專利名稱：無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種無指盤臭蛙(Rana grahami)丙精肽、基因和變異體及其在制藥中的應(yīng)用，屬生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor，serpin)的最基本的功能是防止蛋白質(zhì)水解，調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的水解平衡。通過對(duì)絲氨酸蛋白酶的調(diào)節(jié)，絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)生物體內(nèi)的許多重要的生理生化功能都有重要的影響。以下14類生理生化功能都受絲氨酸蛋白酶抑制劑的調(diào)節(jié)血液凝固、補(bǔ)體形成、纖溶、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞基質(zhì)重建、激素形成及轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解、血壓調(diào)節(jié)、腫瘤抑制以及病毒或寄生蟲致病性的形成。由于如此眾多的生理功能受其的調(diào)節(jié)，絲氨酸蛋白酶抑制劑已成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)。而其研究與開發(fā)則蘊(yùn)含著巨大的臨床治療藥物制備價(jià)值。
腫瘤是危害人類健康的一類主要疾病，而且治療藥物匱乏。據(jù)報(bào)道，惡性腫瘤僅在我國(guó)每年就新增加160萬病例，而且患病年齡逐漸年輕化。目前在化療中所使用的藥物，如阿霉素、環(huán)磷酰胺、腫瘤壞死因子等均具有較大的人體毒性，副作用非常的大，因而腫瘤治療藥物的開發(fā)是藥物研制的熱點(diǎn)。腫瘤擴(kuò)張和轉(zhuǎn)移是目前臨床治療腫瘤效率低下的重要原因之一。絲氨酸蛋白酶抑制劑maspin在體內(nèi)和體外對(duì)腫瘤都有明顯的抑制作用，其作用機(jī)理在于抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和血管形成。
據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，絲氨酸蛋白酶抑制劑如aprotinin除已在臨床上廣泛用于胃炎、胰腺炎等疾病的治療外，也在胸外科手術(shù)中用于抗纖溶，抑制接觸性激活、抗炎癥等。絲氨酸蛋白酶類似物如Kallikrein，tryptase在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及許多炎癥中(如鼻炎、結(jié)膜炎、哮喘、胃腸炎、心血管系統(tǒng)炎癥)發(fā)生中起著重要的作用。臨床試驗(yàn)證明其抑制劑是有效的治療藥物。另一方面，目前臨床上還沒有有效地治療皰疹病毒感染的藥物，近年來發(fā)現(xiàn)抑制皰疹病毒絲氨酸蛋白酶是有效的治療手段。上述這些新的絲氨酸蛋白酶抑制劑藥物已處于II，III期臨床階段和已經(jīng)商品化。
在中國(guó)的傳統(tǒng)中藥和民族醫(yī)藥中，許多兩棲類動(dòng)物被作為藥材而被廣泛的應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylaranaguentheri)和澤蛙(Euphlyctislimnocharis)等。這些兩棲類動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效，已報(bào)道藥理活性有廣譜抗菌作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、對(duì)心血管系統(tǒng)的作用等，另一方面，傳統(tǒng)中藥藥物成分的復(fù)雜性及其炮制方法的局限性也是造成藥物活性成分不能更好發(fā)揮作用的重要原因，因而從這些傳統(tǒng)藥物中尋找特定的活性單體化合物是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容之一。在國(guó)外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已經(jīng)成為新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。國(guó)外學(xué)者已從東方鈴蟾中分離出一低分子量具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的多肽BSTI，而國(guó)內(nèi)學(xué)者從大蹼鈴蟾中分離到了具有絲氨酸蛋白酶抑制作用的多肽BMTI。從蟾蜍和林蛙皮膚中得到了具有舒張血管和降壓作用的bufokinin和ranakinin。從北美豹蛙和阿伯蛙中分離到了具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用的亮精肽和酪精肽。近十幾年對(duì)170多種兩棲類皮膚活性肽和類似物進(jìn)行了篩選，證明有40多種活性肽有較好的藥物開發(fā)前景。
我國(guó)對(duì)兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對(duì)其皮膚活性蛋白肽類物質(zhì)的研究還較少。無指盤臭蛙主要分布于我國(guó)的云南，四川和廣西等省，是我國(guó)的特色資源動(dòng)物之一。而目前關(guān)于無指盤臭蛙皮膚活性物質(zhì)的研究還鮮有報(bào)道。
發(fā)明人將本發(fā)明的無指盤臭蛙丙精肽及其變異體全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。發(fā)明人將本發(fā)明的無指盤臭蛙丙精肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一組具有強(qiáng)烈的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性，同時(shí)具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性和免疫調(diào)節(jié)活性的無指盤臭蛙指盤臭蛙丙精肽、其基因和各種變異體在制藥中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案無指盤臭蛙丙精肽無指盤臭蛙丙精肽是中國(guó)兩棲類動(dòng)物無指盤臭蛙基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量2188.68道爾頓，等電點(diǎn)10.07，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性.無酶活性，無指盤臭蛙丙精肽全序列為Ala1-Ala2-Leu3-Lys4-Gly5-Cys6-Trp7-Thr8-Lys9-Ser10-Ile11-Pro12-Pro13-Lys14-Pro15-Cys16-Phe17-Gly18-Lys19-Arg20，其第6位的半胱氨酸和第16位的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
無指盤臭蛙丙精肽基因的克隆包括無指盤臭蛙皮膚總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法篩選無指盤臭蛙蛋白酶抑制劑基因。擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為23個(gè)核苷酸，其序列為5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT 3’，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列為5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。所獲陽性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測(cè)定?；驕y(cè)序結(jié)果表明編碼無指盤臭蛙丙精肽的基因由304個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggatcat ctccttatct60ttccgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gatgatggag gggaagttac aggggaagaa120
