專利名稱：一種抗流感和禽流感病毒的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，涉及一種抗流感和禽流感病毒的藥物及其制備、檢測方法。
背景技術(shù)：
流行性感冒簡稱流感(Influenza)，是由流感病毒(Influenza Virus，IFV)引起的一種人、畜共患的急性呼吸道疾病，具有傳染性強(qiáng)、流行面廣、發(fā)病率和死亡率高等特點(diǎn)。有證據(jù)表明，每年冬季流感爆發(fā)期全球約有10％的人感染發(fā)病，每年全球大約有50萬人死于各種流感和因流感引起的并發(fā)癥。禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一種禽類烈性傳染病，對養(yǎng)禽業(yè)危害巨大，并威脅著人類的生命健康。2003年12月以來，首先在亞洲爆發(fā)的高致病性H5N1亞型禽流感已蔓延到除非洲以外的多個國家和地區(qū)，造成數(shù)千萬只禽鳥感染而死亡，全球先后共有70余人因感染禽流感病毒而死亡。這場席卷全球的禽流感疫情至今還未得到有效控制。
目前國內(nèi)外對家禽禽流感的控制措施主要包括撲殺、消毒、生物安全與疫苗接種。預(yù)防禽流感發(fā)生的有效措施是接種疫苗，當(dāng)接種的疫苗與臨床流行的毒株亞型一致時，可獲得理想的保護(hù)效果；但接種的疫苗與流行毒株亞型不同時，就不能獲得免疫保護(hù)。禽流感病毒血清亞型眾多，不同亞型的A型流感病毒混合感染時就會發(fā)生基因重組，形成新的禽流感病毒，這給疫苗的研制和應(yīng)用帶來很大困難。生產(chǎn)實踐中經(jīng)常發(fā)生因接種的疫苗與流行毒株亞型不配而導(dǎo)致免疫失敗的案例。因此僅僅依靠禽流感疫苗難以完全控制禽流感的發(fā)生與流行，藥物防治也是控制禽流感發(fā)生、蔓延以及禽傳人的重要措施。
病毒是一類嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的非細(xì)胞型微生物，依賴宿主的細(xì)胞代謝進(jìn)行復(fù)制。抗病毒藥物治療的困難在于藥物在阻斷病毒復(fù)制的同時而不能影響宿主細(xì)胞的正常代謝。因此目前大多數(shù)病毒感染尚無有效治療藥物，抗流感病毒藥物的研究也一直沒有大的突破。近年來，人們對流感病毒表面抗原“神經(jīng)氨酸酶(NA)”認(rèn)識的深入為抗流感新藥的開發(fā)提供了新的途徑。1999年先后上市了兩種NA抑制劑Glaxo Wellcome公司的Zanamivir(扎那米韋)和Roche公司的Oseltamivir(奧司米韋，商品名Tamiflu)。臨床試驗證明，這兩種NA抑制劑可以有效地阻斷流感病毒的復(fù)制過程，預(yù)防用藥和早期用藥療效顯著，不易產(chǎn)生耐藥性，并對所有的流感病毒亞型均有效。但由于這兩種藥物合成步驟復(fù)雜、價格昂貴，目前僅在少數(shù)發(fā)達(dá)國家用于人類流感的防治。
中醫(yī)中藥是我國獨(dú)有的醫(yī)學(xué)體系，博大精深。千百年來，在防治感冒和流感的斗爭中，中醫(yī)中藥發(fā)揮了重要作用。貫眾為多種蕨類植物的干燥根莖，作為中藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、微寒、有小毒，具有清熱解毒、驅(qū)蟲、止血等功效。臨床上用于治療風(fēng)熱感冒、肝炎、濕熱癍疹、吐血、便血及崩漏等疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明貫眾具有抗菌、抗病毒、抗白血病、抗腫瘤、促進(jìn)子宮平滑肌收縮、驅(qū)蟲等藥理作用。盡管綿馬貫眾的藥用歷史悠久，但有關(guān)它的藥效成分、藥理作用等的研究報道卻較少。蘭州佛慈制藥股份有限公司朱榮祖等(專利申請?zhí)?3108749.3)以綿馬貫眾為君藥，配以板藍(lán)根、野菊花、山豆根、阿司匹林、馬來酸氯苯那敏等研制的中西藥復(fù)方制劑“復(fù)方貫眾阿司匹林片”，用于防治感冒和流感有顯著效果，但該專利沒有涉及綿馬貫眾抗流感病毒的藥效成分。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的旨在提供一種抗流感和禽流感病毒的藥物，并提供其制備和檢測方法。
(二)技術(shù)方案本發(fā)明提供的抗流感和禽流感病毒的藥物有效成分和/或醫(yī)藥學(xué)上可以接受的輔料組成，所述有效成分是貫眾提取物，它是通過以下方法制備得到的
