專利名稱：一種重組腺病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組腺病毒及其應(yīng)用，特別涉及含有該重組腺病毒的抑制腫瘤細(xì)胞的生長和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物。
背景技術(shù)：
生物體的一切生命活動，從出生、成長、衰老、到出現(xiàn)疾病直至死亡都與基因有關(guān)，基因調(diào)控著細(xì)胞的各種功能。人們現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識到腫瘤是基因異常的疾病，而惡性腫瘤發(fā)病率、死亡率較高，已經(jīng)成為危害人類生命的第一、二位殺手，這使得腫瘤基因治療的研究成為近20年來基因治療的主要研究內(nèi)容和熱點(diǎn)。科學(xué)家利用基因工程技術(shù)，消除、修飾致病基因，注入或增強(qiáng)有益基因，達(dá)到治療疾病的目的。
早在1989年，Rosenberg就首次對人惡性黑色素病患者進(jìn)行了基因治療，此后基因治療的研究層出不窮，不少研究也顯示出臨床療效。常用于腫瘤基因治療臨床試驗(yàn)的目的基因有抑癌基因、自殺基因、耐藥基因、反義基因等。目前研究較多的是重組腺病毒p53，美國自1995年以來即開始了重組腺病毒p53制品的臨床試驗(yàn)，并已完成了I、II期臨床試驗(yàn)及部分III期臨床試驗(yàn)。我國目前已有“今又生”上市(由正常人腫瘤抑制基因p53和改構(gòu)的5型腺病毒基因重組而成)，獲得了國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的新藥證書、準(zhǔn)字號生產(chǎn)批文、藥品GMP證書，是世界首個(gè)獲準(zhǔn)上市的基因治療藥物?；蛑委煵粌H作為一個(gè)新的生物醫(yī)學(xué)概念而為人們所接受，而且作為一種新的治療手段和方法已被廣大研究人員和臨床工作者所實(shí)踐。到目前為止所進(jìn)行的不少研究表明，基因治療實(shí)驗(yàn)是安全、有效和易于操作的。
TFAR19(TF-1 cell apoptosis-related gene 19)是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡調(diào)控基因，國際人類基因命名委員會將其命名為PDCD5(programmed celldeath 5)，其編碼的蛋白主要定位于細(xì)胞內(nèi)，在人類50余種組織中廣泛分布。
目前，國內(nèi)外已有多家實(shí)驗(yàn)室利用不同技術(shù)發(fā)現(xiàn)PDCD5在疾病情況下，特別是在腫瘤如肝癌、乳腺癌及胃癌中的表達(dá)明顯下降，PDCD5的低表達(dá)與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)，而針對PDCD5的siRNA能減弱Bax過表達(dá)誘導(dǎo)的HeLa、HEK293和293T細(xì)胞凋亡，說明低表達(dá)PDCD5賦予這些細(xì)胞一定的抗凋亡能力。
阮國瑞等從mRNA及蛋白水平證實(shí)了PDCD5在白血病病人骨髓細(xì)胞中低表達(dá)。在國際上率先發(fā)現(xiàn)急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)病人比慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)病人表達(dá)更低的PDCD5，CML病人尤其是加速/急變期的CML病人，PDCD5表達(dá)量與BCR-ABL表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，馬曦等進(jìn)一步的研究表明，CML病人PDCD5基因5’調(diào)節(jié)區(qū)2個(gè)SNPs位點(diǎn)影響啟動子活性并與CML易感性有關(guān)，擁有(_27G/_11A)這2個(gè)SNPs位點(diǎn)的啟動子轉(zhuǎn)錄活性減低，并且不能被凋亡誘導(dǎo)因素所上調(diào)。利用酵母雙雜交系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)PDCD5可結(jié)合多個(gè)重要的分子如HTATIP、EEF1G、KIAA1377、RIF1等，其中組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HTATIP(histone acetyltransferase Tat interactive protein 60kD，HTATIP，TIP60)不僅在染色質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用，具有ATP酶、DNA解旋酶及與DNA結(jié)合的活性，而且，在DNA雙鏈斷裂修復(fù)和凋亡中發(fā)揮重要功能，由于CML病人PDCD5表達(dá)降低，擁有5’調(diào)節(jié)區(qū)2個(gè)SNPs位點(diǎn)(_27G/_11A)的啟動子轉(zhuǎn)錄活性減低，并且不能被凋亡誘導(dǎo)因素所上調(diào)，因而推測，CML病人低表達(dá)或異常表達(dá)的PDCD5與TIP60結(jié)合的能力可能受到影響，從而，可能進(jìn)一步影響到TIP60發(fā)揮的染色質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄、DNA雙鏈斷裂修復(fù)和凋亡等等重要功能，BCR-ABL表達(dá)量增加的CML病人PDCD5表達(dá)量進(jìn)一步降低，不僅使這些細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)，也可能增加了基因組內(nèi)在不穩(wěn)定性。說明低表達(dá)PDCD5可能在AML、CML病理機(jī)制或疾病進(jìn)展中起一定作用。
