專利名稱：用于預防糖尿病并發(fā)癥中的治療干涉的化合物和方法
本申請為分案申請，原申請的申請?zhí)枮?8803748.3，申請日為1998年2月5日，發(fā)明名稱為“用于預防糖尿病并發(fā)癥中的治療干涉的化合物和方法”。
根據(jù)35 U.S.C.§202(c)，特此承認美國政府在本文描述的發(fā)明中具有一定的權(quán)利，該發(fā)明的一部分是用國家健康研究所的基金進行的(資助號為DK44050、DK50317和DK50364)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于治療糖尿病、特別是預防、降低或延遲糖尿病并發(fā)癥和相關(guān)病因?qū)W的其它病征發(fā)作的治療劑及其用途。更具體地講，本發(fā)明涉及抑制果糖賴氨酸(FL)酶促轉(zhuǎn)化為果糖-賴氨酸-3-磷酸(FL3P)的一類酶抑制劑，認為該轉(zhuǎn)化是導致糖尿病并發(fā)癥的生化機制中的重要一步。本發(fā)明也涉及評估糖尿病患者經(jīng)歷糖尿病并發(fā)癥風險的方法，也涉及確定治療干涉在預防、降低或延遲糖尿病并發(fā)癥發(fā)作中的效力的方法。
有四種特別嚴重的糖尿病并發(fā)癥，即糖尿病性腎?。惶悄虿⌒砸暰W(wǎng)膜病，它由于破壞視網(wǎng)膜而致盲；涉及外周神經(jīng)功能喪失的糖尿病性神經(jīng)??；以及由毛細管損害引起的循環(huán)問題。人們認為，視網(wǎng)膜病和腎病均是與該疾病狀態(tài)有關(guān)的一般循環(huán)問題的亞類。最近已經(jīng)概述了微血管功能障礙在晚期糖尿病中的作用(Tooke，Diabetes，44721(1995))。在本說明書的全文中，術(shù)語“糖尿病相關(guān)的病理學病征”和同義詞是指包括各種眾所周知的視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病、腎病、大血管病(macroangiopathic)以及其它糖尿病并發(fā)癥。
已經(jīng)廣泛地報道了由糖尿病引起的病理學和由衰老引起的病理學之間的相似性。研究已經(jīng)表明，許多糖尿病相關(guān)的病理學病征同與衰老正常相關(guān)的病理學在臨床上非常相似。例如已經(jīng)表明，在糖尿病中，動脈和關(guān)節(jié)過早僵硬，肺彈性和肺活量過早降低。而且，動脈硬化癥、心肌梗死和中風在糖尿病患者中發(fā)生的頻率比與衰老相匹配的非糖尿病個體中的頻率更高。糖尿病患者對感染也更敏感，更可能在比非糖尿病患者年紀輕時患有高血壓、骨損失加快、骨關(guān)節(jié)炎以及T細胞功能受損。
糖尿病相關(guān)的病理學病征與衰老之間的相似性似乎暗示一個共同的機制原理。已經(jīng)提出了種種機制作為糖尿病相關(guān)的病理學病征和衰老的共同生化基礎(chǔ)。來自人類被試者的數(shù)據(jù)最有力支持的假說是在非酶促糖基化機制上假定的。該假說指出，衰老過程和諸如上述的糖尿病相關(guān)的病理學病征，至少部分是由葡萄糖和葡萄糖衍生的代謝物通過Maillard反應進行蛋白修飾和交聯(lián)所引起的(Monnier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81583(1984)和Lee等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，123888(1984))。由這類糖基化反應產(chǎn)生的修飾的蛋白本文稱為高級糖化終產(chǎn)物修飾的蛋白(AGE-蛋白)。普遍認為，在導致AGE-蛋白形成的多步反應順序中，3-脫氧葡萄糖醛酮(3DG)是關(guān)鍵的中間體。3DG是一種葡萄糖衍生的代謝物，它可以與蛋白反應，導致胞內(nèi)蛋白和胞外蛋白(諸如膠原蛋白和基底膜)交聯(lián)。
在糖尿病并發(fā)癥的情況下，人們認為與該疾病相關(guān)的慢性高血糖在動力學上加速了產(chǎn)生AGE-蛋白的反應。支持該機制的證據(jù)包括這樣的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)表明，來自糖尿病被試者的長壽命蛋白(諸如膠原蛋白和晶狀體晶體蛋白)含有的AGE-蛋白含量顯著高于來自衰老匹配的正常對照的含量。因此，在糖尿病患者中，相對早期時不尋常的白內(nèi)障發(fā)生率可用晶狀體晶體蛋白的修飾和交聯(lián)的速率的提高來解釋。同樣，關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)蛋白-膠原蛋白的修飾和交聯(lián)速率的提高，解釋了在糖尿病患者中觀察到的關(guān)節(jié)和動脈變硬的早期發(fā)作以及肺活量的降低。因為這些蛋白是長壽命的，所以，修飾的結(jié)果傾向于是累積性的。
證明糖尿病并發(fā)癥和高血糖之間因果關(guān)系的另一因素是高血糖記憶。該現(xiàn)象的一個特別突出的實例是狗中嚴重視網(wǎng)膜病的形成，所述狗開始是糖尿病患者，然后經(jīng)治療恢復正常的血液葡萄糖水平。盡管治療時狗眼在組織學上是正常的，但隨著時間的流逝，盡管葡萄糖含量正?；?，但在這些動物中發(fā)生了糖尿病性視網(wǎng)膜病(Engerman等，Diabetes，36808(1987))。因此，在臨床癥狀明顯之前，在早期高血糖期間對眼睛的潛在損害不可逆地發(fā)生了。
已經(jīng)表明，糖尿病病人和動物的早期和晚期糖修飾的AGE-蛋白的濃度高于正常濃度。事實上，AGE-蛋白的增加高于血液葡萄糖水平的增加。AGE-蛋白的濃度可以通過熒光測量來估計，以重排產(chǎn)生蛋白結(jié)合的熒光分子的糖分子的一定百分比表示。
AGE-蛋白的致病作用不限于糖尿病。已將蛋白質(zhì)糖化與阿爾茨海默氏病相關(guān)聯(lián)(Harrington等，Nature，370247(1994))。隨著衰老，也可以觀察到蛋白熒光增加。實際上，某些理論將衰老過程歸因于氧化損害和糖誘導的蛋白修飾的組合。因此，減少AGE-蛋白形成的治療對治療其它病因?qū)W上相似的人類疾病狀態(tài)也可能是有用的，也許可以減慢衰老過程。
一般假定，AGE-蛋白的形成以一個蛋白氨基和一個糖(主要是葡萄糖)的反應開始。一個典型的文獻引述陳述“通過賴氨酸殘基的ε-氨基糖化形成的原始加成物是Amadori化合物、果糖賴氨酸…。糖化是統(tǒng)稱為Maillard反應或褐變反應的一系列復雜反應中的最初一步，它最終導致形成交聯(lián)的、沉淀的、氧化的、褐色的和熒光的蛋白”。K.J.Knecht等，Archives of Biochem.Biophys.，294130(1992)。
由糖形成AGE-蛋白是一個多步過程，涉及早期可逆的與糖的反應，產(chǎn)生含果糖-賴氨酸的蛋白。這些修飾的蛋白然后繼續(xù)反應，產(chǎn)生不可逆修飾的AGE-蛋白。顯然，AGE-蛋白不同于含糖化賴氨酸殘基的蛋白，因為針對AGE-蛋白產(chǎn)生的抗體不與果糖-賴氨酸反應。也很清楚，AGE-蛋白作為多種化學種類存在，然而，幾乎沒有鑒定出這些種類。在最近的研究中，這些化學種類(ε-氨基-(羧甲基)賴氨酸已經(jīng)鑒定為一種重要的最終AGE-蛋白結(jié)構(gòu)(Reddy等，Biochem.，3410872(1995)以及Ikeda等，Biochemistry，358075(1996))。該項研究不能在化學上鑒別構(gòu)成大約50％所述修飾位點的另一AGE-蛋白的表位。最近已經(jīng)開發(fā)了一種研究由核糖形成AGE-蛋白的動力學的方法(Khalifah等，Biochemistry，354645(1996))。然而，該研究提示，核糖可能在AGE-蛋白形成中起重要的生理學作用，這支持以下提供的糖化賴氨酸和果糖-賴氨酸的相對廣義的定義。
其它參考文獻指出了含糖化賴氨酸殘基的蛋白和AGE蛋白之間的區(qū)別，“在數(shù)小時和數(shù)周內(nèi)分別達到席夫堿和Amadori產(chǎn)物的平衡水平。早期糖基化產(chǎn)物的可逆平衡性質(zhì)是重要的，因為它意味著，甚至在非常長壽命的蛋白上，這類產(chǎn)物的總量在短時間內(nèi)也達到了穩(wěn)態(tài)平頂……。由于這些早期糖基化產(chǎn)物在慢性糖尿病患者中數(shù)年內(nèi)不繼續(xù)在膠原蛋白和其它穩(wěn)定的組織蛋白上累積，因此，它們的濃度與或者糖尿病性視網(wǎng)膜病的存在或者嚴重性無關(guān)是不奇怪的…。然而，膠原蛋白和血管壁的其它長壽命蛋白上的某些早期糖基化產(chǎn)物不解離。而是它們經(jīng)歷一系列緩慢復雜的化學重排，形成不可逆的高級糖基化終產(chǎn)物”。M.Brownlee等，New England Journal of Medicine，3181315(1988)。產(chǎn)生科學文獻中描述的這些修飾蛋白的唯一途徑，涉及蛋白質(zhì)和糖分子之間的一個最初反應。
