專利名稱：：使甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌對苯唑西林敏感的組合物和方法
技術領域：
：本發(fā)明的領域是抗菌治療組合物和方法，尤其是含有所選兒茶素的協(xié)同組合(combination)對曱氧西林抗性金黃色葡萄球菌(methicillinresistantStaphylococcusaureus)(MRSA)的治療。
背景技術：
：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和其他茶兒茶素以前已被用作抗菌劑，并且該活性的例子在現(xiàn)有技術中是熟知的(如參見，Jpn.J.Bacteriol.(1991);46:839-845)。然而，要顯示出顯著的抗菌作用，劑量通常要非常高因此在生理情況或體內(nèi)一般達不到。Shimamura在美國專利5，358，713號中報道了以相似的高濃度使用選擇的兒茶素防止MRSA對另一個人轉移。為了降低某些抗生素藥物的最小抑制濃度，將抗生素藥物與某些兒茶素相組合，并且有報道選擇的兒茶素是阿米卡星、氯霉素和各種的(3-內(nèi)酰胺抗生素的敏化劑，如Shimamura在U.S.5，807,564中所述。同樣，有報道玫瑰多酚能降低各種的P-內(nèi)酰胺抗生素的最小抑制濃度(如參見，MicrobiolImmunol.2004;48(1):67-73.)。然而，至少對于某些兒茶素，有效濃度的要求仍然相對高。在治療MRSA傳染的其他嘗試中，選擇的兒茶素也與特異性的茶黃素化合物組合，如EP0761226中所述生產(chǎn)抗菌組合物。但是，關于某些兒茶素依然有同樣的困難。對更多已知的選擇的兒茶素的組合，Morree等在美國專利6,652,890號中公開了EGC和EC的混合物，它能有效抑制表達NOX的贅生性細胞的NADH氧化酶從而治療癌癥。然而，在那個參考文獻中未報道該組合對細菌的作用。在更多已知使用兒茶素作為抗生素藥物的嘗試中，各種的兒茶素進行化學修飾如Stapleton等在WO2005/034976中所述。當該修飾過的兒茶素與它們未被修飾的相應成分相比提供了顯著的抗菌效果時，合成和純化增加了費用，并且對人類給藥還未被證明是安全和有效的。因此，雖然消滅MRSA和/或使MRSA對各種的抗生素敏感的許多組合物和方法在現(xiàn)有技術中是已知的，但是它們的全部或幾乎全部有一個或多個缺點。所以，仍需要對治療和/或化學預防MRSA傳染的改進藥劑。發(fā)明概述本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)當選擇的抗生素已經(jīng)與沒食子?；瘍翰杷?galloylatedcatechin)組合時，一些非沒食子?；膬翰杷?non-galloylatedcatechin)將增強MRSA對選擇的抗生素的敏感性。在本發(fā)明主題的一方面，降低抗生素藥物對金黃色葡萄球菌曱氧西林抗性菌林的MIC(最小抑制濃度)的方法，包括使金黃色葡萄球菌與使抗生素藥物的MIC降低到第一個水平的有效濃度的沒食子酰化兒茶素接觸的步驟。下一個步驟，確認非沒食子酰化的兒茶素的應用進一步協(xié)同地將抗生素藥物的MIC從第一水平降低到第二水平，再下一個步驟中，在沒食子?；瘍翰杷卮嬖谙?，使金黃色葡萄球菌與使抗生素藥物的MIC降低到第二水平的有效濃度的非沒食子酰化的兒茶素接觸。最優(yōu)選，抗生素藥物可以是特征為(3-內(nèi)酰胺抗生素(如，苯唑西林、曱氧西林、青霉素)，四環(huán)素類抗生素，(如，四環(huán)素、四一霉素、差向四環(huán)素，等)，和/或氯霉素型抗生素藥物(如，氯霉素、dextramycin、l-脫氧氯霉素，等)，沒食子?；瘍翰杷厥荅CG或EGCG，和/或非沒食子?；膬翰杷厥荅C或EGC。根據(jù)特定組合，預期當金黃色葡萄球菌沒有與沒食子?