目前基因治療中常用的表達(dá)載體主要分為真核表達(dá)質(zhì)粒和病毒表達(dá)載體，雖然二者都能有效地使外源基因在細(xì)胞中表達(dá)，但由于真核表達(dá)質(zhì)粒在體內(nèi)難以定向?qū)氚屑?xì)胞，故在基因治療應(yīng)用上受到限制。
而病毒表達(dá)載體是利用宿主細(xì)胞表面天然存在的受體將外源基因定向?qū)氚屑?xì)胞，且能轉(zhuǎn)導(dǎo)不分裂的細(xì)胞。腺病毒(AdV)載體系統(tǒng)由于其基因組較易操作，具有可大量制備、表達(dá)量高及不整合等優(yōu)點(diǎn)因而在目前的基因治療中倍受青睞。
腺病毒載體的廣譜性腺病毒系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于表達(dá)人體和非人體蛋白，腺病毒能感染很大范圍的哺乳動物細(xì)胞，除了一些淋巴細(xì)胞外，腺病毒可以感染其他所有類型的細(xì)胞。在非復(fù)制細(xì)胞中研究基因表達(dá)，腺病毒系統(tǒng)為最佳。腺病毒系統(tǒng)已用于多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)，取得了預(yù)期臨床效果。
腺病毒載體的安全性載體源于第一代人5型腺病毒，為腺病毒中致病力最弱的病毒株，該病毒株野生型也僅會偶致普通感冒；載體基因不整合到宿主細(xì)胞基因組中，無遺傳毒性；載體經(jīng)基因工程改構(gòu)，只對細(xì)胞實(shí)施一次感染，不能復(fù)制，無環(huán)境污染。國內(nèi)外10余年來批準(zhǔn)的有關(guān)重組人p53腺病毒制品的臨床試驗(yàn)達(dá)58項(xiàng)，使用過約30000個(gè)劑量，均未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)、未測及最大耐受劑量。與DNA損傷性腫瘤治療方法(如放、化療)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，未增加重組腺病毒的整合率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含有人PDCD5基因的重組腺病毒。
本發(fā)明所提供的重組腺病毒，是將人PDCD5基因的表達(dá)盒插入Ad5的基因組DNA中得到的重組腺病毒；所述人PDCD5基因的表達(dá)盒包括啟動子、人PDCD5的cDNA和終止子。
所述人PDCD5基因的表達(dá)盒中，啟動子為MCMV啟動子，所述終止子為SV40的終止子。
所述人PDCD5基因的表達(dá)盒還包括SV40 polyA信號序列。
所述人PDCD5基因的表達(dá)盒通過如下方法插入Ad5的基因組DNA中利用AdMAX系統(tǒng)(microbix公司，購自本元正陽基因技術(shù)股份有限公司)將人PDCD5的cDNA插入pDC316的多克隆位點(diǎn)后再與Ad5基因組質(zhì)粒pBHGIox(delta)E1，3Cre一起轉(zhuǎn)化293細(xì)胞，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞，得到含有PDCD5基因的重組腺病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物。
本發(fā)明所提供的抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物，它的活性成分為上述重組腺病毒和治療腫瘤的化療藥物。
所述治療腫瘤的化療藥物可以是任何一種目前可用的化療藥物，如可為依托泊甙(VP-16)，或甲磺酸伊馬替尼(Imatinib)，或伊達(dá)比星(IDR)。
該藥物可用于非實(shí)體瘤細(xì)胞或?qū)嶓w瘤細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的重組腺病毒與多種化療藥物聯(lián)合給藥對造血系統(tǒng)來源的細(xì)胞或腫瘤治療，都有明顯的協(xié)同作用。本發(fā)明的重組腺病毒可廣泛用于腫瘤基因治療。


圖1為pDC316-PDCD5的EcoR I和HindIII雙酶切鑒定電泳2為重組腺病毒Ad-PDCD5的鑒定圖譜圖3為不同MOI的Ad-eGFP腺病毒感染白血病細(xì)胞系K562、Jurkat及CEM 48h后轉(zhuǎn)染效率圖4為不同MOI的Ad-PDCD5感染K562細(xì)胞72h后對K562細(xì)胞存活率的影響圖5為流式細(xì)胞術(shù)測定Ad-PDCD5與VP-16對K562細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用圖6為MTT實(shí)驗(yàn)測定Ad-PDCD5與VP-16對K562細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用圖7A為MOI 400、1600的Ad-PDCD5和1.9ng/ml IDR對K562細(xì)胞凋亡的影響圖7B為MOI 400、1600的Ad-PDCD5和7.5ng/ml IDR對K562細(xì)胞凋亡的影響圖7C為MOI 400的Ad-PDCD5和15ng/ml IDR對K562細(xì)胞凋亡的影響圖8為Ad-PDCD5感染K562細(xì)胞增加Imatinib誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡圖9為K562細(xì)胞感染Ad-null或Ad-PDCD5后在裸鼠體內(nèi)生長情況圖10為K562細(xì)胞感染Ad-PDCD5后腹腔給予低劑量IDR治療抑制其在裸鼠體內(nèi)生長圖11為隔日腹腔給予Ad-PDCD5 24h后腹腔給予低劑量IDR治療，各四次，抑制K562細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長圖12為隔日腹腔給予Ad-PDCD5 24h后腹腔給予低劑量IDR治療，各四次，結(jié)束治療24h后的瘤體組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況圖13為腫瘤局部給予Ad-PDCD5 24h后腹腔給予低劑量IDR治療，各四次，抑制其在裸鼠體內(nèi)生長圖14為Ad 