纖維素(CMC)的凝血酶溶液與人皮膚的粘附性的試驗(yàn)表明，加入CMC極大地增強(qiáng)了粘度和粘附性。但是令人驚奇地，我們也發(fā)現(xiàn)，這些凝血酶溶液的穩(wěn)定性進(jìn)一步地增強(qiáng)，將包含2.0%CMC的0.5mM氨基苯曱脒，0.20MMOPS，10mMHEPES，0.13MNaCl的1mg/ml人凝血酶(來(lái)自血漿，3300單位/mg,BiovitrumAB,Sweden)溶液在37。C下溫育，確定活性衰減曲線。所得到的T70%值是175天?！蹲陶?-^岸趟#餘#秉合參#潛定#^也研究了4種其他聚合物乙基羥乙基纖維素(EHEC)、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉和冷水魚(yú)明膠。這四種聚合物都增強(qiáng)了凝血酶溶液的粘附性和粘度。進(jìn)一步研究了這些聚合物與凝血酶溶液的相容性和穩(wěn)定性，包括將包含各種聚合物的0.20MM0PS、0.5mM氨基苯曱脒、10mMHEPES、0.13MNaCl，pH7.4中1mg/ml人凝血酶(來(lái)自血漿，3300單位/mg,BiovitrumAB，Sweden)溶液在37。C下溫育。所使用的聚合物的濃度是EHEC，0.6%;兩種不同的淀粉，4.0%;和明膠，12.8%。EHEC與凝血酶完全相容，并獲得了與不含EHEC的相應(yīng)溶液相同的T70%值，即65天左右。包含淀粉的溶液的T70%值是22和26天。在明膠中凝血酶的穩(wěn)定是非常良好的，T70%值是90天以上，這表明，冷水魚(yú)明膠具有額外的穩(wěn)定作用。用兔子在一系列試驗(yàn)中試驗(yàn)本發(fā)明的組合物阻止出血的能力。所選擇的模型為在肝上切口，這是一個(gè)經(jīng)常使用的模型。打開(kāi)兔子的腹部，暴露出肝。在肝表面制造出3mm長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)切口，并用注射器將0.10ml的受試溶液施用于該傷口。測(cè)定止血的時(shí)間。用每種溶液進(jìn)行10-12次實(shí)驗(yàn)。在去掉每個(gè)系列試驗(yàn)中的最高和最低值后計(jì)算出血時(shí)間的平均值。為進(jìn)行比較，在該研究中也包括常用的止血?jiǎng)㏕isseel(Baxter),它是一種纖維蛋白膠?；旧细鶕?jù)制造商的推薦使用Tisseel。用具有混合室的雙注射器將0.2ml的溶液施用于每個(gè)傷口。所得到的結(jié)果在下表4中給出。表4出血實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>從這些結(jié)果顯而易見(jiàn)地看出，根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定的凝血酶溶液在出血患者的快速完成止血中是最有效的，它與常用的藥劑相當(dāng)或者更好。-與/s封并w畝容^將包含0.4mg/ml人凝血酶(來(lái)自血漿，3300單位/mg,BiovitrumAB，Sweden)的10mMHEPES,0.14MNaCl，0.5mM氨基苯曱脒，0.20MMOPS,pH7.4的溶液吸附到一片聚氨酯貪(由以HartmannScandicareAB,Anderstorp，SwedenLigasone出售)上。使用的溶液的量足以飽和該聚氨酯片。將該片轉(zhuǎn)移到試管中，然后封閉以防止蒸發(fā)。將該試管保存在37。C下，通過(guò)在聚氨酯片上輕壓以不同時(shí)間間隔取溶液的樣品。活性衰減曲線顯示的T70%值是74天，對(duì)應(yīng)地穩(wěn)定性增強(qiáng)的因子是46。測(cè)定穩(wěn)定的溶液中凝血酶對(duì)表面的吸附。將約3x3mm的殼聚糖(至少85%脫乙?；琒igma-Aldrich)的固體小片在400單位/ml人凝血酶(來(lái)自血漿，3300單位/mg，BiovitrumAB，Sweden)的10mMHEPES,0.13MNaCl，pH7.4溶液中溫育10分鐘。該溶液具有下列添加物l)無(wú)，2)0.10M嗎啉，2mMN-(2'-苯氧基)-4-氨基吡啶,3)0.10M嗎啉，2mMN-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶，0.5%羧曱基纖維素。然后取出該小片，并在濾紙上干燥。為了得到凝血酶凝固活性的測(cè)定值，將一個(gè)小片置于試管中，并加入0.4ml的1.3mg/ml纖維蛋白原溶液。為了改善對(duì)凝固的檢測(cè)，該試管也包括一個(gè)小的鋼球。小片在不同溫育混合物中初始獲得的凝固時(shí)間在1到4分鐘之間變化。在Eppendorf管中在37。C下溫育7天后，在溶液l)中溫育的小片的凝固時(shí)間極大地延長(zhǎng)。該值在24到27分鐘之間。相反，在溶液2)和3)中溫育的小片的凝固時(shí)間在1到2.5分鐘的范圍內(nèi)，即與初始值相同。顯然，用溶液2)和3)獲得了對(duì)凝血酶活性的強(qiáng)烈穩(wěn)定作用。