；瘍翰杷亟佑|時第一水平等于或少于抗生素藥物MIC的50%，和/或當金黃色葡萄球菌沒有與沒食子酰化兒茶素接觸時第二水平等于或少于抗生素藥物MIC的5%。在其它預期方面，當金黃色葡萄球菌沒有與沒食子?；瘍翰杷亟佑|時第一水平等于或少于抗生素藥物MIC的5%,并且當金黃色葡萄球菌沒有與沒食子?；瘍翰杷亟佑|時第二水平等于或少于抗生素藥物MIC的0.5%。所以，至少有些例子中，金黃色葡萄球菌與濃度少于10微克/毫升的沒食子?；瘍翰杷亟佑|，和與濃度等于或少于50微克/毫升的非沒食子酰化的兒茶素接觸。從不同觀點來看，本發(fā)明者也預期了抑制金黃色葡萄球菌(如，BB568、EMRSA-16或EMRSA-15)的甲氧西林抗性菌林生長的方法，其中在一個步驟中，使金黃色葡萄球菌與沒食子?；瘍翰杷睾涂股厮幬锏慕M合接觸，其中沒食子?；瘍翰杷睾涂股厮幬镆砸种粕L的無效濃度存在。在另一個步驟中，在上述組合的存在下，使金黃色葡萄球菌與以抑制金黃色葡萄球菌生長的有效濃度的非沒食子?；膬翰杷亟佑|。與上述方法相似，該方法中優(yōu)選抗生素藥物是濃度為60微克/毫升的卩-內(nèi)酰胺抗生素，并且，其中沒食子?；瘍翰杷厥菨舛葹?微克/毫升的ECG，和/或非沒食子?；膬翰杷?如，EC或EGC)是以至少25微克/毫升和更加典型至少50微克/毫升的濃度存在的。所以，在本發(fā)明主題的另一方面，抗生素藥物(如，p-內(nèi)酰胺抗生素)組合物包括沒食子酰化兒茶素和非沒食子?；膬翰杷兀渲?，相對于沒食子?；膬翰杷?，非沒食子酰化的兒茶素是以協(xié)同地降低抗生素藥物MIC的濃度存在。預期的組合物進一步包括與以下組合物相關的信息，其中相對于沒食子酰化的兒茶素，該組合物中沒食子?；瘍翰杷睾头菦]食子?；膬翰杷匾詤f(xié)同組合存在，有效地降低抗生素藥物的MIC。最優(yōu)選，沒食子?；瘍翰杷厥荅CG或EGCG，而非沒食子?；膬翰杷厥荅C或EGC。通常，非沒食子?；膬翰杷睾蜎]食子酰化兒茶素是以至少3:1重量比存在，更典型以至少6:1重量比存在。還應當意識到該組合物可以許多方式配制，特別優(yōu)選局部制劑(如，噴霧劑、乳膏、軟膏，等)。本發(fā)明的多種目的、特征、方面和優(yōu)點地通過發(fā)明的下面優(yōu)選實施方式詳細描述將更清楚。附圖的簡要說明圖1是描述對于EMRSA-16，EC和ECG的組合對苯唑西林MIC的協(xié)同作用的圖。圖2A是總結EC、EGC和EGCG對ECG使選擇的金黃色葡萄球菌菌林對苯唑西林敏感能力的作用的表。圖2B是總結EC和EGC對EGCG使金黃色葡萄球菌菌林對苯唑西林敏感能力的作用的表。詳細描述本發(fā)明者意想不到地發(fā)現(xiàn)使用沒食子?；瘍翰杷氐膬翰杷亟閷У腗RSA對各種抗生素藥物的敏化作用能通過將沒食子?；瘍翰杷嘏c非沒食子?；膬翰杷亟M合而進一步提高，且最優(yōu)選與相應的非沒食子酰化的兒茶素組合。明顯地，當獨自使用時，促進抗生素藥物敏感性的非沒食子酰化的兒茶素看上去對藥物的最小抑制濃度的作用很少或沒有。如這里所用的術語"MRSA"，"金黃色葡萄球菌甲氧西林抗性菌抹"和"曱氧西林抗性金黃色葡萄球菌"在這里互換使用，并且是指對許多，更典型是對所有(3-內(nèi)酰胺類抗生素藥物具有抗性的金黃色葡萄球菌。也可能存在涉及頭孢菌素和/或碳青霉烯類的其他耐藥性。分離出的醫(yī)院相關的MRSA經(jīng)常是對其他常用的抗菌劑，包括紅霉素、克林霉素和四環(huán)素有多重耐藥性的，而分離出的群落相關的(community-associated)MRSA經(jīng)常是只對|3-內(nèi)酰胺類抗生素藥物和紅霉素具有抗性?？剐园凑誑CLS(臨床實驗室標準的全國委員會)協(xié)議確認，并且通常分別由苯唑西林MIC測試中MIC等于或大于4微或少于10mm或19mm而反映。如這里所用的術語"最小抑制濃度"和"MIC"可互換使用，且指在細菌生長沒有被抑制的特定培養(yǎng)基中抗生素藥物的最小濃度。這里所用的術語"沒食子?；瘍翰杷?