許多參考文獻指出，AGE-蛋白的形成通過一個多步途徑發(fā)生，而3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)是該途徑中的關(guān)鍵中間體。M.Brownlee，Diabetes，43836(1994)；M.Brownlee，Diabetes Care，151835(1992)；T.Niwa等，Nephron，69438(1995)；W.L.Dills，Jr.，Am.J.Clin.Nutr.，58S779(1993)；H.Yamadat等，J.Biol.Chem.，26920275(1994)；N.Igaki等，Clin.Chem.，36631(1990)。在

圖1中描述了普遍接受的由糖和蛋白反應形成3DG的途徑。正如在圖1中可見到的，糖(葡萄糖)分子最初與蛋白-賴氨酸的氨基(I)形成席夫堿。產(chǎn)生的席夫堿然后重排，產(chǎn)生果糖-賴氨酸修飾的蛋白(II)。導致(II)的反應是自由可逆的。(II)可以重排，產(chǎn)生3DG和游離的蛋白賴氨酸。3DG和蛋白之間的隨后反應在AGE-蛋白形成中是第一個不可逆的步驟。
就我們所知，從未報道過3DG可以由替代途徑產(chǎn)生，或事實上，主要的3-DG源來自一個酶催化的代謝途徑，而非來自圖1所示的非催化的反應。
糖尿病患者血清中的3DG顯著高于非糖尿病患者(12.78±2.49μM相對于1.94±0.17μM)。(Toshimitsu Niwa等，Nephron，69438(1995))。然而，在正常的健康個體中發(fā)現(xiàn)這種毒性化合物。因此，機體已經(jīng)形成對該分子的解毒途徑是不奇怪的。這些反應之一是由醛還原酶催化的，它通過將3DG還原為在尿中有效排泄的3-脫氧果糖(3DF)而將3DG解毒(Takahashi等，Biochem，341433(1995))。另一解毒反應由氧代醛脫氫酶將3DG氧化為3-脫氧-2-酮葡萄糖醛酸(DGA)(Fujii等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，210852(1995))。
對數(shù)據(jù)研究的結(jié)果表明，至少這些酶之一的醛還原酶的效力在糖尿病中受不利影響。當從正常大鼠肝臟中分離時，該酶的一部分在賴氨酸67、84和140上部分糖化，當與正常未修飾的酶相比時，催化效力低(Takahaski等，Biochem.，341433(1995))。由于糖尿病患者的糖化蛋白的比率高于正常血糖的個體，因此他們的3DG水平可能較高，并且通過將該反應性分子還原為3DF而將該反應性分子解毒的能力降低。
已經(jīng)研究了醛還原酶的機制。這些研究確定，這種重要的解毒酶受醛還原酶抑制劑(ARI)抑制(Barski等，Biochem.，3411264(1995))。目前正在對ARI減少糖尿病并發(fā)癥的潛力進行臨床研究。這些化合物作為一類，已經(jīng)表現(xiàn)出對短期糖尿病并發(fā)癥的某些作用。然而，它們?nèi)狈﹂L期糖尿病并發(fā)癥的臨床作用，并且它們使喂食高蛋白膳食的大鼠的腎功能惡化。正如下文所表述的，這一發(fā)現(xiàn)與構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的新發(fā)現(xiàn)的賴氨酸回收的代謝途徑一致。高蛋白膳食將增加果糖-賴氨酸的消耗，果糖-賴氨酸通過腎臟的賴氨酸回收途徑轉(zhuǎn)化為3DG。產(chǎn)生的3DG通過還原為3DF的解毒將受ARI治療的抑制，與未接受ARI的大鼠相比，這必然導致對腎臟損害的增加。這是因為ARI對醛糖還原酶的抑制會降低醛糖還原酶還原3DG和3DF的有效性。
先前已經(jīng)研究了3-DG在導致人類疾病中的作用，這些將從以下概述的專利的綜述中認識到。
Ulrich等的美國專利5,476,849描述了一種方法，使用氨基-苯甲酸和衍生物抑制AGE-蛋白的形成。這些化合物假定通過與3-DG反應、并在它可以與蛋白反應而開始AGE-蛋白形成的不可逆步驟之前將其從該系統(tǒng)中去除而起作用。
Cerami等的美國專利4,798,583和5,128,360描述了氨基胍防止AGE-蛋白形成和糖尿病誘導的動脈壁蛋白交聯(lián)的用途。表明氨基胍與早期糖基化產(chǎn)物反應。該早期產(chǎn)物為本文所定義的3DG。這些專利沒有設(shè)想抑制3-DG形成的可能性。它們的焦點僅僅是將該毒性分子絡(luò)合。
France等的美國專利5,468,777描述了預防口腔中由蛋白非酶促褐變引起的牙齒染色的方法和藥劑。半胱氨酸和半胱氨酸衍生物被說成在該中請中特別有用。
Ulrich等的美國專利5,358,960描述了采用氨基取代的咪唑抑制AGE-蛋白形成的方法。表明這些化合物與早期糖基化產(chǎn)物(3DG)反應。在該專利中沒有提及3DG的代謝源可能存在。該專利設(shè)想，3DG僅僅作為蛋白非酶促褐變中的中間體而產(chǎn)生。
Ulrich等的美國專利5,334,617描述了可用作AGE-蛋白形成抑制劑的氨基酸。賴氨酸和其它雙官能氨基酸被說成在該方面特別有用。這些氨基酸被描述為與葡萄糖和蛋白反應的早期糖基化產(chǎn)物反應?？磥恚搶＠忻枋龅脑缙谔腔a(chǎn)物為3DG。
Ulrich等的美國專利5,318,982描述了使用作為抑制劑的1，2，4-三唑抑制AGE-蛋白的形成。該專利中描述的抑制劑含有定位與3DG反應并將其絡(luò)合的二氨基取代基。該專利將這些化合物描述為與早期產(chǎn)物(本文定義的3DG)反應。
Ulrich等的美國專利5,272,165描述了使用2-亞烷基-氨基胍作為AGE-蛋白形成的抑制劑。該專利中所述的抑制劑據(jù)說與3DG高度反應。在該專利中沒有提及抑制3DG的代謝形成。
Ulrich等的美國專利5,262,152描述了使用氨基腙和衍生物抑制AGE-蛋白的形成。該專利中所述的化合物為α-效應胺(α-effectamine)。W.P.Jencks，第3版，McGraw Hill，New York。該類化合物已知與例如3DG的二羰基化合物反應。
Ulrich等的美國專利5,258,381描述了使用2-取代-2-咪唑啉抑制AGE-蛋白的形成。該專利中描述的化合物含有可以迅速與3DG反應的相鄰氨基。
Ulrich等的美國專利5,243,071描述了使用2-亞烷基-氨基胍抑制AGE-蛋白的形成。該專利中所述的化合物與3DG高度反應，并通過將該反應性毒性分子絡(luò)合而起作用。
Ulrich等的美國專利5,221,683描述了使用二氨基吡啶化合物抑制AGE-蛋白的形成。被描述為特別有用的所述二氨基吡啶化合物會與3DG反應，形成穩(wěn)定的、含六元環(huán)的絡(luò)合物。
Ulrich等的美國專利5,130,337描述了使用氨基腙和衍生物抑制AGE-蛋白的形成。該專利中所述的抑制劑為α-效應胺(α-effctamine)，它們?nèi)绫绢I(lǐng)域已知的，會與3DG快速反應，形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。
Ulrich等的美國專利5,130,324描述了使用2-亞烷基-氨基胍抑制AGE-蛋白的形成。該專利中所述的化合物通過與由葡萄糖與蛋白反應產(chǎn)生的早期糖基化產(chǎn)物(3DG)反應而起作用。
Ulrich等的美國專利5,114,943描述了使用氨基取代的嘧啶抑制AGE-蛋白的形成。該專利中所述的化合物據(jù)說與3DG快速反應并將其解毒。
上述專利中沒有一個提示抑制3DG的代謝形成，作為預防糖尿病并發(fā)癥的治療干涉工具。實際上，這些專利中甚至沒有一個提示在3DG產(chǎn)生中涉及酶促途徑。
Ulrich等的美國專利5,108,930描述了檢測生物樣品中氨基胍水平的方法。該測定被描述為在通過測量氨基胍消除的時間而測定腎功能中具有潛在效用。在該專利中計劃用于該測定方法的主要效用是用于測定氨基胍的組織水平，使得可以在動物和人類的研究中維持足以抑制AGE-蛋白形成的劑量。在該專利中沒有提及使用尿3DG、3DF或DGA的比率來確定有并發(fā)癥風險的糖尿病患者。
Szwergold等的美國專利5,231,031描述了一種方法，評估糖尿病相關(guān)的病理學病征的風險，并且確定對這些并發(fā)癥的治療效力。該專利描述了糖尿病患者紅細胞中的兩種磷酸化化合物。這兩種化合物在該專利中沒有在化學上得到鑒定。然而，沒有一種化合物是3DG或3DF，在本發(fā)明的診斷實施方案中測定了尿中3DG和3DF的水平。
通過測量糖基化終產(chǎn)物而監(jiān)測糖尿病患者中代謝控制的方法是已知的。已知糖基化血紅蛋白的濃度反映出前數(shù)周內(nèi)的平均血液葡萄糖濃度。授權(quán)于A.Cerami等的美國專利4,371,374描述了一種方法，通過定量測定尿中糖基化蛋白的降解產(chǎn)物(更具體地講為非酶促糖基化的氨基酸和肽)而監(jiān)測葡萄糖水平。該方法表明利用堿性硼酸的親和性，與糖基化終產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的共平面順-二醇基團形成特殊的絡(luò)合物，以分離并定量這類終產(chǎn)物.