為了測(cè)定體內(nèi)止血活性，在根據(jù)實(shí)施例8所述的動(dòng)物模型中，將在溶液3)中溫育的殼聚糖小片應(yīng)用于兔子的肝的傷口上。止血的平均時(shí)間是27秒(基于6次試驗(yàn))。說(shuō)效^其滋辨^-哮琳不^凝J&^^賴浙評(píng)價(jià)了嗎啉是凝血酶抑制劑的可能性。通常通過(guò)凝固試驗(yàn)測(cè)定凝血酶的纖維蛋白原凝固活性，其中通過(guò)機(jī)械或光學(xué)裝置檢測(cè)纖維蛋白原溶液凝固的時(shí)間。在該實(shí)驗(yàn)程序中的凝固試驗(yàn)是在pH7.4的0.01MHEPES、0.13MNaCl緩沖液中進(jìn)行的，該實(shí)驗(yàn)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(EU藥典)進(jìn)行的。使用包含89單位/ml的人凝血酶(來(lái)自血漿，3300單位/mg,BiovitrumAB，Sweden)溶液，測(cè)定1/5、1/10和1/16的稀釋液。通過(guò)加入調(diào)節(jié)到pH7.4的濃嗎啉溶液在HEPES緩沖液中來(lái)制備不同濃度的嗎啉溶液。當(dāng)將嗎啉溶解于水中時(shí)，pH升高至9-10，這樣加入HC1以得到pH7.4。這樣也增強(qiáng)了溶液的離子強(qiáng)度。表I顯示了所得到的結(jié)果。用標(biāo)準(zhǔn)曲線將觀測(cè)到的凝固時(shí)間轉(zhuǎn)換為凝血酶的濃度。表5嗎啉的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>從這些結(jié)果顯而易見(jiàn)地，將嗎啉的濃度提高到一定水平會(huì)延長(zhǎng)凝固時(shí)間。但是，當(dāng)用NaCl增強(qiáng)離子強(qiáng)度時(shí)，觀測(cè)到了相同的現(xiàn)象，顯示了相同的特性。這樣，在所有的可能性中，離子強(qiáng)度增強(qiáng)導(dǎo)致了作用的延長(zhǎng)。進(jìn)一步地，已知離子強(qiáng)度從O.15M提高到O.22M導(dǎo)致纖維蛋白的聚合文變(B.Bloraback，r/ro邁6os2.siesearc力，vol.83，(1996),p.1-75，特別是p.18)。這實(shí)際上對(duì)應(yīng)于在本實(shí)驗(yàn)系列中研究的范圍，其中NaCl的初始濃度是O.13M,然后提高到0.18M，并一直提高到O.33M。這也對(duì)應(yīng)于所觀測(cè)到的平臺(tái)水平?？傊?，嗎啉本身不是一種凝血酶的抑制劑。權(quán)利要求1.穩(wěn)定的絲氨酸蛋白酶組合物，包含a)絲氨酸蛋白酶；b)所述絲氨酸蛋白酶的可逆抑制劑；和c)具有式I的穩(wěn)定劑Mid="icf0001"file="S2005800516550C00011.gif"wi="58"he="27"top="60"left="39"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中n是0、1或2；X是O、N或CH2；R1-R4相同或不同、選自H、-CH2-R6、-CH2-O-R6、-CH2-S-R6、-CH2-NH-R6、-CO-O-R6、-CO-NH-R6、-CH2-NH-CO-R6、-CH2-O-CO-R6、-CH2-NH-CO-NHR6、-CH2-NH-CO-OR6、-CH2-NH-CS-NHR6和-CH2-O-CO-NHR6；R5是R1-R4或P-Q；P選自-(CH2)m-和-(CH2)m-Y-(CH2)m-、其中m是1-6且Y是O、NH或S；Q選自H、-SO3、-COOH、-NH2、-OH和-CONH2；R6各自獨(dú)立地選自H、取代或未取代的低級(jí)烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的苯甲基、取代或未取代的芳基或單-、二-、或三環(huán)的具有一個(gè)或多個(gè)雜原子的未取代或取代的雜芳環(huán)和非芳香雜環(huán)，所述取代的基團(tuán)的取代基選自低級(jí)烷基、鹵素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜-芳香化合物、非芳香雜環(huán)、烷氧基、烷氨基；或其藥學(xué)可接受的鹽。2.根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其中所述絲氨酸蛋白酶選自胰蛋白酶、激肽釋放酶、凝血酶、纖溶酶、尿激酶、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、IX因子的活化形式、X因子的活化形式和XI因子的活化形式.3.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中所述可逆抑制劑顯示的Ki值是0.01到2mM,例如0.04mM到0.5mM。4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中所述絲氨酸蛋白酶是凝血酶。