將貫眾塊根粉粹，用體積重量比4-10倍的50-90％的乙醇水溶液回流提取2-4次，合并提取液，濃縮，以水溶解濃縮液至水溶液重量為貫眾藥材重量的1-1.5倍，依次用乙酸乙酯和正丁醇分別萃取2-3次，每次用萃取液的體積與貫眾水溶液體積為1∶1，合并正丁醇萃取液，揮發(fā)正丁醇，濃縮得膏狀液體，干燥，即得。
所述膏狀液體的干燥可以是低溫烘干或噴霧干燥，干燥后所得的貫眾提取物為紅棕色或棕黑色。
本發(fā)明所得的貫眾提取物對人和動物流感、禽流感具有預(yù)防和治療作用。可以按照常規(guī)制劑工藝，將本發(fā)明所述的貫眾提取物制備成任何一種適合于臨床使用的制劑，例如散劑、片劑、膠囊、口服液等。
本發(fā)明還提供了所述抗流感和禽流感病毒的藥物的檢測方法，是用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀對貫眾提取物進(jìn)行分析以獲得提取物的指紋圖譜。其色譜分析條件為色譜柱XDB-C18柱(150mm×2.1mmi.d.，3.5um)；二元梯度洗脫，A相為乙腈，B相為水，均含1％甲酸，流速為0.5mL/min。質(zhì)譜條件為ESI離子源，正、負(fù)離子模式檢測；APCI離子源，正離子模式檢測；自動3級質(zhì)譜(自動選擇最強(qiáng)離子進(jìn)行源內(nèi)誘導(dǎo)裂解)。
優(yōu)選的色譜條件色譜柱XDB-C18柱(150mm×2.1mm i.d.，3.5um)；二元梯度洗脫，A相為乙腈，B相為水，均含1％甲酸；梯度程序20％A相，保持2min，逐漸增加A相比例，至50min時A相為100％，保持10min；流速0.5mL/min；進(jìn)樣量20μL。
優(yōu)選的質(zhì)譜條件ESI及APCI離子源，正、負(fù)離子模式檢測；霧化器N2壓力40psi；干燥氣N2流速9L/min；質(zhì)量掃描范圍100～1000u；自動3級質(zhì)譜(自動選擇最強(qiáng)離子進(jìn)行源內(nèi)誘導(dǎo)裂解)。
經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)分析，貫眾提取物中的主要成分是間苯三酚衍生物的低聚物，包括根皮吡喃酮PB、黃綿馬酸AA、白綿馬素AA、綿馬素AA、綿馬素AP、黃綿馬酸AB、綿馬酸ABA、綿馬根酸ABA、綿馬酸ABB、綿馬酸PBP、東北貫眾素ABAA、東北貫眾素ABPP、東北貫眾素ABBP、東北貫眾素PBBP等。其中根皮吡喃酮PB、黃綿馬酸AA、綿馬素AA、綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬酸ABB、綿馬酸PBP、東北貫眾素ABPP、東北貫眾素PBBP等9種化合物為首次在綿馬貫眾中發(fā)現(xiàn)的新化合物。
在APCI(+)和ESI(-)兩種檢測模式得到的總離子流色譜中，含有多聚間苯三酚衍生物的組分峰面積之和分別占全部組分色譜峰面積的61.6％和77.8％。其中分子量為404Da的綿馬素AA或白綿馬素AA、分子量為612 Da的綿馬根酸ABA或綿馬酸ABP、分子量為626Da的綿馬酸ABB在貫眾提取物中的含量較高。
(三)有益效果本發(fā)明首次提供了貫眾提取物在制備抗流感和禽流感病毒的藥物中的應(yīng)用，并且提供了應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)分析技術(shù)及結(jié)果構(gòu)建綿馬貫眾提取物指紋圖譜的方法。該方法包括貫眾提取物的HPLC-MS分析條件、色譜峰的特征、色譜組分的質(zhì)譜提供的化合物結(jié)構(gòu)信息等。本發(fā)明公開的指紋圖譜及其技術(shù)可用于綿馬貫眾的品種鑒別及貫眾提取物的質(zhì)量監(jiān)控。


圖1為貫眾提取物HPLC-APCI-MS(+)分析總離子流色譜2為貫眾提取物HPLC-ESI-MS(+)分析總離子流色譜3為貫眾提取物HPLC-ESI-MS(-)分析總離子流色譜4為多聚間苯三酚衍生物的準(zhǔn)分子離子結(jié)構(gòu)及其質(zhì)譜裂解途徑推測具體實施方式
通過下面給出的本發(fā)明的具體實施例可以進(jìn)一步清楚地理解本發(fā)明，但下述實施例不是對本發(fā)明的限定。
