專(zhuān)利名稱(chēng)：與佐劑一起注射的重組活疫苗的制作方法
本案為分案申請(qǐng)，母案申請(qǐng)?zhí)枮?9803575.0(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/FR99/00453)，申請(qǐng)日為1999年3月1日，發(fā)明名稱(chēng)為“與佐劑一起注射的重組活疫苗”。
本發(fā)明涉及一種結(jié)合和體內(nèi)表達(dá)一個(gè)或多個(gè)異源基因的重組活疫苗的改進(jìn)。特別涉及包含佐劑的這種疫苗，涉及佐劑化合物在這種疫苗應(yīng)用中的用途以及相關(guān)的接種方式。本發(fā)明也涉及制備這些疫苗的方法。
結(jié)合滅活或亞單位疫苗佐劑來(lái)增強(qiáng)對(duì)這些疫苗包含的抗原的免疫應(yīng)答是常規(guī)方式。
同樣當(dāng)微生物的減毒導(dǎo)致免疫反應(yīng)減低時(shí)，可以在減毒活疫苗中結(jié)合佐劑。
最近，也已提出針對(duì)數(shù)種病原體聯(lián)合免疫，其中利用滅活疫苗作為一價(jià)和減毒活疫苗作為另一單價(jià)。還提出了重建減毒活疫苗，在包含佐劑的滅活疫苗組合物中以?xún)龈尚问奖４?。所說(shuō)的組合物作為活疫苗的重建載體，而不尋求任何佐劑效果。
EP-A-532 833提出一種抗馬鼻肺炎(rhinopneumonia)的疫苗，這種病是由馬皰疹病毒(EHV)引起的疾病。該疫苗是一種滅活的包含佐劑的疫苗，由滅活的EHV-4和EHV-1病毒組合，包含基于聚丙烯酸聚合物的Havlogen佐劑。
對(duì)于大部分皰疹病毒，當(dāng)前沒(méi)有有效的疫苗來(lái)在感染后迅速清除病毒。已知的疫苗嘗試對(duì)臨床癥狀的出現(xiàn)進(jìn)行保護(hù)?？傊瑢?duì)于病毒排泄的效果有限。
根據(jù)EP-A-532 833，據(jù)認(rèn)為所開(kāi)發(fā)的疫苗導(dǎo)致病毒排泄79％到93％的降低(見(jiàn)結(jié)果部分)。9個(gè)中8個(gè)對(duì)照動(dòng)物中在攻擊后平均排泄病毒1.4天，而攻擊后通常的排泄期為多于或等于5天。這代表低劑量的攻擊，接受免疫的馬與對(duì)照相比人為地增加了保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)中病毒排泄的減少因此并不顯著。
聚羧乙烯聚合物(carbomer)類(lèi)型的佐劑還被用于含滅活病毒的馬流感疫苗(IEV)中。
Mumford等(Epidemiol.Infect.(1994)，112，421-437)指出需要兩劑量的馬流感疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生瞬時(shí)的體液免疫和在馬中抗病毒的弱保護(hù)作用。作者比較了滅活疫苗中加入或不加破傷風(fēng)類(lèi)毒素時(shí)聚羧乙烯聚合物和磷酸鋁的佐劑效果。在所有病例中，針對(duì)H7N7和H3N8株，第一次免疫后，利用SRH(單輻射溶血)技術(shù)檢測(cè)到低抗體滴度，需要第二次及第三次免疫來(lái)產(chǎn)生較強(qiáng)的瞬時(shí)免疫反應(yīng)。
US-A-4 500 513也在加入聚羧乙烯聚合物的滅活疫苗進(jìn)行了抗馬流感病毒的接種試驗(yàn)。沒(méi)有精確描述動(dòng)物的來(lái)源及醫(yī)學(xué)狀態(tài)，可能為田間動(dòng)物(11攔，第二段)。利用血凝抑制技術(shù)檢測(cè)到較高的抗體滴度，表明試驗(yàn)動(dòng)物可能已被流感病毒感染，因此免疫后誘導(dǎo)的反應(yīng)是加強(qiáng)類(lèi)型，而不是初始免疫類(lèi)型。
最后，F(xiàn)ort Dodge Solvay推出了聚羧乙烯聚合物佐劑中的滅活馬流感疫苗(DuvaxynIE和IE-T plus)和滅活馬鼻肺炎疫苗(DuvaxynEHV1，4)。
包含氫氧化鋁佐劑的抗馬流感的商業(yè)滅活疫苗(例如Tetagripiffa，Merial，Lyons，法國(guó))也已知。
大量的其他佐劑用于常規(guī)商業(yè)滅活或亞單位疫苗?？梢蕴岬嚼纾瑲溲趸X，磷酸鋁，Avridine，DDA，單磷?；珹，Pluronic L121和其他的嵌段聚合物，胞壁酰肽，皂苷，海藻糖二霉菌酸酯，馬來(lái)酐和乙烯的共聚物，苯乙烯和丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物，聚磷腈，油性乳劑及類(lèi)似物。
WO-A-94 16681建議以油包水、水包油或水包油包水乳劑形式的佐劑疫苗組合物補(bǔ)充表達(dá)異源包膜病毒基因的重組活疫苗。
這樣的溶液可能有許多的缺點(diǎn)。
實(shí)際應(yīng)用中，在一方面，最終用戶(hù)應(yīng)該有凍干的活性組分，另一方面，有已經(jīng)配好的乳劑，使得能夠?qū)龈苫钚越M分重構(gòu)。
儲(chǔ)存過(guò)程中乳劑缺乏穩(wěn)定性對(duì)于重建疫苗的效果和安全性可能有害。
減毒活微生物的活性因?yàn)橛拖嗟牟环€(wěn)定可能受到質(zhì)疑。當(dāng)病毒因此失去其存活性時(shí)尤其如此。
乳劑中的疫苗在注射部位的安全性也會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。
因此本發(fā)明的目的是提供新的疫苗組合物，其基于表達(dá)至少一種異源核酸序列、特別是異源基因的重組活疫苗，包含能夠使得與無(wú)佐劑的相同疫苗相比顯著增強(qiáng)免疫并且非常適合于這類(lèi)疫苗的佐劑。
申請(qǐng)人現(xiàn)發(fā)現(xiàn)聚羧乙烯聚合物類(lèi)化合物在這種類(lèi)型疫苗的要求條件下能夠作為佐劑，而且其比例出人意料。在動(dòng)物皰疹病毒上進(jìn)行的試驗(yàn)(EHV-1，馬皰疹病毒)顯示添加聚羧乙烯聚合物在實(shí)驗(yàn)感染中能夠以出人意料的比例降低病毒排泄。其余在馬中用馬流感病毒A進(jìn)行的試驗(yàn)令人驚異的表明，能夠獲得較早和較高的血清抗體滴度，優(yōu)于那些用最好的商業(yè)疫苗獲得的效果。
因此本發(fā)明的主題是一種重組活疫苗，其包含一種結(jié)合和體內(nèi)表達(dá)異源核酸序列、優(yōu)選一個(gè)病原因子基因的病毒載體，和至少一種選自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和馬來(lái)酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物的佐劑化合物。
優(yōu)選的化合物是尤其由糖或多元醇的多鏈烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。這些化合物以聚羧乙烯聚合物(carbomer)的名稱(chēng)為人所知(Pharmeuropa Vol.，8，No.2，1996年6月)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以參看US-A-2 909 462(作為文獻(xiàn)引入)，其描述了由多羥基化合物交聯(lián)的這種丙烯酸聚合物，該多羥基化合物至少有3個(gè)羥基，優(yōu)選的不多于8個(gè)，至少3個(gè)羥基的氫原子被至少有2個(gè)碳原子的不飽和脂肪基團(tuán)取代。優(yōu)選的基團(tuán)含有2-4個(gè)碳原子，如乙烯基，烯丙基和其他乙烯不飽和基團(tuán)。不飽和基團(tuán)本身可含有其他取代基，例如甲基。稱(chēng)為Carbopol的銷(xiāo)售產(chǎn)品(BF Goodrich，Ohio，USA)是特別適合的。它們是由烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯(lián)的。其中，可提到Carbopol974P，934P，和971P。
在馬來(lái)酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物中，優(yōu)選共聚物EMA(Monsanto)，為線性或交聯(lián)的馬來(lái)酸酐和乙烯的共聚物，例如由二乙烯醚交聯(lián)?？蓞⒖嘉墨I(xiàn)J.Fields等，自然(Nature)，186778-780，1960年6月4日，作為文獻(xiàn)引入。