5基因組質(zhì)粒pBHGIox(delta)E1，3Cre的物理圖譜具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、人PDCD5重組腺病毒的構(gòu)建、鑒定及純化陽性對照質(zhì)粒pCDI-TFAR19(含有PDCD5的cDNA序列)，制備方法見文獻(xiàn)(LiuH T，Wang Y G，Zhang Y M，et al.TRAR19，a novel apoptosis-related genecloned from human leukemia cell line TF-1，could enhance apoptosis of sometumor cells induced by growth factor withdrawal.Biochem Biophy Res Commun，1999，254203-210)，用EcoR V和HindIII切下目的基因PDCD5，pDC316(購自本元正陽公司)用SmaI和HindIII切開，純化和回收相應(yīng)的片段后，用T4連接酶將PDCD5基因連接到pDC316質(zhì)粒上，篩選陽性克隆，得到含有PDCD5基因(序列表中序列1)的質(zhì)粒，構(gòu)建成pDC316-PDCD5。
其中，pDC316質(zhì)粒含有以下元件1.Ampr為質(zhì)粒在E.coli(如DH5α)中擴(kuò)增提供氨芐抗性(終濃度100μg/ml)。
2.ori質(zhì)粒在E.coli中的復(fù)制起點(diǎn)。
3.AdAd序列，可以與Ad基因組質(zhì)粒發(fā)生同源重組。
4.ITRAd反向末端重復(fù)序列，是Ad基因組的包裝識別信號。
5.MCMV來自MCMV病毒的立早啟動子。
6.SV40 polyA來自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信號。
7.LoxP真核重組酶(Cre)的重組識別序列。
將pDC316-PDCD5、陽性對照質(zhì)粒pCDI-TFAR19和pDC316分別用EcoR I和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖如圖1所示，與陽性對照質(zhì)粒pCDI-TFAR19相比，構(gòu)建的pDC316-PDCD5質(zhì)粒均可切出目的基因片段PDCD5，說明pDC316-PDCD5的結(jié)構(gòu)正確。圖1中，1為pDC316的EcoR I和HindIII雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果，2-6為pDC316-PDCD5的EcoR I和HindIII雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果，7為陽性對照質(zhì)粒pCDI-TFAR19的EcoR I和HindIII雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果。
將pDC316-PDCD5與Ad 5基因組質(zhì)粒pBHGIox(delta)E1，3Cre(腺病毒骨架)(本元正陽公司購得，具體結(jié)構(gòu)如圖14)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)并對隨機(jī)挑取的11個(gè)Ad-PDCD5重組腺病毒單斑的細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液進(jìn)行PCR鑒定，PCR引物如下上游5’atggcggacgaggagcttg 3’；下游5’tcaataatcgtcatcttcatcag 3’PCR擴(kuò)增條件94℃5min然后(94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec)30個(gè)循環(huán)，最后72℃7min，放4℃待用。Ad-PDCD5重組腺病毒的鑒定結(jié)果如圖2所示，表明隨機(jī)挑取的11個(gè)單斑的細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液均擴(kuò)增出與目的基因相符的片段，293細(xì)胞和無外源基因的腺病毒均無擴(kuò)增產(chǎn)物，說明pDC316-PDCD5在293細(xì)胞中已完成重組出毒，已篩選出含有目的基因的重組腺病毒Ad-PDCD5。圖2中，A組以細(xì)胞培養(yǎng)上清為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；B組以細(xì)胞裂解液為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。以下為各孔擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR模板1-11Ad-PDCD5重組腺病毒單斑；-1293空細(xì)胞；-2Ad-null空病毒；+1pCDI-TFAR19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞；+2pDC316-PDCD5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞；+3pDC316-PDCD5質(zhì)粒；MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
對照病毒Ad-eGFP，即PDCD5基因被增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(greenfluorescent protein，GFP)取代的重組腺病毒和Ad-null(不含外源目的基因的重組腺病毒)用同樣方式構(gòu)建。病毒繁殖、純化、滴度測定按Graham等人(GrahamF L，Prevce L.Gene transfer and expression protocols Methods in MolecularBiology，Vol 7.Murray Z J ed.Clifton，NJThe Humane Press Inc，1991.109-128)的方法進(jìn)行。