實施例1 貫眾提取物的制備取綿馬貫眾塊根，粉粹至全部過40目篩，用80％的乙醇水溶液回流提取2次，貫眾粉占乙醇水溶液的15％(W/V)，合并提取液，減壓蒸餾濃縮，揮發(fā)回收乙醇，剩余提取物加適量水溶解，貫眾水溶液的重量為貫眾的1.5倍，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別萃取3次，每次所用萃取液的體積與貫眾水溶液相當(dāng)，合并正丁醇萃取液，減壓蒸餾濃縮，揮干回收正丁醇，得膏狀液體，低溫烘干、粉粹，得紅棕色或粽黑色粉末，即為貫眾提取物。
實驗例1 本發(fā)明藥物對雞胚內(nèi)流感病毒(H9N2株)增殖的抑制作用1.實驗材料禽流感病毒株A/Chicken/Guangdong/3/2004(H9N2)。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院分離、純化、保存及鑒定。(該病毒為低致病性禽流感病毒，除華南農(nóng)業(yè)大學(xué)外，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、中國疾病預(yù)防與控制中心病毒研究所、中國科學(xué)院武漢病毒研究所病毒保藏中心等單位均有保藏。申請人所在單位有國家農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的生產(chǎn)H9亞型禽流感疫苗的生產(chǎn)許可證(2003新獸藥證字第35號)。其分離和鑒定方法參見文獻(xiàn)1.畢英佐，曹永長，朱基美等.廣東禽流感的血清學(xué)調(diào)查[J]，中國畜禽傳染病，1998，20(1)32-34；2.秦愛建，邵紅霞，錢琨等.抗禽流感病毒H5和H9亞型血凝素特異性單克隆抗體的研制與應(yīng)用[J]，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2003，25(3)161-163。)試驗用雞胚9日齡SPF雞胚，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)科技中心提供。
試驗用藥物貫眾提取物自行制備，選用藥材為綿馬貫眾，任意來源的綿馬貫眾應(yīng)均可在此使用。
HA試驗用紅細(xì)胞為0.5％的雞紅細(xì)胞，自行配制。
2.試驗方法用雞胚試驗測定貫眾提取物的半數(shù)致死劑量LD50，確定適當(dāng)?shù)乃幬飫┝浚挥秒u胚試驗測定禽流感病毒對雞胚的半數(shù)感染量EID50，確定適當(dāng)?shù)墓ザ緷舛取２捎孟冉o藥物后攻毒與先攻毒后給藥兩種不同給藥方式進(jìn)行雞胚試驗，確定藥物的預(yù)防及治療效果。
2.1藥物對雞胚的半數(shù)致死劑量LD50的測定貫眾提取物先用少量1，2-丙二醇(不超過溶劑量的20％)溶解，加生理鹽水配成5.00％的溶液，倍比稀釋為2.50％、1.25％、0.62％、0.32％共5個濃度梯度，9只胚/組，0.2mL/胚，觀察72小時。對胚不致死、不影響胚體正常發(fā)育者判為安全。按Reed-Muench兩氏法計算半數(shù)中毒(致死)劑量。
2.2藥物劑量的選擇根據(jù)2.1測得的貫眾提取物對雞胚的LD50結(jié)果，按雞胚全部存活的最高安全藥物濃度為雞胚內(nèi)抑制流感病毒的起始濃度，倍比稀釋，設(shè)5個濃度組進(jìn)行實驗。同時設(shè)生理鹽水對照組和西藥金剛烷胺對照組。
2.3流感病毒(H9N2株)雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測定將病毒原液(H9N2株)用滅菌生理鹽水按10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12共8個濃度梯度稀釋，接種9日齡雞胚，每個稀釋度接種9枚胚，0.2mL/胚，37℃孵育96小時，24小時內(nèi)死亡的胚棄去，測定24小時后死亡胚的HA效價，大于4孔為陽性，按Reed-Muench兩氏法計算EID50。
2.4藥物對雞胚內(nèi)流感病毒(H9N2)的抑制作用測定每只胚攻毒量為100倍EID50(0.2mL)，尿囊腔接種及給藥，12只胚/組，給藥0.2mL/胚。預(yù)防用藥在給藥后1h后攻毒，治療用藥在攻毒后1h給藥。37℃孵育96小時，期間每天照胚2次，24小時內(nèi)死亡的胚棄去。統(tǒng)計胚的死亡情況，并測定雞胚尿囊液的HA效價。