5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中該可逆抑制劑選自N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶及其衍生物、苯甲脒、N，N-二乙基乙二胺、氨基苯曱脒、脒基吡啶和叔丁基脒.6.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中該可逆抑制劑選自N-(2，_苯氧基)-4-氨基吡啶及其衍生物、N，N-二乙基乙二胺、脒基吡啶和叔丁基脒.7.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中該可逆抑制劑是N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶或其衍生物。8.根據(jù)權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)的組合物，其中該絲氨酸蛋白酶是纖溶酶。9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中該可逆抑制劑選自N，N-二乙基乙二胺、氨基苯甲脒和苯甲脒。10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一的組合物，其中該絲氨酸蛋白酶是胰11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其中該可逆抑制劑選自氨基苯甲脒和苯甲脒。12.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中式I中n是l或2。13.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中式I中n是l。14.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中穩(wěn)定劑M是式II的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(II)其中RLR4相同或不同，選自H、-CH2-R6;R5是Ri-R"或P-Q;P選自-(CH丄-和-(CH2)邁-Y-(CH丄-，其中m是l-6且Y是0、NH或S;Q選自H、-S03、-C00H、-NH2、-OH和-CONH2;R6各自獨(dú)立地選自H、取代或未取代的低級(jí)烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的苯曱基、取代或未取代的芳基或單-、二-、或三環(huán)的具有一個(gè)或多個(gè)雜原子的未取代或取代的雜芳環(huán)和非芳香雜環(huán)，所述取代的基團(tuán)的取代基選自低級(jí)烷基、卣素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜-芳香化合物、非芳香雜環(huán)、烷氧基、烷氨基；或其藥學(xué)可接受的鹽。15.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中穩(wěn)定劑M是式III的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(III)其中R5是-CH廣R6或P-Q;P選自-(CH丄-或-(CH2)m-Y-(CH2)m-，其中m是l-6且Y是0、NH或S;Q選自H、-S03、-COOH、-NH2、-OH和-C0冊(cè)2;R6各自獨(dú)立地選自取代或未取代的低級(jí)烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的苯曱基、取代或未取代的芳基、所述取代的基團(tuán)的取代基選自低級(jí)烷基、卣素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜-芳香化合物、非芳香雜環(huán)、烷氧基、烷氨基；或其藥學(xué)可接受的鹽。16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中穩(wěn)定劑M選自嗎啉、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、嗎啉代丁基磺酸、嗎啉代丙基羧酸、嗎啉代乙基醇和嗎啉代乙基磺酸。17.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其中穩(wěn)定劑M選自嗎啉和3-(N-嗎啉代)丙磺酸.18.根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，其中穩(wěn)定劑M是嗎啉。19.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制劑是N-(2'-苯氧基)-4-氨基吡啶，穩(wěn)定劑M是嗎啉。20.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶，可逆抑制劑是N-(2'-苯氧基)-4-氨基吡啶，穩(wěn)定劑M是3-(N-嗎啉代)丙磺酸。