Ad-PDCD5及Ad-null毒種各生產(chǎn)50個(gè)125cm2培養(yǎng)瓶病毒，收獲的病毒經(jīng)純化后進(jìn)行質(zhì)檢，高效液相色譜法測二者純度均達(dá)到98％以上，Ad-null及Ad-PDCD5產(chǎn)品TCID50測定結(jié)果分別為6.3×1010TCID50/ml及2.2×1010TCID50/ml。
實(shí)施例2、流式細(xì)胞術(shù)檢測Ad-PDCD5對K562細(xì)胞存活率的影響1、流式細(xì)胞術(shù)測定Ad-eGFP腺病毒感染白血病細(xì)胞48h時(shí)的轉(zhuǎn)染效率在腫瘤細(xì)胞K562、Jurkat及CEM生長處于對數(shù)生長期時(shí)，以5×104個(gè)/孔接種于24孔板中，分別加入不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI，即病毒感染單位數(shù)/細(xì)胞數(shù))的Ad-eGFP腺病毒(用1ml無血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋)37℃、5％CO2孵育48h后，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，通過流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)光為488nm，檢測光為530nm)，用Cellquest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析。
每一樣品收集1×104個(gè)細(xì)胞，每種細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞大小設(shè)定一個(gè)單細(xì)胞區(qū)域，該區(qū)域的細(xì)胞用于熒光分析。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對照，設(shè)定GFP陽性細(xì)胞區(qū)(M1區(qū))使陰性對照M1區(qū)細(xì)胞數(shù)不超過0.1％，F(xiàn)CM)分析結(jié)果用轉(zhuǎn)染率表示。轉(zhuǎn)染率即GFP陽性細(xì)胞陽性率，用下列公式計(jì)算轉(zhuǎn)染率＝樣品M1區(qū)細(xì)胞百分率-陰性對照M1區(qū)細(xì)胞百分率；結(jié)果如圖3所示，表明MOI為20、100、200、400的Ad-eGFP腺病毒感染白血病細(xì)胞系K562、Jurkat及CEM 48h后轉(zhuǎn)染效率依次增加，MOI 400時(shí)K562、Jurkat及CEM細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分別可達(dá)71.2％、86.6％及65.5％。圖3中，Control為陰性對照，即未轉(zhuǎn)染的白血病細(xì)胞系K562、Jurkat及CEM。
2、不同MOI的Ad-PDCD5感染K562細(xì)胞72h后對K562細(xì)胞存活率的影響在腫瘤細(xì)胞K562生長處于對數(shù)生長期時(shí)，以5×104個(gè)/孔接種于24孔板中，分別加入不同MOI的Ad-PDCD5重組腺病毒37℃、5％CO2孵育72h后，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，按Annexin-V-Fluos試劑盒(北京寶賽公司)說明進(jìn)行標(biāo)記，以K562細(xì)胞為對照，流式細(xì)胞術(shù)(FACSort型，美國Becton Dickinson公司)上檢測紅色(PI，DNA)和綠色(Annexin-V，F(xiàn)ITC)熒光強(qiáng)度。兩者均陰性細(xì)胞為活細(xì)胞，F(xiàn)ITC陽性、PI陰性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，兩者均陽性細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC陰性、PI陽性細(xì)胞為死亡細(xì)胞。根據(jù)FCM散點(diǎn)圖，以對照管射門，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占百分比。
結(jié)果如圖4所示，表明用MOI為400、800、1600、3200的Ad-PDCD5感染K562細(xì)胞72h后，存活細(xì)胞均可達(dá)到85％以上，與不感染(control)或感染Ad-null相比沒有明顯差別。
實(shí)施例3、Ad-PDCD5重組腺病毒與VP-16的協(xié)同作用1、流式細(xì)胞術(shù)測定人Ad-PDCD5重組腺病毒與VP-16的協(xié)同作用取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，分為6組，以MOI200分別感染Ad-null及Ad-PDCD5各2組，2組K562細(xì)胞作為對照，24h后，以0.5μg/ml(終濃度)的VP-16分別處理K562、感染Ad-null的K562細(xì)胞及Ad-PDCD5的K562細(xì)胞各一組，24h后離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，按Annexin-V-Fluos試劑盒(北京寶賽公司)說明進(jìn)行標(biāo)記，以K562細(xì)胞為對照，流式細(xì)胞術(shù)(FACSort型，美國Becton Dickinson公司)上檢測紅色(PI，DNA)和綠色(Annexin-V，F(xiàn)ITC)熒光強(qiáng)度。兩者均陰性細(xì)胞為活細(xì)胞，F(xiàn)ITC陽性、PI陰性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，兩者均陽性細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC陰性、PI陽性細(xì)胞為死亡細(xì)胞。根據(jù)FCM散點(diǎn)圖，以對照管射門，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占百分比。