3.結(jié)果按2.1測得貫眾提取物對雞胚的LD50為10.0mg/胚(5.0％，0.2mL)，最高安全藥物濃度為5.0mg/胚(2.5％，0.2mL)。金剛烷胺水溶液對雞胚的LD50為3.5mg/胚。按2.3測得流感病毒(H9N2株)對雞胚的EID50為10-9，因此試驗攻毒濃度為10-7(100EID50)。藥效試驗各組雞胚死亡情況及不同劑量貫眾提取物對流感病毒(H9N2株)雞胚內(nèi)增殖的抑制作用測定結(jié)果見表1-1。結(jié)果表明100EID50的攻毒量導(dǎo)致雞胚死亡的數(shù)量較少，只有金剛烷胺高劑量組死亡率較高(3/12)，其它試驗組死胚1-2枚或不死亡，表明本試驗采用的H9N2毒株的毒力較弱。但感染對照組的HA效價平均值為11.3，表明該毒株的繁殖力較強(qiáng)。貫眾提取物5.00mg、2.50mg、1.25mg三劑量組不論是預(yù)防用藥還是治療用藥，胚囊液的HA效價均為0；0.625mg劑量的預(yù)防組HA為0，治療組HA為2.3；而金剛烷胺1.25mg劑量預(yù)防組和治療組的HA效價分別是1.8和3.2，0.625mg劑量預(yù)防組和治療組的HA效價分別是4.6和5.8，比相同濃度的貫眾提取物的HA都高，表明貫眾提取物對H9N2流感病毒有顯著抑制作用，其抑制效果明顯優(yōu)于金剛烷胺。
表1-1不同劑量貫眾提取物對流感病毒(H9N2株)雞胚內(nèi)增殖的抑制作用測定結(jié)果

注與感染對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01實驗例2 本發(fā)明藥物對小鼠人工感染流感病毒的藥效學(xué)試驗1.實驗材料試驗動物昆明小鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)(廣州)實驗動物中心提供。
試驗藥物貫眾提取物粉，自行制備，每克貫眾提取物相當(dāng)于2.6g生藥。選用藥材為綿馬貫眾。
A型流感病毒FM1鼠肺適應(yīng)株來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究所。
2.試驗方法及結(jié)果2.1貫眾提取物對小鼠的急性毒性試驗昆明小鼠20只，重量19～21克，隨機(jī)分組為4組，每組5只，灌<p>小鼠注射脂多糖24h后，開始觀察到有小鼠的死亡，繼續(xù)觀察至72h。各組小鼠的死亡情況見表4。從表中可看出蝮蛇毒有效組分能顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率，低劑量組降低15％，中劑量組降低55％，高劑量組降低65％。
表4蝮蛇毒有效組分降低膿毒癥小鼠死亡率的試驗結(jié)果

實施例5在實施例4下“用蝮蛇毒有效組分對膿毒癥實驗小鼠的作用”中以先注射脂多糖，再注射蝮蛇毒有效組分做替換，也得到了相類似的試驗結(jié)果。
實施例6用烙鐵頭蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預(yù)防和治療膿毒癥作用的烙鐵頭蛇毒有效組分。
實施例7用白眉蝮蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預(yù)防和治療膿毒癥作用的白眉蝮蛇毒有效組分。
實施例8用眼鏡王蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預(yù)防和治療膿毒癥作用的眼鏡王蛇毒有效組分。
實施例9用尖吻蝮蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預(yù)防和治療膿毒癥作用的尖吻蝮蛇毒有效組分。
實施例10用眼鏡蛇毒替換實施例1-5中的蝮蛇毒，也得到了類似的具有預(yù)防和治療膿毒癥作用的眼鏡蛇毒有效組分。
實施例11
結(jié)果表明貫眾提取物0.9g/kg和2.7g/kg劑量組能明顯降低A型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)值，肺指數(shù)抑制率分別為19.58％和27.97％。其降低效果比金剛烷胺組效果好(P＜0.05)。
2.3對流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用選取11-13g體重的昆明鼠110只，雌雄兼用，按體重隨機(jī)分為6組，分別為正常對照組、病毒對照組、金剛烷胺組，貫眾提取物高、中、低劑量組、正常對照組10只，其余各組均為20只。感染前一天起給藥，每天上下午各給藥1次，連續(xù)給藥5天。正常對照組和病毒對照組均灌喂等容生理鹽水。給藥后第二天，除正常對照組外，其余各組小鼠在乙醚輕度麻醉下，以20倍LD50流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1滴鼻感染。觀察小鼠感染后的發(fā)病情況，記錄感染后15天內(nèi)小鼠的死亡只數(shù)，結(jié)果見表2-3。結(jié)果表明，貫眾提取物0.9g/kg和2.7g/kg劑量組對A型流感病毒感染小鼠死亡具有明顯的保護(hù)作用，死亡保護(hù)率分別為50％和65％(P＜0.01)，小鼠的平均存活天數(shù)由感染對照組的7.3天分別提高到11.5天和12.9天(P＜0.01)。
