專利名稱：重組人子宮珠蛋白在治療炎癥和纖維變性疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及使用天然人子宮珠蛋白(hUG)或重組人子宮珠蛋白(rhUG)對(duì)炎癥和纖維變性疾病的治療。已證實(shí)了UG(hUG或rhUG)的新的生理作用和療法。具體地說，本發(fā)明涉及通過給藥hUG或rhUG抑制PLA2和/或預(yù)防纖連蛋白沉積來治療炎癥和纖維變性疾病。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種治療為嚴(yán)重的肺臨床疾病的新生兒呼吸窘迫綜合征(RDS)和支氣管肺發(fā)育不良(BPD)以及為一種腎病的腎小球腎病，這兩種疾病的特征均在于炎癥和纖維變性疾病。
本申請(qǐng)所引用的參考文獻(xiàn)涉及本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)的狀況，其均被本文引作參考。
背景技術(shù)：
炎癥和纖維變性疾病近些年來，對(duì)改進(jìn)的用于治療炎癥和纖維變性疾病的治療劑的研究已受到廣泛的注意。為肺表面活性劑缺乏疾病的新生兒RDS為尤其令人感興趣的一種疾病，因?yàn)樗窃缙谛律鷥核劳龅囊粋€(gè)主要原因。雖然引入表面活性劑的治療顯著地增加了RDS病人的存活率，但這類病人人群中有很大比例的人出現(xiàn)慢性炎癥和纖維變性疾病是一個(gè)主要問題。同樣，當(dāng)病人腎被阻塞并不再過濾血液時(shí)，遺傳性纖連蛋白沉積腎小球腎病導(dǎo)致晚期腎衰竭。腎病的特征在于纖連蛋白沉積和腎的纖維化，這使得器官喪失功能并最終不能維持生命。
PLA2(磷脂酶A2)，一類水解甘油磷脂Sn2位置酯鍵的內(nèi)源性酶，是涉及炎癥和纖維變性疾病的許多蛋白中的一種。它還負(fù)責(zé)肺內(nèi)表面活性劑磷脂的水解。子宮珠蛋白(還稱作CC10、CC16、CC17、尿蛋白-1、P-1、孕酮結(jié)合蛋白、PCB-結(jié)合蛋白、克拉拉細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)、胚動(dòng)素、視黃醛結(jié)合蛋白、磷脂結(jié)合蛋白和α2微珠蛋白)在體外抑制PLA2的活性。
子宮珠蛋白為小的球狀同型二聚體蛋白。它具有15.8kDa的分子量，但它在凝膠電泳中以相當(dāng)于10kDa的大小遷移。人子宮珠蛋白在成人肺中為大量的，包含高達(dá)全部可溶性蛋白的約7％。然而，它的表達(dá)在發(fā)育的人胎兒中并未完全活化直至妊娠后期。結(jié)果，早產(chǎn)嬰兒的細(xì)胞外肺液包含比成人肺液少得多的UG。UG還由胰腺表達(dá)。
由于它們從細(xì)胞磷脂庫中釋放花生四烯酸(AA)，因此PLA2在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。AA在稱為花生四烯酸級(jí)聯(lián)的過程中被代謝為大量可能的炎癥介體。
通過升高的血清或局部PLA2活性已確定一些急性和慢性臨床疾病(參見下面表1)。
表1.與PLA2活性相關(guān)的臨床疾病疾病 部位類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 血清，滑液，WBC膠原血管疾病 血清胰腺炎 血清腹膜炎 腹膜液和細(xì)胞敗血性休克 血清ARDS* 血清和肺泡液急性腎衰竭 血清自身免疫眼色素層炎 血清，房水支氣管哮喘 支氣管液*成人呼吸窘迫綜合征目前沒有有效的可用于臨床應(yīng)用的PLA2抑制劑。至今，僅一些PLA2抑制劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但均未獲準(zhǔn)用于商業(yè)銷售。
纖連蛋白(Fn)為以一些不同形式存在并由不同組織分泌的200kDa糖蛋白。Fn為一種必需的蛋白，并且在小鼠中Fn基因的靶定破壞表明它在胚胎發(fā)生中具有關(guān)鍵作用。Fn還在炎癥、細(xì)胞粘附、組織修復(fù)和纖維變性中起著關(guān)鍵的作用，并在損傷部位沉積。血漿纖連蛋白(pFn)由肝臟分泌并在血漿中循環(huán)。在肺中，細(xì)胞Fn(cFn)在炎癥和損傷時(shí)分泌。兩種類型的Fn是炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的趨化因子。炎癥發(fā)生期間，大量的炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞滲入肺，這可導(dǎo)致肺纖維變性和最終死亡。在人臨床疾病，如新生兒RDS和BPD等肺部疾病以及腎小球腎炎等腎臟疾病中已檢測到升高水平的Fn。
UG的作用純化的人UG的氨基酸分析表明它與其它“UG樣”蛋白，如兔UG的結(jié)構(gòu)類似但不相同。人與兔UG之間70個(gè)氨基酸中39個(gè)相同(參見圖1)?！癠G樣”蛋白，包括人UG/CC10、大鼠CC10、小鼠CC10和兔UG顯示種特異性和組織特異性抗原差異以及它們的組織分布和體外生化活性的不同。根據(jù)組織和來源種類，在許多不同的文章中描述了UG樣蛋白，包括大鼠肺、人尿、痰、血液成分、兔子宮、大鼠和人前列腺和人肺。目前，仍未知這些蛋白的生理作用。
盡管多年的研究，這些蛋白在體內(nèi)的生物學(xué)作用仍然不清楚。UG樣蛋白之間缺乏結(jié)構(gòu)的相同性使得不可能根據(jù)某蛋白在體外或其它由結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白顯示的活性來預(yù)測其是否在人體內(nèi)將具有治療功效。例如，兔UG與5％的孕酮結(jié)合，而在相同試驗(yàn)中，人子宮珠蛋白結(jié)合的孕酮的量小于5％。人UG具有比兔UG(5.4)低的等電點(diǎn)(4.6)。
Stripp等(1996)報(bào)道了關(guān)于被制備用來消除子宮珠蛋白的表達(dá)的子宮珠蛋白剔除小鼠的研究。該小鼠具有克拉拉細(xì)胞，其中該細(xì)胞顯示不定的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)來代替子宮珠蛋白分泌顆粒，但沒有其它表型。這種觀察結(jié)果極其重要，因?yàn)轭A(yù)測了伴隨有肺炎癥和纖維變性的肺功能。而且，這種剔除小鼠沒有顯示腎、胰腺或生殖異常，這表明子宮珠蛋白在體內(nèi)控制炎癥或纖維變性中不具有顯著的作用。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包含PLA2抑制有效量的重組人子宮珠蛋白(rhUG)或其片段或衍生物以及藥物可接受載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含纖連蛋白結(jié)合有效量的重組人子宮珠蛋白或其片段或衍生物以及藥物可接受載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含PLA2抑制或纖連蛋白結(jié)合有效量的用于治療靶適應(yīng)證的活性劑的藥物組合物。
而且，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種在需要這種治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)抑制PLA2酶的方法，其中該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥PLA2抑制有效量的天然或重組人子宮珠蛋白或其片段或衍生物。
進(jìn)一步，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種在需要這種治療的病人中治療或預(yù)防炎癥疾病的方法，其中該方法包括給藥抗炎有效量的天然或重組人子宮珠蛋白或其片段或衍生物。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種在需要這種治療的病人中治療或預(yù)防纖維變性疾病的方法，其中該方法包括給藥纖連蛋白結(jié)合有效量的天然或重組人子宮珠蛋白或其片段或衍生物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療或預(yù)防特征在于內(nèi)源UG缺乏的炎癥或纖維變性疾病的方法，其中該方法包括給藥補(bǔ)償量的天然或重組人子宮珠蛋白或其片段或衍生物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種包含PLA2抑制或纖連蛋白結(jié)合有效量的天然或重組人子宮珠蛋白或其片段或衍生物的化妝品組合物。
另外，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種包含PLA2抑制或纖連蛋白結(jié)合有效量的天然或重組人子宮珠蛋白或其片段或衍生物的血液補(bǔ)充物。
最后，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供臨床樣品中子宮珠蛋白纖連蛋白復(fù)合物的定量分析法。
發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)子宮珠蛋白在體內(nèi)抑制PLA2和預(yù)防纖連蛋白沉積和纖維變性中起關(guān)鍵的生理作用。在新品系的轉(zhuǎn)基因子宮珠蛋白“剔除”小鼠和涉及肺炎癥和纖維變性的新生兒呼吸窘迫綜合征(RDS)的猴模型中進(jìn)行的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這些作用。本發(fā)明的子宮珠蛋白剔除小鼠(下文稱“UG KO小鼠/小鼠”)在早期和晚期發(fā)作疾病時(shí)分別顯示致死的腎小球腎病和腎實(shí)質(zhì)纖維變性。對(duì)正常的小鼠給藥外源Fn導(dǎo)致Fn在腎中的沉積，但給藥等摩爾量的Fn和rhUG未導(dǎo)致沉積。
已證實(shí)在存在rhUG時(shí)PLA2在體內(nèi)活性降低。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，UGKO小鼠的表型表明與具有功能性UG基因的同窩幼畜中的PLA2活性相比，在不存在UG時(shí)，血清PLA2活性顯著升高。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)患有RDS的早產(chǎn)猴給藥rhUG顯示在肺的細(xì)胞外液中抑制PLA2活性。
其它實(shí)驗(yàn)證實(shí)在體外PLA2可降解用于治療RDS的人工表面活性劑(通常為Survanta)，并且UG可抑制這種降解。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)在氣管內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥后，在體內(nèi)UG介導(dǎo)PLA2抑制和Fn沉積。
使用子宮珠蛋白剔除小鼠的實(shí)驗(yàn)證實(shí)rhUG可用來治療其中子宮珠蛋白被發(fā)現(xiàn)缺乏或蛋白本身具有導(dǎo)致功能喪失的突變的疾病?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)rhUG可用來治療或預(yù)防其中在循環(huán)中或炎癥或纖維變性位點(diǎn)功能性內(nèi)源子宮珠蛋白缺乏的炎癥或纖維變性疾病。在一些肺炎癥或纖維變性疾病中發(fā)現(xiàn)血清和/或支氣管-肺泡滲出液中的hUG水平降低，包括處于發(fā)展成新生兒BPD的危險(xiǎn)中的早產(chǎn)嬰兒。發(fā)現(xiàn)UG可用來補(bǔ)充缺乏或缺陷性內(nèi)源子宮珠蛋白以預(yù)防或治療這些炎癥和纖維變性疾病。