授權(quán)予A.Cerami的美國專利4,761,368描述了褐變多肽(例如牛血清白蛋白和聚-L-賴氨酸)中存在的發(fā)色團的分離和純化。發(fā)色團2-(2-糠酰)-4(5)-2(糠酰)-1H-咪唑(FFI)是由兩分子葡萄糖與兩個源自賴氨酸的氨基縮合而衍生的共軛雜環(huán)。該專利還描述了FFI在測量蛋白樣品中“衰老”(高級糖基化的程度)的方法中的用途，在該方法中，通過測定該樣品中上述發(fā)色團的量，然后將該測量結(jié)果與標準(具有一定量FFI的蛋白樣品，已經(jīng)將FFI與該樣品的“年齡”相關(guān)聯(lián))相比，測定所述樣品的“年齡”。
在現(xiàn)有的治療糖尿病患者的方法中，對于鑒定那些有形成糖尿病相關(guān)的病理學病征風險的糖尿病患者、通過治療干涉預防、減少或延遲這類病征發(fā)作、以及確定這類治療干涉益處的有效方法，有長期存在的、未滿足的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明源自下述代謝途徑的發(fā)現(xiàn)，該途徑涉及酶介導的FL向FL3P的轉(zhuǎn)化，并在受糖尿病影響的器官中產(chǎn)生相對高濃度的3-脫氧葡萄糖醛酮(3DG)。隨后對這一新發(fā)現(xiàn)的途徑的生化功能的研究傾向于指出，該途徑在糖尿病性腎病的病因?qū)W中具有重要作用。也推測該途徑導致發(fā)生各種已知的糖尿病相關(guān)的病理學病征。
該發(fā)現(xiàn)已經(jīng)建立了本發(fā)明中的實際應用，一方面，本發(fā)明提供具有酶抑制活性并有效抑制果糖-賴氨酸轉(zhuǎn)化為果糖-賴氨酸-3-磷酸的一類化合物。通過測定，可容易地測定本發(fā)明化合物的相關(guān)酶抑制活性。該測定方法包括提供一種果糖-賴氨酸、三磷酸腺苷(ATP)、一種果糖-賴氨酸-3-磷酸激酶源和其量足以證明抑制活性的一種本發(fā)明化合物的水溶液；使產(chǎn)生的溶液經(jīng)受促進果糖-賴氨酸-3-磷酸和二磷酸腺苷形成的條件，果糖-賴氨酸-3-磷酸和二磷酸腺苷為上述激酶、果糖-賴氨酸和三磷酸腺苷相互作用的產(chǎn)物；并且測量至少一種這類產(chǎn)物的產(chǎn)量，與相同相對量的果糖-賴氨酸、三磷酸腺苷和果糖-賴氨酸-3-磷酸激酶源、沒有加入本發(fā)明化合物的水溶液相比，本發(fā)明的化合物降低這類產(chǎn)物的量。剛剛描述的測定方法也屬于本發(fā)明的范圍。
按照另一方面，本發(fā)明提供用于預防、減少或延遲糖尿病患者中糖尿病并發(fā)癥發(fā)作的藥用制劑，包含作為活性藥劑的一種上述本發(fā)明化合物和一種藥學上可接受的載體。
按照本發(fā)明的再一方面，提供用于在有發(fā)生糖尿病并發(fā)癥風險的患者中預防、減少或延遲糖尿病并發(fā)癥發(fā)作的方法，該方法包括給予該患者一種本發(fā)明的化合物，其量可以有效地抑制果糖-賴氨酸向果糖-賴氨酸-3-磷酸的酶促轉(zhuǎn)化。這同一方法可以用于預防或治療其它病因?qū)W相似的疾病狀態(tài)，這些將在下文進一步描述。
按照又一方面，本發(fā)明提供糖尿病患者經(jīng)歷糖尿病相關(guān)的病理學病征風險的評估方法。該方法包括給予該患者糖化賴氨酸殘基源，其量提供預定劑量的糖化賴氨酸殘基；并且以正常被試者(即非糖尿病被試者或沒有糖尿病臨床癥狀的被試者)中的3-脫氧葡萄糖醛酮與3-脫氧果糖之比為基準，測定得自該患者的生物樣品中3-脫氧葡萄糖醛酮與3-脫氧果糖之比。與無癥狀被試者的3-脫氧葡萄糖醛酮與3-脫氧果糖之比相比，該糖尿病患者樣品中的該比率較高表明該患者有較高風險經(jīng)歷糖尿病相關(guān)的病理學病征。
本發(fā)明也提供一種方法，評估治療干涉在預防糖尿病并發(fā)癥中的效力。該方法包括，測定得自該治療干涉開始前后的糖尿病患者的生物樣品中3-脫氧葡萄糖醛酮、3-脫氧果糖和果糖-賴氨酸的濃度。然后將3-脫氧葡萄糖醛酮和3-脫氧果糖的濃度之和與所述樣品中的果糖-賴氨酸濃度相比。與測得的取自該治療干涉開始之前的生物樣品中的3-脫氧葡萄糖醛酮、3-脫氧果糖和果糖-賴氨酸的濃度相比，在取自治療干涉開始之后的該生物樣品中，3-脫氧葡萄糖醛酮和3-脫氧果糖的濃度之和相對于果糖-賴氨酸濃度的降低，為該治療干涉效力的指示。
作為本發(fā)明的再一方面提供一種方法，將一種食品導致發(fā)生糖尿病相關(guān)的病理學病征的可能性報告給糖尿病病人。該方法包括測量該食品中糖化賴氨酸殘基的含量，并且在例如該食品的包裝上或在計劃讓糖尿病患者使用的出版物中將該信息提供糖尿病患者。
附圖簡述圖1展示參與產(chǎn)生不可逆修飾的AGE-蛋白的多步反應的最初一步。
圖2說明參與賴氨酸回收途徑的反應。
圖3圖示尿分布型，顯示進食2gFL、隨后跟蹤24小時的單個個體的3DF、3DG和FL隨時間的變化。
圖4圖示進食2g果糖賴氨酸的7個自愿者的3DF隨時間的尿排泄。
圖5展示一組對照動物和維持含0.3％糖化蛋白的飼料的實驗組之間3DF和N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶的圖示比較。
圖6圖示喂食或者對照膳食或者富含糖化蛋白的膳食的大鼠的尿中3DF和3DG水平之間的線性關(guān)系。
圖7A和7B圖示對3DF禁食水平作圖的正常者和糖尿病患者的尿中3DG的禁食水平。
發(fā)明詳述如下支進一步詳細描述的，提供以下定義以有助于理解本發(fā)明1.糖化賴氨酸殘基-本文所用的表述“糖化賴氨酸殘基”，是指通過還原糖和一種含賴氨酸蛋白反應產(chǎn)生的穩(wěn)定加成物的修飾的賴氨酸殘基。
大多數(shù)蛋白的賴氨酸殘基位于蛋白表面，如對帶正電氨基酸所預期的。因此，與血清或其它生物流體接觸的蛋白上的賴氨酸殘基，可以自由地與溶液中的糖分子反應。該反應以多步發(fā)生。最初一步涉及所述賴氨酸的游離氨基和該糖的酮基之間形成席夫堿。這種最初產(chǎn)物然后經(jīng)歷Amadori重排，產(chǎn)生穩(wěn)定的酮胺化合物。
該系列反應可以用各種糖發(fā)生。當涉及的糖為葡萄糖時，最初的席夫堿產(chǎn)物將涉及該葡萄糖的C-1上的醛部分與所述賴氨酸的ε-氨基之間形成亞胺。Amadori重排將導致形成與果糖、1-脫氧-1-(ε-氨基賴氨酸)-果糖(本文稱為果糖-賴氨酸或FL)的C-1碳偶聯(lián)的賴氨酸。
用其它醛糖，例如半乳糖和核糖將發(fā)生相似的反應(Dills，Am.J.Clin.Nutr.，58S779(1993))。對于本發(fā)明來說，無論所述修飾性糖分子的精確結(jié)構(gòu)如何，任何還原糖和蛋白賴氨酸的ε-氨基殘基反應的早期產(chǎn)物均包括在糖化賴氨酸殘基的含義內(nèi)。
而且，術(shù)語糖化賴氨酸殘基、糖化蛋白以及糖基化蛋白或賴氨酸殘基在本文中可互換使用，這與目前科學雜志中的用法一致，在這些科學雜志中，這類表述常?；Q使用。
2.果糖-賴氨酸-術(shù)語“果糖-賴氨酸”(FL)本文用來表示任何糖化賴氨酸，無論是加入蛋白/肽中的，還是從蛋白/肽通過蛋白水解消化釋放的。該術(shù)語具體不限于通常稱為果糖-賴氨酸的化學結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)據(jù)報道由蛋白的賴氨酸殘基和葡萄糖反應而形成。如上所述，賴氨酸的氨基可以與種類繁多的糖反應。實際上，一篇報道指出，葡萄糖是測試的一組十六(16)個不同糖中反應性最小的糖(Bunn等，Science，213222(1981))。因此，無論在該說明書中何處提及果糖-賴氨酸，都包括與葡萄糖類似的由半乳糖和賴氨酸形成的塔格糖-賴氨酸，同樣包括所有其它糖的縮合產(chǎn)物，無論它是否是天然存在的。根據(jù)本文的描述，人們會理解，蛋白-賴氨酸殘基和糖之間的反應涉及多個反應步驟。該反應順序中的最后幾步涉及蛋白的交聯(lián)和稱為AGE-蛋白的多聚體種類的產(chǎn)生，其中某些有熒光。這類修飾蛋白的蛋白水解消化不產(chǎn)生與糖分子共價連接的賴氨酸。因此，這些種類不包括在本文所用的術(shù)語“果糖-賴氨酸”的含義內(nèi)。
3.果糖-賴氨酸-3-磷酸-該化合物通過將高能磷酸基團從ATP酶促轉(zhuǎn)移至FL而形成。本文所用的術(shù)語果糖-賴氨酸-3-磷酸(FL3P)是指包括可以酶促形成的所有磷酸化果糖-賴氨酸部分，無論是游離的還是蛋白結(jié)合的。
4.果糖-賴氨酸-3-磷酸激酶-該術(shù)語是指這樣的一種或多種蛋白，如上所述，當另外供應高能磷酸源時，所述蛋白可以將FL酶促轉(zhuǎn)化為FL3P。
5.3-脫氧葡萄糖醛酮-3-脫氧葡萄糖醛酮(3DG)是1，2-二羰基-3-脫氧糖(也稱為3-脫氧己酮糖醛酮(3-deoxyhexulosone))，它在FL3P分解產(chǎn)生游離賴氨酸和無機磷酸時形成。對于本說明書來說，術(shù)語3-脫氧葡萄糖醛酮計劃包括FL3P分解時形成的所有可能的二羰基糖，具有上述FL3P的廣義定義。
6.FL3P賴氨酸回收途徑-在人類腎臟以及可能在其它組織中存在一個賴氨酸回收途徑，它再生作為游離氨基酸或在多肽鏈中加入的未修飾的賴氨酸。正如以下進一步解釋的，該途徑是導致糖尿病并發(fā)癥的重要因素。
7.AGE-蛋白-術(shù)語“AGE-蛋白”(高級糖化終產(chǎn)物修飾的蛋白)已經(jīng)用于科學雜志中，用于本文是指糖和蛋白之間反應的最終產(chǎn)物(Brownlee，Diabetes Care，151835(1992)以及Niwa等，Nephron，69438(1995))。顯然，例如蛋白的賴氨酸殘基和葡萄糖之間的反應不以果糖-賴氨酸的形成而終止。FL可以經(jīng)過多個脫水和重排反應，產(chǎn)生非酶促的3DG，3DG再與游離氨基反應，導致所涉及蛋白的交聯(lián)和褐變。實際上，適當?shù)淖C據(jù)表明，上文定義的3DG是該修飾反應中的中心中間體。