21.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，進(jìn)一步包含粘性和粘附性聚合物，選自多糖和明膠。22.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，其中所述粘性和粘附性聚合物是多糖。23.根據(jù)權(quán)利要求22的組合物，其中所述多糖選自淀粉、其衍生物、纖維素、其衍生物及其混合物。24.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其中所述多糖選自羧甲基纖維素、乙基羥乙基纖維素及其混合物。25.根據(jù)權(quán)利要求22的組合物，其中所述多糖是羧甲基殼聚糖。26.根據(jù)權(quán)利要求22-25任一的組合物，其中所述多糖的濃度是0.l-5%。27.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，其中所述粘性和粘附性聚合物是明膠。28.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中所述明膠是冷水魚(yú)明膠。29.根據(jù)權(quán)利要求27-28任一的組合物，其中所述明膠的濃度是0.5-20%。30.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中所述絲氨酸蛋白酶的濃度是0.001-2mg/ml。31.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中所述絲氨酸蛋白酶是凝血酶，凝血酶的濃度是5-35QQ活性單位/ml。32.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中所述絲氨酸蛋白酶是凝血酶，凝血酶的濃度是2Q0-10QG活性單位/ml。33.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中所述絲氨酸蛋白酶是凝血酶，凝血酶的濃度是5-20活性單位/ml。34.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中所述絲氨酸蛋白酶的可逆抑制劑的濃度是G.1-10mM。35.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其中所述穩(wěn)定劑的濃度是0.02-0.5M。36.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物，其為選自溶液和凝膠，例如水性溶液或水性凝膠的形式。37.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的組合物作為藥物的應(yīng)用。38.根據(jù)權(quán)利要求1-36任一項(xiàng)的組合物在制備實(shí)現(xiàn)給出血患者止血的藥物中的應(yīng)用，其中絲氨酸蛋白酶是凝血酶。39.實(shí)現(xiàn)給出血患者止血的方法，包括以足以減少或阻止所述出血的量在出血位點(diǎn)上使用根據(jù)權(quán)利要求l-36任一項(xiàng)的組合物，其中該組合物中所述絲氨酸蛋白酶是凝血酶。40.根據(jù)權(quán)利要求33的組合物在整形外科中的應(yīng)用。41.根據(jù)權(quán)利要求l-36任一項(xiàng)的組合物在制備用于血栓溶解治療的藥物中的應(yīng)用，其中所述絲氨酸蛋白酶選自纖溶酶、尿激酶和組織纖維蛋白溶酶原激活劑。42.在需要的患者中進(jìn)行血栓溶解治療的方法，包括以足以進(jìn)行所述治療的量給患者施用根據(jù)權(quán)利要求l-36任一項(xiàng)的組合物，其中該組合物中所述絲氨酸蛋白酶選自纖溶酶、尿激酶和組織纖維蛋白溶酶原激活劑。43.可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑和權(quán)利要求1中所定義的穩(wěn)定劑M的組合在穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶組合物中的應(yīng)用，其中所述可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑和所述穩(wěn)定劑M協(xié)同作用以產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶穩(wěn)定效果。44.根據(jù)權(quán)利要求43的應(yīng)用，其中該絲氨酸蛋白酶是如權(quán)利要求2、4、8、10、30、31、32和33任一項(xiàng)中所定義。45.根據(jù)權(quán)利要求43-44的應(yīng)用，其中該可逆抑制劑是如權(quán)利要求3、5、6、7、9、11和34任一項(xiàng)中所定義。46.