是指其中的C環(huán)用一個被取代或未被取代的苯曱酸基，且最常見是沒食子酸酯基修飾的化合物(名稱，參見下面的式1)。最典型地，被取代或未被取代的苯曱酸酯基在C環(huán)的3位共價連接。在該被取代的苯曱酸上預期的取代基包括一個或多個羥基和它們相應的酯基，各種的烷基醚基、氨基、硝基、硫酸根和/或磷酸根基團，其中每一個可能進一步被取代。比較起來，這里所用的術語"非沒食子?；膬翰杷?是指C環(huán)可以或不可以用取代基修飾的化合物，但是，存在于C環(huán)的3位上的那個取代基，不是沒食子酸酯基。因此，在許多其他適當?shù)娜〈?，非沒食子?；膬翰杷氐腃環(huán)的3位上是氫或羥基。在本發(fā)明主題物的一個優(yōu)選方面，本發(fā)明者在沒食子?；瘍翰杷乇韮翰杷貨]食子酸酯(ECG)濃度在O微克/毫升和12.5微克/毫升之間變化下培養(yǎng)金黃色葡萄球菌EMRSA-16菌抹，以增加該菌抹對苯唑西林的敏感性。然后記錄這些MIC,并且在存在非沒食子?；膬翰杷乇韮翰杷貪舛仍?微克/毫升和50微克/毫升之間變化下重復實驗。顯著地，非沒食子酰化的兒茶素的增加以顯著和協(xié)同方式降低了MIC。當表兒茶素用非沒食子酰化表沒食子兒茶素替換時，得到了近似的結果。相比較，當使用沒食子酰化表沒食子兒茶素沒食子酸酯時，實質上沒有獲得顯著的和協(xié)同的效果。不希望局限于任何特殊理論或^^說，本發(fā)明者預期，納摩爾濃度的兒茶素可能通過它們分成磷脂柵欄的能力調(diào)整生物膜的結構和功能。沒食子酰化兒茶素被認為比它們的非沒食子?；愃莆锬芨畹貪B入磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺雙層。因此，期望ECg和EGCg占據(jù)膜中的更深的位置，并且EC和EGC位于更淺的位置(更接近磷脂-水界面)。膜滲透的這些區(qū)別與這些分子修飾葡萄球菌(3-內(nèi)酰胺抗性的能力相當。有意思地，被加到脂質雙層中的ECg和EGCg的量在EC存在下明顯增加，提高兒茶素沒食子酸酯降低葡萄球菌的J3-內(nèi)酰胺抗性水平的能力的可能性可以通過非沒食子?；膬翰杷卦鰪?。在本發(fā)明主題物的另一個預期方面，應該理解除表兒茶素沒食子酸酯(ECG)外的許多沒食子?；瘍翰杷卦谶@里也被認為是適用的。在其他沒食子?；瘍翰杷刂校A期適當?shù)幕衔锇▋翰杷貨]食子酸酯(CG)，沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，茶黃素單沒食子酸酯A,茶黃素單沒食子酸酯B和茶黃素雙沒食子酸酯。應該進一步注意，這里預期的兒茶素(沒食子酰化和非沒食子?；?包括光學異構體、手性中心，和/或立體異構體，并且所有這些形式(和混合物)都在這里考慮。同樣，非沒食子?；膬翰杷乜梢园ㄔS多可供選擇的化合物，包括兒茶素(C)，沒食子兒茶素(GC)和表沒食子兒茶素(EGC)。因此，這里考慮的優(yōu)選的沒食子?；头菦]食子酰化的兒茶素具有式1的結構式l其中R,、R2、R3、R4、R3'、R4'、和Rs'獨立地是H、OH或M;其中M是OC(O)R、OC(S)R、OC(NH)R、OR或R,其中R是任選被取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基或芳基(和最優(yōu)選一個，二或三羥基的苯曱酸基)；其中結構中的A、B和C表示各自的環(huán)；并且在兒茶素是沒食子?；瘍翰杷貢r，R3"是沒食子酸酯基；并且在兒茶素是非沒食子?；膬翰杷貢r，R3"是M且條件是在OC(O)R中R不是沒食子酸基。關于沒食子?；瘍翰杷氐倪m當濃度，通常預期所有濃度被認為是適當?shù)?，只要該濃度達到敏感化的至少某一水平(即，與生長在同樣情況下無沒食子?；瘍翰杷氐南啾冉档土丝股厮幬锏腗IC)。而且，應看出不同的沒食子?；瘍翰杷卦谙喈?shù)臈l件下將顯示出對MIC明顯的降低。更進一步，tw二的兒茶素的濃度確定。所以，沒食子?