9.“糖化膳食”-本文所用的該表述是指其中一定百分比的正常蛋白用糖化蛋白取代的任何給定的膳食。表述“糖化膳食”和“糖化蛋白膳食”本文可互換使用。
至少某些糖尿病并發(fā)癥，可能所有的糖尿病并發(fā)癥是由葡萄糖和其它反應性糖共價修飾蛋白引起的。M.Brownlee，Diabetes，43836(1994)。如上所述，已經(jīng)表明糖尿病病人和動物的糖修飾蛋白的濃度高于正常。事實上，糖尿病相關(guān)的AGE-蛋白的增加高于血液葡萄糖水平的增加。
先前普遍認為，3DG在體內(nèi)的起源來自含糖化賴氨酸殘基的蛋白的分解。也普遍認為，這些糖化賴氨酸可能不用作氨基酸源。正如下文所表述的，這種先前的看法是不正確的。
如上所述，從先前未知的在酶催化反應中產(chǎn)生3DG的代謝途徑的發(fā)現(xiàn)展開本發(fā)明。該酶促途徑能夠進行酶抑制，由此減少毒性3DG的產(chǎn)生。
在對糖尿病性腎病的一系列研究過程中，對來自鏈脲菌素(streptozotoxin)誘導的糖尿病大鼠腎臟的高氯酸提取物進行31P NMR光譜的檢查，在NMR光譜中顯示一個不尋常的新峰。本發(fā)明人先前的研究已經(jīng)證明，在大鼠晶狀體和人紅細胞中存在果糖-3-磷酸(A.Petersen等，Biochem.J.，284363-366(1992)；Lal等，Arch.Biochem.Biophys.，318191(1995)；Szwergold等，Science，247451(1990)以及Lal等，Investigative Opthalmology and Visual Science，36(5)969(1995))。較早的研究已經(jīng)鑒定出大鼠晶狀體中的其它不尋常的磷酸化糖(Szwergold等，Diabetes，44810(1995)以及Kppler等，Metabolism，441527(1995))。因此，假定這一新鑒別的峰是另一種磷酸化糖是合理的。更加廣泛的實驗室研究表明，這種新化合物不是單糖，而是在果糖組分的3位磷酸化的果糖-賴氨酸。
以兩種方式證實了該鑒定。用以下實施例2中公開的方法合成真正的果糖-賴氨酸-3-磷酸(FL3P)，顯示在31P NMR光譜中與糖尿病大鼠腎臟中所述峰共振(co-resonate)。也將合成的果糖-賴氨酸注射入非糖尿病大鼠中。這些大鼠在該注射后表現(xiàn)出其腎臟中FL3P水平顯著增加。
進行了兩個實驗，以證明FL3P在一個酶催化的反應中直接由FL衍生。合成在該果糖部分的C3位用氘標記的果糖-賴氨酸，并將其注射入大鼠。注射后3小時，取出這些大鼠的腎臟，用高氯酸萃取。NMR光譜表明，從這些大鼠分離的FL3P物質(zhì)在所述果糖部分的C3位含有氘標記。另外，大鼠腎臟勻漿證明在需要ATP和果糖-賴氨酸的反應中產(chǎn)生FL3P的能力。這后一個提及的實驗證實存在特殊的FL3P激酶，因為當僅將果糖賴氨酸和ATP在生理條件下共同溫育時，沒有形成FL3P。涉及腎皮質(zhì)分級分離的其它實驗已經(jīng)證明，該激酶活性在腎臟中不是均勻分布的，而是集中在證明在人類和動物糖尿病性腎臟中損害的最早的解剖部位之一的近端小管區(qū)。
FL3P在水溶液中不穩(wěn)定。它快速降解形成3DG、賴氨酸和無機磷酸。該反應也在體內(nèi)發(fā)生。目前不知道體內(nèi)FL3P的降解是自發(fā)反應還是酶催化的反應。然而，非常懷疑涉及酶催化，因為由果糖-賴氨酸產(chǎn)生3DG在完整的腎臟中發(fā)生得非?？?。
圖2顯示了FL3P賴氨酸回收途徑中的反應步驟。在第一步中，在一個由FL3P激酶催化的反應中，果糖-賴氨酸和ATP反應，形成果糖-賴氨酸-3-磷酸(FL3P)和ADP。在果糖部分的3位發(fā)生磷酸化，導致果糖賴氨酸分子的去穩(wěn)定化。產(chǎn)生的FL3P然后分解形成3-脫氧葡萄糖醛酮(3DG)、無機磷酸和未修飾的、游離的、可重新使用的賴氨酸，這在蛋白合成中可以加以利用。醛還原酶通過將3DG還原為在尿中排泄的3-脫氧果糖(3DF)，而將3DG解毒。
盡管圖2描述了使用最普遍的糖化賴氨酸、果糖-賴氨酸的該途徑，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，種類繁多的相似分子可以通過該途徑流出，這是顯而易見的。實際上，正如以下進一步詳細解釋的，F(xiàn)L3P賴氨酸回收途徑的底物選擇性是相當廣的，保證了上述術(shù)語的廣義定義。
其它實驗已經(jīng)表明，在包括綿羊、豬、狗、兔子、奶牛、小鼠和雞的種類繁多的動物物種中，發(fā)現(xiàn)賴氨酸回收途徑。該途徑也存在于人類中。已知賴氨酸是大多數(shù)食品中以相對低濃度存在的必需氨基酸，因此可以理解FL3P賴氨酸回收途徑的普遍存在。另外，食品中的相當大百分比的賴氨酸殘基以糖化形式存在，當蒸煮該食品時，這種修飾的賴氨酸的比例將增加。由于這些糖化賴氨酸殘基不可以用于蛋白合成，因此賴氨酸的回收途徑具有很大的用途，為具有該途徑的生物體提供選擇優(yōu)勢。
糖尿病對賴氨酸回收途徑具有兩個作用。當從糖尿病患者中分離時，血液蛋白含有糖化賴氨酸的濃度高于從非糖尿病個體分離的濃度。因此，糖尿病患者承受的通過賴氨酸回收途徑的通量大于非糖尿病患者。另外，根據(jù)對糖尿病患者和正常者尿中3DG和3DF之比的初步觀察，糖尿病患者通過該途徑產(chǎn)生的將3DG解毒的能力似乎降低。這兩個因素綜合起來，在糖尿病患者中產(chǎn)生較高的3DG尿濃度(參見圖7；也參見Lal等，Arch.Biochem.and Biophys.，342(1)254-60(1997)。
參與賴氨酸回收途徑的因子已經(jīng)在腎臟以外的其它組織中鑒定出，具體是紅細胞、晶狀體和外周神經(jīng)組織。所有這些組織均受糖尿病并發(fā)癥的影響。定位于紅細胞中與糖尿病微血管并發(fā)癥相關(guān)，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病，腎臟定位與糖尿病性腎病相關(guān)，而在外周神經(jīng)中的定位與糖尿病性外周神經(jīng)病相關(guān)。這些因子也在胰腺中發(fā)現(xiàn)。正在進行實驗，以確定這些因子在皮膚中的存在。如果發(fā)現(xiàn)存在，則相信它的有害作用可以通過采用合適載體中的本發(fā)明的抑制性化合物局部治療來減輕，以防止膠原蛋白交聯(lián)，由此提高皮膚彈性。
已經(jīng)進行了實驗，趨于證明人類由經(jīng)口攝取的含糖化賴氨酸殘基的蛋白產(chǎn)生3DG和3DF。這些實驗在以下詳細描述，令人信服地證明賴氨酸回收途徑存在于人類中。這些實驗也闡明了令人迷惑的現(xiàn)象，也就是說，某些糖尿病患者發(fā)生糖尿病并發(fā)癥，而其它糖尿病患者，甚至血糖控制差的那些糖尿病患者都不發(fā)生這類并發(fā)癥。從本文提出的數(shù)據(jù)來看，該現(xiàn)象的原因是顯而易見的。糖尿病患者將3DG解毒的能力不同。一個亞群的糖尿病患者群體的醛還原酶活性似乎相對高于大多數(shù)糖尿病患者。因此，這些個體能夠通過有效地將高于正常水平的3DG解毒，而處理通過賴氨酸回收途徑的較高的通量。能力受損的其它個體將其提高水平的3DG解毒的能力較差，因此發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的風險較高。
正如以下更詳細描述的，已經(jīng)經(jīng)實驗證明，賴氨酸回收途徑的刺激可以通過使用糖化蛋白膳食而發(fā)生。如以上用FL的情況一樣，在喂食糖化蛋白膳食的實驗動物中觀察到FL3P、3DG和3DF水平升高。
本發(fā)明的酶抑制劑化合物阻斷賴氨酸回收途徑，防止由FL3P形成毒性3DG。
以下描述了一套廣泛的、能夠顯示用于本發(fā)明實踐的一種合適的酶抑制劑的標準；也描述了測定任何推定的抑制劑是否滿足這些標準的一些試驗。用于按照本發(fā)明使用的候選激酶抑制劑，可以是從植物或微生物中分離的天然產(chǎn)物?；蛘?，它們可以是得自酶促反應及其機制的合理理解的合成分子。抑制劑也可以通過組合方法合成?？梢杂呻S機起始點產(chǎn)生組合文庫。此外，可以利用組合方法產(chǎn)生種類繁多的、與先前鑒定的靶FL3P激酶抑制劑相關(guān)的化合物。
不考慮所述推定的抑制劑源，認為不滿足所有下列標準的化合物不是能夠抑制賴氨酸回收途徑并由此預防、減少或延遲糖尿病并發(fā)癥或相關(guān)病因?qū)W病征發(fā)作的有用的治療劑。
1.該抑制劑應該是小分子，并且容易被細胞吸收。為了滿足該標準，該抑制劑的分子量必須小于2,000道爾頓，更理想的是大約1,000道爾頓或更小。
2.該抑制劑必須表現(xiàn)出對FL3P激酶的競爭性、非競爭性、不可逆或自殺性的抑制。如果該抑制劑為競爭性或非競爭性抑制劑，則抑制常數(shù)K；必須小于大約1mM。理想的是，它必須小于100μM，更理想的是大約40μM或更低。如果該抑制劑表現(xiàn)出自殺性抑制或其它不可逆抑制，則對抑制劑常數(shù)的要求尚有爭論。
3.該抑制劑在水溶液中必須是可溶性的，并且在生理pH的水溶液中必須是穩(wěn)定的。只有當該抑制劑或該抑制劑的鹽在不低于10μM濃度下在生理鹽水或血清中可溶時，才滿足對溶解性的要求。只有當抑制劑于37℃溶于生理鹽水中的溶液在溫育1小時后保留的活性大于50％時，才滿足這一穩(wěn)定性要求。理想的是，在溫育1天或更長時間時，該抑制劑保留的活性必須大于50％。
4.該抑制劑必須表現(xiàn)出可接受的藥代動力學。也就是說，它必須在給予該藥劑后以治療有效濃度保留至少1小時。理想的是，它應該維持有效濃度至少8小時。更理想的是，每日給藥一次應該是為維持該抑制劑治療濃度必需的所有給藥量。該要求不意味著該抑制劑必需能夠在首次給藥后建立治療濃度。存在許多僅在給藥延長時觀察到治療效果的成功藥物的實例。該標準不意味著，一旦達到有效濃度，則該濃度應該能夠在最后一次給予藥物后維持1小時以上。本文描述了治療效力的測試。