從結(jié)構(gòu)方面看，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物和共聚物EMA優(yōu)選有下式的基本單元形成 其中-R1和R2相同或不同，代表H或CH3-x＝0或1，優(yōu)選x＝1-y＝1或2，并且x+y＝2。
對(duì)于共聚物EMA，x＝0，y＝2。對(duì)于聚羧乙烯聚合物，x＝y(tǒng)＝1。
這些聚合物在水中的溶解產(chǎn)生酸性溶液，該溶液將被中和優(yōu)選至生理pH，以得到佐劑溶液，疫苗本身將結(jié)合到佐劑溶液中。因此聚合物羧基部分以COO-形式存在。
優(yōu)選的，本發(fā)明的佐劑溶液，特別是聚羧乙烯聚合物的溶液，在蒸餾水中制備，優(yōu)選加入氯化鈉，得到的溶液為酸性pH。該貯存溶液以如下方式稀釋?zhuān)瑢⑵浼尤氲揭?guī)定量(以得到需要的最終濃度)(或其大部分)的加有NaCl的水中、優(yōu)選生理鹽水(NaCl 9g/l)，所有的一次或分幾部分加入伴隨或隨后中和(pH 7.3-7.4)，優(yōu)選利用NaOH中和。該生理pH的溶液本身將被用于重建疫苗，特別以?xún)龈尚问劫A存的疫苗。
最終的疫苗組合物中的聚合物濃度將為0.01％-2％w/v，特別是0.06％-1％w/v，優(yōu)選0.1-0.6％w/v。
已證實(shí)本發(fā)明對(duì)于抗動(dòng)物皰疹病毒免疫接種特別有效。本發(fā)明特別涉及馬皰疹病毒(特別是EHV-1和EHV-4)，貓皰疹病毒(FHV)，犬皰疹病毒(CHV)，禽皰疹病毒(Marek和ILTV)，牛皰疹病毒(BHV)和豬皰疹病毒(PRV＝Aujeszky病病毒或假狂犬病病毒)。
本發(fā)明主題因此是含有至少一種結(jié)合和表達(dá)該皰疹病毒的至少一種基因的病毒載體和至少一種本發(fā)明的佐劑的重組活疫苗。
作為例子，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參見(jiàn)WO-A-92 15672(作為文獻(xiàn)引入)描述了基于能表達(dá)該基因的痘病毒的表達(dá)載體的產(chǎn)生?？梢钥吹嚼绫磉_(dá)EHV-1的gB，gC，gD基因的金絲雀痘(vCP132)，它還可用于EHV-4；表達(dá)這些相同基因的痘苗病毒(vP 1043)；表達(dá)EHV-1的gI(gB)，gIII(gC)和gIV(gD)基因的痘苗病毒；表達(dá)FHV-1的gD的金絲雀痘病毒；或表達(dá)PRV的gI(gB)，gIII(gC)和gp50(gD)重組體。還可參考WO-A-95/26 751(作為文獻(xiàn)引入)，它描述了重組病毒vCP320，vCP322和vCP294，它們分別表達(dá)CHV的gB，gC，gD基因。還可參考FR-A-2 647808或WO-A-9012882中的重組體表達(dá)FHV、PRV和BHV基因，作為文獻(xiàn)引入。
還證實(shí)本發(fā)明用于抗流感病毒的免疫接種的特別有利，如本文對(duì)于EIV(馬流感病毒)所證明的。還可提到禽流感(AIV)、豬流感(豬流感病毒)。
作為實(shí)例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參見(jiàn)WO-A-92 15 672中的表達(dá)EIVHA基因的重組金絲雀痘。
本發(fā)明主題因此是包含至少一種結(jié)合和表達(dá)該流感病毒的至少一個(gè)基因的病毒載體和本發(fā)明的至少一種佐劑的重組活疫苗。特別的，該疫苗含有2或3個(gè)載體的混合物，每個(gè)載體結(jié)合和表達(dá)HA基因，這些基因從不同病毒株獲得，例如馬流感株P(guān)rague、Kentucky和Newmarket。與此相似，單一載體可用于結(jié)合和表達(dá)2或3株病毒的HA。
本發(fā)明還可用于其他動(dòng)物病原體，如特別是FeLV(還參見(jiàn)如WO-A-92 15672中表達(dá)env、gag的金絲雀痘病毒重組體＝vCP93和vCP97)，破傷風(fēng)(還參見(jiàn)WO-A-92 15672和表達(dá)破傷風(fēng)毒素的重組體vCP161和vCP1075，金絲雀痘病毒和痘苗病毒)，Carre’s病病毒(犬瘟病毒或CDV)(見(jiàn)WO-A-95 27780中的重組體vCP258，作為文獻(xiàn)引入)。
本發(fā)明主題因此是包含至少一種結(jié)合和表達(dá)該病毒至少一個(gè)基因的病毒載體的重組活疫苗。
本發(fā)明的主題還在于多價(jià)重組疫苗，即包含兩個(gè)或多個(gè)表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)疾病抗原的重組載體，以混合物的形式存在于本發(fā)明的佐劑溶液中。
另外，本發(fā)明還可用于任何類(lèi)型的病毒表達(dá)載體，例如痘病毒(痘苗病毒，包括根據(jù)WO-A-92/15672的NYVAC，雞痘，金絲雀痘，鴿痘，豬痘等)，腺病毒，皰疹病毒。發(fā)現(xiàn)金絲雀痘，例如ALVAC(WO-A-95/27780和WO-A-92/15672)在本發(fā)明中特別適合。
在一種即用型、尤其是重建的疫苗中，病毒載體以正常使用和文獻(xiàn)中描述的量存在。
重組活疫苗通常以?xún)龈尚问酱嬖?，便于貯藏，應(yīng)用前立即重建于溶劑或賦形劑中，即本發(fā)明的佐劑溶液中。
本發(fā)明的主題還在于免疫接種的套件，包括獨(dú)立包裝的凍干疫苗和本發(fā)明用于重建凍干疫苗的佐劑化合物溶液。
本發(fā)明的主題還在于免疫接種方法，包括通過(guò)腸胃外優(yōu)選皮下、肌肉內(nèi)或皮內(nèi)途徑或粘膜途徑使用本發(fā)明的疫苗一次或多次，任選地包括一個(gè)在佐劑化合物溶液中重建凍干疫苗(重組載體)的前置步驟。
該方法的一個(gè)目的是保護(hù)動(dòng)物免于臨床癥狀和減少病毒排泄，特別是對(duì)于單純皰疹病毒的情形。
另一個(gè)目的是增強(qiáng)免疫應(yīng)答使得其較早產(chǎn)生，特別在第一次免疫接種時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。
本發(fā)明的主題還在于本發(fā)明的佐劑化合物在制備重組活疫苗中的應(yīng)用，特別是誘導(dǎo)改進(jìn)的和較早的免疫應(yīng)答和/或增強(qiáng)的病毒排泄減少的疫苗?？蓞⒖忌衔乃鰞?nèi)容。
現(xiàn)將通過(guò)非限制性實(shí)施例和參照附圖更詳盡地描述本發(fā)明-
圖1代表EIV Newmarket 2/93株的EIV HA基因的核酸序列；-圖2代表FHV-1 gC基因的核酸序列；-圖3代表顯示免疫接種抗馬皰疹病毒的不同疫苗的馬中，試驗(yàn)感染后病毒排泄變化的圖表。
實(shí)施例實(shí)施例1金絲雀痘病毒“ALVAC”中C3，C5和C6插入位點(diǎn)的供體質(zhì)粒的產(chǎn)生金絲雀痘病毒“ALVAC”不同插入位點(diǎn)的供體質(zhì)粒(Tartaglia等，病毒學(xué)(Virology)1992.188.217-232，作為文獻(xiàn)引入)描述在WO-A-95/27780的實(shí)施例20中。
這些質(zhì)粒在本申請(qǐng)中以下列方式命名“質(zhì)粒VQH6CP3LSA.2”用于“C3”位點(diǎn)“質(zhì)粒HC5LSP28”用于“C5”位點(diǎn)“質(zhì)粒pC6L”用于“C6”位點(diǎn)。
實(shí)施例2重組病毒vCP258(ALVAC/CDV HA+F)的產(chǎn)生CDV病毒的Onderstepoort株用于分離HA和F基因(HA基因序列被描述于Curran等，病毒學(xué)1991.72.443-447中，F(xiàn)基因序列被描述于Barrett等，病毒研究(Virus Research)1987.8.373-386，均作為文獻(xiàn)引入)。
供體質(zhì)粒pMM103的用于在ALVAC病毒的C6座位插入H6痘苗啟動(dòng)子-CDV F基因和H6痘苗啟動(dòng)子-CDV HA基因的表達(dá)盒，其構(gòu)建被描述于WO-A-95/27780的實(shí)施例19中。
該質(zhì)粒被用于和ALVAC病毒的體外重組的供體質(zhì)粒(Piccini等，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)1987.153.545-564，作為文獻(xiàn)引入)，產(chǎn)生稱(chēng)為vCP258的重組病毒，如上面所述申請(qǐng)的實(shí)施例19。