根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種體內(nèi)治療炎癥疾病的方法，包括對(duì)需要這種治療的病人給藥抗炎有效量的UG。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種體內(nèi)抑制可溶性PLA2酶的方法，包括對(duì)需要這種治療的病人給藥PLA2抑制有效量的UG。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防纖維變性疾病的方法，它包括對(duì)需要這種治療的病人給藥纖連蛋白結(jié)合有效量的UG。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種通過加入纖連蛋白結(jié)合量的UG治療或預(yù)防原纖維形成的方法。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防特征在于內(nèi)源功能性UG缺乏的炎癥或纖維變性疾病的方法，它包括對(duì)需要這種治療的病人給藥補(bǔ)償量的UG。
本發(fā)明還提供包含有效量的rhUG與藥物可接受載體或稀釋劑的藥物組合物。該組合物可為可注射溶液劑的形式和用于氣管內(nèi)給藥的液體或半氣霧劑的形式。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含UG和肺表面活性劑(例如Survanta(來自Abbott實(shí)驗(yàn)室的牛肺提取物)和Exosurf(來自Glaxo-Wellcome的化學(xué)合成肺表面活性劑))以及藥物可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明還包括包含PLA2抑制或纖連蛋白結(jié)合有效量的rhGU、治療靶適應(yīng)證的活性劑和載體的藥物組合物。PLA2抑制或纖連蛋白結(jié)合有效量的rhUG減少炎癥，并從而確保有效量的活性劑到達(dá)治療部位。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供定量臨床樣品中子宮珠蛋白纖連蛋白復(fù)合物的分析法，其中將懷疑包含子宮珠蛋白-纖連蛋白復(fù)合物的臨床樣品與抗原捕獲劑接觸，例如固定在不溶載體上的單特異性的兔多克隆抗體；向樣品中加入抗原檢測劑，例如纖連蛋白特異性抗體；使用例如次生抗體檢測與載體結(jié)合的任何復(fù)合物的存在，其中次生抗體為例如使用標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)與諸如辣根過氧化物酶綴合的抗-IgG抗體，其中酶底物被轉(zhuǎn)化為可使用標(biāo)準(zhǔn)分光光度或熒光設(shè)備定量的產(chǎn)色或熒光化合物。
本發(fā)明還提供包含PLA2抑制和/或纖連蛋白結(jié)合有效量的人子宮珠蛋白和藥物可接受的載體或稀釋劑的化妝品組合物或血液補(bǔ)充物。


參考附圖將更詳細(xì)地描述本發(fā)明，其中圖1UG樣蛋白的順序；圖2A示轉(zhuǎn)基因UG剔除小鼠的預(yù)期的靶定構(gòu)建物；限制位點(diǎn)為B-BamIII，E＝EcoRI，H＝HindIII；圖2B-2D示通過PCR和蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)轉(zhuǎn)基因胚胎的后代中的基因構(gòu)建物；(B)靶定的ES R1細(xì)胞克隆的蛋白質(zhì)印跡分析，其中Wt＝野生型；(C)來自后代的尾生物樣品的基因組DNA的代表性的PCR分析；基因型和其對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物如下UG+/+，304bp；UG+/-，304和667bp；UG-/-，667bp；(D)小鼠尾基因組DNA的蛋白質(zhì)印跡分析；圖2E示通過RT-PCR分析證實(shí)在UG-/-小鼠的肺組織中不存在UG-mRNA；從具有UG+/+，UG+/-和UG-/-基因型的同窩幼畜的肺組織中提取的全部RNA的RT-PCR分析；在基因型為UG+/+和UG+/-的肺中可檢測273bp RT-PCR產(chǎn)物，但在UG-/-小鼠的肺中缺乏；圖2F顯示通過蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)在UG-/-小鼠的肺中不存在UG蛋白；來自肺裂解物的蛋白(各30mg)通過在非還原條件下使用4-20％梯度的SDS-PAGE電泳解析并使用兔抗-小鼠UG進(jìn)行免疫印跡；圖2G顯示使用免疫組織化學(xué)法證實(shí)在UG-/-小鼠的肺組織切片中的支氣管上皮細(xì)胞中不存在UG；UG+/+小鼠支氣管上皮細(xì)胞(上面的列)上的黑色染色表明UG的免疫反應(yīng)性；注意在UG-/-小鼠肺(下面的列)不存在免疫反應(yīng)性。
圖3A-3J比較來自正常和UG-/-小鼠的腎切片的組織病理學(xué)分析，顯示僅在剔除小鼠中有異常實(shí)質(zhì)纖維變性和腎小球Fn沉積；來自UG+/+(A)和其UG-/-(B)同窩幼畜的腎切片的H&E染色；(C)患有嚴(yán)重實(shí)質(zhì)纖維變性的10月齡小鼠的腎切片；(D)顯示腎小管增生的(C)中的相同的小鼠腎的一個(gè)區(qū)(放大倍數(shù)40X，g＝腎小球；f＝纖維變性；t＝腎小管)；(E)患有嚴(yán)重腎病的UG-/-小鼠的腎小球沉積的透射電鏡(放大倍數(shù)6000X)；(F)(E)中的插圖放大60,000X倍，顯示表明為膠原(col)的長的具細(xì)紋的纖維性結(jié)構(gòu)和與Fn原纖維一致的短的彌散結(jié)構(gòu)；(G)使用小鼠Fn-抗體的對(duì)來自UG+/+小鼠的腎切片進(jìn)行的Fn免疫熒光；(H)來自患有嚴(yán)重腎病的UG-/-小鼠的腎切片的Fn-免疫熒光；UG+/+(I)和UG-/-(J)小鼠的腎切片的Mason’s三色染色；UG-/-小鼠腎切片的腎小球上的藍(lán)色染色為膠原(放大倍數(shù)約40X)。
圖4A顯示僅在UG-/-小鼠的腎中存在Fn聚集物；來自UG+/+和UG-/-小鼠的血漿、腎和肝臟的Fn的免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡；僅在UG-/-小鼠腎的裂解物中檢測到了多亞基Fn帶(粗箭頭)。
圖4B和4C顯示體外UG-Fn復(fù)合物的形成；(B)將等摩爾濃度的UG和Fn一起培養(yǎng)，免疫沉淀，并使用Fn或UG抗體通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行檢測；免疫沉淀物包含F(xiàn)n(泳道2，上面的列)和UG(泳道2，下面的列)；兩列的泳道1代表Fn和UG標(biāo)準(zhǔn)；(C)4℃下，將等摩爾濃度的125I-UG與Fn一起培養(yǎng)1小時(shí)，產(chǎn)生的復(fù)合物通過6％非還原，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳解析；泳道1，考馬氏蘭染色的Fn-UG異聚體；泳道2，其放射自顯影圖。
圖4D顯示在正常但不在UG-/-小鼠中存在UG-Fn復(fù)合物；使用Fn抗體對(duì)來自UG+/+和UG-/-小鼠血漿進(jìn)行免疫沉淀并使用Fn和UG抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡；Fn(上面的列)；UG(下面的列)；std＝UG和Fn標(biāo)準(zhǔn)。
圖4E顯示體外UG對(duì)Fn自身聚集的劑量依賴性抑制；在不存在(泳道2)和存在改變量的UG(泳道3-5)時(shí)，125I-UG與未標(biāo)記的Fn的親和交聯(lián)；極高分子量的強(qiáng)度，在不存在UG下形成的放射活性Fn帶(泳道2)以劑量依賴性方式降低；泳道1，在不存在UG和DSS下，125I-Fn與未標(biāo)記Fn的交聯(lián)；空心箭頭-多聚體Fn；較細(xì)的箭頭＝220kDa Fn。
圖4F顯示UG對(duì)Fn-膠原復(fù)合物形成的抑制；在不存在(泳道3)和存在(泳道4)UG時(shí)，125I-膠原I與未標(biāo)記的Fn的親和交聯(lián)；泳道1，考馬氏蘭染色的膠原I；膠原I的α1-α1鏈和膠原I的α2-α2鏈；泳道2，在不存在UG和DSS時(shí)，125I-膠原I與未標(biāo)記Fn的交聯(lián)。
圖5A-5F顯示僅在不存在UG時(shí)，正常和UG-/-小鼠的腎中的Fn沉積的免疫組織化學(xué)分析；(A)經(jīng)靜脈獲得等摩爾濃度的Fn和UG混合物的野生型小鼠的腎切片；(B)獲得與(A)等劑量的Fn但未獲得UG的UG+/+小鼠；(C)表面健康的獲得Fn和UG混合物的UG-/-小鼠；(D)僅獲得Fn(與(C)相同的劑量)，但未獲得UG的UG-/-小鼠；(E)在僅補(bǔ)充有可溶性hFn的培養(yǎng)基中生長的培育細(xì)胞的Fn原纖維形成；(F)與(E)相同的飼以含有等摩爾濃度可溶性hFn和UG的混合物的培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物(放大倍數(shù)40X，g＝腎小球)。
圖6A-6B示用于檢測臨床樣品中UG-Fn復(fù)合物的診斷分析公式。
圖7顯示UG二聚體通過8.0kDa MWCO透析膜，但不通過3.5kDaMWCO透析膜。
具體實(shí)施例方式
rhUG本發(fā)明的rhUG基本上具有與天然人UG蛋白相同的氨基酸序列。具有與天然人蛋白“基本上相同的”氨基酸序列的氨基酸序列包括至少75％與天然人蛋白相同的rhUG。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，rhGU具有至少85％的同一性，在一個(gè)最優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，rhGU與天然UG具有至少98％的同一性。
還包括在本發(fā)明方法中的是UG片段或衍生物的使用。UG的“片段”指具有天然蛋白序列的六個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸的天然hUG氨基酸序列的一部分。術(shù)語“衍生物”指UG的肽類似物，包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代和/或一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分的加入，例如?；瘎┗蚧腔瘎?，前提是衍生物保留母體分子的生物學(xué)活性。
而且，用于本發(fā)明方法中的UG基本上為純的。術(shù)語“基本上為純的”指具有約75％至約100％純度的UG。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，UG具有約90％至約100％的純度，在一個(gè)最優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，UG具有至少95％的純度。
UG的臨床用途另一方面，本發(fā)明提供一種用于治療或預(yù)防炎癥或纖維變性疾病的方法，包括對(duì)可能為動(dòng)物或人的哺乳動(dòng)物給藥有效量的UG。
下面非限制性的疾病的實(shí)例為與UG缺乏、過度PLA2活性和纖連蛋白沉積相關(guān)的那些的實(shí)例。
表2.重組子宮珠蛋白的臨床用途(根據(jù)UG特性分組)UG特性 疾病UG缺乏 (1)新生兒支氣管肺發(fā)育不良(2)血液透析并發(fā)癥(3)爭光霉素肺(4)慢性阻塞性肺疾病(5)肺氣腫過度PLA2活性 (1)全身性炎癥(炎癥) (2)哮喘(3)膽囊纖維變性(4)眼炎癥，包括自身免疫眼色素層炎和角膜移植手術(shù)；(5)與產(chǎn)科和婦科相關(guān)的疾病，包括早產(chǎn)和生育力(出自體內(nèi))過度PLA2活性 (1)自身免疫疾病，包括類風(fēng)濕性(免疫調(diào)節(jié)) 關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、炎性腸疾病和節(jié)段性回腸炎(2)移植器官排斥纖連蛋白沉積 (1)腎纖維組織形成(2)肺纖維組織形成，包括自發(fā)性肺纖維變性；(3)血管纖維變性在人炎癥/纖維變性疾病中UG缺乏、PLA2活性和纖連蛋白聚集與沉積之間的典型的相互關(guān)系總結(jié)在下面。