；瘍翰杷?包括ECG)的各種的濃度被考慮且通常在0微克/毫升和50毫克/毫升(甚至更高)之間，但更典型在l微克/毫升和1毫克/毫升之間且最典型在5微克/毫升和100微克/毫升之間。同樣，考慮的非沒食子?；膬翰杷氐臐舛葧兓⑷Q于許多因素，包括非沒食子?；膬翰杷氐木唧w化學結構、沒食子?；瘍翰杷氐臐舛群皖愋停毦?，和/或抗生素藥物。然而，通常預期非沒食子酰化的兒茶素的濃度在0微克/毫升和50毫克/毫升(甚至更高)之間，更典型在1微克/毫升和1毫克/毫升之間和最典型在5微克/毫升和100微克/毫升之間。此外，非沒食子?；膬翰杷卮嬖诹肯鄬τ跊]食子?；瘍翰杷貎?yōu)選(但不是必需)至少等摩爾量，更優(yōu)選1.1-2.0比1的過摩爾量，甚至更優(yōu)選2.0-4.0比1的過摩爾量，且最優(yōu)選2.0-10.0比1的過摩爾量。更進一步，非沒食子酰化的兒茶素優(yōu)選是與沒食子?；瘍翰杷叵鄬膬翰杷?。例如，在第一水平的敏感化由ECG作用時，優(yōu)選非沒食子?；膬翰杷厥荅C。在另一個例子中，在第一水平的敏感化由EGCG作用時，優(yōu)選非沒食子?；膬翰杷厥荅GC。然而，還應認識到超過一種兒茶素(沒食子?；?或非沒食子?；?可以被用于預期的組合中。例如，第一水平的敏感化可以由包括至少一種沒食子?；瘍翰杷氐膬翰杷氐幕旌衔镒饔茫缓?，第二個更低水平的敏感化，可以由單一的非沒食子?；膬翰杷刈饔?。在另一方面，在需要時，第一水平的敏感化可以由單一的兒茶素作用，然后，第二個更低水平的敏感化，可以由包括至少一種非沒食子?；膬翰杷氐幕旌衔镒饔谩Ｊ褂脙翰杷鼗旌衔飼r，特別優(yōu)選分離自植物(如，茶樹、葡萄、藍莓等)的混合物。分離出的該兒茶素能標準化為沒食子酰化與非沒食子?；膬翰杷氐谋壤A先確定的一種特定制劑。例如，在一種沒食子?；瘍翰杷乇壤純?yōu)勢的綠茶萃取物中，各個兒茶素通常百分比的可能是10-15%EGCg,2-3%ECG，2%EC和2-3%EGC(如，Suganuma等1999年，CanRes.59:44畫47)。在另一方面，也可以制備或改進萃取物使其以得到非沒食子?；膬翰杷貫橹鞯妮腿∥?如，10-20%EGC和EC,2-3%ECG和5%EGCG)。此外，咖啡因、可可堿、茶堿和酚酸，如沒食子酸，可能也存在于綠茶萃取物的組分中，并且典型地以比多酚少的量存在。在其他預期的萃取物中，特別適合的多酚萃取物包括polyphenonE和polyphenol!B,兩者都可購自MitsuiNorinJapan(1-2-9Nishishinbashi、Minato-ku，東京，105-8427,日本)，并可以進一步被用作特定制劑的基本材料。關于抗生素藥物，通常預期非沒食子酰化的兒茶素可以進一步增強預先敏感化的MRSA對多種抗生素藥物的敏感性(即，降低MIC),該抗生素藥物包括全部或幾乎全部的(3-內(nèi)酰胺抗生素、四環(huán)素，和/或氯霉素型藥物。因此，在其他抗生素藥物中，預期的抗生素包括各種的青霉素(如，千星青霉素，芐青霉素(青霉素G)，苯氧基曱基青霉素(青霉素V),雙氯西林、氟氯西林、阿莫西林、氨節(jié)西林等)，各種的頭孢菌素(如，頭孢氨芐、頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢孟多、頭孢曲松、頭孢噻肟等)，各種的碳青霉烯類(如，亞胺培南、美羅培南、艾他培南等)，單環(huán)內(nèi)酰胺類(如，氨曲南)，各種的四環(huán)素類(如，四環(huán)素、四一霉素、差向四環(huán)素等)和各種的氯霉素型抗生素藥物(如，氯霉素、dextramycin、1-脫氧氯霉素，等)。根據(jù)抗生素藥物的種類和沒食子?；瘍翰杷氐臐舛?，應理解用非沒食子?；膬翰杷厥姑舾行缘脑黾涌赡茏兓艽?。然而，通常預期敏感性的增加(即，MIC的降低)是至少2倍(如，從20微克/毫升到10微克/毫升)，更典型至少3倍，還更典型的是至少4-6倍和最典型至少5-10倍(如，從50微克/毫升到10微克/毫升)。