實(shí)施例3重組病毒vCP1502(ALVAC/EIV Prague株HA)的產(chǎn)生HA基因(EIV Prague株)的序列列于WO-A-92/15672的圖23中。馬流感病毒Prague 56株基因組的病毒RNA利用CLONTECH(Palo Alto，CA)的提取試劑盒“總RNA分離試劑盒”(Cat#K1042-1)從該病毒的100ul病毒懸液中提取。收集RNA沉淀于10ul超純水中，隨后取2ul純化的病毒RNA作模板并利用下面的寡核苷酸，按PCR反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增EIV Prague株的HA基因進(jìn)行互補(bǔ)DNA合成反應(yīng)
TAY51A(SEQ ID No.1)(70堿基)5′CGCGGCCATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAACACTCAAATTCTAATATTAGCCACTTCGG3′和TAY53A(SEQ ID No.2)(36堿基)5′CGCGCGGCGGTACCTTATATACAAATAGTGCACCGC3′將得到的PCR片段連接到載體pCRII(Invitrogen，San Diego，CA)產(chǎn)生質(zhì)粒pJT007。
用NruI和Asp718消化質(zhì)粒pJT007，分離約1800bp的NruI-718片段，其包含H6啟動(dòng)子的末端和全長(zhǎng)的EIV Prague株的HA基因。該片段與預(yù)先用NruI和Asp718消化的供體質(zhì)粒C5 HC5LSP28連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJT008。該質(zhì)粒含有H6-Prague 56HA基因的表達(dá)盒，位于ALVAC病毒的C5座位。該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)通過(guò)測(cè)序和完全酶切圖得到證實(shí)。
該質(zhì)粒是將H6-Prague 56HA基因的表達(dá)盒插入到C5座位的供體質(zhì)粒。
用NotI線性化后，質(zhì)粒pJT008被用做供體質(zhì)粒和ALVAC病毒體外重組(Piccini等，酶學(xué)方法1987.153.545-563)，產(chǎn)生的重組病毒命名為vCP1502。
實(shí)施例4重組病毒vCP1529(ALVAC/EIV Kentucky 1/94株HA)的產(chǎn)生馬流感病毒Kentucky 1/94株(Daly等，J.Gen.Virol.1996.77.661-671，作為文獻(xiàn)引入)基因組的病毒RNA利用CLONTECH(Palo Alto，CA)抽提試劑盒“總RNA分離試劑盒”(Cat#K1042-1)從該病毒的100ul病毒懸液中抽提。收集RNA沉淀于10ul超純水中，隨后取2ul純化的病毒RNA作為模板和下面的寡核苷酸，為擴(kuò)增HA基因進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)TAY55A(SEQ ID No.3)(70堿基)5′CGCGGCCATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAGACAACCATTATTTTGATACTACTGACCC3′和TAY57A(SEQ ID No.4)(42堿基)
5′CGCGCGGCGGTACCTCAAATGCAAATGTTGCATCTGATGTTG3′將得到的PCR片段連接到載體pCRII(Invitrogen，San Diego，CA)中產(chǎn)生質(zhì)粒pJT001?？寺〉劫|(zhì)粒pJT001中的EIV Kentucky 1/94株HA基因的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的EIV Kentucky 1/94株HA基因的序列沒(méi)有不同(登錄號(hào)L39914，作為文獻(xiàn)引入)。
用NruI和Asp718消化含有HA基因(Kentucky 1/94株)的質(zhì)粒pJT001，分離約1800bp的NruI-718片段(包含H6啟動(dòng)子的末端和全長(zhǎng)的Kentucky 1/94株HA基因)。該片段與預(yù)先用NruI和Asp718消化的供體質(zhì)粒C5 HC5LSP28連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJT005。該質(zhì)粒含有H6-Kentucky 1/94株HA基因的表達(dá)盒，位于ALVAC病毒的C5座位。該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)通過(guò)測(cè)序和完全酶切圖得到證實(shí)。
該質(zhì)粒是將H6-Kentucky1/94株HA基因的表達(dá)盒插入到C5座位的供體質(zhì)粒。
用NotI線性化后，質(zhì)粒pJT005被用做供體質(zhì)粒和ALVAC病毒體外重組(Piccini等，酶學(xué)方法1987.153.545-563)，產(chǎn)生的重組病毒命名為vCP1529。
實(shí)施例5重組病毒vCP1533(ALVAC/EIV Newmarket 2/93 HA)的產(chǎn)生馬流感病毒Newmarket 2/93株(Daly等，J.Gen.Virol.1996.77.661-671)基因組的病毒RNA利用CLONTECH(Palo Alto，CA)抽提試劑盒“總RNA分離試劑盒”(Cat#K1042-1)從該病毒的100ul病毒懸液中抽提。收集RNA沉淀于10ul超純水中，隨后取2ul純化的病毒RNA作為模板并利用下面的寡核苷酸，為擴(kuò)增HA基因進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)CCL007(SEQ ID No.5)(40堿基)5′TTGTCGACTCAATCATGAAGACAACCATTATTTTGATACT3′和CCL0018(SEQ ID No.6)(34堿基)5′TTGGATCCTTACTCAAATGCAAATGTTGCAYCTG3′將得到的PCR片段連接到載體pCRII(Invitrogen，San Diego，CA)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pCCL026。HA基因(EIV Newmarket 2/93株)的序列顯示于圖1(SEQ ID No.7)。
含HA基因(EIV Newmarket 2/93株)的質(zhì)粒pCCL026用SpeI和AccI消化。下述的寡核苷酸TAY99N(SEQ ID No.8)(74堿基)5′CTAGTTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAAGACAACCATTATTTTGATACTACTGACCCATTGGGT3′TAY100N(SEQ ID No.9)(72堿基)5′AGACCCAATGGGTCAGTAGTATCAAAATAATGGTTGTCTTCATTACGATACAAACTTAACGGATATCGCGAA3′被退火并與SpeI+AccI消化的質(zhì)粒pCCL026連接得到pJT003。雙鏈寡核苷酸TAY99N/TAY100N含有截至NruI位點(diǎn)的H6啟動(dòng)子的3’區(qū)域和HA基因的頭40個(gè)編碼堿基。
用NruI和XhoI消化質(zhì)粒pJT003，分離約1800bp的包含H6啟動(dòng)子的末端和全長(zhǎng)HA基因的NruI-XhoI片段。該片段與預(yù)先用NruI和XhoI消化的供體質(zhì)粒C5 HC5LSP28連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJT004。該質(zhì)粒含有H6-Newmarket 2/93株HA基因的表達(dá)盒，位于ALVAC病毒的C5座位。該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)通過(guò)測(cè)序和完全酶切圖得到證實(shí)。
該質(zhì)粒是將H6-Newmarket 2/93株HA基因的表達(dá)盒插入到C5座位的供體質(zhì)粒。
用PvuI線性化后，質(zhì)粒pJT004被用做供體質(zhì)粒和ALVAC病毒體外重組(Piccini等，酶學(xué)方法1987.153.545-563)，產(chǎn)生的重組病毒命名為vCP1533。