新生兒支氣管-肺發(fā)育異常(新生兒BPD)新生兒BPD特征在于新生嬰兒中肺組織的嚴(yán)重炎癥和不可逆的纖維變性，這通常是呼吸窘迫綜合征(RDS)的結(jié)果。然而，該疾病還可能由胎糞吸入綜合征或感染導(dǎo)致。
由于肺hUG的合成可與表面活性劑共調(diào)節(jié)，并在妊娠后期開始，故該疾病與hUG缺乏相關(guān)。因此，嚴(yán)重早產(chǎn)的新生兒可能缺乏UG以及表面活性劑。hUG的缺乏可能導(dǎo)致與在新生兒BPD中見到的炎癥和纖維變性相關(guān)的增加的PLA2活性和Fn相關(guān)的纖維變性。一些嬰兒對(duì)合成的表面活性劑不反應(yīng)，這可能是由于過量的PLA2活性。因此，UG可用來治療新生兒BPD。
優(yōu)選的給藥途徑為借助于氣管內(nèi)或全身性途徑直接滴注。
多器官功能衰竭(MOF)過量的PLA2活性與由于細(xì)菌膿毒癥或外傷的MOF有關(guān)。該疾病的特征在于全身性的炎癥反應(yīng)，包括迅速大量的組織損傷以及肺、腎、胰腺、腸和脈管系統(tǒng)器官功能的喪失。最近的證據(jù)指出MOF的啟動(dòng)為升高的全身性可溶的磷脂酶A2活性、其對(duì)組織細(xì)胞膜的直接裂解以及對(duì)如肺表面活性劑的必需磷脂的水解。在臨床實(shí)驗(yàn)中直接抑制PLA2的努力已經(jīng)成功。
在MOF中，內(nèi)源UG的量不足以對(duì)抗PLA2的超活化。外源施加的UG可用來治療MOF。
遠(yuǎn)器官功能衰竭(ROF)包括對(duì)不是首先被外傷或感染影響的器官的器官的損傷。通常遠(yuǎn)器官功能衰竭涉及多于一種的遠(yuǎn)器官，導(dǎo)致多器官功能衰竭。例如胰腺炎是對(duì)醇攝取、感染或外傷反應(yīng)的胰腺炎癥，它可能導(dǎo)致成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)，急性腎衰竭(ARF)和全身性休克。炎性腸疾病或腹膜炎的發(fā)作可導(dǎo)致ROF/MOF。ROF/MOF與高水平的循環(huán)活化的PLA2相關(guān)。全身性給藥hUG可防止ROF/MOF。在患有ROF/MOF的病人中立即注射UG可降低嚴(yán)重性或消除PLA2介導(dǎo)的器官衰竭和休克。
胰腺炎所有形式的胰腺炎都涉及全身性和局部升高的I型可溶性PLA2活性。胰腺炎通常導(dǎo)致特征在于肺中升高的可溶性PLA2活性的肺機(jī)能不全或ARDS。因此，作為體內(nèi)可溶性I型PLA2抑制劑，UG為治療兩種形式的急性胰腺炎的極好的代表，并且作為所有急性形式的胰腺炎中肺機(jī)能不全的預(yù)防性措施。
優(yōu)選的給藥途徑為靜脈內(nèi)途徑。
炎性腸疾病炎性腸疾病(IBD)，包括潰瘍性結(jié)腸炎、直腸炎和節(jié)段性回腸炎，特征在于II型可溶性PLA2的增加的局部產(chǎn)生和活性。在IBD中循環(huán)的可溶性PLA2活性也可能升高。作為增加的PLA2活性的后果，IBD在嚴(yán)重的情況下導(dǎo)致肺機(jī)能不全或ARDS(這類似于胰腺炎)。
在I BD中給藥外源UG的合理性與胰腺炎相同通過抑制PLA2、Fn聚集和/或沉積下調(diào)炎癥反應(yīng)和防止?fàn)窟B遠(yuǎn)器官(肺和腎)。
優(yōu)選的給藥途徑為在住院病人中通過靜脈內(nèi)途徑。
細(xì)菌性肺炎患有活細(xì)菌肺炎的病人的BAL液體顯示具有比死亡者高2-3X水平的UG。肺的細(xì)菌性感染可能過度活化內(nèi)源可溶性PLA2?？山o藥UG以抑制或控制這種作用。
如果病人插管，優(yōu)選的給藥途徑為借助于氣管內(nèi)途徑，如果不是，則通過靜脈內(nèi)注射。
透析并發(fā)癥透析主要的并發(fā)癥為血栓形成，即自發(fā)形成血塊。在病人中，這通常阻塞血管經(jīng)過部分，破壞治療以及導(dǎo)致局部缺血，有時(shí)危及生命。血液透析的第二個(gè)問題是鄰近靜脈的炎癥和/或纖維變性，它將透析的血液返回至病人主循環(huán)中。鄰近靜脈的纖維變性通常以對(duì)透析血液的返回的耐受性和壓力的增加來檢測。第三個(gè)問題是血管經(jīng)過部位的纖維變性以及關(guān)閉或瘺管。第四個(gè)問題是加快的動(dòng)脈硬化，第五個(gè)問題是剩余腎功能的喪失，這主要是由于Fn的沉積。
在此過程中內(nèi)源性UG被透析掉的可能性提供了對(duì)這些問題的一個(gè)解釋。選擇性地除去內(nèi)源UG使得循環(huán)的Fn不聚集形成激發(fā)它們通過相互粘附或粘附于血管腔中形成血塊反應(yīng)的血塊形成病灶或沉積在紅細(xì)胞中。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGs)為負(fù)責(zé)建造在基膜、皮膚和血塊中發(fā)現(xiàn)的大分子網(wǎng)格的酶。在不存在競爭作為活化的TGs的底物的游離UG時(shí)，F(xiàn)n和其它血塊成分發(fā)生交聯(lián)。
鄰近靜脈和血管到達(dá)部位的炎癥和纖維變性以及加速的動(dòng)脈粥樣硬化可通過Fn在血管腔的沉積來解釋。纖連蛋白在血管內(nèi)皮的沉積促進(jìn)血小板和白細(xì)胞的粘附，在不存在PLA2抑制時(shí)它們可被加速。Fn的血管沉積還可促進(jìn)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)的脂肪、膽固醇和蛋白的局部沉積。纖連蛋白已知為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊以及與腎病和初級(jí)和剩余腎功能喪失相關(guān)的腎小球沉積的主要成分。因此，通過減少炎癥和纖連蛋白的沉積，UG的給藥可減少或消除這些問題。
給藥UG的優(yōu)選途徑為在透析前、期間和之后靜脈灌注。
另一種方法，內(nèi)源性UG的喪失可通過向透析緩沖液中加入U(xiǎn)G或用UG預(yù)覆蓋透析膜或這兩種方法來預(yù)防。
器官移植術(shù)語“器官”指例如實(shí)體器官，如腎、肝臟和心臟以及骨髓、角膜和皮膚。
有兩種類型的器官移植排斥急性的和慢性的。急性排斥為涉及PLA2活性和被通常損傷移植物的炎癥細(xì)胞浸潤的炎癥過程。
慢性排斥涉及Fn介導(dǎo)的移植物的纖維變性，包括局限于移植物的動(dòng)脈粥樣硬化。因此，給藥UG可用來治療或預(yù)防急性和慢性移植排斥。
優(yōu)選的給藥途徑為通過注射。
器官移植的另一個(gè)方面為在從供體移出之前、移植期間和在受體中時(shí)的器官的缺血，這導(dǎo)致急性排斥。已知缺血導(dǎo)致升高的PLA2活性和組織壞死。因此，UG可用來預(yù)防此缺血。UG的優(yōu)選形式為灌注液體或儲(chǔ)存緩沖液，其中來自體內(nèi)的器官保存在此。
I型糖尿病的預(yù)防I型糖尿病來自通過自身免疫反應(yīng)對(duì)胰腺組織的損傷。胰腺通常分泌可溶性的PLA2和hUG至血液循環(huán)中。在本發(fā)明的子宮珠蛋白剔除(KO)小鼠(本文稱為“UG KO小鼠”)的胰腺中報(bào)道了壞死性損傷。
在不存在子宮珠蛋白時(shí)，UG KO小鼠顯示可引發(fā)自身免疫反應(yīng)的類似的胰腺組織損傷。因此，UG可用來預(yù)防或終止I型糖尿病的緩慢進(jìn)程。優(yōu)選的給藥途徑為通過注射。
腎病的預(yù)防和治療UG KO小鼠中的腎Fn沉積和纖維變性類似于人腎病中Fn的沉積和纖維變性。因此，UG的給藥可預(yù)防或減緩處于如II型糖尿病危險(xiǎn)中的病人的腎病發(fā)展進(jìn)程。
預(yù)防和治療眼炎癥眼炎癥，包括眼色素層炎、視網(wǎng)膜炎和術(shù)后炎癥的特征在于增加的PLA2活性。因此，UG可被局部、眼內(nèi)或全身性給藥以減少眼的炎癥。
動(dòng)脈硬化動(dòng)脈硬化為全身性血管纖維化增厚。它通過Fn在脈管系統(tǒng)壁的沉積來啟動(dòng)和/或介導(dǎo)。動(dòng)脈粥樣硬化是除開Fn沉積外還涉及膽固醇沉積的動(dòng)脈硬化的一種形式。因此，UG可被給藥以預(yù)防或減少動(dòng)脈硬化。
急性腎衰竭急性腎衰竭(ARF)通常是遠(yuǎn)器官炎癥、感染或直接損傷的結(jié)果，它導(dǎo)致可溶性PLA2在血液循環(huán)中的釋放和活化。ARF期間對(duì)腎的損傷可相當(dāng)嚴(yán)重，具有由炎癥促進(jìn)的急性組織損傷并可溶至腎的纖維變性中，從長期來看導(dǎo)致降低的腎功能。如UG KO小鼠所示，UG的抗炎癥和抗纖維化的特性在腎中尤其相關(guān)。
優(yōu)選的給藥途徑為通過注射或全身性給藥。
總之，下面非限制性的疾病表與PLA2和/或纖連蛋白沉積的抑制相關(guān)，每一種為通過本發(fā)明方法治療或預(yù)防的疾病的代表關(guān)節(jié)/骨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；自身免疫 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、I型糖尿病、眼色素層炎、牛皮癬、全身性紅斑狼瘡(SLE)和節(jié)段性回腸炎；胰腺； 胰腺炎；腹膜； 腹膜炎、闌尾炎；血管/全身性敗血性休克、膠原血管病、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、過敏性休克、血吸蟲病和損傷性休克；腎 急性腎衰竭、腎細(xì)菌感染、由于腎腫瘤、預(yù)防化療劑或抗體治療導(dǎo)致的纖維變性、預(yù)防糖尿病性腎病、預(yù)防和/或治療特發(fā)性腎病導(dǎo)致的炎癥；肝臟 肝炎、病毒性肝炎和肝硬化；膀胱 膀胱炎、尿道炎癥、輸尿管炎癥和膀胱炎癥，如間質(zhì)膀胱炎；生殖系統(tǒng)/雌性 陰道炎、宮頸炎、骨盆炎癥、卵巢炎癥(輸卵管炎)、子宮內(nèi)膜異位、陰道念珠菌病和輸卵管炎癥或纖維變性；生殖系統(tǒng)/雄性 陰莖炎癥、前列腺炎癥、曲細(xì)精管和精囊炎癥、睪丸炎癥和輸精管腺管、副睪和前列腺炎癥；
眼眼色素層炎、視網(wǎng)膜炎、創(chuàng)傷、由于化學(xué)物質(zhì)或抽煙的損傷、由于CMV視網(wǎng)膜炎的眼炎癥、結(jié)膜炎(細(xì)菌感染)、病毒感染、由于感染劑的眼炎癥、眼手術(shù)后的眼炎癥、包括白內(nèi)障除去、激光手術(shù)、角膜移植、腫瘤切除、由于視網(wǎng)膜色素瘤(腫瘤)的眼炎癥、由于輻射暴露的眼炎癥、由于變態(tài)反應(yīng)的炎癥；心臟 心內(nèi)膜炎；肺支氣管哮喘、ARDS、肺炎、自發(fā)性肺纖維變性、化療(博來霉素、氨甲喋呤)導(dǎo)致的肺纖維變性、暴露于環(huán)境化學(xué)物質(zhì)(石棉、清潔劑、污染物，例如二惡因和尾氣中的PCB)導(dǎo)致的肺纖維變性、吸煙、從淹溺恢復(fù)期間的肺炎癥和新生兒RDS；腸炎性腸疾病、結(jié)腸炎、節(jié)段性回腸炎、直腸炎、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、由于感染劑、輪狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒的炎癥、HIV、胃潰瘍、胃食道回流疾病和扁桃體炎；痔；移植 任何器官或組織的移植手術(shù)后給藥以控制炎癥或纖維變性和排斥；耳中耳炎；和皮膚 牛皮癬、蕁麻疹、變態(tài)反應(yīng)性皮炎、硬皮病、接觸性皮炎、化學(xué)性皮炎(由于毒性常青藤和橡樹，及暴露于化學(xué)物質(zhì)，如PCB、氯、氨、清潔劑、毒性劑)。
而且，UG可單獨(dú)給藥或與常用于治療或預(yù)防上述疾病的其它活性劑或組合物混合給藥。這些活性劑或組合物包括，但不局限于類固醇、非類固醇抗炎劑(NSAIDs)、化療劑、止痛劑、免疫治療劑、抗病毒劑、抗真菌劑、疫苗、免疫抑制劑、造血生長因子、激素、細(xì)胞因子、抗體、抗血栓形成劑、心血管藥物或生育藥物。而且還包括口服耐受性藥物、維生素和礦物質(zhì)。