表2-3貫眾提取物對流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用


注與病毒對照組比較**P＜0.01，*P＜0.05，與金剛烷胺組比較#P＜0.05。
實驗例3 貫眾提取物HPLC-ESI/APCI-MS分析及圖譜的指紋特征分析1.實驗部分1.1試劑與樣品乙腈為HPLC級，水為MiliQ超純水，甲酸、石油醚(60-90℃沸程)、乙酸乙酯、正丁醇及95％的乙醇均為分析純。
1.2樣品處理50g綿馬貫眾粉碎成粗粉，用500mL50％的乙醇水溶液分3次加熱回流提取，合并提取液，減壓旋蒸至膏狀后用50mL水溶解，分別用50mL乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，將正丁醇萃取液合并旋蒸近干后減壓干燥，加適量甲醇溶解，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析。
1.3儀器及條件美國Agilent公司1100系列液相色譜—離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀及工作站。色譜柱XDB-C18柱(150mm×2.1mm i.d.，3.5um)；二元梯度洗脫，A相為乙腈，B相為水，均含1％甲酸；梯度程序20％A相，保持2min，逐漸增加A相比例，至50min時A相為100％，保持10min；流速0.5mL/min；進(jìn)樣量20μL。
質(zhì)譜條件ESI離子源，正、負(fù)離子模式檢測；APCI離子源，正離子模式檢測；霧化器N2壓力40psi；干燥氣N2流速9L/min；質(zhì)量掃描范圍100-1000u；自動3級質(zhì)譜(自動選擇最強(qiáng)離子進(jìn)行源內(nèi)誘導(dǎo)裂解)。
2.結(jié)果與分析
2.1 HPLC-APCI-MS(+)分析結(jié)果及其指紋信息貫眾提取物的HPLC-APCI-MS分析的總離子流色譜見圖1。經(jīng)歸一化后，圖1中各色譜組分峰的相對面積見表3-1。表3-1還給出了各色譜組分一級質(zhì)譜包含的離子及一級質(zhì)譜中主要離子的二級和三級質(zhì)譜。APCI正離子模式檢測到的離子一般是[M+H]+離子，也有少量[M+NH4]+離子，因此可根據(jù)一級質(zhì)譜推測出各色譜組分的可能分子量。部分色譜組分的一級質(zhì)譜包含多個離子，而這些離子的二級質(zhì)譜又表明其一級質(zhì)譜的不同離子間不存在子母關(guān)系，說明這些色譜組分含有2種或2種以上化學(xué)成分。表3-1表明，HPLC-APCI-MS(+)可檢測到貫眾提取物中25種不同分子量的物質(zhì)。其中分子量為404的成分其色譜峰面積最大，為17.9％，其次為分子量分別為612(15.7％)、626、418(8.3％)、265(8.0％)的幾種成分。各組分的峰面積取決于該組分在質(zhì)譜儀中的電離效率及其濃度，雖然不能根據(jù)組分的峰面積推斷該組分的相對含量，但如果各組分是分子結(jié)構(gòu)相似的同系物，它們的電離效率相當(dāng)，則可根據(jù)總離子流色譜峰面積推測組分的相對含量。
表3-1貫眾提取物HPLC-APCI-MS(+)分析總離子流色譜峰組分指紋信息


*.表示相應(yīng)組分的二級及三級質(zhì)譜母離子。
2.2 HPLC-ESI-MS(+)分析結(jié)果及其指紋信息貫眾提取物的HPLC-ESI-MS(+)分析的總離子流色譜見圖2。經(jīng)歸一化后，圖2中各色譜組分峰的相對面積見表3-2。表3-2還給出了各色譜組分一級質(zhì)譜包含的離子及一級質(zhì)譜中主要離子的二級和三級質(zhì)譜。ESI正離子模式檢測到的離子一般是[M+H]+離子，部分分子同時出現(xiàn)[M+Na]+離子，二者的m/z相差22。根據(jù)一級質(zhì)譜推測出各色譜組分的可能分子量。在表3-2中，有18個色譜組分的一級質(zhì)譜同時包含m/z相差22的兩種離子，是該組分電離同時形成了[M+H]+、[M+Na]+離子。