仍進一步預期，MRSA與沒食子?；?或非沒食子?；膬翰杷氐慕佑|優(yōu)選(但不是必需)在抗生素藥物存在下進行。最典型(但不是必需)，沒食子?；头菦]食子酰化的兒茶素一起給藥于存在MRSA的環(huán)境中。例如，尤其給藥是體外或局部給藥(如，殺菌噴霧劑、體外培養(yǎng)、局部軟膏，等)，兒茶素的組合可以與抗生素溶液混合。在另一個例子中，尤其是所述組合對哺乳動物給藥時，兒茶素的組合也可以口服和與抗菌制劑分開給藥(可以經(jīng)或可以不經(jīng)口服或腸外給藥的)。所以，應承認沒食子?；?或非沒食子?；膬翰杷乜梢栽S多制劑給藥，并且特別優(yōu)選的制劑包括固體(如，分離的兒茶素或從茶萃取物得到的多酚粉末)或液體形式(如，液體兒茶素制劑或茶萃取物)的口服制劑。特別優(yōu)選的制劑包括局部制劑(如，乳膏、軟膏、凝膠、洗液，等)。有許多這樣的現(xiàn)有技術已知的可購得的制劑，并且所有些在這里是被視為適用的。這種制位使用而使局部濃度小于l毫克/毫升。根據(jù)這些和進一步的考慮，本發(fā)明者因此預期到一種降低抗生素藥物對MRSA的MIC的方法，其中金黃色葡萄球菌與使抗生素藥物MIC降低到第一水平的有效濃度的沒食子?；瘍翰杷亟佑|。在另一步驟中，確認(如，通過書面或顯示信息)非沒食子酰化的兒茶素的應用進一步協(xié)同地將抗生素藥物的MIC從第一水平降低到第二水平，再另一步驟中，金黃色葡萄球菌，在沒食子?；瘍翰杷卮嬖谙屡c非沒食子?；膬翰杷亟佑|，其中非沒食子酰化的兒茶素濃度為使抗生素藥物的MIC降低到第二水平的有效濃度。例如，在一種典型應用中，適當?shù)牡谝凰降扔诨蛏儆谠诮瘘S色葡萄球菌沒有與沒食子?；瘍翰杷亟佑|時抗生素藥物MIC的50%,并且適當?shù)牡诙降扔诨蛏儆谠诮瘘S色葡萄球菌沒有與沒食子?；瘍翰杷亟佑|時抗生素藥物MIC的5%。在這樣例子中，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)MRSA與濃度少于10微克/毫升的沒食子?；瘍翰杷睾蜐舛鹊扔诨蛏儆?0微克/毫升的非沒食子?；膬翰杷亟佑|。在其他例子中，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)第一水平等于或少于MIC的5%,并且第二水平等于或少于MIC的0.5%。因此，適當?shù)姆椒ㄒ舶▽RSA與沒食子?；瘍翰杷睾涂股厮幬锏慕M合接觸以抑制MRSA生長的方法，其中沒食子?；瘍翰杷睾涂股厮幬锸且砸种粕L的無效濃度(如，ECG的濃度為5微克/毫升且P-內(nèi)酰胺抗生素的濃度為60微克/毫升)存在。在另一步驟，然后在上述組合的存在下，將MRSA與以抑制MRSA生長的有效濃度的非沒食子酰化的兒茶素(如，EC或EGC濃度為至少25微克/毫升且更加典型為至少50微克/毫升)接觸。該方法特別理想用于將MRSA(如，BB568、EMRSA-16和EMRSA-15)從耐藥性或過渡特征(關于特殊抗生素藥物)轉換成敏感特征。在更進一步預期的方面，預期的藥物組合物包括沒食子?；瘍翰杷?如，ECG或EGCG),非沒食子?；膬翰杷?EC或EGC)和任選的抗生素藥物(如，P-內(nèi)酰胺抗生素)，其中，相對于沒食子?；膬翰杷?，非沒食子?；膬翰杷厥且詤f(xié)同地降低抗生素藥物的最小抑制濃度的濃度存在的。該組合物典型地進一步與以下信息相聯(lián)系，其中相對于沒食子酰化的兒茶素，沒食子酰化兒茶素和非沒食子?；膬翰杷厥且越档涂股厮幬颩IC的協(xié)同組合而存在的。在其他適當?shù)谋嚷手?，非沒食子酰化的兒茶素和沒食子?；瘍翰杷厥且灾亓勘葹橹辽?:1，更典型為至少3:1和再典型為至少6:1存在的。已經(jīng)如上討論，應該認可所述組合物可以用許多方法配制，包括口月良和局部制劑。然而，特別優(yōu)選制劑是局部制劑。