5.該抑制劑必須是無毒的。該標準要求當以治療劑量給予時，該抑制劑不表現(xiàn)對人類的毒性。理想的是，當該抑制劑以兩倍于治療效果所需水平的血液和/或靶組織水平存在時，毒性應該不明顯。更理想的是，在6倍或更高倍于治療范圍的水平下，應該沒有明顯的毒性?？梢灾煌ㄟ^長期的抑制劑治療，預防糖尿病并發(fā)癥。因此，對無毒性的要求必須包括急性毒性和在延長的長期使用期間可能變得明顯的慢性毒性?？梢圆捎煤芎媒⒌膭游镅芯浚菀椎卦u估候選分子的毒性。在一期臨床試驗中評估人類毒性。
在對本發(fā)明實踐有用的化合物中，包括下式的那些化合物以及所述化合物的異構(gòu)體和藥學上可接受的鹽 其中，X為-NR’-或-O-，R’選自H、線性或支鏈烷基(C1-C4)和未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)；R為選自以下的取代基H、氨基酸殘基、多氨基酸殘基、肽鏈、線性或支鏈脂族基(C1-C8)(該基團為未取代的或用至少一個含氮或含氧取代基取代)、線性或支鏈脂族基(C1-C8)(該基團為未取代的或用至少一個含氮或含氧取代基取代，并且被至少一個-O-、-NH-或-NR”-部分中斷)，R”為線性或支鏈烷基(C1-C6)以及未取代或取代的芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)，前提是當X代表-NR’時，R和R’同它們連接的氮原子一起也可以代表一個具有5-7個環(huán)原子的取代或未取代的雜環(huán)，氮和氧中的至少一個是所述環(huán)中僅有的雜原子，所述芳基(C6-C10)或芳烷基(C7-C10)以及所述雜環(huán)取代基選自H、烷基(C1-C6)、鹵素、CF3、CN、NO2和-O-烷基(C1-C6)；R1為具有1-4個線性碳原子的多元醇部分，Y為或者羰基部分 或亞羥甲基部分 Z選自-H、-O-烷基(C1-C6)、-鹵素、-CF3、-CN、-COOH和-SO3H2以及可選的-OH。
含氮或含氧“R”取代基的說明性實例包括衍生自γ-氨基-α-羥基丁酸(-(CH2)2-CHOH-COOH)、1，2，4-三氨基丁烷(-(CH2)2-CHNH2-CH2NH3)、3，6-二氨基-5-羥基庚酸(-CH2-CH(OH)-CH2-CH(NH2)-CH2-COOH)等的那些取代基。
式I的結(jié)構(gòu)具有不對稱中心，可以作為外消旋物、外消旋混合物和各種立體異構(gòu)體以及它們的混合物產(chǎn)生，所有這類異構(gòu)形式均屬于本發(fā)明范圍。
盡管具有以上式I結(jié)構(gòu)的某些化合物是先前已知的，但認為其它化合物是新的，因此屬于本發(fā)明范圍，所有式I化合物在體內(nèi)抑制酶催化產(chǎn)生3DG的用途也屬于本發(fā)明范圍。
可以通過使合適的糖(例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖或它們的衍生物)與氨基酸或其它合適的伯胺或仲胺反應，產(chǎn)生具有羰基部分(即Y＝-C(＝O)-)的抑制劑，來制備上式的抑制劑?；蛘?，可以在將席夫堿中間體選擇性地還原為胺的試劑(諸如NaBH3CH)存在下，使諸如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖或此類糖的糖與本文所述類型的氨基取代的或羥基取代的反應物反應，由此產(chǎn)生具有醇部分(即Y＝-CH(-OH)-)的抑制劑。當使用時，氨基酸反應物的反應性部分可以是α-碳上的氨基或所述酸側(cè)鏈上的氨基或羥基。合適的氨基酸包括必需氨基酸。具體實例包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸和色氨酸。其它合適的反應物來自一類更廣泛的氨基羧酸，例如焦谷氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸等。如果需要，也可以使用上述氨基酸的N-?；苌?，諸如甲酰賴氨酸。
其它合適的反應物包括但不限于未取代或取代的芳基(C6-C10)化合物(其中該取代基可以是烷基(C1-C3)、烷氧基、羧基、硝基和鹵素基團)、未取代或取代的烷烴(其中該取代基可以是至少一個烷氧基)；或未取代或取代的含氮雜環(huán)化合物(其中所述取代基可以是烷基(C1-C3)、芳基(C6-C10)、烷氧基、羧基、硝基或鹵素基團)。最后一組提及的反應物的說明性實例，包括間甲基-、對甲基-、間甲氧基-、鄰甲氧基-和間硝基-氨基苯、鄰-和對-氨基苯甲酸；正丙胺、正丁胺、3-甲氧基丙胺；嗎啉和哌啶(piperdine)。
在所附的表A中提出了具有上式的代表性抑制劑化合物。在本發(fā)明實踐中可以用作抑制劑的已知化合物的實例，包括但不限于葡甲胺(meglumine)、山梨糖醇賴氨酸和甘露糖醇賴氨酸。
本文所述的抑制劑化合物可以與各種無機或有機酸或堿形成藥學上可接受的鹽。合適的堿包括例如堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨、取代的銨和其它胺鹽。合適的酸包括例如鹽酸、氫溴酸和甲磺酸。
式I化合物的藥學上可接受的鹽可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法制備。
可以采用種類繁多的激酶活性測定，確定化合物抑制FL3P激酶的能力。一個有用的測定涉及在腎勻漿或其它酶源存在下，將潛在的抑制劑與果糖-賴氨酸和ATP一起溫育。制備所述測定組分的溶液，它通常含有1毫摩爾或更少的本發(fā)明抑制劑化合物、范圍為1-10毫摩爾的一定量的果糖賴氨酸(FL)、范圍為0.1-10毫摩爾的一定量的ATP和其量足以將FL轉(zhuǎn)化為果糖賴氨酸-3-磷酸的所述酶源。進行溫育的pH范圍內(nèi)應該為4.5-9.5，理想的是中性或近中性pH。進行溫育的溫度應該符合酶活性，為4-40℃。理想的是，該溫育在生理溫度下進行。溫育后，通過酸沉淀該蛋白終止該反應，通過31P-NMR光譜學測定FL3P的產(chǎn)生。與不含抑制劑的對照樣品相比時，在含抑制劑化合物的樣品中，F(xiàn)L3P的產(chǎn)生將減少或消除。
其它測定具有快速測定酶抑制的用途。一個這種測定涉及使用果糖-賴氨酸和γ-標記的32P或33P-ATP。由于FL3P不與Dow-1結(jié)合，而ATP和大多數(shù)其它磷酸與Dow-1結(jié)合，因此通過在預定反應時間后，通常為10分鐘后，使該測定溶液通過Dow-1樹脂柱，將產(chǎn)物FL3P與其余反應混合物分離是可能的。將產(chǎn)生的溶液加入閃爍液體(例如Ecoscint A)的容器中并計數(shù)，以測定產(chǎn)生的放射性的量。
因為難以獲得大量的人類組織，所以最好使用克隆入表達系統(tǒng)(諸如大腸桿菌)中的重組形式的激酶?？梢匀菀椎貜慕M織特異性cDNA文庫的“鳥槍法”克隆，得到所述克隆的激酶。這類文庫容易得自商業(yè)來源。例如它們可以得自Clontech，Palo Alto，CA。可以采用商業(yè)上得自Stratagen(位于San Diego，California)的λ克隆系統(tǒng)，進行設(shè)想的鳥槍法克隆。該克隆試劑盒帶有詳細的使用說明。
本發(fā)明的藥用制劑包含作為活性組分的一種或多種上述化合物，結(jié)合一種藥學上可接受的載體介質(zhì)或輔助劑。
這些組分可以以各種給藥形式制備，包括液體或固體。因此，該制劑可以為片劑、囊片(caplet)、丸劑或糖衣丸，或可以填入諸如膠囊的合適容器中，或在懸浮劑的情況下，可以裝入瓶中。本文所用的“藥學上可接受的載體介質(zhì)”包括任何和所有的適合于所需具體給藥形式的溶劑、稀釋劑或其它液體溶媒、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等。合適載體介質(zhì)的代表性實例包括明膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、植物和動物脂肪和油、樹膠、聚亞烷基二醇或此類物質(zhì)。Remington’sPharmaceutical Sciences，第15版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，PA 1975)公開了用于配制藥用制劑的各種載體和制備藥用制劑的已知技術(shù)。除了在任何常規(guī)載體介質(zhì)與本發(fā)明的酶抑制劑不相容的情況下，諸如由于產(chǎn)生任何不良的生物效應或者以有害方式與該藥用制劑的其它組分相互作用，設(shè)想其使用屬于本發(fā)明范圍。
在本發(fā)明的藥用制劑中，所述活性藥劑的存在量可以為該制劑(包括載體介質(zhì)和/或輔助劑(如果有的話))總量的至少5％(重量)，一般不大于98％(重量)。最好是，活性藥劑的比例在該組合物重量的65％和95％之間變化。
優(yōu)選的補充活性藥劑是在體內(nèi)與3DG結(jié)合的化合物。該類化合物包括但不限于氨基胍、氨基苯甲酸及其衍生物、半胱氨酸及其衍生物、氨基取代的咪唑、1，2-二取代的苯并咪唑、取代1，2，4-三唑、二氨基吡啶及其衍生物、氨基取代的嘧啶、氨基醇、二胺等。特別是包括血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑的抗高血壓藥物也可以作為補充活性藥劑包括于本發(fā)明的藥用制劑中。
如果必需或需要，諸如保護該活性化合物免受胃中酸破壞、或促進該活性化合物吸收入血流的化合物的輔助劑，也可以加入該藥用制劑中。這類輔助劑可以包括例如絡(luò)合劑等，諸如硼酸鹽或部分抵銷胃中酸性條件的其它鹽。通過將該活性化合物作為脂肪酸鹽傳遞(在該活性化合物含有一種或多種堿性官能團的情況下)，可以提高吸收。
可以采用有效抑制FL3P賴氨酸回收途徑的任何給藥量和任何給藥途徑，將本發(fā)明的化合物與任何補充活性組分一起給予。因此，本文所用的表述“治療有效量”是指該酶抑制劑無毒、但足以提供所需治療以對抗糖尿病并發(fā)癥或為了其它醫(yī)學原因而抑制3DG代謝產(chǎn)生(諸如減低衰老作用或減少其中AGE-蛋白形成具有致病作用的其它人類疾病狀態(tài))的量。根據(jù)物種、年齡和該患者的一般健康狀況、并發(fā)癥的性質(zhì)、具體的酶抑制劑及其給藥模式等，所需的準確量可以變化。