檢測結(jié)果如圖5所示，表明Ad-PDCD5感染24h后加VP-16 0.5μg/ml再作用24h的K562細(xì)胞與對照組相比有更多的凋亡細(xì)胞，對照細(xì)胞(control，未經(jīng)感染和未經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞)、感染Ad-null的K562細(xì)胞(Ad-null)、感染Ad-PDCD5的K562細(xì)胞(Ad-PDCD5)、經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞(VP-16)、經(jīng)Ad-null感染和經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞(Ad-null+VP-16)及經(jīng)Ad-PDCD5感染和經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞(Ad-PDCD5+VP-16)凋亡細(xì)胞所占百分比依次為11.7％、14.4％、13.1％、30.4％、29.6％、49.3％。
2、MTT實(shí)驗(yàn)測定Ad-PDCD5重組腺病毒與VP-16的協(xié)同作用取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，分為6組，以MOI200分別感染Ad-null及Ad-PDCD5各2組，2組K562細(xì)胞作為對照，24h后，以0.5μg/ml(終濃度)的VP-16分別處理K562、感染Ad-null的K562細(xì)胞及Ad-PDCD5的K562細(xì)胞各一組，細(xì)胞接種于96孔板，100μl/孔，于培養(yǎng)0、24、48小時(shí)加入MTT工作液(5mg/ml)，每孔20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入10％SDS-0.01mol/LHCl溶解細(xì)胞，570nm波長(Bio-Rad 650型酶標(biāo)儀)下測定OD值，每時(shí)間段每樣品測定5孔求平均值。細(xì)胞增殖率＝(24h或48h OD值-Oh OD值)/Oh OD值。
檢測結(jié)果如圖6所示，表明與K562或感染Ad-null的K562細(xì)胞相比，感染Ad-PDCD5的K562細(xì)胞24h或48h時(shí)細(xì)胞增殖率沒有明顯差別，24h時(shí)，K562(對照，未經(jīng)感染和未經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞)、感染Ad-null的K562細(xì)胞(Ad-null)及感染Ad-PDCD5的K562細(xì)胞(Ad-PDCD5)細(xì)胞增殖率分別為73.9％、69.8％、78.0％；48h時(shí)，分別為146.6％、151.4％、142.2％。但在0.5μg/ml VP16作用下，感染Ad-PDCD5的K562細(xì)胞增殖率比對照組明顯下降甚至出現(xiàn)負(fù)增殖，24h時(shí)，經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞(VP16)、經(jīng)Ad-null感染和經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞(Ad-null+VP16)及經(jīng)Ad-PDCD5感染和經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞(Ad-PDCD5+VP16)細(xì)胞增殖率分別為57.3％、53.0％、23.8％；48h時(shí)，分別為26.5％、23.3％、-10.0％。圖6中，control為未經(jīng)感染和未經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞，Ad-null為感染Ad-null的K562細(xì)胞，Ad-PDCD5為感染Ad-PDCD5的K562細(xì)胞，VP16為經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞，Ad-null+VP16為經(jīng)Ad-null感染和經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞，Ad-PDCD5+VP16為經(jīng)Ad-PDCD5感染和經(jīng)VP-16處理的K562細(xì)胞。
實(shí)施例4、Ad-PDCD5感染K562細(xì)胞增加IDR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡1、MOI 400、1600的Ad-PDCD5和1.9ng/ml IDR對K562細(xì)胞凋亡的影響取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，分為10組，以MOI 400分別感染Ad-null及Ad-PDCD5各2組，以MOI 1600分別感染Ad-null及Ad-PDCD5各2組，2組K562細(xì)胞作為對照，24h后，以1.9ng/ml(終濃度)IDR分別處理K562、感染Ad-null的K562細(xì)胞及Ad-PDCD5的K562細(xì)胞各一組，24h后離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，按Annexin-V-Fluos試劑盒(北京寶賽公司)說明進(jìn)行標(biāo)記，以K562細(xì)胞為對照，流式細(xì)胞術(shù)(FACSort型，美國Becton Dickinson公司)上檢測紅色(PI，DNA)和綠色(Annexin-V，F(xiàn)ITC)熒光強(qiáng)度。兩者均陰性細(xì)胞為活細(xì)胞，F(xiàn)ITC陽性、PI陰性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，兩者均陽性細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC陰性、PI陽性細(xì)胞為死亡細(xì)胞。根據(jù)FCM散點(diǎn)圖，以對照管射門，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占百分比。