實(shí)施例6重組病毒vCP132(ALVAC/EHV-1 gB+gC+gD)的產(chǎn)生重組病毒的構(gòu)建被描述于WO-A-92/15762的實(shí)施例25和26中。該病毒通過(guò)ALVAC病毒和供體質(zhì)粒pJCA049的體外重組產(chǎn)生。供體質(zhì)粒含有下述3個(gè)克隆到C3插入位點(diǎn)的表達(dá)盒I3L痘苗啟動(dòng)子-EHV-1 gB基因H6痘苗啟動(dòng)子-EHV-1 gC基因42K昆蟲(chóng)痘病毒啟動(dòng)子-EHV-1 gD基因
EHV-1的gB、gC、gD基因的序列被描述于專(zhuān)利申請(qǐng)WO-A-92/15672的圖2(EHV-1的gp13基因序列＝gC)、圖6(EHV-1的gp14基因序列＝gB)和圖12(EHV-1的gD、gp63和gE基因序列)。
實(shí)施例7重組病毒vCP243(ALVAC/FHV-1 gB+gC+gD)的產(chǎn)生FHV-1的gB基因(CO株)的序列被描述于專(zhuān)利申請(qǐng)WO-A-90/12882的圖34中。
FHV-1的gC基因(CO株)(序列示于圖2)(SEQ ID No.10)從EcoRI F片段(7.6kbp)中克隆?；蜷L(zhǎng)度1599bp，編碼一533氨基酸的蛋白。
FHV-1的gD基因(CO株)(序列示于WO-A-92/15762的圖28中)從EcoRI M片段(4.4kbp)中克隆(質(zhì)粒pFHVEcoRIM)。
在早期轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(TTTTTNT)水平突變的I3L-FHV-1 gB基因表達(dá)盒的構(gòu)建用下列寡核苷酸MP287(SEQ ID No.11)(20堿基)5′GATTAAACCTAAATAATTGT3′和JCA158(SEQ ID No.12)(21堿基)5′TTTTTCTAGACTGCAGCCCGGGACATCATGCAGTGGTTAAAC3′以含有I3L痘苗啟動(dòng)子(Riviere等，J.Virol.199266.3424-3434，座位文獻(xiàn)引入)的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生120bp的XbaI平端片段(含有I3L痘苗啟動(dòng)子)＝片段A。用下列寡核苷酸JCA213(SEQ ID No.13)(18堿基)5′GGGTTTCAGAGGCAGTTC3′JCA238(SEQ ID No.14)(21堿基)5′ATGTCCACTCGTGGCGATCTT3′以質(zhì)粒pJCA001為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生720bp的BamHI平端片段(含有FHV-1 gB基因的5’部分)＝片段B。
用XbaI消化片段A，然后磷酸化。用BamHI消化片段B，然后磷酸化。片段A和片段B共同和預(yù)先用XbaI+BamHI消化的載體pBluescriptSK+進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJCA075。
下列寡核苷酸JCA158(SEQ ID No.15)和JCA211(SEQ ID No.16)(21堿基)5′GTGGACACATATAGAAAGTCG3′用于以質(zhì)粒pJCA075為模板的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生510bp的XbaI平端片段(含有融合到在早期轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(TTTTTNT)水平突變的FHV-1 gB基因的5’端的I3L痘苗啟動(dòng)子)＝片段C。
下列寡核苷酸JCA212(SEQ ID No.17)(21堿基)5′CACCTTCAGGATCTACTGTCG3′和JCA213(SEQ ID No.13)(18堿基)用于以質(zhì)粒pJCA001為模板的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生330bp的BamHI平端片段(含有FHV-1 gB基因的中間部分)＝片段D。
用XbaI消化片段C，然后磷酸化。用BamHI消化片段D，然后磷酸化。片段C和片段D共同和預(yù)先用XbaI+BamHI消化的載體pBluescriptSK+進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJCA076。
下列寡核苷酸JCA239(SEQ ID No.18)(24堿基)5′ACGCATGATGACAAGATTATTATC3′和JCA249(SEQ ID No.19)(18堿基)5′CTGTGGAATTCGCAATGC3′用于通過(guò)以質(zhì)粒pJCA001為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生695bp的EcoRI平端片段(含有FHV-1 gB基因開(kāi)始的3’部分)＝片段E。下列寡核苷酸JCA221(SEQ ID No.20)(48堿基)5′AAAACTGCAGCCCGGGAAGCTTACAAAAATTAGATTTGTTTCAGTATC3′和JCA247(SEQ ID No.21)(36堿基)5′GGTATGGCAAATTTCTTTCAGGGACTCGGGGATGTG3′用于通過(guò)質(zhì)粒pJCA001為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生560bp的PstI平端片段(含有在早期轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(TTTTTNT)水平突變的FHV-1 gB基因3’端第二部分)＝片段F。
用EcoRI消化片段E，然后磷酸化。用PstI消化片段F，然后磷酸化。片段E和片段F共同和預(yù)先用EcoRI+PstI消化的載體pIBI24(International Biotechnologies Inc.，New Haven，CT)進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJCA077(包含I3L痘苗啟動(dòng)子-FHV-1 B基因的表達(dá)盒)。
42K-FHV-1 gD表達(dá)盒的構(gòu)建下列寡核苷酸RG286(SEQ ID No.22)(17堿基)5′TTTATATTGTAATTATA3′和M13F(SEQ ID No.23)(17堿基)5′GTAAAACGACGGCCAGT 3′用于以含有42K昆蟲(chóng)痘病毒AmEPV啟動(dòng)子的質(zhì)粒(被描述于專(zhuān)利US-A-5,505,941的實(shí)施例21中)為模板的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生130bp的EcoRI平端片段(含有42K昆蟲(chóng)痘苗啟動(dòng)子)＝片段A。
下列寡核苷酸JCA234(SEQ ID No.24)(21堿基)5′ATGATGACACGTCTACATTTT3′和JCA235(SEQ ID No.25)(21堿基)5′TGTTACATAACGTACTTCAGC3′用于通過(guò)以質(zhì)粒pFHVEcoRIM為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生185bp的BamHI平端片段(含有FHV-1 gD基因的5’部分)＝片段B。
用EcoRI消化片段A，然后磷酸化。用BamHI消化片段D，然后磷酸化。片段C和片段D共同和預(yù)先用EcoRI+BamHI消化的載體pBluescript SK+進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJCA078。
用BamHI和XhoI消化質(zhì)粒pFHVEcoRIM(見(jiàn)上文)分離得到1270bp的BamHI-XhoI片段(含有FHV-1 gD基因的3’部分)。該片段與預(yù)先用BamHI和XhoI消化的載體pIBI24連接得到質(zhì)粒pJCA072。
下列寡核苷酸JCA242(SEQ ID No.26)(18堿基)
5′GAGGATTCGAAACGGTCC3′和JCA237(SEQ ID No.27)(53堿基)5′AATTTTCTCGAGAAGCTTGTTAACAAAAATCATTAAGGATGGTAGATTGCATG3′用于以質(zhì)粒pFHVEcoRIM為模板的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生290bp的XbaI-XhoI片段。用XbaI和XhoI消化該片段＝片段C(含有FHV-1 gD基因的末端)。