實驗通過EC介導的ECG與膜的加強結合因為金黃色葡萄球菌膜由磷脂酰甘油(63-74%),賴氨酰磷脂酰甘油(17-22%)和心磷脂(5-15%)獨特地組成，本發(fā)明者用Kajiya等所述的HPLC分析(Kajiya、K.、S.Kurnazawa和T.Nakayama.2001年，Stericeffectsontheinteractionofteacatechinswithlipidbilayers.Biosci.Biotechnol.Biochem.65:2638-2643)確定了非沒食子酰化的兒茶素增強ECG與金黃色葡萄球菌結合的能力。EC、EGC、ECG和EGCG由東京食品技術有限公司(TokyoFoodTechnoCo.Ltd.)提供(東京，日本)。金黃色葡萄球菌BB568是構成PBP2a的生產(chǎn)者(constitutivePBP2aproducer)(由B.Berger-Bachi,UniversityofZiirich提供)，并且EMRSA-15和EMRSA-16臨床上分離自RoyalFreeHospital,倫敦。ECG與對數(shù)中期的EMRSA-16細胞的結合通過濃度為25微克/毫升的EC提高。13。/。EC群(pool)在35i:培養(yǎng)20分鐘后結合(bound),并且22%的ECG與細胞連接。在EC存在下，ECG結合上升到41。/。。EC結合也由于ECG的存在而提高(35.5。/。)。因此，EC看上去促進了ECG與葡萄球菌細胞以及PC和PE脂質體的結合。金黃色葡萄球菌敏化作用測試為檢測是否該協(xié)同結合得到了增強的生物活性，將EC和EGC增強金黃色葡萄球菌對苯唑西林敏化程度的能力進行了測定。檢測板MIC分析用200ld含有約104CFU接種物的補充了2%NaCl的Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)基(Oxoid，Basingstoke,英國)在96孔微滴定測定盤上進行。在35。C培養(yǎng)24小時后得到MIC值。使用金黃色葡萄球菌ATCC29213作為標準易感菌抹。三重組合的分級抑制濃度(FIC)指數(shù)計算如下SFIC=FIC0XA+FICB+FICC=[CcombOXA/MICOXA]十[C畫VMICb〗+[Ccombc/MICc]，其中OC,bc是被測試的兒茶素的濃度。Ce。mb0XA是在抑制生長的組合中苯唑西林最低濃度，并且MICoxa，MICB和MICc是化合物單獨使用時的MIC。對二種化合物的組合，省略了術語(Ce。^c/MICc)。FIC指數(shù)^).5說明有協(xié)同作用。我們測定了EC、EGC和EGCG對ECG使EMRSA-16、EMRSA-15和BB568對苯唑西林敏感的能力的作用，并且這些實驗的結果在圖2A中被列出。苯唑西林對BB568，EMRSA-16和EMRSA-15的MIC分別為256,512和16毫克/毫升。兒茶素化合物固有的抗葡萄球菌的活性^f艮小或沒有，其MIC范圍為64-512毫克/毫升。濃度為12.5毫克/毫升的ECG使苯唑西林對金黃色葡萄球菌BB568和EMRSA-16的MIC降低到苯唑西林轉折點(breakpoint)之下；在3.12毫克/毫升較低的濃度下對EMRSA-15達到相似的作用。顯著地，非沒食子?；膬翰杷谽C和EGC不能使苯唑西林對這些分離菌的MIC降低。然而，這些化合物明顯提高了ECG降低苯唑西林抗性的能力。濃度為3.12毫克/毫升的ECG使對BB568和EMRSA-16的MIC分別降低到64和128毫克/毫升。與6.25毫克/毫升EC組合，苯唑西林對這些分離菌的易感性增加到8毫克/毫升；在3.12毫克/毫升ECG存在下增加EC濃度到25毫克/毫升得到了2毫克/毫升的值。當EGC與ECG組合使用時，觀察到了相似的降低。FIC指數(shù)表明了在苯唑西林、ECG和EC或EGC之間對所有三種金黃色葡萄球菌分離菌都有強的協(xié)同作用。在高濃度時，ECG(^12.5毫克/毫升)與EC和EGC(^50毫克/毫升)兩種組合在沒有苯唑西林時都抑制了EMRSA-16生長。