本發(fā)明的化合物最好以易于給予和劑量均一性的劑量形式配制。本文所用的劑量單位形式是指適用于待治療患者的酶抑制劑的物理上獨立的單位。每個劑量應該含有計算產(chǎn)生所需治療效果的活性物質(zhì)的量，所述活性物質(zhì)或者為其本身，或者結(jié)合選定的藥用載體介質(zhì)。通常，本發(fā)明化合物以含有按該制劑的重量計大約1mg至大約2,500mg該化合物的劑量單位給予，其范圍最好為大約5mg至大約250mg。
根據(jù)待治療的糖尿病并發(fā)癥的性質(zhì)，本發(fā)明的化合物可以經(jīng)口、胃腸外(諸如肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、靜脈輸注等)給予。經(jīng)口或胃腸外給予的本發(fā)明化合物的劑量水平可以大約為每日0.7ug 至大約20mg/kg患者體重，最好每日為大約30μg至大約3.5mg/kg患者體重，一日一次或多次，以獲得所需的治療效果。
只要口服劑量能夠產(chǎn)生治療上有活性的血液和/或靶組織水平的抑制劑，則特別優(yōu)選口服活性的酶抑制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測量血液、腎臟和其它靶組織的去蛋白樣品中的小分子抑制劑的水平?？梢詫⑦@些樣品中的抑制劑濃度與預定的抑制常數(shù)相比。遠低于該抑制常數(shù)的組織水平提示缺乏治療活性。在不可逆抑制劑的情況下，這種缺乏可以通過相應組織中FL3P激酶水平的測定而被證實或被駁倒。在所有情況下，可以通過讓人類或動物被試者進食富含糖化賴氨酸殘基或果糖-賴氨酸的食品，并測定進食前后其尿中3DG和3DF的量，來評估治療活性。如下文進一步詳細描述的，與被試者進行抑制劑治療之前的分泌水平相比，這些在其系統(tǒng)中具有治療活性抑制劑的相同被試者的3DG和3DF的分泌均將減少，而果糖-賴氨酸的尿分泌將增加。
本發(fā)明化合物通常每日給予一次，最多每日給予4-5次，這取決于選擇的恰當?shù)囊种苿?。盡管最好是一日一次的給藥制度，但糖尿病患者習慣于密切關(guān)注其疾病狀態(tài)，因此，如果需要，他們?nèi)菀捉邮芨l繁給藥制度，以便提供上述日劑量。然而，本文所述化合物和組合物的精確的給藥制度，必需取決于單個待治療患者的需要、給予的治療類型和主治醫(yī)師的判斷。本文所用的術(shù)語“患者”包括人類和動物。
本文所述的抑制劑化合物可用來對抗糖尿病并發(fā)癥，特別是糖尿病性腎病，它影響多于40％的糖尿病患者，并且是需要透析和移植的晚期腎病的主要原因。另外，這些抑制劑可以用來預防或治療可歸因于AGE-蛋白形成的其它病理學病征，諸如高血壓、中風、神經(jīng)退化性疾病(例如Alzheimers類型的老年性癡呆)、循環(huán)性疾病、動脈硬化癥、骨關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障和衰老的普遍使人衰弱的作用。
初步實驗已經(jīng)表明，嚴重不利的健康影響是通過長期消費糖化蛋白而刺激賴氨酸回收途徑產(chǎn)生的。FL的情況也是如此，在喂食糖化蛋白膳食的實驗動物中觀察到FL3P、3DG和3DF增加，參見表B。進食這種膳食8個月后，在進食糖化蛋白膳食的動物中觀察到類似在糖尿病腎臟中發(fā)現(xiàn)的明顯的腎病理學證據(jù)，如以下實施例10中進一步的描述。在進食少量糖化蛋白的人類志愿者的尿中，也觀察到3DG和3DF水平的短暫升高。
表B
由于這一新發(fā)現(xiàn)的賴氨酸回收途徑的刺激導致系統(tǒng)3DG水平的顯著提高，因此進行一項研究以確定糖化膳食是否對妊娠產(chǎn)生顯著作用。迄今獲得的結(jié)果提示，如在以下的實施例中所表述的，由該途徑引起的作用非常強。
此外，眾所周知，在大鼠和小鼠的敏感品系中，在早期生活(斷奶后)中維持所述動物的膳食可以對1型糖尿病的發(fā)生率有顯著的影響，發(fā)生率為10％-90％。已經(jīng)在最近十年期間對該現(xiàn)象的研究投入了相當大的努力。例如，參見Diabetes，46(4)5 89-98(1997)和DiabetesMetab.Rev.，12(4)341-59(1996)和其中引用的參考文獻。一些本發(fā)明人已經(jīng)對處于誘導糖尿病兩個極端的兩種膳食進行了研究。AIN-93(Dyets，Inc.)引起的糖尿病發(fā)生率最低，產(chǎn)生的已經(jīng)觀察到的尿3DF/肌苷酸的比率最小(1.0)。Purina 500誘導的糖尿病發(fā)生率最高，使3DF/肌苷酸的比率提高2.5倍。由于在大鼠胰臟中觀察到FL3P、3DG和3DF，因此可能果糖賴氨酸激酶和該代謝途徑中的代謝物參與I型糖尿病的發(fā)生。對該類型糖尿病敏感的動物(在人類胰島素依賴性糖尿病或I型糖尿病中有用的模型)具有異常的免疫系統(tǒng)，這使得它們對胰臟β-細胞中形成的未知抗原敏感，導致動物自身免疫系統(tǒng)對其β-細胞的自身免疫攻擊。這導致它們隨后被破壞，由此剝奪了該動物制造胰島素的能力。眾所周知，與蛋白反應的3DG可以制造新的抗原位點。因此，各種膳食的抗原特性的來源看來是通過胰臟中果糖賴氨酸-3-磷酸的分解產(chǎn)生的3DG。
此外，因為已知3DG一般與胺反應，所以它可能能夠與DNA相互作用，表現(xiàn)出誘變和致癌潛力，并且使蛋白交聯(lián)。
FL3P賴氨酸回收途徑的發(fā)現(xiàn)，使得首次可以區(qū)分糖尿病患者群體，并確定該群體的哪些亞群可能發(fā)生糖尿病并發(fā)癥。這一確定可以在試驗對象的生物流體上常規(guī)進行，例如尿、血液組分(特別是血漿或血清)、淋巴液、組織液等。
過夜禁食后，讓人類被試者進食含相對高濃度糖化賴氨酸殘基的食品源。作為實例，這種食品可以為酪蛋白/糖“曲奇”(諸如以下實施例5中描述的)或某些其它合適的糖化賴氨酸或合成果糖-賴氨酸源的形式。當利用含糖化賴氨酸殘基的蛋白時，糖化賴氨酸的含量應該優(yōu)選為總蛋白氨基酸的0.02-10％，或更優(yōu)選為大約0.2-0.4％?？诜┝恐械奶腔嚢彼釟埢目偭繎摯蠹s為0.3克。最好是，在消費該糖類賴氨酸源之前收集尿樣，然后在1小時、3小時和5小時或在各個臨床狀態(tài)可以保證的這類其它合適時間時收集尿樣。
測定這些尿樣中的3DG和3DF水平，并計算這些代謝物的比率。該測定中使用的具體方法學對于本發(fā)明的實踐并不重要。如果需要，可以利用以下實施例5中描述的GC法。或者，正如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，可以使用比色或免疫測定法。
顯然，如最近完成的糖尿病控制和糖尿病實驗清楚地證明的，糖尿病患者面臨的主要風險因素是糖血控制(glycemic control)。然而，糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率不能僅用血糖水平來解釋；當將糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率與歷史血糖水平進行比較時，觀察到相當寬的分布。
確定發(fā)生糖尿病并發(fā)癥風險最大的糖尿病患者群體亞群的一種方法是本發(fā)明的一個特別顯著的方面。該方法涉及在攝食糖化賴氨酸源之前、最理想的是在其之后，測量FL、3DG和3DF水平。
例如，正常被試者尿中的3DG與3DF之比持續(xù)不變，大約為0.025，而糖尿病患者的比率較高，可以高至高5倍或5倍以上。這一點由圖7中的數(shù)據(jù)支持，圖7表明，血糖正常者的3DG/3DF之比為0.025(1/39.77)，在該數(shù)值附近分布相當緊密，而糖尿病患者的比率高于平均比率2倍(平均0.069)，而且在該平均值附近相當分散。
如本文證明的，糖尿病患者3DG的產(chǎn)生增加。因此，抗糖尿病并發(fā)癥需要高度有效地去除這種毒性代謝物。用本文所述方法計算的3DG與3DF之比，使得人們可以評估3DG解毒途徑的效力。比率低的那些個體一般對發(fā)生糖尿病并發(fā)癥有抗性。比率較高(包括在正常范圍內(nèi)包括的比率)的個體風險較高，而比率高于正常范圍的個體尤其有發(fā)生這些并發(fā)癥的風險。
最近對四個不同大鼠品系的血漿和尿中果糖賴氨酸(FL)的測量已經(jīng)證明在下述情況下有相當大的變異性，即在這些大鼠中它們各自的腎臟加工血液中的FL。根據(jù)該化合物及其代謝物與肌酸酐之比，在四個品系中的兩個品系(Long Evans、褐色挪威(Brown Norway))中，實際上腎過濾的所有FL均出現(xiàn)在尿中。至于其它兩個品系(Sprague Dawley、Fischer)，根據(jù)與肌酸酐過濾的比較，血漿中10-20％的FL出現(xiàn)在尿中。這些測量結(jié)果強烈地提示在哺乳動物腎臟中FL加工的主要變異性。如果已知嚙齒動物和人類的腎臟的功能相當，則假定在人類中存在FL加工的相似變異是合理的。由于FL主要輸入至果糖賴氨酸回收途徑，因此，在從超濾吸收大量FL的那些人中這整個途徑可能受顯著刺激，導致腎臟中3-脫氧葡萄糖醛酮(3DG)的局部水平高，整個機體系統(tǒng)水平也高。這一觀察可以用作診斷試驗的基礎(chǔ)，其中同時期獲得的血漿樣品或血清樣品與尿樣的比較，將確定FL流入腎臟的通量以及出現(xiàn)在尿中的通量的分數(shù)。該比率大致低于1的那些個體則將具有發(fā)生種種腎病理學的風險，包括但不限于糖尿病性腎病、老年時的腎衰竭和腎癌。
采用賴氨酸回收途徑的測試，可以容易和安全地確定本發(fā)明激酶抑制劑的治療效力。該測試方案與以上剛剛提出的方法相同，只是除測定尿3DG和3DF水平外，還測定尿的果糖賴氨酸水平。在開始FL3P激酶抑制劑治療之前和之后進行該測試是有用的。在每個時間點將尿中3DG和3DF的水平相加，將其與同一樣品中測定的果糖-賴氨酸水平相比較。