用XbaI和XhoI消化質(zhì)粒pJCA072，分離得到3575bp的XbaI-XhoI片段(載體pIBI24+FHV-1+FHV-1 gD基因的3’開(kāi)始部分)＝片段D。將片段C和片段D進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJCA073。
用BamHI和XhoI消化質(zhì)粒pJCA073，分離得到960bp的BamHI-XhoI片段(FHV-1 gD基因的3’部分)＝片段A。用HpaI-BamHI消化質(zhì)粒pJCA078，分離得到310bp的HpaI-BamHI片段(含有融合到FHV-1 gD基因的5’部分的42K啟動(dòng)子)＝片段B。片段A和片段B共同和預(yù)先用EcoRV+XhoI消化的載體pBluescript SK+進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJCA080(含有42K啟動(dòng)子-FHV-1 gD基因的表達(dá)盒)。
H6-FHV-1 gC表達(dá)盒的構(gòu)建用EcoRI消化FHV-1病毒(CO株)的基因組DNA，將約7500bp的EcoRIF片段克隆到pBluescript SK+，得到質(zhì)粒pFHVEcoRIF。下列寡核苷酸JCA274(SEQ ID No.28)(55堿基)5′CATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGACGATATAGGATGGGAC3′和JCA275(SEQ ID No.29)(18堿基)5′ACTATTTTCAATACTGAC3′用于以質(zhì)粒pFHVEcoRIF為模板的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生的片段用NruI-SalI消化后產(chǎn)生107bp的NruI-SalI片段(含有融合到FHV-1 gC基因的5’部分的H6痘苗啟動(dòng)子的3’部分)＝片段A。
下列寡核苷酸JCA276(SEQ ID No.30)(18堿基)
5′AAATGTGTACCACGGGAC3′和JCA277(SEQ ID No.31)(54堿基)5′AAGAAGCTTCTGCAGAATTCGTTAACAAAAATCATTATAATCGCCGGGGATGAG3′用于以質(zhì)粒pFHVEcoRIF為模板的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生片段用EcoRV和HindIII消化后產(chǎn)生370bp的EcoRV-HindIII片段(含有FHV-1 gC基因的3’部分和HpaI-EcoRI-PstI-HindIII位點(diǎn))＝片段B。
用NruI和HindIII消化質(zhì)粒pJCA020(見(jiàn)上文)，分離得到NruI-HindIII片段(包含H6痘苗啟動(dòng)子的5‘部分)＝片段C。用BamHI和EcoRV消化質(zhì)粒pFHVEcoRIF，分離得到580bp的BamHI-EcoRV片段(包含F(xiàn)HV-1 gC基因中間部分)＝片段D。片段A和片段C共同和預(yù)先用HindIII和SalI消化的載體pBluescript SK+進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJCA097。片段B和片段D共同和預(yù)先用BamHI和HindIII消化的載體pBluescript SK+進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJCA099。
用PstI和SalI消化質(zhì)粒pJCA097，分離得到200bp的PstI-SalI片段(包含H6-gC 5’部分的表達(dá)盒)＝片段E。用BamHI和SalI消化質(zhì)粒pFHVEcoRIF，分離得到600bp的SalI-BamHI片段(FHV-1 gC的第二段中間部分)＝片段F。片段E和片段F共同和預(yù)先用BamHI和PstI消化的載體pBluescript SK+進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJCA098。用EcoRI和BamHI消化質(zhì)粒pJCA098，分離得到820bp的EcoRI-BamHI片段(包含H6-FHV-1 gC 5’部分的表達(dá)盒)＝片段G。用BamHI和HindIII消化質(zhì)粒pJCA099(見(jiàn)上文)，分離得到960bp的BamHI-HindIII片段(含有FHV-1 gC基因的3’部分)＝片段H。片段G和片段H共同和預(yù)先用EcoRV和HindIII消化的載體pBluescript SK+進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJCA100(包含H6痘苗啟動(dòng)子-FHV-1 gC基因的表達(dá)盒)。
用NruI和EcoRI消化質(zhì)粒pJCA100，分離得到1650bp的包含融合到FHV-1 gC基因的H6啟動(dòng)子的3’部分的NruI-EcoRI片段。該片段和預(yù)先用NruI和EcoRI消化的載體pJCA053(表達(dá)盒位VQH6-IBV M于載體pBluescript SK+中)進(jìn)行連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJCA108(包含載體pBluescript SK+中的VQH6-gC表達(dá)盒)。用SmaI和BamHI消化質(zhì)粒pJCA079(見(jiàn)上文)，分離得到840bp的SmaI-BamHI片段(包含表達(dá)盒I3L-FHV-1 gB基因的5’部分)＝片段A。還利用HindIII和BamHI消化質(zhì)粒pJCA079，分離得到2155bp HindIII-BamHI的片段(包含F(xiàn)HV-1 gB基因的3’部分)＝片段B。用HindIII和EcoRI消化質(zhì)粒pJCA108(見(jiàn)上文)，分離得到1830bp的HindIII-EcoRI片段(包含VQH6-FHV-1gC表達(dá)盒)＝片段C。用XhoI和EcoRI消化質(zhì)粒pJCA080(見(jiàn)上文)，分離得到1275bp的XhoI-EcoRI片段(包含42K-FHV-1 gD基因的表達(dá)盒)＝片段D。片段A、B、C和D和供體質(zhì)粒pC6L共同連接得到質(zhì)粒pJCA109。
該質(zhì)粒包含位于ALVAC病毒的C6座位中的H6-FHV-1 gC、I3L-FHV-1gB基因和42K-FHV-1 gD基因的表達(dá)盒。該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)通過(guò)測(cè)序和完全酶切圖譜得到證實(shí)。
該質(zhì)粒是將H6-FHV-1 gC、I3L-FHV-1 gB基因和42K-FHV-1 gD基因的表達(dá)盒插入到ALVAC病毒的C6座位的供體質(zhì)粒。
用NotI線性化后，質(zhì)粒pJCA109被用做供體質(zhì)粒和ALVAC病毒體外重組(Piccini等，酶學(xué)方法1987.153.545-563)，產(chǎn)生的重組病毒命名為vCP243。
實(shí)施例8佐劑本發(fā)明疫苗中應(yīng)用的聚羧乙烯聚合物是Carbopol974P，由BFGoodrich公司生產(chǎn)(分子量大約為3百萬(wàn))。
貯藏液含有1.5％w/v的Carbopol974P，首先制備于含有1g/l氯化鈉的蒸餾水中。
該貯藏液隨后用于制備的生理鹽水中的4mg/ml Carbopol溶液。
將貯藏液一次或任選地分?jǐn)?shù)次倒入全部生理鹽水(或任選地大部分生理鹽水)中，每次用NaOH(例如1N或濃度更高)調(diào)節(jié)pH到大約7.3-7.4。
這樣獲得的Carbopol的即用溶液可被最終用戶(hù)用于重建凍干重組疫苗。
實(shí)施例9應(yīng)用表達(dá)I型馬皰疹病毒(EHV-1)的糖蛋白gB、gC和gD的重組金絲雀痘病毒載體vCP132(見(jiàn)實(shí)施例6)進(jìn)行馬的免疫接種1.免疫接種和攻擊的方法無(wú)顯示最近暴露于EHV-1和EHV-4的血清學(xué)癥狀的20匹小馬(Welsh山小馬)被隨機(jī)分成4組(A-D)，每組5匹。
對(duì)A和B組免疫接種表達(dá)EHV-1 Kentucky D株的糖蛋白gB、gC和gD的重組金絲雀痘病毒vCP132。疫苗被重建于無(wú)菌水(A組)或?qū)嵤├?的4mg/ml的聚羧乙烯聚合物溶液(B組)中。