這樣的離子對同時出現(xiàn)在同一色譜峰中有利于更準(zhǔn)確推測組分的分子量。表3-2中保留時間21.2min色譜組分的一級質(zhì)譜中m/z679、701可能分別是組分分子([M+H]+340)的[2M+H]+和[2M+Na]+峰。表3-2中有31個色譜峰的一級質(zhì)譜包含多個離子，而這些離子的二級質(zhì)譜又表明其一級質(zhì)譜的不同離子間不存在子母關(guān)系，說明這些色譜組分含有2種或2種以上化學(xué)成分。表3-2中有多個色譜峰雖然保留時間不同，但根據(jù)它們的質(zhì)譜推測的分子質(zhì)量相同，顯然它們不是結(jié)構(gòu)完全相同的物質(zhì)，而是結(jié)構(gòu)不同的成分，一些具有相同一級、二級及三級質(zhì)譜離子的不同保留時間的色譜組分很可能是同分異構(gòu)體。表3-2中分子量為452的成分其色譜峰面積最大，為12.8％，其次為分子量分別為339、348(10.9％)、380、265、364(8.8％)、474、226(5.4％)的幾種成分。
表3-2貫眾提取物HPLC-ESI-MS(+)分析總離子流色譜峰組分指紋信息



注*.表示相應(yīng)組分的二級及三級質(zhì)譜母離子；#.表示該相對分子質(zhì)量值是根據(jù)相應(yīng)組分的一級質(zhì)譜含有m/z相差22的離子對而推定；§.表示該相對分子質(zhì)量值是根據(jù)相應(yīng)組分的一級質(zhì)譜含有m/z相差一倍(二聚體)的離子對而推定。
2.3 HPLC-ESI-MS(-)分析結(jié)果及其指紋信息貫眾提取物的HPLC-ESI-MS(-)分析的總離子流色譜見圖3。經(jīng)歸一化后，圖3中各色譜組分峰的相對面積見表3-3。表3-3還給出了各色譜組分一級質(zhì)譜包含的離子及一級質(zhì)譜中主要離子的二級和三級質(zhì)譜。ESI負(fù)離子模式檢測到的是[M-H]-離子，組分可能的分子量是一級質(zhì)譜的m/z+1。表3-3中有多個色譜峰雖然保留時間不同，但根據(jù)它們的質(zhì)譜推測的分子質(zhì)量相同，表明它們是結(jié)構(gòu)不同的成分，其中具有相同一級、二級及三級質(zhì)譜離子的不同保留時間的色譜組分很可能是同分異構(gòu)體。表3-3中保留時間14.8min色譜組分的一級質(zhì)譜中m/z 695是m/z 347離子的二倍，在相同保留時間的HPLC-ESI-MS(+)一級質(zhì)譜中，包含m/z 349，因此可推測該組分的相對分子質(zhì)量是348Da，m/z 695是m/z 347離子的二聚體。表3-3中分子量為612、626、404、418的幾種成分的色譜峰面積較大。
表3-3貫眾提取物HPLC-ESI-MS(-)分析總離子流色譜峰組分指紋信息



注§.表示該相對分子質(zhì)量值是根據(jù)相應(yīng)組分的一級質(zhì)譜含有m/z相差一倍(二聚體)的離子對而推定。
2.4不同電離方式得到的總離子流色譜及組分質(zhì)譜比較表3-4兩種或三種電離模式能同時檢測出的貫眾提取物組分

*.推測組分相對分子質(zhì)量依據(jù)的離子。
盡管貫眾提取物的色譜分離條件完全一致，但不同電離模式得到的總離子流色譜及各色譜組分的質(zhì)譜有顯著差異。ESI正離子檢測模式得到的色譜組分最多，共52個；其次為ESI負(fù)離子檢測模式，共檢測出38種色譜組分；APCI正離子檢測模式得到的色譜峰組分最少，僅有20個。比較三種不同檢測模式的色譜組分保留時間，可以看出ESI負(fù)離子模式檢測到的組分大部分是在保留時間30min以后出峰的組分，而ESI正離子模式檢測到的組分分布在保留時間0-55min的范圍，表明極性較大的組分在ESI電離源中不易失去質(zhì)子帶負(fù)電荷，不同極性的組分較易在ESI電離源中捕獲H+及Na+離子，生成準(zhǔn)分子離子。貫眾提取物的大部分組分在APCI電離源中不能與H+結(jié)合生成離子，因此APCI(+)模式檢測到的組分較少。比較不同電離方式在相同保留時間的色譜組分的一級質(zhì)譜，可以看出三種電離方式檢測到的離子不完全一致，表3-4比較了三種檢測模式在同一保留時間檢測到的一級質(zhì)譜離子，并根據(jù)相同保留時間色譜組分在兩種或三種電離模式下均能檢測到的離子推測出該組分含有的成分的相對分子質(zhì)量。表3-4結(jié)果表明，共有9個組分能在APCI(+)、ESI(+)和ESI(-)三種電離模式下同時被檢出，共有8個組分能在APCI(+)和ESI(+)兩種電離模式下同時被檢出，共有3個組分能在APCI(+)和ESI(-)兩種電離模式下同時被檢出。APCI(+)和ESI(+)能同時檢測到的組分主要在色譜分離的前半段(R.T＜32.0min)，三種模式能同時檢測到的組分主要在色譜分離的后半段(R.T＞32.0min)。比較相同保留時間三種電離模式檢測到的色譜組分的一級質(zhì)譜，可以看出ESI(-)容易檢測出的質(zhì)量數(shù)較大的組分，而APCI(+)和ESI(+)易檢測出質(zhì)量數(shù)較小的組分。