而且，UG可作為用于在注射部位抑制炎癥或給藥其它治療劑或預(yù)防劑以抑制炎癥或由這些物質(zhì)導(dǎo)致的免疫反應(yīng)的載體來給藥。在此方面，UG使得能對(duì)靶適應(yīng)證給藥有效量的活性劑。
UG還可以化妝品組合物的形式給藥用于限制由傷口愈合或在皮膚炎癥反應(yīng)期間導(dǎo)致的纖維變性、疤痕、瘢痕形成。
而且，UG可用作血液補(bǔ)充物，即作為合成或捐獻(xiàn)的人血的添加物。
最后，UG可用來通過加入至精子、體外受精卵和在轉(zhuǎn)移至人和其它哺乳動(dòng)物的母體子宮之前的胚胎中來提高人工受精的比率。
本發(fā)明涉及UG在預(yù)防或治療PLA2和纖連蛋白相關(guān)的疾病中的用途。在預(yù)防疾病方面，“預(yù)防”指在易感或可能易感人群中預(yù)防疾病發(fā)生，或限制其嚴(yán)重性或發(fā)展，而術(shù)語“治療”指改善疾病或病理學(xué)狀況。
UG可靜脈內(nèi)給藥，或在治療新生兒RDS/BPD和成人RDS的情況下，借助于氣管內(nèi)管以液體或半氣霧劑形式給藥。其它可行的給藥途徑包括局部、眼、經(jīng)皮膚、透皮、肛門、全身性、肌肉內(nèi)、緩釋、口服、陰道、十二指腸內(nèi)、腹膜內(nèi)和結(jié)腸內(nèi)給藥。這些組合物可以藥物學(xué)、營養(yǎng)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的劑量和方法對(duì)需要這種給藥的個(gè)體或病人給藥，給藥時(shí)考慮這些因素，如年齡、性別、體重和特定個(gè)體或病人的情況以及給藥途徑。本發(fā)明的組合物還可以控制釋放的劑型給藥。再次考慮到如年齡、性別、體重以及特定個(gè)體或病人的情況以及給藥途徑，組合物可與其它活性劑同時(shí)給藥或順序給藥。
本發(fā)明的組合物的實(shí)例包括用于口服給藥的可食用的組合物，如固體或液體制劑，例如膠囊劑、片劑、丸劑以及類似的給藥于管口的液體制劑，例如口、鼻、肛門、陰道等，制劑如懸浮劑、糖漿或酏劑；和用于胃腸外、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)(如注射給藥)給藥的制劑，如無菌懸浮劑或乳劑。然而，由于組合物中的活性成分可與蛋白混合，使得當(dāng)其給藥至血流中時(shí)，由于血液蛋白的沉淀，可能形成血塊；本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)考慮這種情況。
在這些組合物中，UG可與適宜載體、稀釋劑或賦形劑混合，如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、DMSO、乙醇等。UG可以用于再配制在等滲水溶液、鹽水、葡萄糖或DMSO緩沖液中的冷凍干燥的形式提供。在一些鹽溶液中，觀察到一些rhUG沉淀；這種現(xiàn)象可用作一種分離本發(fā)明化合物的方法，例如通過“鹽析”法。
進(jìn)一步，本發(fā)明還設(shè)想提供UG的試劑盒。該試劑盒還包括一個(gè)包含適宜載體、稀釋劑或賦形劑的單獨(dú)的容器。試劑盒可包括用于同時(shí)或順序給藥的降低或減輕上述疾病的致病作用的其它試劑。其它試劑可以單獨(dú)的容器或與UG混合的形式提供。另外，試劑盒可包括關(guān)于混合或混合成分和/或給藥的說明書。
本發(fā)明還設(shè)想一種治療或預(yù)防特征在于內(nèi)源功能性UG缺乏的炎癥或纖維變性疾病的方法，它包括對(duì)需要這種治療的病人給藥補(bǔ)償量的UG。術(shù)語“補(bǔ)償量”指使總UG(內(nèi)源功能性UG和外源UG)的局部肺或全身性濃度至其正常的范圍內(nèi)所需的UG的量。更具體地說，內(nèi)源UG的局部肺濃度的正常范圍為約＞50毫克UG/微克血清白蛋白或＞50毫克/升。血清UG濃度的正常范圍為＞50毫克/升。
本發(fā)明的組合物包含獲得預(yù)期目的有效量的天然和/或重組hUG，即提高的UG血漿或組織水平以產(chǎn)生選擇性抑制PLA2和降低的炎癥和/或纖連蛋白的結(jié)合以減輕其在纖維變性疾病中聚集和/或沉積的所需效果。組合物包含與藥物可接受的載體或稀釋劑混合的有效量的基本上純化的天然和/或重組人UG。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明的組合物包含與藥物可接受的載體或稀釋劑混合的有效量的天然和/或重組hUG和肺表面活性劑。對(duì)肺局部氣管內(nèi)給藥足以抑制PLA2活性和/或纖連蛋白沉積的UG需要在單劑或復(fù)劑中范圍為0.2μg/kg至500mg/kg基本純化量的UG蛋白。UG通常以單劑為20ng/kg至500mg/kg的量一次或多次給藥，或連續(xù)灌注高達(dá)10g。
天然和/或重組hUG還可借助于氣管內(nèi)途徑與人工肺表面活性劑，如Survanta結(jié)合給藥。UG與Survanta(5mls/kg)共同給藥，UG不結(jié)合表面活性劑，阻止它發(fā)揮治療功效。肺表面活性劑通常在組合物中以約10-90％(重量計(jì))存在，較通常為約20-80％(重量計(jì))。由于其極低的表面張力，表面活性劑攜帶有UG擴(kuò)展在肺的內(nèi)表面。借助于靜脈內(nèi)注射全身性給藥足以抑制PLA2活性和/或纖連蛋白沉積的UG在延長的時(shí)間內(nèi)(天)需要范圍為0.5μg至連續(xù)灌注數(shù)克蛋白的基本上純的天然和/或重組hUG的量。
用于注射和半氣霧劑氣管內(nèi)送遞的適宜的制劑包括任選具有粘度調(diào)節(jié)劑和穩(wěn)定劑的天然和/或重組hUG的水溶液。
如本文所采用的術(shù)語“PLA2抑制有效量”指抑制PLA2活性和降低或減輕病人組織或身體炎癥的UG的量。術(shù)語“纖連蛋白結(jié)合有效量”指結(jié)合纖連蛋白以降低其聚集和/或沉積，并防止或降低原纖維形成或纖維變性的UG的量。如本文所使用的術(shù)語“抗炎量”指降低或減輕組織或身體炎癥的量。通常，給藥至成人用于治療炎癥和纖維變性疾病的UG的量為單劑0.2μg/kg至500mg/kg或在延長的時(shí)間內(nèi)給藥的高達(dá)數(shù)克。對(duì)于新生兒，在治療新生兒RDS中，范圍通常為單劑為50ng/kg至100mg/kg或在延長的時(shí)間內(nèi)連續(xù)給藥高達(dá)10g。連續(xù)灌注的有效安全速率為50ng/kg/小時(shí)至500mg/kg/小時(shí)。
實(shí)施例現(xiàn)將進(jìn)一步參考下面非限制性的實(shí)施例來說明本發(fā)明。除非另有說明，份和百分?jǐn)?shù)以重量計(jì)。
實(shí)施例1體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過Mantile等的方法(1993)獲得重組人UG。
在妊娠142天通過剖腹產(chǎn)產(chǎn)下體重各為約400g的一只雄性和雌性P.cyanocephalus品種。這是建立的RDS模型(Coalson，J.J.等，BPD的狒狒模型II病理學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)分子病理學(xué)37355-350(1982))。
分娩后，將幼仔用酮胺(10mg/kg)麻醉并用2.5mm直徑的氣管內(nèi)管插管。借助于通過經(jīng)皮膚注射入橈動(dòng)脈放置的動(dòng)脈線監(jiān)測血?dú)夂蛪毫?。將一深的靜脈線經(jīng)皮膚放置入隱靜脈內(nèi)，通過它給藥液體、抗生素和藥物。將動(dòng)物放在飼服控制的紅外溫室中并用帶有加濕器的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)時(shí)間、壓力調(diào)節(jié)的通風(fēng)器進(jìn)行通風(fēng)，保持在36-37℃。最初設(shè)置為適宜胸運(yùn)動(dòng)所需的FiO21.0，速率為40/分鐘，I/E比例1∶1.5，4cmH2O正向末端呼氣壓力(PHEP)和峰吸氣壓力(PIP)。FiO2保持在1.0，調(diào)節(jié)PIP以保持PaCO2為40±10托。每小時(shí)監(jiān)測血?dú)狻⒀?xì)胞比容、電解質(zhì)、凝血酶原時(shí)間、部分促凝血酶原激酶時(shí)間和血糖試條。抽取用于研究的血液容量性地被加入肝素的成年狒狒血液代替。通過電解質(zhì)以10cc/kg/小時(shí)給藥靜脈內(nèi)液體，并當(dāng)心率超過180次/分鐘時(shí)如所需地增加。當(dāng)堿不足超過-10時(shí)加入碳酸氫鈉(2meq/kg)。實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)給藥氨芐青霉素(50mg/kg/天，以兩次分開的劑量)和慶大霉素(5mg/kg/天，以兩次分開的劑量)。
一只動(dòng)物接受表面活性劑加上PBS(處理號(hào)1)，第二只動(dòng)物(處理號(hào)2)接受表面活性劑加上兩倍劑量的1mg/kg rhUG。經(jīng)氣管內(nèi)管直接將表面活性劑和rhUG對(duì)肺給藥。使用的表面活性劑為Survanta(RossLabs)，表面活性劑制劑來自牛肺組織，除開磷脂還包含表面活性劑脫輔基蛋白B和C。第一次劑量的rhUG與表面活性劑一起給藥，第二次在第一次之后4小時(shí)給藥。監(jiān)測動(dòng)物的動(dòng)脈血?dú)狻㈦娊赓|(zhì)和EKG。在開始表面活性劑治療后50小時(shí)殺死它們。在24和48小時(shí)的時(shí)候，用包含蛋白酶抑制劑(PMSF，10μg/ml亮抑蛋白酶肽，10μg/ml胃蛋白酶抑制劑和桿菌肽)的PBS灌洗肺。將其冷凍于-80℃下直至分析PLA2活性。通過Bradford方法(Biorad)測定總蛋白。根據(jù)Levin等的方法(1986；見上文)測定肺洗出物中的PLA2活性并示于下表。
表3體內(nèi)UG的檢測結(jié)果處理#時(shí)間 肺洗出物PLA2活性(ccpm/10μg蛋白)124小時(shí)303048小時(shí)2607224小時(shí)173948小時(shí)996上面給出的數(shù)據(jù)為兩次測定的平均值。結(jié)果表明氣管內(nèi)給藥rhUG在體內(nèi)抑制PLA2。接受了表面活性劑和rhUG的動(dòng)物與接受了表面活性劑而沒有r hUG的動(dòng)物相比在其肺洗出物液體中具有顯著較低的PLA2活性。數(shù)據(jù)證實(shí)與表面活性劑結(jié)合給藥rhUG在保護(hù)表面活性劑磷脂中有益。
實(shí)施例2在體外可溶性PLA2對(duì)人工表面活性劑水解的抑制在體外rhUG抑制可溶性PLA2對(duì)人工表面活性劑的水解。Survanta為來自牛肺的人工表面活性劑并被用來治療患有RDS的早產(chǎn)新生兒和患有RDS的成人(ARDS)。組I可溶性PLA2，即豬胰腺PLA2(BoehringerMannheim)對(duì)Survanta的水解特征在于其作為底物與熒光磷脂酰膽堿底物(Cayman Chemicals)競爭，產(chǎn)生花生四烯酸產(chǎn)物的能力。
Survanta是組I可溶性PLA2體外降解的底物。在體外Survanta迅速地被在人肺的細(xì)胞外液體中發(fā)現(xiàn)的PLA2降解。在體外RhUG抑制Survanta的降解。
實(shí)施例3UG剔除小鼠的構(gòu)建制備轉(zhuǎn)基因UG KO小鼠，目的在于用于確定子宮珠蛋白在哺乳動(dòng)物生理學(xué)中的作用以及產(chǎn)生在嚴(yán)重炎性臨床疾病中UG作為治療劑的模型。第一步是構(gòu)建適宜的DNA載體，通過它來靶定和打斷內(nèi)源小鼠子宮珠蛋白基因。將包含來自129/SVJ小鼠品系的外顯子3和子宮珠蛋白基因的旁側(cè)序列(Ray，1993)的3.2kb BamHI-EcoRI DNA片段亞克隆至如Lei等(1996)描述的pPNW載體的相應(yīng)位置。通過PCR(引物Primer-L(來自內(nèi)顯子1)5’-TTCCAAGGCAGAACATTTGAGAC-3’；Primer-R(來自外顯子2)5’-TCTGAGCCAGGGTTGAAAGGC-3’)擴(kuò)增包含部分外顯子2和其上游序列的0.9kb片段，NotI和XhoI限制性位點(diǎn)被遺傳改造至末端用于定向亞克隆至基因靶定載體。在該構(gòu)建物中，編碼27個(gè)氨基酸的79bp的外顯子2缺失。將PCR片段放置于pPNW中編碼新霉素抗性基因的上游，產(chǎn)生基因靶定載體pPNWUG。載體示于圖2A中，其中PGK-neo盒打斷子宮珠蛋白基因，破壞蛋白質(zhì)編碼序列。