對(duì)C組免疫接種商業(yè)滅活全EHV疫苗，其包含滅活的EHV-1和EHV-4和6mg聚羧乙烯聚合物，每劑量體積為1.5ml。
D組是對(duì)照組，對(duì)該組動(dòng)物免疫接種表達(dá)流感A/equi-1/Prague56病毒的HA糖蛋白的重組金絲雀痘病毒vCP1502(見(jiàn)實(shí)施例3)，與B組相同的條件下重建于聚羧乙烯聚合物中。
疫苗的詳細(xì)情況示于表1中
每個(gè)動(dòng)物在第0和第35天頸部深肌肉注射接受一劑量的疫苗。
在第56天，小馬通過(guò)鼻內(nèi)滴入105TCID50的EHV-1 Ab4/8株進(jìn)行攻擊。
2.血清學(xué)檢測(cè)根據(jù)Thompson等，Equine Vet.J.，8，58-65，1976描述的技術(shù)進(jìn)行中和試驗(yàn)SN。EHV-1病毒(RACH)用作抗原。
SN滴度被表達(dá)為產(chǎn)生50％中和的血清稀釋度的倒數(shù)(log10)。
3.病毒學(xué)監(jiān)測(cè)病毒的表達(dá)每日監(jiān)測(cè)一次，共10天。利用鼻咽拭子收集病毒至病毒運(yùn)送培養(yǎng)基中。拭子提取物在微量滴定板上利用兔腎細(xì)胞RK13進(jìn)行滴定。滴度利用Karber公式計(jì)算，表達(dá)為log10TCID50/ml。
4.結(jié)果這些免疫接種后沒(méi)有觀察到明顯的局部或系統(tǒng)的反應(yīng)。
血清中和SN抗體的平均反應(yīng)(引起50％中和活性的稀釋度的log10)是
在聚羧乙烯聚合物中的疫苗vCP132中觀察到抗體滴度的顯著性增加。
所有的5匹對(duì)照小馬都通過(guò)鼻咽排泄病毒。這些未免疫馬的病毒排泄平均持續(xù)5天，最大的病毒排泄在感染后4天。
A、C和D組的所有的小馬在攻擊后都排泄病毒。與此對(duì)照，接種本發(fā)明疫苗的B組5匹小馬中只有兩匹排泄病毒。另外，B組病毒的排泄量明顯少于包括C組的其他組動(dòng)物的排泄量。B組動(dòng)物病毒排泄期較其他組動(dòng)物短。
可參見(jiàn)圖1和下面的曲線下面積值，其中非常清楚地表明聚羧乙烯聚合物存在下的疫苗vCP132免疫接種的小馬基本沒(méi)有病毒排泄。特別與商業(yè)疫苗相比，結(jié)果非常顯著。與對(duì)照相比，可觀察到B組動(dòng)物病毒排泄的顯著性減少，而在C組和對(duì)照之間未觀察到顯著性差異。病毒排泄的明顯和出人意料的減少水平有特別的益處，有利于在馬與馬之間限制病毒的傳播。
每匹小馬總病毒(曲線下面積)A17.1B3.0C9.7D16.3實(shí)施例10應(yīng)用表達(dá)流感A/eqiu-2/Newmarket/2/93病毒糖蛋白HA的重組金絲雀痘病毒載體vCP1533(見(jiàn)實(shí)施例5)加入聚羧乙烯聚合物進(jìn)行馬的免疫接種1.免疫和攻擊方法本實(shí)驗(yàn)利用7-8月齡的20匹小馬(Welsh山小馬)，它們無(wú)可檢測(cè)到的抗H3N8和H7N7病毒抗體，用SRH(單輻射溶血)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。動(dòng)物的陰性狀態(tài)使得可以在最好的條件下，根據(jù)體液免疫反應(yīng)研究各種疫苗的效力。小馬被隨機(jī)分成4組(A-D)，每組5-6匹。
對(duì)A組免疫接種表達(dá)流感A/eqiu-2/Newmarket/2/93病毒糖蛋白HA的重組金絲雀痘病毒vCP1533。疫苗被重建于含有4mg/ml的聚羧乙烯聚合物Carbopol974P中。
對(duì)B組免疫接種商業(yè)疫苗，其包含3株滅活的流感病毒Prague/56、Suffolk/89和Miami/63、破傷風(fēng)類(lèi)毒素及聚羧乙烯聚合物(4mg)和氫氧化鋁(2.2mg)佐劑的混合物，每劑量體積為1.5ml。
對(duì)C組免疫接種疫苗C，其含有2種滅活流感株P(guān)rague/56、Newmarket/2/93及破傷風(fēng)類(lèi)毒素和氫氧化鋁。
對(duì)D組免疫接種重組金絲雀痘苗vCP132(見(jiàn)上文)，疫苗被重建于含有4mg/ml聚羧乙烯聚合物974P的溶液中。最后一組用做攻擊對(duì)照組。
疫苗的詳細(xì)情況描述于表II中
每個(gè)動(dòng)物以5周間隔頸部深肌肉注射接受二劑量的每劑1ml的疫苗。
第二次免疫后兩周，每匹小馬被暴露于總107.7EID50的流感A/eqiu-2/Sussex/89病毒約20ml的尿囊液得到的氣溶膠進(jìn)行感染，利用ULTRA2000型噴霧裝置(De Villbiss，Somerset PA)，如Mumford等，EquineVet J.，2293-98，1990中所述。
2.血清學(xué)檢測(cè)在下列天收集全血樣品0(第一次免疫以前及同一天)、7、14、35(第二次免疫前及同一天)、49(攻擊前及同一天)、56和63。
準(zhǔn)備血清貯存和保藏于-20℃到使用。對(duì)所有血清檢測(cè)抗流感A/eqiu-1/Prague/56和流感A/eqiu-2/Newmarket/2/93的SRH抗體，如Wood等(J.Hyg.，90，371-384，1983)所述。
溶血區(qū)直徑利用自動(dòng)讀數(shù)儀在垂直的兩個(gè)方向測(cè)量。計(jì)算區(qū)域的表面積，50％的增加被認(rèn)為有顯著性。滴度表示成溶血的mm23.病毒學(xué)監(jiān)視按如下方法監(jiān)視病毒的排泄利用鼻咽拭子收集10天，每日一次，收集到病毒運(yùn)送培養(yǎng)基上。每只拭子的洗出物10倍系列稀釋于pH7.2的PBS中，將0.1ml的稀釋液接種到10日齡雞胚的尿囊腔中。從34℃72小時(shí)培養(yǎng)后收集的雞胚尿囊液中的血凝活性計(jì)算拭子提取物的病毒滴度(EID50/ml)。
4.結(jié)果第一次免疫接種后沒(méi)有觀察到明顯的局部或系統(tǒng)的反應(yīng)，B組中的一匹馬例外。
應(yīng)注意Suffolk和Newmarket株是相似的(Daly等，J.Gen..Virol1996，661-671)，這使得與在實(shí)驗(yàn)條件下與商業(yè)疫苗的比較完全有效。
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，沒(méi)有小馬具有可檢測(cè)到的抗流感A/eqiu-2/Newmarket/2/93或流感A/eqiu-1/Prague/56的SRH抗體。第一次免疫后一周的血清學(xué)結(jié)果顯示，沒(méi)有小馬預(yù)先感染了流感(無(wú)可觀察到的加強(qiáng)效果)。
第一次免疫后二周，沒(méi)有小馬產(chǎn)生可檢測(cè)到的抗流感A/eqiu-1/Prague/56抗體反應(yīng)。另外，免疫疫苗C的6匹小馬中的6匹，免疫商業(yè)疫苗B和對(duì)照組D的5匹小馬中的4匹無(wú)可檢測(cè)到的抗流感A/eqiu-2/Newmarket/2/93 SRH抗體。相反，用加入聚羧乙烯聚合物佐劑的金絲雀痘苗免疫的5匹都檢測(cè)到較高的SRH抗體平均155.4+/-32.9。表III顯示從每匹動(dòng)物的SRH抗體滴度得到的結(jié)果。
表III.SRH結(jié)果(mm2)
本發(fā)明的疫苗第一次免疫后14天引起高抗體滴度的出現(xiàn)，而對(duì)于疫苗B和C，同期第一次免疫沒(méi)有引起可檢測(cè)水平的抗體出現(xiàn)。這樣早的抗體滴度的產(chǎn)生是顯著的和不可預(yù)期的結(jié)果，是以前從未觀察到的。
實(shí)施例11應(yīng)用表達(dá)流感A/eqiu-1/Prague/56病毒糖蛋白HA的重組金絲雀痘苗載體vCP1502(見(jiàn)實(shí)施例3)加入聚羧乙烯聚合物進(jìn)行馬的免疫接種vCP1502免疫接種的實(shí)施例1的對(duì)照，也被用于血清學(xué)的檢測(cè)。
下表IV顯示在免疫加入Carbpol947P的108pfu的vCP1502的動(dòng)物中，第0(第一次注射V1)和35(第二次注射V2)天得到的IHA(血凝抑制)滴度。
表IV
如上一個(gè)實(shí)施例，觀察到注射與聚羧乙烯聚合物混合的金絲雀痘-EIV(表達(dá)A equi-1/Prague病毒的HA基因)免疫后14天可得到高的特異性IHA滴度。值得注意的是，該高滴度在加強(qiáng)后進(jìn)一步顯著增加，達(dá)到以前從未在未進(jìn)行預(yù)先刺激的馬中觀察到的對(duì)EIV H7N7病毒HA抗原高平均滴度水平。