檢測結(jié)果如圖7A所示，表明Ad-PDCD5感染24h后加1.9ng/ml IDR再作用24h的K562細(xì)胞與對照組相比有更多的凋亡細(xì)胞，對照細(xì)胞(Control，未經(jīng)感染和未經(jīng)IDR處理的K562細(xì)胞)、經(jīng)MOI 400Ad-null感染和經(jīng)IDR 1.9ng/ml處理的K562細(xì)胞(Ad-null，MOI 400+IDR 1.9ng/ml)、經(jīng)MOI 1600Ad-null感染和經(jīng)IDR 1.9ng/ml處理的K562細(xì)胞(Ad-null，MOI 1600+IDR 1.9ng/ml)、經(jīng)IDR 1.9ng/ml處理的K562細(xì)胞(IDR 1.9ng/ml)、經(jīng)MOI 400Ad-PDCD5感染和經(jīng)IDR 1.9ng/ml處理的K562細(xì)胞(Ad-PDCD5，MOI 400+IDR 1.9ng/ml)、經(jīng)MOI 1600Ad-PDCD5感染和經(jīng)IDR 1.9ng/ml處理的K562細(xì)胞(Ad-PDCD5，MOI1600+IDR 1.9ng/ml)凋亡細(xì)胞所占百分比依次為13.5％、14.5％、38.9％、11.8％、32.2％、64.6％。
2、MOI 400、1600的Ad-PDCD5和7.5ng/ml IDR對K562細(xì)胞凋亡的影響除添加的IDR的終濃度為7.5ng/ml外，其它實(shí)驗(yàn)方法與步驟1相同，檢測結(jié)果如圖7B所示，表明Ad-PDCD5感染24h后加7.5ng/ml IDR再作用24h的K562細(xì)胞與對照組相比有更多的凋亡細(xì)胞，對照細(xì)胞(Control，未經(jīng)感染和未經(jīng)IDR處理的K562細(xì)胞)、經(jīng)MOI 400Ad-null感染和經(jīng)IDR 7.5ng/ml處理的K562細(xì)胞(Ad-null，MOI 400+IDR 7.5ng/ml)、經(jīng)MOI 1600Ad-null感染和經(jīng)IDR7.5ng/ml處理的K562細(xì)胞(Ad-null，MOI 1600+IDR 7.5ng/ml)、經(jīng)IDR 7.5ng/ml處理的K562細(xì)胞(IDR 7.5ng/ml)、經(jīng)MOI 400Ad-PDCD5感染和經(jīng)IDR 7.5ng/ml處理的K562細(xì)胞(Ad-PDCD5，MOI 400+IDR 7.5ng/ml)、經(jīng)MOI 1600Ad-PDCD5感染和經(jīng)IDR 7.5ng/ml處理的K562細(xì)胞(Ad-PDCD5，MOI 1600+IDR 7.5ng/ml)凋亡細(xì)胞所占百分比依次為13.5％、22.8％、47.8％、23.4％、35.8％、71.8％。
3、MOI 400的Ad-PDCD5和15ng/ml IDR對K562細(xì)胞凋亡的影響除感染的Ad-null及Ad-PDCD5分別為MOI 400、添加的IDR的終濃度為15ng/ml和IDR的處理時(shí)間為16小時(shí)外，其它實(shí)驗(yàn)方法與步驟1相同，檢測結(jié)果如圖7C所示，表明Ad-PDCD5感染24h后加15ng/ml IDR再作用16h的K562細(xì)胞與對照組相比有更多的凋亡細(xì)胞，對照細(xì)胞(Control，未經(jīng)感染和未經(jīng)IDR處理的K562細(xì)胞)、經(jīng)IDR 15ng/ml處理的K562細(xì)胞(IDR 15ng/ml)、經(jīng)MOI 400Ad-null感染和經(jīng)IDR 15ng/ml處理的K562細(xì)胞(Ad-null，MOI 400+IDR15ng/ml)、經(jīng)MOI 400Ad-PDCD5感染和經(jīng)IDR 15ng/ml處理的K562細(xì)胞(Ad-PDCD5，MOI 400+IDR15ng/ml)凋亡細(xì)胞所占百分比依次為13.5％、24.3％、22.6％、35.3％。
實(shí)施例5、Ad-PDCD5感染K562細(xì)胞增加Imatinib誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡除感染的Ad-null及Ad-PDCD5分別為MOI 200、感染后48小時(shí)添加化療藥物0.5μmol/L(終濃度)的Imatinib和Imatinib處理時(shí)間為24小時(shí)外，其它實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例4的步驟1相同，檢測結(jié)果如圖8所示，表明Ad-PDCD5感染24h后加0.5μmol/L Imatinib再作用24h的K562細(xì)胞與對照組相比有更多的凋亡細(xì)胞，對照細(xì)胞(Control，未經(jīng)感染和未經(jīng)Imatinib處理的K562細(xì)胞)、經(jīng)MOI 200的Ad-null感染的K562細(xì)胞(Ad-null，M0I 200)、經(jīng)MOI 200的Ad-PDCD5感染的K562細(xì)胞(Ad-PDCD5，MOI 200)、經(jīng)0.5μmol/L的Imatinib處理的K562細(xì)胞(Imatinib 0.5μmol/L)、經(jīng)MOI 200的Ad-null感染和經(jīng)0.5μmol/L的Imatinib處理的K562細(xì)胞(Ad-null，MOI200+Imatinib 0.5μmol/L)和經(jīng)MOI200的Ad-PDCD5感染和經(jīng)0.5μmol/L的Imatinib處理的K562細(xì)胞(Ad-PDCD5，MOI200+Imatinibμmol/L)凋亡細(xì)胞所占百分比依次為8.7％、15％、13.2％、15.3％、14.4％和26.5％。