根據(jù)Nagy，A.等，PNAS 908424(1993)用NotI線性化pPNWUG基因靶定載體并電穿孔至ES R1細(xì)胞中。電穿孔細(xì)胞的9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤和G-418選擇產(chǎn)生156個(gè)克隆，DNA印跡分析證實(shí)野生型子宮珠蛋白等位基因的5.1kb HindIII片段和來自156個(gè)克隆中的3個(gè)的同源重組的另外8.2kb HindIII片段，其示于圖2B中。根據(jù)Capecchi，科學(xué)2441288(1989)，將這些ES R1克隆注射至C57BL/6胚泡中。生成兩種不同的傳于不同嵌合起始物的小鼠品系。讓攜帶靶定子宮珠蛋白基因座的雜合后代(UG+/-)交配，通過圖2C所示的PCR以及圖2D所示的DNA印跡分析后代的基因型。
實(shí)施例4UG基因剔除和小鼠UG(mUG)蛋白不存在的證實(shí)為了證實(shí)純合剔除小鼠(UG-/-)不具有任何可檢測的mUG，檢測子宮珠蛋白基因靶定小鼠在一些器官，包括肺中的UG-mRNA和mUG蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)方法通過規(guī)定的動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。從UG+/+、UG+/-和UG-/-小鼠的不同器官分離全部RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測mUG-mRNA。使用mUG特異性引物，mPr(5’-ATCTTGCTTACACAGAGGACTTG-3’)逆轉(zhuǎn)錄靶分子，使用PCR引物mPr和mPl(5’-ATCGCCATCACAATCACTGT-3’)擴(kuò)增產(chǎn)生的cDNA。將PCR產(chǎn)物與來自UG基因序列外顯子-2的mPp(5’-ATCAGAGTCTGGTTATGTGGCATCC-3’)寡核苷酸探針雜交。用于小鼠GAPDH RT-PCR的引物和探針如下；mGAPDH-r(5’-GGCATCGAAGGTGGAAGAGT-3’)；mGAPDH-1(5’-ATGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3’)；mGAPDH-p(5’-GAAGGTGGTGAAGCAGGCATCTGAGG-3’)。圖2E顯示在UG+/+、UG+/-，但不在UG-/-小鼠肺中檢測到了mUG-mRNA。類似的數(shù)據(jù)(未顯示)表明mUG-mRNA不存在于UG-/-小鼠的前列腺或子宮中，但存在于具有完整子宮珠蛋白基因的小鼠中。
肺中的mUG蛋白的免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析產(chǎn)生示于圖2F的類似確證的結(jié)果。來自UG+/+和UG-/-小鼠的腎、肝臟和肺的的組織裂解物通過在包含2mM苯基甲基磺酰氯和各20μg/mL抑蛋白酶肽、亮抑蛋白酶肽和胃蛋白酶抑制劑A的緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1％Triton X-100，0.2％脫氧膽酸鹽，150mM NaCl，5mM EDTA)中勻漿制備。將勻漿在4℃下以17,500×g離心30分鐘，并如所描述的(E.Harlow和D.Lane，抗體；實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第一版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY，1988)通過將組織裂解物或血漿蛋白(1mg/mL)與兔抗小鼠Fn抗體(1∶100稀釋)一起保溫進(jìn)行免疫沉淀。通過在10％甘油，50mMTris-HCl，pH 7.5，250mM NaCl，4.3mM磷酸鈉存在下，將等摩爾濃度的mFn與rhUG 4℃保溫1小時(shí)，接著加入抗-mFn抗體(1∶100稀釋)，使純小鼠Fn(mFn)與uhUG一起共免疫沉淀(Mantile，G等，生物化學(xué)雜志26720343(1993))。還原條件下，在4-20％或6％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分辨等量的提取組織蛋白(30μg)或免疫沉淀物，接著用抗小鼠Fn(1∶2000稀釋)或UG(1∶2000稀釋)的兔抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。在來自UG-/-小鼠的組織或體液中未檢測到mUG，而來自UG+/+和UG+/-小鼠的組織的確包含mUG蛋白。
最后，對(duì)UG-/-小鼠肺的組織病理學(xué)分析，僅在支氣管上皮細(xì)胞中缺乏mUG特異性免疫染色。將來自UG+/+、UG+/-和UG-/-小鼠的肺組織固定在Bouin氏液或10％中性緩沖的福爾馬林固定液中，包埋在石蠟中，切成4-6微米。將它們用蘇木精和伊紅(H&E)染色。通過Masson氏三色法檢測膠原，PTAH檢測纖維蛋白或Congo紅檢測淀粉狀蛋白將選擇的組織染色。對(duì)于mUG和mFn的免疫組織化學(xué)檢測，使用Vectastain兔Elite ABC試劑盒(Vector實(shí)驗(yàn)室)。通過使用對(duì)應(yīng)于mUG氨基酸序列(Lys28-Thr49，具體為KPFNPGSDLQNAGTQLKRLVDT)的合成肽(Peptide Technologies，Inc.)產(chǎn)生mUG的兔抗體(CytImmune)。以1∶1000的稀釋度使用mFn的兔抗體(GIBCO BRL)，mUG的抗體以1∶500使用。
這三組結(jié)果證實(shí)純合子宮珠蛋白剔除小鼠UG-/-缺乏mUG蛋白或任何可檢測的蛋白成分。
實(shí)施例5子宮珠蛋白剔除小鼠的表型在179只源于UG+/-小鼠雜交的小鼠中，46只(26％)為+/+，90(50％)為+/-和43只(24％)為UG-/-表型，表明打破的mUG基因座以孟德爾方式遺傳，UG+/+、UG+/-和UG-/-小鼠在出生時(shí)存活率相同。然而，GU-/-小鼠顯示新的表型，其中它們發(fā)展成特征在于惡質(zhì)病、嚴(yán)重蛋白尿和與體重大大降低相關(guān)的低血鈣的進(jìn)行性疾病。蛋白尿?yàn)樵谀蛑信判巩惓８咚降陌椎鞍缀推渌宓鞍椎募膊?。它表明腎小球功能異常和腎衰竭。對(duì)受影響動(dòng)物(如上所述對(duì)于肺)的腎的組織病理學(xué)研究揭示了示于圖3的暴發(fā)性腎腎小球疾病。與UG+/+小鼠的腎小球比較，UG-/-小鼠的那些為細(xì)胞過少并具有大量的嗜曙紅的蛋白沉積。UG-/-小鼠中的致命腎病的時(shí)間進(jìn)程為早期發(fā)生(4-5周時(shí)間)或后期發(fā)生(10月時(shí)間)。在開始4周齡表現(xiàn)稍微健康的那些UG-/-小鼠在兩月齡時(shí)具有病灶性的腎小球沉積。在約10個(gè)月時(shí)，這些小鼠具有類似于死于早期發(fā)生疾病的小鼠的嚴(yán)重的惡質(zhì)病。雜合子具有在UG-/-小鼠中觀察到的較輕度形式的腎病?；加型砥诎l(fā)生疾病的小鼠的腎的組織病理學(xué)不僅顯示如早期發(fā)生疾病中的嚴(yán)重的腎小球病，而且具有顯著的腎實(shí)質(zhì)纖維變性和腎小管增生(參見圖3)。雖然在腎中發(fā)現(xiàn)了UG-/-小鼠的顯著的病理學(xué)，但組織病理學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)看來為血管來源的胰腺的偶然的壞死病灶區(qū)。而且，還發(fā)現(xiàn)了表明為編程性細(xì)胞死亡實(shí)體的胸腺和脾結(jié)構(gòu)中的病灶區(qū)。令人感興趣的是，胰腺表達(dá)mUG基因，并且該器官還為I組細(xì)胞外PLA2的豐富來源；由于這為主要的消化酶，因此它的活化可能導(dǎo)致組織損傷。
由于子宮珠蛋白已被報(bào)道具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性，并且由于已知反應(yīng)性淀粉樣變性應(yīng)答于炎癥而發(fā)生，mUG-裸鼠中腎小球的沉積可能是淀粉樣蛋白。反應(yīng)性淀粉樣變性特征在于淀粉狀蛋白和免疫復(fù)合物的沉積。UG-/-小鼠中腎沉積物的同一性通過腎切片的免疫組織化學(xué)來確定。來自UG-/-和UG+/+小鼠的腎切片用剛果紅染色，并在偏振光下觀察。在該實(shí)驗(yàn)中淀粉狀蛋白產(chǎn)生陽性雙折射；然而，UG-/-小鼠的腎小球清楚的為陰性。對(duì)UG-/-小鼠的腎小球中的IgA，IgG或IgM-免疫復(fù)合物存在的免疫熒光研究以及對(duì)主要淀粉狀蛋白的存在的免疫組織化學(xué)分析也為陰性。因此，UG-/-小鼠的腎小球沉積物不包含淀粉狀蛋白和免疫復(fù)合物，因此看來不是炎癥應(yīng)答的結(jié)果。
實(shí)施例6UG-/-腎中的Fn和膠原蛋白的檢測UG-/-小鼠的腎沉積物通過透射電子顯微鏡觀察以說明它們的結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)。將來自患有腎小球損傷的UG-/-小鼠的腎固定在福爾馬林中并包埋在環(huán)氧樹脂中。將薄的切片用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色以用于電子顯微鏡下觀察。以6000X或60,000X進(jìn)行顯微照相。沉積物主要包含兩種類型的纖維性結(jié)構(gòu)；一種類型為相對(duì)不常見的長的具條紋的纖維，另一種更大量的短的分散纖維(圖3E和3F)。由于ECM蛋白，如膠原蛋白和纖連蛋白產(chǎn)生類似的纖維性結(jié)構(gòu)，因此UG-/-小鼠腎小球沉積物可能包含這些蛋白。
接著通過使用抗mFn抗體的免疫熒光分析腎小球沉積物。福爾馬林固定的組織切片被用于使用兔抗-mFn和FITC-綴合山羊抗兔IgG的免疫熒光。類似地，還進(jìn)行使用特異于mFn、膠原蛋白I和III、玻連蛋白、層粘連蛋白和骨橋蛋白的抗體的免疫熒光研究。使用ZeissAxiophot顯微鏡對(duì)落射熒光進(jìn)行照相。野生型小鼠的腎小球中的Fn特異性免疫熒光實(shí)質(zhì)上不可檢測(圖3G)，在UG-/-同窩幼畜的腎小球中密集(圖3H)。當(dāng)使用Masson氏三色染色，UG+/+小鼠的腎小球?yàn)殛幮?圖3I)，UG-/-小鼠(圖3J)的那些為陽性，表明在腎小球沉積物中膠原蛋白的存在。使用膠原蛋白I和膠原蛋白III特異性抗體的免疫熒光證實(shí)了這些結(jié)果。由于已知Fn與其它細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白相互反應(yīng)，我們還通過免疫組織化學(xué)檢測了UG+/+和UG-/-小鼠的腎小球中的層粘連蛋白、玻連蛋白和骨橋蛋白的存在，其結(jié)果為陰性。