實(shí)施例12對(duì)貓的應(yīng)用受試的重組病毒是表達(dá)貓皰疹病毒gB、gC、gD基因的重組金絲雀痘病毒(貓皰疹病毒＝FHV)。該重組病毒稱(chēng)為vCP243(見(jiàn)實(shí)施例7)。
FHV模型中的免疫/攻擊方法如下。
在D0和D28通過(guò)皮下途徑對(duì)貓免疫接種。
疫苗CORIFELIN是Merial(法國(guó)，里昂)銷(xiāo)售的一種亞單位FHV疫苗，其含有至少200IDR單位的FHV病毒組分，25ug純化的貓杯狀病毒抗原，0.1mg的乙基汞硫代水楊酸鈉和1ml油性賦形劑QS。
利用FHV攻擊株通過(guò)口鼻途徑在D49進(jìn)行攻擊。
攻擊后14天進(jìn)行臨床監(jiān)測(cè)，注意臨床征兆(根據(jù)歐洲藥典的規(guī)則記錄臨床征兆)。
攻擊后根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估保護(hù)-每組的平均臨床分，與其他每組和對(duì)照組的平均臨床分相比較。
-攻擊后FHV病毒排泄的水平(攻擊后D0-D10每日一次準(zhǔn)備的咽拭子上病毒載量的測(cè)量)。
-在D0、D28、D49和D63收集的血樣中FHV中和抗體的滴度。
對(duì)于所有這些標(biāo)準(zhǔn)，每組的平均水平還與其他每組和對(duì)照組的平均水平相比較。
實(shí)施例13對(duì)于狗的應(yīng)用受試的重組病毒是表達(dá)Carre病病毒(犬瘟病毒，CDV)的HA和F基因的重組金絲雀痘病毒。該重組病毒稱(chēng)為vCP258(見(jiàn)實(shí)施例2)。
CDV模型中的免疫/攻擊方法如下。
在D0和D28通過(guò)皮下途徑對(duì)貓免疫接種。
疫苗EURICAN是Merial(法國(guó)，里昂)銷(xiāo)售的一種活疫苗。一商業(yè)劑量含有最少104pfu的CDV Onderstepoort疫苗株。
在D56用1/10稀釋度的CDV“Snyderhill”攻擊株(由USDA分批制備和提供)通過(guò)顱內(nèi)方式進(jìn)行攻擊。攻擊后21天進(jìn)行臨床監(jiān)測(cè)，注意臨床征兆(根據(jù)歐洲藥典規(guī)則記錄臨床征兆)。
攻擊后根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估保護(hù)-每組的平均臨床分，與其他每組和對(duì)照組的平均臨床分相比較。
-攻擊后CDV病毒血癥的水平(在D56、D61、D63、D66、D70、D77測(cè)定淋巴細(xì)胞中的病毒載量)。
-在D0、D14、D28、D42、D56、D63、D77的CDV中和抗體滴度。
對(duì)于所有這些標(biāo)準(zhǔn)，每組的平均水平還與其他每組和對(duì)照組的平均水平相比。
權(quán)利要求
1.丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物或馬來(lái)酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物以及含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼動(dòng)物皰疹病毒抗原的核苷酸序列的重組病毒載體在制備佐劑化的疫苗中的應(yīng)用，所述疫苗用于保護(hù)動(dòng)物不患所述皰疹病毒引起的疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述核苷酸序列編碼馬皰疹病毒EHV-1和/或EHV-4抗原，并且是生產(chǎn)用于保護(hù)馬不患所述皰疹病毒引起的疾病的佐劑化疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述佐劑含有聚羧乙烯聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述病毒載體含有痘病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述痘病毒選自痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、鴿痘病毒和豬痘病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中所述病毒載體是表達(dá)EHV-1和/或EHV-4的gB、gC和gD的重組金絲雀痘病毒。
7.丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物或馬來(lái)酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物以及含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼流感病毒抗原的核苷酸序列的重組病毒載體在制備佐劑化的疫苗中的應(yīng)用，所述疫苗用于保護(hù)動(dòng)物不患流感。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述核苷酸序列編碼馬流感病毒抗原，并且是生產(chǎn)用于保護(hù)馬不患馬流感的佐劑化疫苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述佐劑含有聚羧乙烯聚合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-8中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述病毒載體含有痘病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述痘病毒選自痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、鴿痘病毒和豬痘病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中所述病毒載體是含有編碼流感病毒HA的核苷酸序列的重組金絲雀痘病毒。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的應(yīng)用，該應(yīng)用是通過(guò)兩種或三種重組金絲雀痘病毒來(lái)實(shí)現(xiàn)的，每種金絲雀痘病毒含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼來(lái)自不同馬流感病毒株系的馬流感病毒HA的核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的應(yīng)用，該應(yīng)用是通過(guò)這樣的金絲雀痘病毒來(lái)實(shí)現(xiàn)的，即所述金絲雀痘病毒含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼兩種或三種來(lái)自不同馬流感病毒株系的馬流感病毒HA的核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中所述馬流感病毒株系是Prague、Kentucky和/或Newmarket。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中所述馬流感病毒株系是Prague、Kentucky和/或Newmarket。
17.根據(jù)權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中所述病毒載體是表達(dá)EHV-1和/或EHV-4的gB、gC和gD的重組金絲雀痘病毒。
18.丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物或馬來(lái)酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物以及含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼馬皰疹病毒抗原的核苷酸序列的重組病毒載體在制備佐劑化的疫苗中的應(yīng)用，所述疫苗用于在馬中誘導(dǎo)馬皰疹病毒排泄的顯著降低。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的應(yīng)用，其中所述佐劑含有聚羧乙烯聚合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的應(yīng)用，其中所述病毒載體含有痘病毒。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的應(yīng)用，其中所述痘病毒選自痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、鴿痘病毒和豬痘病毒。