在攝食富含糖化賴氨酸殘基的食品后，在尿中發(fā)現(xiàn)的3DG和3DF峰值水平得自賴氨酸回收途徑的活性。這些代謝物與未反應的果糖-賴氨酸(這是人尿的正常組分)的濃度比反映出該途徑的活性。抑制賴氨酸回收途徑，將引起排泄的3DG和3DF的量減少，而果糖-賴氨酸的排泄水平提高。因此，可以通過測量治療開始后(3DG+3DF)/果糖-賴氨酸之比的降低，定量測定激酶抑制劑的治療效力。值得注意的是，尿體積或代謝物濃度不是闡明該測定中的因素，因為僅僅考慮代謝物的比率。
人們從以上公開內(nèi)容中會認識到，經(jīng)口攝入的含高濃度糖化賴氨酸殘基的食品，會導致產(chǎn)生腎臟和血清的3DG。比較好的是提醒例如糖尿病患者的有腎病風險的個體避免這些高濃度的食品。可以采用各種各樣的方法，測定糖化賴氨酸殘基的濃度。在以下實施例4中描述了一個這樣的測定方法。然而，精確測定糖化賴氨酸殘基水平的任何合適的測量方法均可以代替以上例舉的測定方法。具體設(shè)想的測定方法的實例包括但不限于比色法和免疫法。
無論使用何種測量方法，測定預制食品中糖化賴氨酸殘基的含量以及將這些測定通知有發(fā)生腎功能障礙風險的個人，使得這些個人可以避免攝食糖化賴氨酸含量高的食品，均屬于本發(fā)明范圍。
提供以下實施例以進一步詳細地描述本發(fā)明。提供這些實施例僅僅為了說明，決不應該解釋為限制本發(fā)明。這些實施例中給出的所有溫度均以攝氏度計，除非另外指明。
實施例1FL3P的分離和鑒定對糖尿病大鼠腎臟的高氯酸提取物的31PNMR分析，顯示于6.24ppm的一個新的一磷酸糖的共振，這在非腎臟組織中未觀察到，而且在非糖尿病腎臟中水平大大降低。通過將該提取物在微晶纖維素柱色譜分離，采用1-丁醇-乙酸-水(5∶2∶3)作為洗脫劑，分離引起觀察到的共振的化合物。通過質(zhì)子2D COSY，測定該結(jié)構(gòu)為3-磷酸果糖-賴氨酸。后來通過給動物注射按先前所述(Finot和Mauson，Helv.Chim.Acta，521488(1969))制備的FL，并且表明直接磷酸化為FL3P，而證實這一點。使用于3位特異性氘化的FL證實磷酸位置為碳-3。這通過分析偶合和去偶合的31P NMR光譜來進行。正常的P-O-C-H偶合在FL3P中產(chǎn)生雙峰，J值為10.3Hz，而P-O-C-D沒有偶合，偶合和去偶合的均產(chǎn)生單峰，發(fā)現(xiàn)3-氘化FL3P也是同樣。FL3P的獨特特性是，當用硼氫化鈉處理時，它轉(zhuǎn)化為于5.85ppm和5.95ppm的兩個新共振，這對應于甘露糖醇和3-磷酸山梨糖醇-賴氨酸。
實施例2FL3P的合成將1mmol 3-磷酸二芐基-葡萄糖和0.25mmol α-芐酯基-賴氨酸在50ml MeOH中回流3小時。用100ml水稀釋該溶液，并在吡啶形式的Dow-50柱(2.5×20cm)上進行色譜分離，首先用水(200ml)洗脫，然后用600ml緩沖液(0.1M吡啶和0.3M乙酸)洗脫。靶化合物于水洗滌結(jié)束和緩沖液洗滌開始時洗脫。于20psi氫氣下用5％Pd/C去除cbz和芐基封閉基團，產(chǎn)生FL3P，得率為6％。
實施例3由FL和ATP酶促產(chǎn)生FL3P以及篩選抑制劑的測定首先用31P NMR證明腎皮質(zhì)中的激酶活性。將3g新鮮豬腎皮質(zhì)樣品在9ml50mM pH 7.5 Tris·HCl中勻漿，所述Tris·HCl含有150mM KCl、5mM DTT、15mM MgCl2。將其以10,000g離心30分鐘，然后上清液以100,000g離心60分鐘。加入硫酸銨至60％飽和度。于4° 1小時后，離心收集沉淀，并將其溶于5ml原始緩沖液中。將2ml等分樣品的該溶液與10mM ATP和10mM FL(按以上實施例1制備)于37°溫育2小時。反應用300uL高氯酸猝滅，離心除去蛋白，在Sephadex G 10柱(5×10cm)上脫鹽。對反應混合物的31P NMR分析檢測到FL3P的形成。
根據(jù)由此獲得的激酶活性的證明，開發(fā)出放射性測定。該測定設(shè)計利用FL3P缺乏與Dow-1陰離子交換樹脂的結(jié)合。在努力分離FL3P期間發(fā)現(xiàn)FL3P的特征。由于大多數(shù)磷酸結(jié)合于該樹脂，因此推測與ATP反應的所有化合物中的大多數(shù)以及任何過量的ATP將結(jié)合，將FL3P留在溶液中。第一步是測定去除該測定中的ATP所需的樹脂量。通過將所述混合物吸移到0.9ml水中的200mg Dow-1的懸浮液中，渦旋混合并離心以裝填樹脂，完成這一步。從中將0.8ml上清液吸移到200mg新的干樹脂上，渦旋混合并離心。將0.5ml體積的上清液吸移到10ml Ecoscint A中并計數(shù)。殘留的計數(shù)為85cpm。該方法用于該測定。于4°將來自粗皮質(zhì)勻漿60％硫酸銨沉淀的沉淀物，重新溶于勻漿緩沖液中。該測定物含有0.1ml 50mM pH 7.5 Tris·HCl中的10mM γ33P-ATP(40,000cpm)、10mM FL、150mM KCl、15mM MgCl2、5mM DTT。采用1mg、2mg和4mg蛋白于37°以三份重復進行30分鐘的測定，確定FL3P的產(chǎn)生速率和酶濃度之間的關(guān)系。減去無FL的并流洗脫的空白，并記錄數(shù)據(jù)。觀察到的活性相當于大約20nmols/hr./mg.蛋白的FL3P合成速率。
實施例4用葡甲胺和各種多元醇賴氨酸抑制3-脫氧葡萄糖醛酮的形成a.通用的多元醇賴氨酸的合成。
將糖(11mmoles)、α-芐酯基-賴氨酸(10mmols)和NaBH3CN(15mmoles)溶于50ml MeOH-H2O(3∶2)中，于25°攪拌18小時。用過量的Dow-50(H)離子交換樹脂處理該溶液，以分解過量的NaBH3CN。將該混合物(液體加樹脂)轉(zhuǎn)移到Dow-50(H)柱(2.5×15cm)上，用水充分洗滌，以去除過量的糖和硼酸。用5％NH4OH洗脫芐酯基-多元醇賴氨酸。將蒸發(fā)獲得的殘留物溶于水-甲醇(9∶1)中，采用10％鈀炭催化劑用氫氣(20psi)還原。過濾并蒸發(fā)產(chǎn)生所述多元醇賴氨酸。
b.用山梨糖醇賴氨酸、甘露糖醇賴氨酸和半乳糖醇賴氨酸降低尿和血漿3-脫氧葡萄糖醛酮的實驗方案。
收集6只大鼠3小時的尿液。也獲得血漿樣品。然后通過腹膜內(nèi)注射，給予所述動物10μmols或者山梨糖醇賴氨酸、甘露糖醇賴氨酸或者半乳糖醇賴氨酸。收集另外3小時的尿液，在此3小時結(jié)束時獲得血漿樣品。
如以下實施例5中所述，測定這些樣品中的3-脫氧葡萄糖醛酮，將可變體積對肌酸酐歸一化。對于尿3-脫氧葡萄糖醛酮的平均降低，用山梨糖醇賴氨酸降低50％，用甘露糖醇賴氨酸降低35％，而用半乳糖醇賴氨酸降低35％。對于血漿3-脫氧葡萄糖醛酮，用山梨糖醇賴氨酸降低40％，用甘露糖醇賴氨酸降低58％，而用半乳糖醇賴氨酸降低50％。
c.使用葡甲胺降低尿3-脫氧葡萄糖醛酮。
按緊接上面的b)中所述處理3只大鼠，只是腹膜內(nèi)注射萄甲胺，而不是注射上述賴氨酸衍生物。注射后3小時，尿中的平均3-脫氧葡萄糖醛酮降低42％。
實施例5攝入糖化蛋白后人類的尿FL、3DG和3DF的升高a.含糖化蛋白食品的制備將260g酪蛋白、120g葡萄糖和720ml水混合，得到均一的混合物。將該混合物轉(zhuǎn)移至金屬盤上，于65°蒸煮68小時。然后將產(chǎn)生的餅狀物磨成粗粉。
用凱氏法測定，該粉末含有60％蛋白。
b.糖化賴氨酸含量的測定通過與6N HCl回流20小時，將在以上步驟a.中制備的1g粉末水解。用NaOH溶液，將產(chǎn)生的溶液調(diào)至pH 1.8，并稀釋至100ml。在氨基酸分析儀上，以得自果糖賴氨酸酸水解的產(chǎn)物furosine，測定果糖賴氨酸含量。以該方法，測定該餅狀物含有5.5％(w/w)果糖賴氨酸。
c.實驗方案志愿者用2天進食無果糖賴氨酸的膳食，然后消費按本文所述制備的22.5g食品，由此有效地接受2g劑量的果糖賴氨酸。以2小時間隔收集14小時的尿，最后于24小時收集一次。
d.尿中FL、3DG和3DF的測量采用46°的Water C18無氨基酸柱，用乙腈-甲醇-水(45∶15∶40)至乙腈-乙酸鈉-水(6∶2∶92)的梯度洗脫系統(tǒng)以1ml/min洗脫，用具有Waters 996二極管陣列的HPLC測定FL。定量測定使用葡甲胺內(nèi)標。
將該樣品去離子后，用HPLC測定3DF。在Dionex DX-500 HPLC系統(tǒng)中進行分析，該系統(tǒng)使用一個PA1柱(Dionex)，用32mM氫氧化鈉以1ml/min洗脫。根據(jù)以合成3DF每日獲得的標準曲線進行定量。
將該樣品去離子后，通過GC-MS測定3DG。用PBS中過量10倍的二氨基萘得到3DG。乙酸乙酯萃取產(chǎn)生無鹽組分，用Tri-Sil(Pierce)將其轉(zhuǎn)化為三甲基硅醚。在Hewlett-Packard 5890選定離子監(jiān)測GC-MS系統(tǒng)上進行分析。在熔凝硅石毛細管柱(DB-5，25mx.25mm)上，采用以下溫度程序進行GC注射口250°，起始柱溫150°，將該柱溫保持1分鐘，然后以16°/分鐘升至290°，保持15分鐘。3DG的定量使用選定的離子監(jiān)測，采用U-13C-3DG內(nèi)標。
圖3所示的圖表示一個志愿者在消費所述糖化蛋白后尿中的FL、3DF和3DG的產(chǎn)生。非常明顯的是，所有三種代謝物均快速出現(xiàn)。3DF和3DG均表現(xiàn)出甚至在24小時后也略微升高。
圖4所示的圖表示7人測試組的每個成員中3DF的形成。在所有情況下均觀察到相似的圖式。如圖4所顯示的，在FL大藥丸攝入后(after the FL bolus)大約4小時，3DF的排泄達到峰值，甚至在該大藥丸攝入后24小時，也可注意到3DF略微升高。