根據(jù)權(quán)利要求43-45任一的應(yīng)用，其中穩(wěn)定劑M是如權(quán)利要求12-18和35任一項(xiàng)中所定義。47.根據(jù)權(quán)利要求43-46任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述組合進(jìn)一步包含選自多糖和明膠的粘性和粘附性聚合物。48.根據(jù)權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中該粘性和粘附性聚合物是如權(quán)利要求22-29任一項(xiàng)中所定義。49.根據(jù)權(quán)利要求43-48任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑是N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶和所述穩(wěn)定劑M是3-(N-嗎啉代)丙磺酸。50.穩(wěn)定絲氨酸蛋白酶組合物方法，包括將絲氨酸蛋白酶與a)所迷絲氨酸蛋白酶的可逆抑制劑；和b)式I的穩(wěn)定劑M或其藥學(xué)可接受的鹽混合<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(I)其中n是0、1或2;X是0、N或CH2;RiR4相同或不同、選自H、-CH廣R6、-CH廣O-R6、-CH廠S-R6、-CH2-NH-R6、-C0-0-R6、-CO-匪-R6、-CH廣NH-C0-R6、-CH廠O-C0-R6、-CH廣NH-C0-NHR6、-CH2-NH-C0-0R6、-CH2-冊(cè)-CS-NHR6和-CH2-0-CO-NHR6;R5是RLR4或P-Q;P選自-(CH丄-和-(CH丄-Y-(CH丄-，其中m是l-6且Y是0、NH或S;Q選自H、-S03、-COOH、-NH2、-OH和-C0NH2;R6各自獨(dú)立地選自H、取代或未取代的低級(jí)烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的苯曱基、取代或未取代的芳基或單-、二或三環(huán)的具有一個(gè)或多個(gè)雜原子的未取代或取代的雜芳環(huán)和非芳香雜環(huán)；所述取代的基團(tuán)的取代基選自低級(jí)烷基、卣素、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜-芳香化合物、非芳香雜環(huán)、烷氧基、烷氨基。51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中該絲氨酸蛋白酶是如權(quán)利要求2、4、8、10、30、31、32和33任一項(xiàng)所定義。52.根據(jù)權(quán)利要求50-51的方法，其中該可逆抑制劑是如權(quán)利要求3、5、6、7、9、11和34任一項(xiàng)所定義。53.根據(jù)權(quán)利要求50-52任一項(xiàng)的方法，其中穩(wěn)定劑M是如權(quán)利要求12-18和35任一項(xiàng)所定義。54.根據(jù)權(quán)利要求50-53任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將絲氨酸蛋白酶與選自多糖和明膠的粘性和粘附性聚合物混合。55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中該粘性和粘附性聚合物是如權(quán)利要求22-29任一項(xiàng)所定義。56.根據(jù)權(quán)利要求50-55任一項(xiàng)的方法，其中所述可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑是N-(2，-苯氧基)-4-氨基吡啶和所述穩(wěn)定劑M是3-(N-嗎啉代)丙磺酸。57.根據(jù)權(quán)利要求1-36任一項(xiàng)的組合物吸附于其上的血管止血裝置，其中組合物中所述絲氨酸蛋白酶是凝血酶。58.根據(jù)權(quán)利要求57的血管止血裝置，包括生物可降解的材料，例如選自殼聚糖和膠原。59.N，N-二乙基乙二胺作為絲氨酸蛋白酶抑制劑的應(yīng)用。60.根據(jù)權(quán)利要求59的應(yīng)用，其中該絲氨酸蛋白酶選自凝血酶和纖溶酶。61.抑制絲氨酸蛋白酶的方法，包括向其中混入抑制量的N，N-二乙基乙二胺。62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中該絲氨酸蛋白酶選自凝血酶和纖溶酶。全文摘要提供一種組合物，其包含絲氨酸蛋白酶；所述絲氨酸蛋白酶的可逆抑制劑；和具有式I的穩(wěn)定劑M也提供該組合物作為藥物的應(yīng)用，和其他應(yīng)用，以及使用其各種性質(zhì)的方法。文檔編號(hào)A61K31/5377GK101272790SQ200580051655公開(kāi)日2008年9月24日申請(qǐng)日期2005年9月22日優(yōu)先權(quán)日2005年9月22日發(fā)明者H·阿格蘭,L-O·安德松申請(qǐng)人:特羅比奧股份公司