gtaaaaagag ctgcactcaa agggtgctgg accaagagta taccaccaaa gccttgtttt180ggaaaaagat aaaacttgaa atggaaatca tctgatgtgg aatatcattt agctaaatgc240taaatgtctg ataaaaaata aaatatattg cacgtacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaa 304編碼成熟無指盤臭蛙丙精肽序列的為第130-189位核苷酸，其氨基酸序列為Ala Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg1 5 10 15 20利用蛋白組學(xué)方法設(shè)計(jì)無指盤臭蛙丙精肽的變異體，其變異體如下丙精肽2，第1位和第2位的丙氨酸同時(shí)缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg丙精肽3，第1位的丙氨酸和第20位的精氨酸同時(shí)缺失Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys丙精肽4，第1、2的丙氨酸和第20位的精氨酸同時(shí)缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys丙精肽5，第1、2的丙氨酸、第19位的賴氨酸和第20位的精氨酸同時(shí)缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly。
無指盤臭蛙丙精肽及其變異體的制備方法根據(jù)編碼無指盤臭蛙丙精肽的基因推斷無指盤臭蛙丙精肽的氨基酸序列，利用蛋白組學(xué)方法設(shè)計(jì)無指盤臭蛙丙精肽的突變體，用自動(dòng)多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。然后用HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體作為制備治療腫瘤、胃炎、胰腺炎藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在于由無指盤臭蛙丙精肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，利用蛋白組學(xué)方法設(shè)計(jì)無指盤臭蛙丙精肽的突變體，合成的無指盤臭蛙丙精肽及其突變體具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。該無指盤臭蛙丙精肽及其突變體具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便、抑制腫瘤效果明顯的有益特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
無指盤臭蛙丙精肽基因克隆I、無指盤臭蛙皮膚總RNA提取
A.活體無指盤臭蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時(shí)，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國(guó)GIBCOBRL公司產(chǎn)品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘。
B.加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。
C.上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為無指盤臭蛙皮膚總RNA。
II、無指盤臭蛙皮膚mRNA的純化無指盤臭蛙皮膚mRNA分離純化采用美國(guó)PROMEGA公司的PolyATtractmRNAIsolation Systems試劑盒。
A.取無指盤臭蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分鐘，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。
B.磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。
C.將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的無指盤臭蛙皮膚mRNA。
D.加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
III、無指盤臭蛙皮膚cDNA文庫構(gòu)建采用CLONTECH公司CreatorTMSMARTTMcDNALibrary Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒。
A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)1.在0.5ml無菌的離心管加入1μl無指盤臭蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達(dá)到5μl。
2.混勻離心管中的試劑并短暫離心，72℃保溫2分鐘。
3.將離心管在冰上孵育2分鐘。
4.在離心管中加入以下試劑2.0μ15×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶。
5.混合離心管中試劑并短暫離心，在42℃保溫1小時(shí)。
6.將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。
7.從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。
B.采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈
1.95℃預(yù)熱PCR儀。
2.將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)。
3.在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增①95℃20秒鐘②22個(gè)循環(huán)95℃5秒鐘68℃6分鐘4.循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行抽提。
C.PCR產(chǎn)物用PROMEGA公司的WizardSV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下1.將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
2.加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
3.重復(fù)步驟2。
4.16,000g離心5分鐘。
5.將離心純化柱置于新的離心管中。
6.加入30μl超純水，在室溫下靜置5分鐘。
7.16,000g離心1分鐘，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。
D.大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備1.挑取單個(gè)DH5α菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于50ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩2小時(shí)。當(dāng)OD600值達(dá)到0.35時(shí)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。
2.將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。
3.于4℃以4100r/min離心10min，以回收細(xì)胞。
4.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。
5.每50ml初始培養(yǎng)液且30ml預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀。
6.于4℃以4100r/min離心10min，以回收細(xì)胞。