22.丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物或馬來(lái)酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物以及含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼流感病毒抗原的核苷酸序列的重組病毒載體在制備佐劑化的疫苗中的應(yīng)用，所述疫苗用于在馬中誘導(dǎo)流感病毒排泄的顯著降低。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述佐劑含有聚羧乙烯聚合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述病毒載體含有痘病毒。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的應(yīng)用，其中所述痘病毒選自痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、鴿痘病毒和豬痘病毒。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述病毒載體是含有編碼流感病毒HA的核苷酸序列的重組金絲雀痘病毒。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的應(yīng)用，該應(yīng)用是通過(guò)兩種或三種重組金絲雀痘病毒來(lái)實(shí)現(xiàn)的，每種金絲雀痘病毒含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼來(lái)自不同馬流感病毒株系的馬流感病毒HA的核苷酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的應(yīng)用，該應(yīng)用是通過(guò)這樣的金絲雀痘病毒來(lái)實(shí)現(xiàn)的，即所述金絲雀痘病毒含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼兩種或三種來(lái)自不同馬流感病毒株系的馬流感病毒HA的核苷酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的應(yīng)用，其中所述馬流感病毒株系是Prague、Kentucky和/或Newmarket。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的應(yīng)用，其中所述馬流感病毒株系是Prague、Kentucky和/或Newmarket。
31.丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物或馬來(lái)酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物以及含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼流感病毒抗原的核苷酸序列的重組病毒載體在制備佐劑化的疫苗中的應(yīng)用，所述疫苗用于在馬中誘導(dǎo)針對(duì)所述流感病毒的抗體的早期產(chǎn)生。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的應(yīng)用，其中在單次給藥后即可觀察到抗體產(chǎn)生。
33.根據(jù)權(quán)利要求31-32中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述佐劑含有聚羧乙烯聚合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求31-32中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述病毒載體含有痘病毒。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中所述痘病毒選自痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、鴿痘病毒和豬痘病毒。
36.根據(jù)權(quán)利要求31或32的應(yīng)用，其中所述病毒載體是含有編碼流感病毒HA的核苷酸序列的重組金絲雀痘病毒。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的應(yīng)用，該應(yīng)用是通過(guò)兩種或三種重組金絲雀痘病毒來(lái)實(shí)現(xiàn)的，每種金絲雀痘病毒含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼來(lái)自不同馬流感病毒株系的馬流感病毒HA的核苷酸序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的應(yīng)用，該應(yīng)用是通過(guò)這樣的金絲雀痘病毒來(lái)實(shí)現(xiàn)的，即所述金絲雀痘病毒含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼兩種或三種來(lái)自不同馬流感病毒株系的馬流感病毒HA的核苷酸序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的應(yīng)用，其中所述馬流感病毒株系是Prague、Kentucky和/或Newmarket。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的應(yīng)用，其中所述馬流感病毒株系是Prague、Kentucky和/或Newmarket。
41.丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物或馬來(lái)酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物以及含有并在體內(nèi)表達(dá)編碼流感病毒抗原的核苷酸序列的重組病毒載體在制備佐劑化的疫苗中的應(yīng)用，所述疫苗用于保護(hù)鳥(niǎo)類(lèi)不患禽流感。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的應(yīng)用，其中所述佐劑含有聚羧乙烯聚合物。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的應(yīng)用，其中所述病毒載體含有痘病毒。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的應(yīng)用，其中所述痘病毒選自痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、鴿痘病毒和豬痘病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組活疫苗，其包含一種結(jié)合和體內(nèi)表達(dá)異源核苷酸序列、優(yōu)選一個(gè)病原因子基因的病毒載體，和至少一種選自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和馬來(lái)酸酐與鏈烯基衍生物的共聚物的佐劑化合物。特別涉及由糖或多元醇的多鏈烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物(聚羧乙烯聚合物)，尤其是由烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯(lián)。該佐劑化合物也可以是例如有由二乙烯醚交聯(lián)的馬來(lái)酸酐和乙烯的共聚物。
文檔編號(hào)A61K31/22GK1846786SQ20061000862
公開(kāi)日2006年10月18日 申請(qǐng)日期1999年3月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月3日
發(fā)明者J－C·F·奧登奈特, J·M·明克 申請(qǐng)人:梅瑞爾公司