2.5多聚間苯三酚類衍生物的結(jié)構(gòu)推測已有的研究表明，多聚間苯三酚類衍生物在綿馬屬植物種分布廣泛，是綿馬屬植物的生物標(biāo)志物。吳壽金、高增平等研究發(fā)現(xiàn)綿馬貫眾種含有白綿馬素AA、黃綿馬酸AB、綿馬酸ABP、綿馬酸ABA、綿馬根酸ABA、東北貫眾素ABBA、東北貫眾素ABAA、東北貫眾素ABBP、東北貫眾素ABPA等9種間苯三酚類衍生物。本實驗利用HPLC-ESI/APCI-MS聯(lián)用分析貫眾有效部位，得到了有效部位的總離子流色譜圖及各色譜組分的多級質(zhì)譜圖。在ESI(+)和APCI(+)的檢測模式下，多個色譜組分的質(zhì)譜中包含m/z 191、193、197、209、211、223、391、403、417、431等間苯三酚衍生物的特征離子；在ESI(-)的檢測模式下，多個色譜組分的質(zhì)譜中包含m/z 195、207、209、211、389、401、403、417、429等間苯三酚衍生物的特征離子。在前人對綿馬屬植物中間苯三酚類衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究報道基礎(chǔ)上，本發(fā)明根據(jù)貫眾有效部位色譜組分的質(zhì)譜圖對含有以上特征離子的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)推導(dǎo)，確定了綿馬貫眾有效部位中含有14種多聚間苯三酚類衍生物，分別是根皮吡喃酮PB、黃綿馬酸AA、白綿馬素AA、綿馬素AA、綿馬素AP、黃綿馬酸AB、綿馬酸ABA、綿馬根酸ABA、綿馬酸ABB、綿馬酸PBP、東北貫眾素ABAA、東北貫眾素ABPP、東北貫眾素ABBP、東北貫眾素PBBP等。其中根皮吡喃酮PB、黃綿馬酸AA、綿馬素AA、綿馬素AP、綿馬酸ABA、綿馬酸ABB、綿馬酸PBP、東北貫眾素ABPP、東北貫眾素PBBP等9種化合物為首次在綿馬貫眾中發(fā)現(xiàn)的新化合物。它們的準(zhǔn)分子離子結(jié)構(gòu)及其可能的裂解途徑見圖4。
三種質(zhì)譜檢測模式均檢測到貫眾藥效部位含有多種多聚間苯三酚衍生物。其中APCI(+)檢測模式得到的總離子流色譜中，12個色譜組分含有間苯三酚衍生物的特征質(zhì)譜離子，其色譜峰面積之和占全部組分色譜峰面積的61.6％，其中保留時間為41.9min的組分峰面積占17.9％，[M+H]+為m/z 405，其化學(xué)成分是分子量為404的綿馬素AA或白綿馬素AA；保留時間為50.0min的組分峰面積占15.7％，[M+H]+為m/z 613，其化學(xué)成分是分子量為612的綿馬根酸ABA或綿馬酸ABP。ESI(-)檢測模式得到的總離子流色譜中，19個色譜組分含有間苯三酚衍生物的特征質(zhì)譜離子，其色譜峰面積之和占全部組分色譜峰面積的77.8％，其中保留時間為49.5min的組分峰面積占17.2％，[M-H]-為m/z 611，其化學(xué)成分是分子量為612的綿馬根酸ABA或綿馬酸ABP，結(jié)果與APCI(+)一致；保留時間為47.5min的組分峰面積占9.4％，[M-H]-為m/z 625，其化學(xué)成分是分子量為626的綿馬酸ABB。三種電離模式得到的總離子流色譜中，多個保留時間不同的色譜組分含有相同質(zhì)荷比的離子，如在APCI(+)模式得到的總離子流色譜圖中，在保留時間為37.5min、39.6min、41.9min、47.3min的色譜組分均含有m/z 405的離子，它們對應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)是分子量為404Da的白綿馬素AA、綿馬素AA及其它同分異構(gòu)體。此外，分子質(zhì)量為418、612、626、640Da所對應(yīng)的多聚間苯三酚衍生物也有2種或2種以上同分異構(gòu)體。