實(shí)施例6.荷瘤動物實(shí)驗(yàn)1、K562細(xì)胞感染Ad-null或Ad-PDCD5后在裸鼠體內(nèi)生長情況大量培養(yǎng)的對數(shù)生長期K562細(xì)胞臺盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，分為3組，以MOI 400分別感染Ad-null及Ad-PDCD5各1組，不感染組作為對照(control)，感染24h后，分別離心收集，用無血清RPMI 1640洗滌，以1.5×107個(gè)/點(diǎn)分別接種三組4-5周齡雌性裸鼠腋窩皮下，觀察其在裸鼠體內(nèi)生長情況(裸鼠接種細(xì)胞前2天開始腹腔注射給予環(huán)磷酰胺100mg/Kg體重/次，共2次)。結(jié)果如圖9所示，表明接種細(xì)胞后第7、9、11天，各組間腫瘤大小無差別，K562細(xì)胞感染Ad-null或Ad-PDCD5后在裸鼠體內(nèi)生長的腫瘤大小無差別。圖9中，Control表示接種K562細(xì)胞的裸鼠；Ad-null表示接種感染Ad-null的K562細(xì)胞的裸鼠；Ad-PDCD5表示接種感染Ad-PDCD5的K562細(xì)胞的裸鼠；腫瘤照片表示的是接種細(xì)胞11天后的腫瘤。
2、K562細(xì)胞感染Ad-PDCD5后給予低劑量IDR治療抑制其在裸鼠體內(nèi)生長大量培養(yǎng)的對數(shù)生長期K562細(xì)胞臺盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，分為3組，以MOI 400分別感染Ad-null及Ad-PDCD5各l組，不感染組作為對照(control)，感染24h后，分別離心收集，用無血清RPMI 1640洗滌，以1.5×107個(gè)/點(diǎn)分別接種三組4-5周齡雌性裸鼠腋窩皮下，接種后第二天，感染Ad-null及Ad-PDCD5組，分別在接種細(xì)胞局部隔日給予IDR 375μg/Kg體重/次，共4次，隔日觀察各組K562細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長情況(裸鼠接種細(xì)胞前2天開始腹腔注射給予環(huán)磷酰胺100mg/Kg體重/次，共2次)。
結(jié)果如圖10所示，表明在接種K562細(xì)胞后第7、9、11天時(shí)，Ad-PDCD5+IDR組的腫瘤明顯小于Ad-null+IDR組的腫瘤，Ad-null+IDR與Ad-PDCD5+IDR組相比，P小于0.05。圖10中，Control表示接種K562細(xì)胞的裸鼠；Ad-null+IDR表示接種感染Ad-null的K562細(xì)胞后再注射IDR的裸鼠；Ad-PDCD5+IDR表示接種感染Ad-PDCD5的K562細(xì)胞后再注射IDR的裸鼠；腫瘤照片表示的是接種細(xì)胞11天后的腫瘤。
3、腹腔給予Ad-PDCD5 24h后給予低劑量IDR治療抑制K562細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長大量培養(yǎng)的對數(shù)生長期K562細(xì)胞，臺盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，離心收集，用無血清RPMI 1640洗滌，以1.5×107個(gè)/點(diǎn)接種4-5周齡雌性裸鼠腋窩皮下，接種后第二天隨機(jī)分為六組，分別隔日(24h)腹腔注射感染Ad-null及Ad-PDCD5(各3×109TCID50/ml)各2組共4次，不感染組作為對照，感染24h后，分別隔日腹腔注射給予低劑量IDR(375μg/Kg體重/次)共4次，觀察其在裸鼠體內(nèi)生長情況(裸鼠接種細(xì)胞前2天開始腹腔注射給予環(huán)磷酰胺100mg/Kg體重/次，共2次)。結(jié)果如圖11所示，在接種K562細(xì)胞后第7、9、11天時(shí)，Ad-PDCD5+IDR組的腫瘤明顯小于Ad-null+IDR組的腫瘤，Ad-null+IDR與Ad-PDCD5+IDR組相比，P小于0.01。圖11中，Control表示接種K562細(xì)胞的裸鼠；Ad-null表示接種K562細(xì)胞后再腹腔注射Ad-null的裸鼠，Ad-PDCD5表示接種K562細(xì)胞后再腹腔注射Ad-PDCD5的裸鼠，IDR表示接種K562細(xì)胞后再腹腔注射IDR的裸鼠，Ad-null+IDR表示接種K562細(xì)胞后再腹腔注射Ad-null和再注射IDR的裸鼠；Ad-PDCD5+IDR表示接種K562細(xì)胞后再腹腔注射Ad-PDCD5和再注射IDR的裸鼠；腫瘤照片表示的是接種細(xì)胞11天后的腫瘤。
4、腹腔給予Ad-PDCD5 24h后給予低劑量IDR治療，結(jié)束治療后24h的瘤體組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況具體的實(shí)驗(yàn)方法同步驟3。結(jié)束治療后24h處死裸鼠，腫瘤組織用4％甲醛固定，常規(guī)制備蠟塊及切片，按TUNEL試劑盒(Invotrogen公司)操作說明進(jìn)行組化染色，顯微鏡下以×250，視野范圍0.72mm2下計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值代表每張切片TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，在接種K562細(xì)胞后第11天時(shí)，實(shí)驗(yàn)各組腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況總結(jié)如圖12。Ad-PDCD5+IDR組的腫瘤組織凋亡細(xì)胞明顯多于Ad-null+IDR組的腫瘤組織凋亡細(xì)胞，分別為47.7凋亡細(xì)胞/視野，22.3凋亡細(xì)胞/視野，P小于0.01。