EC和EGC對由ECG介導的苯唑西林敏感化的增強具有明顯地濃度依賴性，如圖1所示(描述了ECG和EC對苯唑西林對EMRSA-16的MIC的作用)。在ECG存在下，沒食子?；瘍翰杷谽GCG降低苯唑西林MIC的有效性顯著降低。例如，與3.12毫克/毫升ECG,25毫克/毫升EGCG只將MIC降低到二分之一(reducedtheMIConlytwofold)。以12.5毫克/毫升的更高的ECG濃度，EGCG損害了ECG降低BB568和EMRSA-16菌抹的MIC的能力。EGCG也能使BB568、EMRSA-16和EMRSA-15對苯唑西林敏感(參見圖2B)，但是與ECG作用相比作用非常不明顯。EC和EGC都能提高敏感化(如圖2B所示)，但作用與[EC/EGC-ECG-苯唑西林]組合比較相對較小，如圖2A所示。因此本發(fā)明人預期非沒食子?；膬翰杷厝鏓C和EGC增強MRSA菌抹對苯唑西林的易感性的能力是通過沒食子酰兒茶素ECG和EGCG經(jīng)對葡萄球菌的細胞質膜靶向的作用實現(xiàn)的。該假說將由在EC或EGC存在下的ECG膜結合增加而證實，如果膜結合和敏感性之間有因果相關。進一步支持該假說的事實是兒茶素通常不進入細胞，這使它們更像能通過膜的生物物理學特性的改變而調(diào)整金黃色葡萄球菌的P-內(nèi)酰胺類抗性(如，通過損壞與雙層相關的蛋白質的功能從而影響物質的跨膜運輸)。上述數(shù)據(jù)清楚地表明，在抗生素存在下，沒食子?；瘍翰杷睾头菦]食子?；膬翰杷刂g關于它們的抗菌作用的相互作用的顯著性和協(xié)同特性。該發(fā)現(xiàn)特別令人驚奇，因為早先研究認為沒食子酸基團對表兒茶素沒食子酸酯活性是必要的(Stapleton,RD.,S.Shah，J.C.Anderson,YHara，J.M.T.Hamilton-Miller和P.W.Taylor.2004.Modilationofbeta-lactamresostanceinStaphylococcusaureusbycatechinsandgallates.InternationalJ.Antimicrol。Agents23:462-467》it匕夕卜，由于這些化合物缺少酯基，所以非沒食子酰化的兒茶素作為酯酶抑制劑是不太可能的。此外，ECG的酯酶穩(wěn)定的衍生物當與苯唑西林組合^f吏用對抗金黃色葡萄球菌時，有相似的活性，所以認為酯酶活性不是一個體外關鍵因素(Anderson，J.C，C.Headley，P.D.Stapleton，andRW.Taylor.2005.Synthesisandantibacterialactivityofahydrolyticallystable(-)-epicatechingallateanalogueforthemodulationofbeta-lactamresistanceinStaphylococcusaureus.Bioorg.Med.Chem.Lett.15:2633-2635)。然而，注意到，其他形式的失活，特別是對兒茶素部分的修飾，其中EC和EGC可作為潛在的抑制劑，不能被排除。因此，使MRSA對苯唑西林敏感化的組合物和方法的具體實施方案和申請已經(jīng)浮皮公開。然而，很明顯，不違背這里本發(fā)明的概念，對本領域普通技術人員而言，除已描述的那些之外的許多改進是可能的。因此，本發(fā)明的主題不受限制，除了所附屬權利要求的精神之外。而且，在解幹說明書和權利要求書時，所有術語應該以與上下文一致的在最大可能有關的方式解釋。特別是，術語"包括，，，和"包含"應該被解釋為提到元素、組分或以非排除性方式的步驟，表明所參考的要素、組分或步驟可以存在或使用，或與沒有明確地被提及的其他元素、組分或步驟組合。此外，當這里引用作為參考的參考文獻中的術語的定義或使用，與本文提供的術語的定義不一致或相反時，使用那個術語在這里提供的定義，而不使用那個術語在參考文獻中的定義。權利要求1.