APCI(+)和ESI(-)兩種檢測模式得到的總離子流色譜中，含有多聚間苯三酚衍生物的組分峰面積分別占全部組分色譜峰面積的61.6％和77.8％，表明多聚間苯三酚類衍生物是貫眾抗流感病毒有效部位的主要成分。ESI(+)檢測模式得到的色譜組分較多(52個)，但含間苯三酚衍生物特征質(zhì)譜離子的色譜組分則較少(8個)，而且其色譜峰面積之和只占全部組分色譜峰面積的12.4％，明顯低于APCI(+)(61.6％)和ESI(-)(77.8％)檢測到的多聚間苯三酚衍生物色譜組分峰面積，表明間苯三酚衍生物在APCI(+)和ESI(-)下的電離效率顯著高于在ESI(+)下的電離效率。
權(quán)利要求
1.一種含有效成分和/或藥學(xué)上可以接受的輔料的抗流感和禽流感病毒的藥物，其特征在于所述有效成分為貫眾提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物，其中的貫眾提取物通過以下方法制備將貫眾塊根粉粹，用體積重量比4-10倍的50-90％的乙醇水溶液回流提取2-4次，合并提取液，濃縮，以水溶解濃縮液至水溶液重量為貫眾藥材重量的1-1.5倍，依次用乙酸乙酯和正丁醇分別萃取2-3次，每次用萃取液的體積與貫眾水溶液體積為1∶1，合并正丁醇萃取液，揮發(fā)正丁醇，濃縮得膏狀液體，干燥。
3.如權(quán)利要求2所述的藥物，其特征在于所述膏狀液體的干燥可以是低溫烘干或噴霧干燥。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的藥物，其特征在于貫眾提取物中含有間苯三酚衍生物的低聚物。
5.如權(quán)利要求1-3任一所述的藥物，其特征在于貫眾提取物中含有根皮吡喃酮PB、黃綿馬酸AA、白綿馬素AA、綿馬素AA、綿馬素AP、黃綿馬酸AB、綿馬酸ABA、綿馬根酸ABA、綿馬酸ABB、綿馬酸PBP、東北貫眾素ABAA、東北貫眾素ABPP、東北貫眾素ABBP、東北貫眾素PBBP。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于它是散劑、片劑、膠囊、口服液或其他醫(yī)藥學(xué)上可以接受的劑型。
7.一種檢測權(quán)利要求1-5任一所述藥物的方法，是用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀對貫眾提取物進(jìn)行分析以獲得提取物的指紋圖譜，其中色譜分析條件為色譜柱XDB-C18柱；二元梯度洗脫，A相為乙腈，B相為水，均含1％甲酸，流速為0.5mL/min；質(zhì)譜條件為ESI離子源，正、負(fù)離子模式檢測；APCI離子源，正離子模式檢測；自動3級質(zhì)譜。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測方法，其采用的梯度程序為20％A相，保持2min，逐漸增加A相比例，至50min時A相為100％，保持10min；流速0.5mL/min；進(jìn)樣量20μL。
9.如權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于質(zhì)譜條件為ESI及APCI離子源，正、負(fù)離子模式檢測；霧化器N2壓力40psi；干燥氣N2流速9L/min；質(zhì)量掃描范圍100-1000u；自動3級質(zhì)譜。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗流感和禽流感病毒的藥物，其有效成分是貫眾提取物。本發(fā)明首次提供了貫眾提取物在制備抗流感和禽流感病毒的藥物中的應(yīng)用，并且提供了應(yīng)用高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)機(jī)分析技術(shù)及結(jié)果構(gòu)建綿馬貫眾提取物指紋圖譜的方法。該方法包括貫眾提取物的HPLC－MS分析條件、色譜峰的特征、色譜組分的質(zhì)譜提供的化合物結(jié)構(gòu)信息等。本發(fā)明公開的指紋圖譜及其技術(shù)可用于綿馬貫眾的品種鑒別及貫眾提取物的質(zhì)量監(jiān)控。
文檔編號A61K9/48GK1846717SQ20061001134
公開日2006年10月18日 申請日期2006年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月22日
發(fā)明者陳建新, 曾振靈, 陳杖榴, 方炳虎, 邱靈才, 陳良柱, 李 杰 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)