圖12中，Control表示接種K562細(xì)胞的裸鼠；Ad-null表示接種K562細(xì)胞后再腹腔注射Ad-null的裸鼠，Ad-PDCD5表示接種K562細(xì)胞后再腹腔注射Ad-PDCD5的裸鼠，IDR表示接種K562細(xì)胞后再腹腔注射IDR的裸鼠，Ad-null+IDR表示接種K562細(xì)胞后再腹腔注射Ad-null和再注射IDR的裸鼠；Ad-PDCD5+IDR表示接種K562細(xì)胞后再腹腔注射Ad-PDCD5和再注射IDR的裸鼠；腫瘤組化照片表示的是接種細(xì)胞11天后的腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況。
5、局部給予Ad-PDCD5 24h后腹腔給予低劑量IDR抑制其在裸鼠體內(nèi)生長大量培養(yǎng)的對數(shù)生長期K562細(xì)胞，臺盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，離心收集，用無血清RPMI 1640洗滌，以1.5×107個(gè)/點(diǎn)接種4-5周齡雌性裸鼠腋窩皮下，接種后第2天隨機(jī)分為2組，分別隔日(24h)在接種局部注射Ad-null及Ad-PDCD5(各3×109TCID50/ml)共4次，感染24h后，分別隔日腹腔注射給予低劑量IDR(375μg/Kg體重/次)共4次，觀察其在裸鼠體內(nèi)生長情況(裸鼠接種細(xì)胞前2天開始腹腔注射給予環(huán)磷酰胺100mg/Kg體重/次，共2次)。結(jié)果如圖13所示，表明在接種K562細(xì)胞后第19、21、22天時(shí)，Ad-PDCD5+IDR組的腫瘤明顯小于Ad-null+IDR組(P小于0.01)。
圖13中，Ad-null+IDR表示接種K562細(xì)胞后在接種局部注射Ad-null和再腹腔注射IDR的裸鼠；Ad-PDCD5+IDR表示接種K562細(xì)胞后在接種局部注射Ad-PDCD5和再腹腔注射IDR的裸鼠；腫瘤照片表示的是接種細(xì)胞后第22天的腫瘤。
序列表<160>1<210>1<211>378<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1atggcggacg aggagcttga ggcgctgagg agacagaggc tggccgagct gcaggccaaa 60cacggggatc ctggtgatgc ggcccaacag gaagcaaagc acagggaagc agaaatgaga120aacagtatct tagcccaagt tctggatcag tcggcccggg ccaggttaag taacttagca180cttgtaaagc ctgaaaaaac taaagcagta gagaattacc ttatacagat ggcaagatat240ggacaactaa gtgagaaggt atcagaacaa ggtttaatag aaatccttaa aaaagtaagc300caacaaacag aaaagacaac aacagtgaaa ttcaacagaa gaaaagtaat ggactctgat360gaagatgacg attattga 378
權(quán)利要求
1.一種重組腺病毒，是將人PDCD5基因的表達(dá)盒插入Ad5的基因組DNA中得到的重組腺病毒；所述人PDCD5基因的表達(dá)盒包括啟動子、人PDCD5的cDNA和終止子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于所述人PDCD5基因的表達(dá)盒中，啟動子為MCMV啟動子，所述終止子為SV40的終止子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組腺病毒，其特征在于所述人PDCD5基因的表達(dá)盒還包括SV40 polyA信號序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組腺病毒，其特征在于所述人PDCD5基因的表達(dá)盒通過如下方法插入Ad5的基因組DNA中將人PDCD5的cDNA插入pDC316的多克隆位點(diǎn)后再與Ad5基因組質(zhì)粒pBHGIox(delta)E1，3Cre一起轉(zhuǎn)化293細(xì)胞，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞，得到含有人PDCD5基因的重組腺病毒。
5.一種抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物，它的活性成分為權(quán)利要求1至4中任一所述的重組腺病毒和治療腫瘤的化療藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于所述治療腫瘤的化療藥物為VP-16，或Imatinib，或IDR。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的藥物，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為非實(shí)體瘤細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的藥物，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為實(shí)體瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組腺病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明的重組腺病毒，是將人PDCD5基因的表達(dá)盒插入Ad5的基因組DNA中得到的重組腺病毒；所述人PDCD5基因的表達(dá)盒包括啟動子、人PDCD5的cDNA和終止子。本發(fā)明的重組腺病毒與多種化療藥物聯(lián)合給藥對造血系統(tǒng)來源的細(xì)胞或腫瘤治療，都有明顯的協(xié)同作用。本發(fā)明的重組腺病毒可廣泛用于腫瘤基因治療。
文檔編號A61K48/00GK1869242SQ20061001215
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者阮國瑞, 馬大龍, 劉艷榮, 陳珊珊, 常艷, 邱曉彥, 秦亞溱, 付家瑜, 李金蘭, 曹輝 申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院, 北京大學(xué)