實(shí)施例7UG-/-小鼠的腎不超量產(chǎn)生Fn為了確定是否Fn過量的產(chǎn)生可能導(dǎo)致其在腎小球中的沉積，我們通過RT-PCR和光密度法評(píng)價(jià)了UG-/-和UG+/+小鼠的腎、肺和肝臟中的Fn-mRNA的相對(duì)量。結(jié)果表明Fn-mRNA的相對(duì)量在UG+/+和UG-/-動(dòng)物中本質(zhì)上相同。因此，F(xiàn)n-mRNA的超量產(chǎn)生可能不是UG-/-小鼠腎小球中Fn沉積的原因。接著我們通過還原條件下的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡比較了UG-/-和UG+/+小鼠的血漿，腎和肝臟中的Fn-蛋白。在野生型小鼠的血漿、腎和肝臟中僅可檢測到220kD Fn種類；然而，UG-/-小鼠的血漿和肝臟裂解物中具有220kD Fn帶，腎裂解物包含另一種獨(dú)特的共價(jià)交聯(lián)的多聚Fn帶(圖4A)。
實(shí)施例8UG-/-小鼠中的提高的血清PLA2活性基于目前的概念，至少在細(xì)胞表面的Fn基質(zhì)裝配和原纖維形成中關(guān)鍵的起始步驟被認(rèn)為包括整聯(lián)蛋白活化和Fn自身聚集。由于UG是炎癥途徑中的關(guān)鍵酶一可溶性磷脂酶A2(sPLA2)的強(qiáng)抑制劑，UG-/-小鼠中mUG的缺乏可能導(dǎo)致發(fā)生為炎性腎病的腎小球性腎炎。因此，我們檢測了年齡、性別和體重匹配的UG+/+(n＝3)和UG-/-小鼠(n＝3)的血清中的PLA2活性。殺死動(dòng)物并根據(jù)制造商的說明，使用PLA2-分析試劑盒(Caymen Chemical)三次重復(fù)測定各樣品的血清PLA2活性。通過Bradford分析(Bio Rad)確定血清中的蛋白濃度并計(jì)算PLA2的比活。UG-/-小鼠的血清PLA2的比活(umol/分鐘/mg蛋白)[36+3.3(SEM)]明顯高于(p＜0.05)UG+/+小鼠[18+2.8(SEM)]。這些結(jié)果提出這種可能性，即在UG-/-小鼠中，較高的PLA2活性可能導(dǎo)致增加的溶血磷脂酸(LPA)的產(chǎn)生，結(jié)果促進(jìn)整聯(lián)蛋白的活化和Fn自身聚集。
實(shí)施例9體外子宮珠蛋白與纖連蛋白的相互作用為了進(jìn)一步理解子宮珠蛋白可能如何防止Fn自身聚集，在體外測定rhUG破壞mFn-Fn相互作用的能力。將等摩爾濃度的rhUG和mFn一起保溫以使得所有蛋白結(jié)合或其它相互作用，接著用抗Fn抗體免疫沉淀，并通過在還原條件下的SDS-PAGE分辨免疫沉淀。如前所述，通過使用mFn或mUG抗體的蛋白質(zhì)印跡分別檢測各種蛋白。結(jié)果表明纖連蛋白與rhUG共免疫沉淀(圖4B)。為了證實(shí)這些結(jié)果，將125I-rhUG與mFn一起保溫，并在非變性和非還原條件下，使用6％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳來分辨復(fù)合物(圖4C)。放射自顯影中對(duì)Fn-UG異聚體的檢測(泳道2)表明在體外可溶性Fn與UG相互作用。為了確定在體內(nèi)是否發(fā)生Fn-UG異聚作用，將UG+/+和UG-/-小鼠的血漿與不與rhUG交叉反應(yīng)的抗mFn抗體進(jìn)行免疫沉淀(圖4D)。抗mFn抗體與來自UG+/+，但不與來自UG-/-小鼠的血漿的mFn和rhUG共沉淀，這表明Fn-UG異聚體存在于UG+/+小鼠的血漿中。因此，F(xiàn)n-UG復(fù)合物并不單純是在體外形成的假象，且天然產(chǎn)生于血清中。
為了確定UG對(duì)Fn結(jié)合的特異性和親和性，我們?cè)诖嬖诤筒淮嬖赨G下將125I-Fn與未標(biāo)記的Fn一起保溫。所有復(fù)合物與二琥珀酰亞胺基底物(DSS)親和交聯(lián)。使用覆蓋有人Fn(hFn)(CollaborativeBiomedical Products)的24孔平板，在不存在和存在UG或Fn(10-12-10-6M)下，將3ul125I-Fn(Sp.Act.6mCi/mgICN Biomedicals)在500ul HBSS中室溫下保溫2小時(shí)。SDS-PAGE以及使用UG抗體對(duì)所有Fn的蛋白質(zhì)印跡未檢測到任何UG污染。將放射標(biāo)記的復(fù)合物用PBS洗滌兩次，溶解在1N NaOH中，用IN HCl中和，通過γ計(jì)數(shù)器測定放射活性。在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，在不存在或存在增加濃度的還原rhUG(5-500μg)下，將125I-hFn(3ul)與20ul(1mg/ml)小鼠Fn的40ulHBSS，pH7.6一起室溫下保溫2小時(shí)。室溫下將樣品與0.20mM DSS交聯(lián)20分鐘，在SDS-樣品緩沖液中煮沸5分鐘，4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并放射自顯影。在不存在UG下，125I-Fn與未標(biāo)記的Fn形成高分子量的放射活性復(fù)合物，但在存在UG時(shí)，F(xiàn)n-Fn聚集物的形成被以依賴于UG濃度的方式抑制(圖4E)。
為了確定在Fn對(duì)UG的結(jié)合親和性與Fn對(duì)其本身的結(jié)合親和性之間是否存在任何差異，進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，其中將125I-Fn與未標(biāo)記Fn一起保溫，并與變化濃度的UG一起固定在多孔平板中。在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，還使用各種濃度的未標(biāo)記的可溶性Fn進(jìn)行了對(duì)125I-Fn與未標(biāo)記固定的Fn的結(jié)合研究。來自兩種類型的結(jié)合實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的Scatchard分析產(chǎn)生具有UG對(duì)Fn的結(jié)合的解離常數(shù)(kds)為13nM，F(xiàn)n對(duì)其本身的結(jié)合的解離常數(shù)為176nM的直線。這些結(jié)果表明由于UG對(duì)Fn的相對(duì)較高的結(jié)合活性，UG有效地對(duì)抗Fn自身聚集。如上面對(duì)Fn所描述的，還在不存在或存在UG下，進(jìn)行了將放射碘標(biāo)記(125I)-膠原蛋白I與未標(biāo)記的Fn一起保溫的親和交聯(lián)實(shí)驗(yàn)。在存在或不存在還原UG(250μg)下，將15ul變性或未變性125I-膠原蛋白I(Sp.Act.65.4mCi/mg)與Fn一起保溫，親和交聯(lián)，電泳并放射自顯影。結(jié)果表明UG對(duì)抗高分子量125I-膠原蛋白-Fn聚集物的形成(圖4F)。
實(shí)施例10rhUG對(duì)腎小球hFn沉積的體內(nèi)抑制為了檢測rhUG是否保護(hù)腎小球免于Fn聚集，對(duì)UG+/+和外表健康的UG-/-同窩仔靜脈內(nèi)單獨(dú)給藥可溶性人Fn(nFn)或與等摩爾濃度的rhUG混合的hFn。
將人Fn(500μg/150ul PBS)給藥至兩月齡，大約22g的UG+/+和外表健康的UG-/-小鼠的尾靜脈中。類似地，對(duì)照鼠被注射500μg與等摩爾濃度的rhUG或白蛋白的150ul PBS混合物。末次注射24小時(shí)后，將小鼠殺死，并將各器官固定在緩沖的福爾馬林中。通過使用單特異性的抗-hFn抗體(GIBCO BRL；克隆1)和FITC綴合兔抗小鼠IgG(Cappel)的免疫熒光觀察腎和其它器官的組織切片。在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，將UG+/+小鼠每天注射僅1mg hFn的150ul PBS達(dá)連續(xù)3天。
注射人Fn的合理性能分辨內(nèi)源小鼠Fn與給藥的hFn。已描述了靜脈內(nèi)給藥的方法和各組織中的hFn的免疫組織化學(xué)檢測。
注射了hFn和rhFn(1∶1摩爾比例)的混合物或僅hFn的野生型UG+/+小鼠的腎小球中的人Fn的免疫熒光類似(圖5A和5B)。然而，注射了hFn和UG混合物的UG-/-小鼠在腎小球中顯示極少的hFn特異性免疫熒光(圖5C)，而僅注射了Fn的那些顯示較高強(qiáng)度的免疫熒光(圖5D)。作為對(duì)照，給藥hFn和BSA的混合物不產(chǎn)生保護(hù)作用。
為了確定這種UG保護(hù)作用是否可通過在UG+/+小鼠中注射較大量的Fn來克服，我們每只動(dòng)物每天注射1mg hFn達(dá)連續(xù)3天。雖然以較低的劑量(500μg/動(dòng)物)對(duì)UG+/+小鼠靜脈內(nèi)給藥在導(dǎo)致任何明顯的腎小球沉積中不起作用(圖5A)，但給藥較高劑量(3mg/動(dòng)物)導(dǎo)致顯著的積累。因此，UG防止腎小球Fn沉積，與UG-/-小鼠相反，由于內(nèi)源UG的存在，UG+/+對(duì)于可溶性Fn的積累具有較高的閾值。
實(shí)施例11組織培養(yǎng)細(xì)胞中rhUG對(duì)纖維形成和Fn基質(zhì)聚集的抑制為了確定在通常的體外組織培養(yǎng)物分析中UG是否阻止Fn纖維形成和基質(zhì)聚集，在僅包含可溶性hFn或等摩爾濃度的hFn和rhUG的混合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。如上測定培養(yǎng)細(xì)胞(CRL6336，ATCC)中的Fn基質(zhì)的聚集和纖維形成。與接受hFn和rhUG的混合物的那些比較(圖5F)，在僅用hFn處理的培養(yǎng)物的細(xì)胞中觀察到的纖維形成水平更高(圖5E)。
實(shí)施例12臨床樣品中的UG-Fn復(fù)合物的檢測對(duì)體液的臨床樣品，如血清、BAL體液和痰中的UG-Fn復(fù)合物的檢測在確定該復(fù)合物在人疾病中的作用非常重要。開發(fā)了用于檢測UG-Fn復(fù)合物的液相診斷分析法，該分析方式示于圖6。與固體載體共價(jià)連接的捕獲抗體為針對(duì)人蛋白產(chǎn)生的單特異性的兔多克隆抗體。固體載體可為珠，如磁性珠，管和ELISA平板。固體載體在各結(jié)合反應(yīng)后提供進(jìn)行洗滌步驟的靈活性以獲得對(duì)于各種樣品類型的更一致的結(jié)果。檢測抗體為Fn特異性的，并可從許多商業(yè)來源獲得。與酶，如辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的抗-IgG抗體接著被用來檢測在標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)中分子鏈末端的抗-Fn IgG，其中酶底物被轉(zhuǎn)化為用分光光度計(jì)和熒光光度計(jì)(Amersham)定量的顯色或熒光化合物。該分析法的檢測限制值為500μgUG-Fn復(fù)合物/ml樣品液體。
實(shí)施例13子宮珠蛋白缺陷暫時(shí)但為急性hUG缺乏是由已知為臨床透析，包括血液透析、腹膜透析和連續(xù)透析(CRRT)的血液清洗技術(shù)產(chǎn)生的。所有形式的臨床透析包括使用半透膜從血液中過濾有毒的身體廢產(chǎn)物，包括化學(xué)代謝物，如尿和小的蛋白，如β2-微球蛋白。
從其在SDS-PAGE中的特殊的遷移已知UG是一種極緊密的蛋白，其中特殊的遷移對(duì)應(yīng)于約10-13kDa的分子量，盡管其真正的分子量為15.7kDa。因此，UG二聚體被預(yù)期在透析實(shí)驗(yàn)中以10-13kDa起作用。令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)二聚體是如此致密以致通過8.0kDa MWCO透析膜。UG還通過14.0kDa MWCO透析膜。
如果不相同，用于這些實(shí)例中的透析膜的組成與生產(chǎn)和用于臨床透析的大多數(shù)膜的組成類似。它們由再生纖維素或乙酸纖維素組成。
對(duì)于本實(shí)驗(yàn)，將不含緩沖添加物的兩份部分純化(一個(gè)純度大于90％，一個(gè)約70％純度)的r hUG細(xì)胞裂解物的1.0ml等份試樣對(duì)1000ml未緩沖的50mM乙酸銨透析，使用三種大小的透析管3.5kDa，8.0kDa和14.0kDa(Spectra/Pro；Thomas Scientific)。在48小時(shí)期間對(duì)各樣品四次更換緩沖液，均在室溫下(約25-27℃)進(jìn)行。各透析樣品的外觀從清亮的黃色變?yōu)榍辶恋臒o色液體。在過程的開始和結(jié)束，通過簡短地對(duì)管道(擠壓系統(tǒng))加壓并觀察任何滲漏來檢查其中不存在滲漏的透析管道系統(tǒng)。管道系統(tǒng)在各末端是雙固定的以進(jìn)一步確保滲漏。