實施例6進食實驗N-乙酰-β-萄糖胺酶(NAG酶)是糖尿病患者中以提高的濃度排泄到尿中的一種酶。人們認為它是一種腎小管損害的早期標記，但尚未充分了解尿中NAG酶增加的發(fā)病機理。已經(jīng)提出，在糖尿病患者中NAG酶尿輸出增加是由糖尿病誘導的近端小管中溶酶體的激活引起的，向尿中的輸出增加，而不是細胞破壞。
該實施例中獲得的結(jié)果表明，在所有的比較中，3DF和NAG酶的水平在實驗組中均相對于對照升高。因此，喂食糖化蛋白的動物將過量的NAG酶排泄到其尿中，類似于糖尿病患者獲得的結(jié)果。與對照動物相比，NAG酶的輸出增加大約50％。于對照相比，這些動物尿中的3DF也增加5倍。如在圖5和圖6中可以見到的，尿3DF與3DG的相關(guān)性極其好。兩種化合物看來均以腎小球過濾速率從血漿中去除，沒有重吸收。
實施例7腎臟蛋白的SDS凝膠每日給2只大鼠注射5μmols或者FL或者甘露糖醇(用作對照)，注射5天。處死動物，取出腎臟，將其解剖為皮質(zhì)和髓質(zhì)。將組織在5倍體積的50mM pH 7.5 Tris·HCl中勻漿，該Tris·HCl含有150mM KCl、15mM MgCl2和5mM DTT。以10,000g離心15分鐘除去細胞碎片，然后上清液以150,000g離心70分鐘。在12％聚丙烯酰胺凝膠以及在4-15％和10-20％梯度凝膠上，通過SDS PAGE分析可溶性蛋白。在所有情況下，與注射甘露糖醇的動物相比時，來自注射FL的動物的腎臟提取物，其分子量較低的條帶消失或目測減少。
實施例83-O-甲基果糖賴氨酸的合成將30ml甲醇和15ml甘油中的19.4g(0.1mol)無水3-O-甲基葡萄糖和1g亞硫酸氫鈉的懸浮液回流30分鐘，然后加入0.035molα-芐酯基-賴氨酸和4ml乙酸。將該溶液回流3小時。該溶液用1倍體積的水處理，并在吡啶形式的Dowex-50柱(4×50cm)上進行色譜分離，首先用水洗脫，然后用乙酸吡啶洗脫。合并并蒸發(fā)含有純品物質(zhì)的組分。將所得的物質(zhì)溶于50ml水-甲醇(9∶1)中，并采用10％鈀炭催化劑，用氫氣(20psi)還原。過濾和蒸發(fā)產(chǎn)生3-O-甲基-果糖賴氨酸。
例如可以通過用諸如果糖的糖化劑，將選定的含氮或含氧原料(它可以是氨基酸、多氨基酸、肽等)糖化，制備具有以上式(I)結(jié)構(gòu)的其它具體化合物，如果需要，可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行化學修飾。
實施例9FL3P激酶活性的另一種測定a.母液的制備制備測定緩沖液，它為100mM HEPES pH 8.0、100mM ATP、2mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM PMSF。制備2mM果糖基-精胺HCl的果糖基-精胺母液。制備2mM精胺HCl的精胺對照溶液。
b.果糖基-精胺的合成通過已知方法(J.Hodge和B.Fisher，Methods Carbohydr.Chem.，299-107(1963))的修改方法，進行果糖基-精胺的合成。在50ml甲醇-水(1∶1)中，以8∶4∶1(精胺∶葡萄糖∶焦亞硫酸鹽)的摩爾比，制備精胺(500mg)、葡萄糖(500mg)和焦亞硫酸鈉(80mg)的混合物，將其回流12小時。用水將該產(chǎn)物稀釋至200ml，上樣至DOW-50柱(5×90cm)。用2倍柱體積的水去除未反應的葡萄糖，用0.1M NH4OH除去該產(chǎn)物和未反應的精胺。凍干合并的該產(chǎn)物的峰組分，通過測定該產(chǎn)物的定量13C NMR光譜中的C-2果糖基峰的積分(以45°脈沖、10秒弛豫延遲(relaxation delay)以及無NOE去偶合收集的NMR數(shù)據(jù))，測定果糖基-精胺的濃度。
c.用于純化的激酶測定制備溫育混合物，包含10μl酶制劑、10μl測定緩沖液、1.0μCi33P ATP、10μl果糖基-精胺母液和70μl水，于37°溫百1小時。溫育結(jié)束時，將90μl(2×45μl)該樣品點樣至兩個2.5cm直徑的磷酸纖維素圓盤(Whatman P-81)上，讓其干燥。將圓盤用水徹底洗滌。干燥后，將圓盤置于閃爍小瓶中并計數(shù)。
以雙份試樣測定每個酶組分與合適的精胺對照。
實施例10在維持糖化蛋白膳食的實驗動物中觀察到的腎臟病理學讓3只大鼠維持糖化蛋白膳食(20％總蛋白；3％糖化)8個月，將其與維持對照膳食的9只同齡大鼠相比。初步發(fā)現(xiàn)在維持糖化膳食的動物中損害的腎小球顯著增加。在這些動物中觀察到的典型病灶是腎小球(glomerular tuft)節(jié)段硬化并粘附于腎小囊、壁上皮腎小管組織變形和間質(zhì)性纖維變性。維持糖化蛋白膳食的所有3只動物和維持對照膳食的動物中的僅1只動物，表現(xiàn)出損害的腎小管多于13％。這種現(xiàn)象偶然發(fā)生的可能性低于2％。除在腎小球中觀察到的病理學外，還觀察到腎小管中的許多hylinated casts。盡管沒有對這些hylinatedcasts進行定量，但這些hylinated casts在維持糖化膳食的動物中發(fā)現(xiàn)得更多。在維持糖化膳食的動物中也觀察到NAG酶水平提高。
從該實驗結(jié)果來看，糖化膳食看來引起實驗動物發(fā)生類似于糖尿病腎臟中觀察到的一系列組織學病變。
實施例11糖化膳食對妊娠的影響在一個初步實驗中，讓5對小鼠維持糖化膳食(18％總蛋白；3％糖化)，在7個月期間生育6次。發(fā)生的6次妊娠產(chǎn)下以下活幼鼠17只、23只、13只、0只、3只和0只。根據(jù)第3次生育后活幼鼠數(shù)的這種急劇下降，讓2群10對小鼠每對維持或者糖化膳食(13％總蛋白；3％糖化)或者對照膳食(13％總蛋白；0％糖化)。到現(xiàn)在為止，這2組幼鼠已經(jīng)生育4次，2組中獲得相似的結(jié)果。第一次妊娠產(chǎn)下49/20(糖化/對照)只幼鼠；第二次妊娠產(chǎn)下18/41只幼鼠；第三次妊娠產(chǎn)生37/27只幼鼠；第四次妊娠產(chǎn)下20/33只幼鼠。第五次妊娠目前正在進行中。已經(jīng)對這些小鼠進行了高血糖測試。在實驗組和對照組中，血液葡萄糖水平分別為120mg/dl和112mg/dl。
在小鼠尿中3DF水平的初步測定正如預期的，表明當維持本文所述糖化膳食時，系統(tǒng)3DF顯著升高(大約5-10倍)。
實施例12果糖賴氨酸途徑的致癌作用為了研究在果糖賴氨酸途徑中形成的代謝物的致癌潛力，在對腎癌具有高度敏感性的一個大鼠品系上已經(jīng)進行了實驗。讓4只大鼠維持糖化蛋白膳食，3只大鼠維持對照膳食。維持該膳食十周后，處死這些動物，檢查其腎臟。在維持該膳食的所有4只動物中，發(fā)現(xiàn)腎癌的尺寸大于1mm，而在對照動物中發(fā)現(xiàn)病灶沒有這樣大。這種情況偶然發(fā)生的可能性低于2％。該數(shù)據(jù)表明，在腎小管細胞(已知為大多數(shù)腎癌起源的細胞)中發(fā)現(xiàn)的、來自動物膳食中的糖化蛋白的過量果糖賴氨酸引起的提高水平的3DG，可以與細胞DNA相互作用，導致種種誘變事件，最終導致致癌事件。存在這種可能性，該過程在人類腎臟和其它部位癌癥的發(fā)生中是重要的。
盡管以上已經(jīng)描述和/或例舉了本發(fā)明的一些實施方案，但根據(jù)以上的公開內(nèi)容，各種其它實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，本發(fā)明不限于描述和/或例舉的具體實施方案，而是能考慮變化和修改，而不脫離所附的權(quán)利要求書的范圍。
表A
a-賴氨酸殘基b-γ-氨基丁酸殘基c-精胺殘基
權(quán)利要求
1.抑制患者酶促產(chǎn)生3-脫氧葡萄糖醛酮的化合物在制備用于在患者中預防由AGE-蛋白形成引起的病理學病征的藥物中的用途，其中所述化合物為選自葡甲胺、山梨糖醇賴氨酸、甘露糖醇賴氨酸和半乳糖醇賴氨酸中的至少一種。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述病理學病征選自高血壓、中風、例如Alzheimers類型老年性癡呆的神經(jīng)退化性疾病、循環(huán)性疾病、動脈硬化癥、骨關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障。
3.果糖-賴氨酸-3-磷酸酶促轉(zhuǎn)化的抑制劑在制備用于在人受試者中緩解3-脫氧葡萄糖醛酮(3DG)的有害作用的藥物中的用途，所述3DG是通過將果糖-賴氨酸酶促轉(zhuǎn)化為果糖-賴氨酸-3-磷酸而產(chǎn)生的，其中所述化合物為選自葡甲胺、山梨糖醇賴氨酸、甘露糖醇賴氨酸和半乳糖醇賴氨酸中的至少一種。
全文摘要
公開了一類化合物，它們在一個新發(fā)現(xiàn)的代謝途徑中的一個ATP依賴性反應中，抑制果糖－賴氨酸酶促轉(zhuǎn)化為果糖－賴氨酸－3－磷酸。根據(jù)該途徑的正常功能，果糖－賴氨酸－3－磷酸(FL3P)分解形成游離的賴氨酸、無機磷酸和3－脫氧葡萄糖醛酮(3DG)，3DG為一種反應性蛋白修飾劑。3DG可以通過將其還原為3－脫氧果糖(3DF)解毒，或它可以與內(nèi)源蛋白反應，形成高級糖化終產(chǎn)物修飾的蛋白(AGE－蛋白)，認為這些蛋白是形成糖尿病并發(fā)癥的原因之一。也公開了一種使用這類抑制劑減少AGE－蛋白形成的治療方法，由此減輕、減少和延遲糖尿病并發(fā)癥，也公開了評估糖尿病患者發(fā)生并發(fā)癥風險的方法以及通過測定經(jīng)口給予含果糖－賴氨酸食品后生物樣品中3DG與3DF之比來確定公開的抑制劑治療的效力的方法。
文檔編號A61P9/12GK1919201SQ20061000689
公開日2007年2月28日 申請日期1998年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月5日
發(fā)明者T·R·布朗, F·卡普勒, B·什維戈爾德, S·拉爾, 蘇邦瑛 申請人:?？怂蛊跛及┌Y中心