7.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。
8.每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀，分裝后備用。
E.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1.在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl無指盤臭蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。
2.加入5μl(等量)的連接酶緩沖混合物。
3.16℃反應(yīng)2小時(shí)。
4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。
5.42℃加熱90秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。
6.加入37℃溫浴過的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。
7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16小時(shí)，形成單菌落。
8.每個(gè)LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含1×106個(gè)單獨(dú)克隆。
IV、無指盤臭蛙丙精肽基因克隆篩選擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為23個(gè)核苷酸，其序列為5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT 3’，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的3’PCRPrimer引物，其序列為5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。
PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行94℃ 30秒鐘，60℃ 30秒鐘和72℃ 45秒鐘，35個(gè)循環(huán)。
首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個(gè)細(xì)菌/毫升，和30個(gè)細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μl)，37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個(gè)樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。
V、無指盤臭蛙丙精肽基因序列測(cè)定和結(jié)果提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，使用儀器為美國(guó)AppliedBiosystems373A全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為BcaBESTTMSequencing PrimerRV-M和BcaBESTTMSequencing Primer M13-47，BcaBESTTMSequencing Primer RV-M序列5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBESTTMSequencing Primer M13-475’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’?；驕y(cè)序結(jié)果自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggatcat ctccttatct60ttccgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gatgatggag gggaagttac aggggaagaa120gtaaaaagag ctgcactcaa agggtgctgg accaagagta taccaccaaa gccttgtttt180ggaaaaagat aaaacttgaa atggaaatca tctgatgtgg aatatcattt agctaaatgc240taaatgtctg ataaaaaata aaatatattg cacgtacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaa 304
無指盤臭蛙丙精肽基因核苷酸的序列表為序列長(zhǎng)度為304個(gè)堿基，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀，序列種類cDNA，來源無指盤臭蛙皮膚。
編碼成熟無指盤臭蛙丙精肽氨基酸序列的為第130-189位核苷酸，其氨基酸序列為Ala Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg1 5 10 15 20無指盤臭蛙丙精肽基因作為基因工程制備無指盤臭蛙丙精肽的應(yīng)用。
無指盤臭蛙丙精肽變異體作為蛋白質(zhì)工程制備指盤臭蛙丙精肽變異體的應(yīng)用。
制備無指盤臭蛙丙精肽及其變異體I、無指盤臭蛙丙精肽的制備方法根據(jù)編碼無指盤臭蛙丙精肽的基因推斷無指盤臭蛙丙精肽的氨基酸序列，利用蛋白組學(xué)方法設(shè)計(jì)無指盤臭蛙丙精肽的突變體，用自動(dòng)多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。
II、分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，以甘油∶間硝基芐醇∶二甲亞砜(1∶1∶1，V∶V∶V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。
III、純化的無指盤臭蛙丙精肽及其變異體用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
無指盤臭蛙丙精肽是中國(guó)兩棲類動(dòng)物無指盤臭蛙基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量2188.68道爾頓，等電點(diǎn)10.07，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性.無酶活性，無指盤臭蛙丙精肽全序列為Ala1-Ala2-Leu3-Lys4-Gly5-Cys6-Trp7-Thr8-Lys9-Ser10-Ile11-Pro12-Pro13-Lys14-Pro15-Cys16-Phe17-Gly18-Lys19-Arg20，其第6位的半胱氨酸和第16位的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
無指盤臭蛙丙精肽變異體是通過蛋白組學(xué)的方法設(shè)計(jì)的一組具有改良的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的環(huán)狀多肽.無酶活性，它們的全序列如下丙精肽2，Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly-Lys-Arg丙精肽3，Ala-Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly-Lys丙精肽4，Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly-Lys丙精肽5，Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly
無指盤臭蛙抗菌肽的藥理實(shí)驗(yàn)1.無指盤臭蛙丙精肽及其變異體抑制絲氨酸蛋白酶的作用不同量的無指盤臭蛙丙精肽及其變異體溶解于0.05M Tris-HCl緩沖液與一定量的胰蛋白酶(最終濃度為40μg/ml)于0.05M Tris-HCl緩沖液于室溫下保溫2min，最后加入發(fā)色底物S-2238(終濃度為40μg/ml)啟動(dòng)反應(yīng)，應(yīng)用PERKIN ELMER(美國(guó))公司生產(chǎn)的分光光度計(jì)于處監(jiān)測(cè)吸收值變化2min，加入同樣體積的0.05M Tris-HCl緩沖液與空白對(duì)照，抑制常數(shù)Ki＝[I]/(V0/VI+1)計(jì)算。[I]為無指盤臭蛙丙精肽及其變異體的摩爾濃度，V0為空白對(duì)照是胰蛋白酶與發(fā)色底物的反應(yīng)速度，V1為加入無指盤臭蛙丙精肽及其變異體后胰蛋白酶與發(fā)色底物的反應(yīng)速度。此試驗(yàn)重復(fù)六次，取平均值。