圖7顯示這些SDS-PAGE分析結(jié)果。90％純度的預(yù)透析的樣品示于泳道7和8，緊接泳道1，2和3中的三個(gè)透析后樣品。UG二聚體不再存在于代表用8.0kDa MWCO膜透析的樣品的泳道中。這些結(jié)果后來用不同批次的部分純化的UG制備物得以證實(shí)。
雖然本發(fā)明結(jié)合目前被認(rèn)為是最可行和優(yōu)選的具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)理解本發(fā)明不局限于所公開的具體實(shí)施方案，相反，覆蓋各種包括在所附權(quán)利要求的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)的各種修改和等同的方法。
參考文獻(xiàn)1.Levin，S.W.et al.，生命科學(xué).381813-1819(1986)；2.Singh G.et al.，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展1039348-355(1990)；3.Mantile，G.et al.，生物化學(xué)雜志26820343-20351(1993)；4.Singh，G.et al.，J.組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志.3673-80(1987)；5.Bernard，A.et al.，臨床化學(xué).38434-435(1992)；6.Dhanireddy，R.et al.，兒科研究.23463A(1988)；7.Dhanireddy，R.et al.，兒科研究.33323A(1993)；8.Piomelli，D.，Op.細(xì)胞生物學(xué).5274-280(1993)；9.Krishnan，R.S.et al.，科學(xué)158490-492(1967)；10.Beier，H.Verhandl Deut.Zool.Ges.Heidelberg(1968)；11.Umland，T.C.et al.，天然結(jié)構(gòu)與生物學(xué).1538-545(1994)；12.Hard，T.et al.，天然結(jié)構(gòu)與生物學(xué).2938-989(1995)；13.Umland，T.C.et al.，天然結(jié)構(gòu)與生物學(xué).2919-922(1995)；14.Stripp，B.R.et al.，Am.T.Physio.271(肺細(xì)胞分子生理學(xué).15)L656-L664(1996)；15.Lesur，O.et al.，Am.T.Respir.急救醫(yī)學(xué).152290-297(1995)；16.Glaser，K.B.，藥理學(xué).3231-66(1995)；17.Tykka，H.T.et al.，Scand.J.斯堪的納維亞腸胃病學(xué)雜志.205-12(1985)；18.Sheuer，W.，Klin.Wochenschr.67153-159(1989)；19.Barnes，H.J.et al.，分子生物雜志.，2月.23，1996；20.Aoki，A.et al.，Mol.Hum.生殖.2419-497(1996)；21.Anderson和Kurkland，微生物學(xué)綜述54198-210(1990)；
22.Miele，L.et al.，生物化學(xué)雜志.2656427-6435(1990)；23.Coalson，J.J.et al.，實(shí)驗(yàn)分子病理學(xué).37355-360(1982)；24.Nagy，A.et al.，美國科學(xué)院院報(bào).908424(1993)；25.Capecchi，M.R.，科學(xué)，2441288(1989)；26.Harlow，E.和Lane D.抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第一版.冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，NY，1988；27.Mantile，G.et al.，生物化學(xué)雜志.26720343(1993)；28.Ruoslahti，E.生物化學(xué)年鑒.57375(1988)；29.R.O.Hynes，F(xiàn)ibronectins，New YorkSpringer-Verlag(1990)；30.Chernousor，M.A.et al.，生物化學(xué)雜志.26610857(1991)；31.Zhang，Q.et al.，細(xì)胞生物學(xué)雜志.1271447(1994)；32.Wu，C.et al.細(xì)胞83715(1995)；33.Zhang，Q.et al.，生物化學(xué)雜志.27133284(1996)；34.Border，W.A.et al.，臨床研究雜志.901(1992)；35.Peri，A.，et al.，臨床研究雜志.922099(1995)；36.Peri，A.et al.，臨床研究雜志.96343(1995)；37.Oh，E.et al.，美國國家科學(xué)院院報(bào).(USA)783218(1981)；38.Mosher，D.F.et al.，現(xiàn)代生物學(xué).4810(1992).
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，包含PLA2抑制有效量的重組人子宮珠蛋白(rhUG)或其片段或衍生物和藥物可接受的載體或稀釋劑。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，進(jìn)一步包含肺表面活性劑。
3.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述rhUG具有約75％至約100％的純度。
4.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述rhUG具有約90％至約100％的純度。
5.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述rhUG具有至少95％的純度。
6.一種藥物組合物，包含纖連蛋白結(jié)合有效量的重組人子宮珠蛋白(rhUG)或其片段或衍生物和藥物可接受的載體或稀釋劑。
7.權(quán)利要求6的藥物組合物，進(jìn)一步包含肺表面活性劑。
8.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述rhUG具有約75％或至100％的純度。
9.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述rhUG具有約90％或至100％的純度。
10.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述rhUG具有至少95％的純度。
11.一種藥物組合物，包含與治療靶適應(yīng)證的活性劑混合的PLA2抑制或纖連蛋白結(jié)合有效量的UG。
12.權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述PLA2抑制或纖連蛋白結(jié)合有效量的rhUG減少炎癥，從而確保有效量的所述活性劑到達(dá)治療位點(diǎn)。
13.一種用于在需要該治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)抑制PLA2酶的方法，所述方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥PLA2抑制有效量的天然或重組人子宮珠蛋白(UG)或其片段或衍生物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述UG具有約75％至約100％的純度。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述UG具有約90％至約100％的純度。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述UG具有至少95％的純度。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述UG為具有基本上與天然人子宮珠蛋白相同序列的重組(rhUG)。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述PLA2抑制有效量的UG為20ng/kg至500mg/kg。
19.權(quán)利要求13的方法，其中所述UG與肺表面活性劑一起給藥。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述肺表面活性劑以約20％至約80％(重量計(jì))的量存在。
21.權(quán)利要求13的方法，其中所述UG通過氣管內(nèi)、眼、靜脈內(nèi)、全身、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或口服途徑給藥。
22.權(quán)利要求13的方法，其中所述UG借助于氣管內(nèi)管以液體或半氣霧劑給藥。
23.權(quán)利要求13的方法，其中所述方法用于治療選自下面的疾病全身性炎癥、哮喘、囊性纖維化、眼炎癥、早產(chǎn)分娩、不育癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、腎病、炎性腸病、節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺炎、腹膜炎、變態(tài)反應(yīng)、多器官功能衰竭、ARDS、急性腎衰竭、感染或術(shù)后炎癥以及移植器官的排斥。
24.權(quán)利要求23的方法，其中眼炎癥由自身免疫性眼色素層炎和角膜移植手術(shù)產(chǎn)生。
25.權(quán)利要求13的方法，其中所述方法用于治療炎癥和免疫調(diào)節(jié)。
26.一種用于在需要該治療的病人中治療或預(yù)防炎癥疾病的方法，所述方法包括對(duì)所述病人給藥抗炎有效量的天然或重組UG或其片段或衍生物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述UG具有約75％至約100％的純度。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述UG具有約90％至約100％的純度。
29.權(quán)利要求26的方法，其中所述UG具有至少95％的純度。
30.權(quán)利要求26的方法，其中所述UG為具有基本上與天然人子宮珠蛋白相同序列的重組(rhUG)。
31.權(quán)利要求26的方法，其中所述PLA2抑制有效量的UG為20ng/kg至500mg/kg。
32.權(quán)利要求26的方法，其中所述UG與肺表面活性劑一起給藥。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述肺表面活性劑以約20％至約80％(重量計(jì))的量存在。
34.權(quán)利要求26的方法，其中所述UG通過氣管內(nèi)、眼、靜脈內(nèi)、全身、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或口服途徑給藥。
35.權(quán)利要求26的方法，其中所述UG借助于氣管內(nèi)管以液體或半氣霧劑給藥。
36.權(quán)利要求26的方法，其中所述炎癥疾病為新生兒RDS。
37.權(quán)利要求26的方法，其中所述炎癥疾病為成人RDS。