降低抗生素藥物對金黃色葡萄球菌甲氧西林抗性菌株的最小抑制濃度的方法，包括使所述金黃色葡萄球菌與沒食子?；瘍翰杷亟佑|，所述沒食子酰化兒茶素的濃度為對于降低抗生素藥物最小抑制濃度到第一水平有效的濃度；確認非沒食子?；膬翰杷氐氖┯眠M一步協(xié)同地使抗生素藥物的最小抑制濃度從第一水平降低到第二水平；和在沒食子?；瘍翰杷卮嬖谙?，使所述金黃色葡萄球菌與非沒食子酰化的兒茶素接觸，所述非沒食子?；瘍翰杷氐臐舛葹橛行Ы档涂股厮幬锏淖钚∫种茲舛戎恋诙降臐舛?。2.權利要求1的方法，其中抗生素藥物選自(3-內(nèi)酰胺抗生素、四環(huán)素和氯霉素。3.權利要求l的方法，其中沒食子?；瘍翰杷厥荅CG或EGCG，并且其中非沒食子?；膬翰杷胤謩e是EC或EGC。4.權利要求1的方法，其中第一水平等于或少于在所述金黃色葡萄球菌沒有與沒食子酰化兒茶素接觸時抗生素藥物最小抑制濃度的50%。5.權利要求1的方法，其中第二水平等于或少于在所述金黃色葡萄球菌沒有與沒食子?；瘍翰杷亟佑|時抗生素藥物最小抑制濃度的5%。6.權利要求1的方法，其中第一水平等于或少于在所述金黃色葡萄球菌沒有與沒食子?；瘍翰杷亟佑|時抗生素藥物最小抑制濃度的5%，并且，第二水平等于或少于在所述金黃色葡萄球菌沒有與沒食子?；瘍翰杷亟佑|時抗生素藥物最小抑制濃度的0.5%。7.權利要求1的方法，其中所述金黃色葡萄球菌與濃度少于10微克/毫升的沒食子?；瘍翰杷兀团c濃度等于或少于50微克/毫升的非沒食子?；膬翰杷亟佑|。8.抑制金黃色葡萄球菌曱氧西林抗性菌林生長的方法，包括使所述金黃色葡萄球菌與沒食子酰化兒茶素和抗生素藥物的組合接觸，其中所述沒食子?；瘍翰杷睾涂股厮幬锏臐舛葘σ种粕L無效；并且在上述組合的存在下，使所述金黃色葡萄球菌與有效抑制所述金黃色葡萄球菌生長的濃度的非沒食子酰化的兒茶素接觸。9.10.權利要求8的方法，其中抗生素藥物是濃度為60微克/毫升的卩-內(nèi)酰胺抗生素，并且，其中沒食子?；瘍翰杷厥菨舛葹?微克/毫升的ECG。11.權利要求10的方法，其中非沒食子酰化的兒茶素是濃度為至少25微克/毫升的EC或EGC。12.權利要求8的方法，其中非沒食子酰化的兒茶素是濃度為至少50微克/毫升的EC或EGC。13.權利要求8的方法，其中所述金黃色葡萄球菌選自BB568、EMRSA-16和EMRSA-15。14.抗生素藥物組合物，包括沒食子?；瘍翰杷?、非沒食子?；膬翰杷睾腿芜x的抗生素藥物；其中，相對于所述沒食子酰化兒茶素，非沒食子?；膬翰杷匾詤f(xié)同降低抗生素藥物的最小抑制濃度的濃度存在；和與以下組合物相關的信息，該組合物中沒食子?；瘍翰杷睾头菦]食子酰化的兒茶素以協(xié)同組合存在，相對于沒食子酰化兒茶素，該協(xié)同組合降低抗生素藥物的最小抑制濃度。15.權利要求14的抗生素藥物組合物，其中沒食子?；瘍翰杷厥荅CG或EGCG。16.權利要求14的抗生素藥物組合物，其中非沒食子?；膬翰杷厥荅C或EGC。17.權利要求14的抗生素藥物組合物，其中非沒食子?；膬翰杷睾蜎]食子?；瘍翰杷氐闹亓勘戎辽贋?:1。18.權利要求M的抗生素藥物組合物，其中非沒食子?；膬翰杷睾蜎]食子?；瘍翰杷氐闹亓勘戎辽贋?:1。19.權利要求14的抗生素藥物組合物，其中抗生素藥物是P-內(nèi)酰胺抗生素。20.權利要求14的抗生素藥物組合物，其中該組合物被配制成局部用組合物。全文摘要進一步增強敏化MRSA對各種抗生素藥物易感性的預期方法和組合物。最優(yōu)選，MRSA是已被沒食子?；瘍翰杷?如，ECG)敏化的，并通過與非沒食子?；膬翰杷?如，EC)接觸達到進一步敏感化，并且最優(yōu)選與相應的非沒食子?；膬翰杷亟佑|。文檔編號A61K31/05GK101351198SQ200580052461公開日2009年1月21日申請日期2005年12月29日優(yōu)先權日2005年12月29日發(fā)明者保羅·斯特普爾頓,原征彥,彼得·泰勒申請人:三井農(nóng)林株式會社;倫敦大學藥學院