無指盤丙精肽及其變異體均能很有效地抑制胰蛋白酶的活性，在上述試驗(yàn)條件下抑制半數(shù)胰蛋白酶活性所需要的無指盤臭蛙丙精肽及其變異體濃度及其抑制常數(shù)Ki見表1。
表1 無指盤臭蛙丙精肽及其變異體對(duì)絲氨酸蛋白酶的抑制作用

2.無指盤臭蛙丙精肽及其變異體抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將待測(cè)樣品用完全培養(yǎng)基進(jìn)行5倍或2倍倍比稀釋，共六個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每孔100μl，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照。每孔滴加3×105個(gè)/ml的HepG2、C8166和Molt-4細(xì)胞100μl。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48小時(shí)后用MTT法測(cè)定待測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。EC50是對(duì)50％宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用時(shí)的濃度。
表1 無指盤臭蛙丙精肽及其變異體抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用

由表1可見，無指盤臭蛙丙精肽及其變異體能顯著抑制肝腫瘤細(xì)胞系(HepG2)和兩種淋巴細(xì)胞系(C8166和Molt-4)的生長(zhǎng)，這表明無指盤臭蛙丙精肽及其變異體具有很強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)免役的作用，并表現(xiàn)出改良的性能，同時(shí)還具有序列簡(jiǎn)單、合成方便等優(yōu)點(diǎn)?？勺鳛橹苽渲委熌[瘤、胃炎、胰腺炎藥物的應(yīng)用。
無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體及其在制藥中的應(yīng)用.seqSEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所<120>無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體及其在制藥中的應(yīng)用<130>1<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>304<212>DNA<213>Rana grahami<400>1atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggatcat ctccttatct60ttccgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gatgatggag gggaagttac aggggaagaa120gtaaaaagag ctgcactcaa agggtgctgg accaagagta taccaccaaa gccttgtttt180ggaaaaagat aaaacttgaa atggaaatca tctgatgtgg aatatcattt agctaaatgc240taaatgtctg ataaaaaata aaatatattg cacgtacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaa 304<210>2<211>20<212>PRT<213>Rana grahami<400>2Ala Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys1 5 10 15Phe Gly Lys Arg20
權(quán)利要求
1.無指盤臭蛙丙精肽，其特征在于該無指盤臭蛙丙精肽是中國(guó)兩棲類動(dòng)物無指盤臭蛙基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量2188.68道爾頓，等電點(diǎn)10.07，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性。無酶活性，無指盤臭蛙丙精肽全序列為Ala1-Ala2-Leu3-Lys4-Gly5-Cys6-Trp7-Thr8-Lys9-Ser10-Ile11-Pro12-Pro13-Lys14-Pro15-Cys16-Phe17-Gly18-Lys19-Arg20，其第6位的半胱氨酸和第16位的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
2.無指盤臭蛙丙精肽基因核苷酸序列，其特征在于cDNA由304個(gè)核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggatcat ctccttatct 60ttccgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gatgatggag gggaagttac aggggaagaa120gtaaaaagag ctgcactcaa agggtgctgg accaagagta taccaccaaa gccttgtttt180ggaaaaagat aaaacttgaa atggaaatca tctgatgtgg aatatcattt agctaaatgc240taaatgtctg ataaaaaata aaatatattg cacgtacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaa 304。
3.權(quán)利要求2所述的無指盤臭蛙丙精肽基因核苷酸序列，其特征在于，編碼成熟無指盤臭蛙丙精肽序列的為第130-189位核苷酸，其氨基酸序列為Ala Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg1 5 10 15 20。
4.無指盤臭蛙丙精肽的變異體，其特征在于其變異體如下丙精肽2，第1位和第2位的丙氨酸同時(shí)缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg丙精肽3，第1位的丙氨酸和第20位的精氨酸同時(shí)缺失Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys丙精肽4，第1、2的丙氨酸和第20位的精氨酸同時(shí)缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys丙精肽5，第1、2的丙氨酸、第19位的賴氨酸和第20位的精氨酸同時(shí)缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly。
5.無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體的應(yīng)用，其特征在于無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體作為制備治療腫瘤、胃炎、胰腺炎藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體及其在制藥中的應(yīng)用，屬生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。無指盤臭蛙丙精肽是一種環(huán)狀多肽，分子量2188.68道爾頓，等電點(diǎn)10.07，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性.無酶活性，無指盤臭蛙丙精肽全序列為NH
文檔編號(hào)A61K38/57GK1850857SQ20061001093
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月30日
發(fā)明者賴仞, 李建許, 李東升, 徐學(xué)清, 韓耀平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所