38.權(quán)利要求26的方法，其中所述炎癥疾病由病毒性感染、細(xì)菌感染、寄生蟲感染或真菌感染導(dǎo)致。
39.權(quán)利要求26的方法，其中所述方法用于治療選自下面的炎癥疾病全身性炎癥、哮喘、囊性纖維化、眼炎癥、早產(chǎn)分娩、遠(yuǎn)器官功能衰竭、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰腺炎、敗血性休克、膠原蛋白血管疾病、過敏性休克、創(chuàng)傷誘導(dǎo)性休克、急性腎衰竭、膀胱炎、尿道炎、輸尿管炎癥、膀胱炎癥、間質(zhì)膀胱炎、陰道炎、子宮頸炎、骨盆炎癥、輸卵管炎、輸尿管炎癥、陰莖炎、前列腺炎、曲細(xì)精管和曲細(xì)小管炎癥、睪丸炎癥、輸精管腺管炎癥、副睪炎和前列腺炎、視網(wǎng)膜炎、由于火或化學(xué)灼燒導(dǎo)致的損傷、支氣管哮喘、ARDS、新生兒RDS、直腸炎、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、胃潰瘍、胃腸回流疾病、扁桃體炎、痔、中耳炎、牛皮癬、蕁麻疹、變態(tài)反應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎、化學(xué)性皮炎、心內(nèi)膜炎和不育癥。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述炎癥為由自身免疫眼色素層炎、CMV視網(wǎng)膜炎、細(xì)菌性感染、病毒性感染、寄生蟲性感染、感染劑的存在、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、輻射暴露、變態(tài)反應(yīng)和角膜移植手術(shù)導(dǎo)致的眼炎癥。
41.一種治療或預(yù)防需要該治療的病人纖維變性疾病的方法，所述方法包括向病人給藥纖連蛋白結(jié)合有效量的天然或重組UG或其片段或衍生物。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述UG具有約75％至約100％的純度。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述UG具有約90％至約100％的純度。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述UG具有至少95％的純度。
45.權(quán)利要求41的方法，其中所述UG為具有基本上與天然人子宮珠蛋白相同序列的重組(rhUG)。
46.權(quán)利要求41的方法，其中所述纖連蛋白結(jié)合有效量的UG為20ng/kg至500mg/kg。
47.權(quán)利要求41的方法，其中所述UG與肺表面活性劑一起給藥。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述肺表面活性劑以約20％至約80％(重量計(jì))的量存在。
49.權(quán)利要求41的方法，其中所述UG通過氣管內(nèi)、眼、靜脈內(nèi)、全身、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或口服途徑給藥。
50.權(quán)利要求41的方法，其中所述UG借助于氣管內(nèi)管以液體或半氣霧劑給藥。
51.權(quán)利要求41的方法，其中所述纖維變性疾病為肺纖維變性。
52.權(quán)利要求41的方法，其中所述纖維變性疾病為腎纖維變性。
53.權(quán)利要求41的方法，其中所述纖維性變性為血管纖維變性。
54.一種治療或預(yù)防特征性在于內(nèi)源性UG缺乏的炎癥或纖維變性疾病的方法，所述方法包括對(duì)需要該治療的病人給藥補(bǔ)償量的天然或重組UG或其片段或衍生物。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述UG具有約75％至約100％的純度。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述UG具有約90％至約100％的純度。
57.權(quán)利要求54的方法，其中所述UG具有至少95％的純度。
58.權(quán)利要求54的方法，其中所述UG為具有基本上與天然人子宮珠蛋白相同序列的重組(rhUG)。
59.權(quán)利要求54的方法，其中所述補(bǔ)償量的UG為20ng/kg至500mg/kg。
60.權(quán)利要求54的方法，其中所述UG與肺表面活性劑一起給藥。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述肺表面活性劑以約20％至約80％(重量計(jì))的量存在。
62.權(quán)利要求54的方法，其中所述UG通過氣管內(nèi)、眼、靜脈內(nèi)、全身、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或口服途徑給藥。
63.權(quán)利要求54的方法，其中所述UG借助于氣管內(nèi)管以液體或半氣霧劑給藥。
64.權(quán)利要求54的方法，其中所述方法用于治療特征在于內(nèi)源性UG缺乏的炎癥或纖維變性疾病，其中所述疾病選自新生兒支氣管肺發(fā)育不良、血液透析并發(fā)癥、博來霉素肺慢性阻塞性肺病和遺傳性腎小球腎病。
65.權(quán)利要求26的方法，其中UG與選自下面的活性劑混合給藥類固醇、非類固醇抗炎劑、化療劑、鎮(zhèn)痛藥、抗體、抗寄生蟲劑、抗病毒劑、抗生素、抗真菌劑、疫苗、腫瘤疫苗、免疫抑制劑、造血生長因子、抗凝劑、心血管藥物、一種或多種維生素和礦物質(zhì)補(bǔ)充物和生育藥物。
66.權(quán)利要求44的方法，其中UG與選自下面的活性劑混合給藥類固醇、非類固醇抗炎劑、化療劑、鎮(zhèn)痛藥、抗體、抗寄生蟲劑、抗病毒劑、抗生素、抗真菌劑、疫苗、腫瘤疫苗、免疫抑制劑、生長因子、抗凝劑、心血管藥物、一種或多種維生素和礦物質(zhì)補(bǔ)充物和生育藥物。
67.權(quán)利要求54的方法，其中UG與選自下面的活性劑混合給藥類固醇、非類固醇抗炎劑、化療劑、鎮(zhèn)痛藥、抗體、抗寄生蟲劑、抗病毒劑、抗生素、抗真菌劑、疫苗、腫瘤疫苗、免疫抑制劑、生長因子、抗凝劑、心血管藥物、一種或多種維生素和礦物質(zhì)補(bǔ)充物和生育性藥物。
68.一種化妝品組合物，包含PLA2抑制有效量的天然或重組人子宮珠蛋白(UG)或其片段或衍生物和藥物可接受載體或稀釋劑。
69.權(quán)利要求68的化妝品組合物，進(jìn)一步包含肺表面活性劑。
70.權(quán)利要求68的化妝品組合物，其中所述UG具有約75％至約100％的純度。
71.權(quán)利要求68的化妝品組合物，其中所述UG具有約90％至約100％的純度。
72.權(quán)利要求68的化妝品組合物，其中所述UG具有至少95％的純度。
73.一種化妝品組合物，包含纖連蛋白結(jié)合有效量的天然或重組人子宮珠蛋白(UG)或其片段或衍生物和可接受載體或稀釋劑。
74.權(quán)利要求73的化妝品組合物，進(jìn)一步包含肺表面活性劑。
75.權(quán)利要求73的化妝品組合物，其中所述UG具有約75％至約100％的純度。
76.權(quán)利要求73的化妝品組合物，其中所述UG具有約90％至約100％的純度。
77.權(quán)利要求73的化妝品組合物，其中所述UG具有至少95％的純度。
78.一種血液補(bǔ)充物，包含PLA2抑制有效量的天然或重組人子宮珠蛋白(UG)或其片段或衍生物和藥物可接受載體或稀釋劑。
79.權(quán)利要求78的血液補(bǔ)充物，進(jìn)一步包含肺表面活性劑。
80.權(quán)利要求78的血液補(bǔ)充物，其中所述UG具有約75％至約100％的純度。
81.權(quán)利要求78的血液補(bǔ)充物，其中所述UG具有約90％至約100％的純度。
82.權(quán)利要求78的血液補(bǔ)充物，其中所述UG具有至少95％的純度。
83.一種血液補(bǔ)充物，包含纖連蛋白結(jié)合有效量的天然或重組人子宮珠蛋白(UG)或其片段或衍生物和藥物可接受載體或稀釋劑。
84.權(quán)利要求83的血液補(bǔ)充物，進(jìn)一步包含肺表面活性劑。
85.權(quán)利要求83的血液補(bǔ)充物，其中所述UG具有約75％至約100％的純度。
86.權(quán)利要求83的血液補(bǔ)充物，其中所述UG具有約90％至約100％的純度。
87.權(quán)利要求83的血液補(bǔ)充物，其中所述UG具有至少95％的純度。
88.一種用于定量臨床樣品中子宮珠蛋白-纖連蛋白復(fù)合物的分析法，其中將推測包含一種或多種子宮珠蛋白-纖連蛋白復(fù)合物的臨床樣品(a)與抗原捕獲劑接觸，(b)將抗原檢測劑加入至所述樣品中，和(c)使用次生抗體檢測與所述捕獲劑結(jié)合的任何復(fù)合物的存在，其中次生抗體與能通過加入與所述化學(xué)部分反應(yīng)的化合物而得以檢測的部分綴合。
89.權(quán)利要求88的分析法，其中所述抗原捕獲劑為固定在不溶性載體中的單特異性的兔多克隆抗體。
90.權(quán)利要求88的分析法，其中次生抗體為與酶結(jié)合的抗IgG抗體，其中與化學(xué)部分反應(yīng)的化合物為在與酶反應(yīng)時(shí)被轉(zhuǎn)化為發(fā)色或熒光化合物的酶底物。
91.權(quán)利要求90的分析法，其中酶為辣根過氧化物酶。
92.權(quán)利要求88的分析法，其中抗原檢測劑為纖連蛋白特異性抗體。
93.一種治療或預(yù)防需要這種治療的病人原纖維形成的方法，所述方法包括對(duì)病人給藥纖連蛋白結(jié)合有效量的天然或重組UG或其片段或衍生物的步驟。
94.權(quán)利要求93的方法，其中所述UG具有約75％至約100％的純度。
95.權(quán)利要求93的方法，其中所述UG具有約90％至約100％的純度。
96.權(quán)利要求93的方法，其中所述UG具有至少95％的純度。
97.權(quán)利要求93的方法，其中所述UG為具有基本上與天然人子宮珠蛋白相同序列的重組(rhUG)。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所述纖連蛋白結(jié)合有效量的UG為20ng/kg至500mg/kg。
99.權(quán)利要求97的方法，其中所述UG與肺表面活性劑一起給藥。
100.權(quán)利要求99的方法，其中所述肺表面活性劑以約20％至約80％(重量計(jì))的量存在。
101.權(quán)利要求93的方法，其中所述UG通過氣管內(nèi)、眼、靜脈內(nèi)、全身、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或口服途徑給藥。
102.權(quán)利要求93的方法，其中所述UG借助于氣管內(nèi)管以液體或半氣霧劑給藥。
103.權(quán)利要求93的方法，其中所述纖維變性疾病為肺纖維變性。
104.權(quán)利要求93的方法，其中所述纖維變性疾病為腎纖維變性。
105.權(quán)利要求93的方法，其中所述纖維變性疾病為血管纖維變性。
106.權(quán)利要求38的方法，其中所述病毒感染為CMV視網(wǎng)膜炎。
107.權(quán)利要求38的方法，其中所述細(xì)菌感染為肺炎或膀胱炎。
108.權(quán)利要求38的方法，其中所述寄生蟲性感染為血吸蟲病。
109.權(quán)利要求38的方法，其中所述真菌感染為陰道念珠菌病。
全文摘要
公開了使用UG體內(nèi)治療炎癥和纖維變性疾病的方法。還公開了治療或預(yù)防特征在于內(nèi)源功能性UG缺乏的炎癥或纖維變性疾病的方法。還提供了包含UG，任選包含肺表面活性劑的組合物以及檢測UG－纖連蛋白復(fù)合物的分析法。
文檔編號(hào)A61P29/00GK1846718SQ20061000850
公開日2006年10月18日 申請(qǐng)日期1998年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月28日
發(fā)明者A·L·皮隆, A·B·姆克赫耶, Z·張 申請(qǐng)人:克拉拉根有限公司, 國家衛(wèi)生協(xié)會(huì)