專利名稱：抗腫瘤的靶向粘附斑激酶fak的rna干擾藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的藥物，尤其是靶向腫瘤細(xì)胞表達(dá)的FAK的RNA干擾抗腫瘤藥物。
背景技術(shù)：
目前用于白血病治療的方法有很多，包括化療、放療、骨髓移植等。但是化療和放療對(duì)病人的身體傷害很大，且容易產(chǎn)生并發(fā)癥，療效也并不穩(wěn)定，對(duì)于某些不敏感的患者幾乎毫無作用。骨髓移植療效強(qiáng)于放化療，但是很難找到與患者完全匹配的配型。RNA干擾策略是近年來發(fā)展比較迅速的一項(xiàng)新的抗腫瘤治療策略，它一般是針對(duì)腫瘤內(nèi)異常表達(dá)的基因進(jìn)行特異性治療，此類基因在正常的細(xì)胞很少表達(dá)或不表達(dá)，因而此類治療方法副作用小，且不存在配型困難的問題，有著廣泛的應(yīng)用前景。
RNA干擾技術(shù)是利用小干擾RNA片段(siRNA)來高效地封閉目的基因的技術(shù)。它采用與目的基因同源的19-25核苷酸長的干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)切酶形成誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)，RISC以siRNA為模板特異地識(shí)別其同源基因mRNA并對(duì)其進(jìn)行遞進(jìn)式剪切，形成強(qiáng)有效的瀑布效應(yīng)，誘導(dǎo)序列特異性的mRNA降解，細(xì)胞表現(xiàn)特定基因的缺陷表型。該策略可以將癌癥基因關(guān)閉，而僅有一個(gè)堿基突變則喪失RNA干擾作用，對(duì)正常細(xì)胞影響甚微，特異性強(qiáng)。siRNA無論在體內(nèi)還是體外都比反義技術(shù)有更多優(yōu)勢(shì)，因此更廣泛地應(yīng)用在基因治療的領(lǐng)域中。
粘附斑激酶(FAK)屬于非受體胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶家族，可以調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的很多功能，包括增殖、周期、遷移、存活。由于FAK的這些調(diào)節(jié)功能和腫瘤的進(jìn)展有很大的聯(lián)系，所以FAK成為研究腫瘤遷移、浸潤、增殖、存活的熱點(diǎn)。已經(jīng)在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了FAK基因的異常表達(dá)，見RNAinterference targeting focal adhesion kinase enhances pancreatic adenocarinomagemcitabine chemosensitivity.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications.2003；311786-792。并與腫瘤的進(jìn)展有很大聯(lián)系，這為FAK成為腫瘤治療的靶點(diǎn)提供了依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種抗腫瘤的靶向粘附斑激酶的RNA干擾藥物，采用RNAi技術(shù)，在mRNA水平針對(duì)粘附斑激酶基因的siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞系中的粘附斑激酶基因進(jìn)行干擾，能有效抑制粘附斑激酶基因的表達(dá)，從而更加高效安全地對(duì)腫瘤進(jìn)行治療。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是該藥物主要組分包括一段干擾RNA序列，該序列是針對(duì)FAK基因mRNA選取的一段siRNA序列，稱之為RNAi-FAK，所述RNA干擾藥物為RNAi-FAK核苷酸序列，該RNAi-FAK核苷酸序列為5’-GCGAUUAUAUGUUAGAGAU-3’其針對(duì)的FAK靶點(diǎn)為5’-GCGATTATATGTTAGAGAT-3’(FAK基因中457號(hào)位點(diǎn)至475號(hào)位點(diǎn))。
所述的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物的siRNA核苷酸片段可以是由化學(xué)合成所得到的，也可以是由相應(yīng)的DNA片段裝載進(jìn)載體內(nèi)表達(dá)得到的，相應(yīng)的DNA片段也是由化學(xué)合成法制備。關(guān)于核酸鏈的合成技術(shù)，其方法詳見《生物化學(xué)》(P598，高等教育出版社，第三版，王鏡巖、朱圣庚、徐長法)。
給藥途徑可采用直接siRNA注射法、脂質(zhì)體包裹siRNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法中的一種。
1、裸siRNA直接注射將裸siRNA直接注射到機(jī)體的肌肉、皮內(nèi)、皮下、粘膜、靜脈內(nèi)。這種方法簡(jiǎn)單易行。
2、脂質(zhì)體包裹siRNA直接注射法包裹siRNA的脂質(zhì)體能與組織細(xì)胞發(fā)生膜融合，而將RNA攝入，減少了核酸酶對(duì)RNA的破壞。注射途徑同裸siRNA直接注射。
3、金包被DNA基因槍轟擊法將質(zhì)粒DNA包被在金微粒子表面，用基因槍使包被DNA的金微粒子高速穿入組織細(xì)胞。
4、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法選擇一種容易進(jìn)入某組織器官的細(xì)菌，將其繁殖基因去掉，然后用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌，當(dāng)這些細(xì)菌進(jìn)入某組織器官后，由于不能繁殖，則自身裂解而釋放出質(zhì)粒DNA。如可口服的減毒沙門氏菌。
本發(fā)明采用RNAi技術(shù)，在mRNA水平針對(duì)FAK基因的RNAi，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，推遲細(xì)胞周期，抑制腫瘤耐藥和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化。研制的RNAi能有效抑制粘附斑激酶FAK的表達(dá)，為RNAi技術(shù)應(yīng)用于白血病的治療提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)和有效新藥。


圖1是轉(zhuǎn)染后，兩組細(xì)胞內(nèi)FAK mRNA的轉(zhuǎn)錄情況；圖2是轉(zhuǎn)染后，兩組細(xì)胞內(nèi)FAK蛋白的表達(dá)情況；圖3是用siRNA處理以后，k562細(xì)胞的增殖情況的改變。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物作進(jìn)一步的詳細(xì)說明小片段RNA的制備和細(xì)胞轉(zhuǎn)染1)采用化學(xué)合成法。將所選擇RNA片段提交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(以下簡(jiǎn)稱上海生工)利用RNA合成儀合成所選取的RNA片段5’-GCGAUUAUAUGUUAGAGAU-3’。
2)質(zhì)粒表達(dá)法。將選擇片段對(duì)應(yīng)的DNA序列提交上海生工利用DNA合成儀合成，裝入能夠產(chǎn)生shRNA的pGE-1質(zhì)粒(invitrogene)中，用該片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA。
本發(fā)明采用的K562細(xì)胞系是人慢性粒系白血病的細(xì)胞系。細(xì)胞接種于含10％的小牛血清的RPMI1640(Gibco BRL公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前5×104/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板中，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，我們使用脂質(zhì)體lipofactamine 2000(invitrogen)分別將RNAi-FAK和si-neg轉(zhuǎn)染入k562細(xì)胞中，48小時(shí)后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
1.RNAi對(duì)FAK基因mRNA表達(dá)的情況mRNA的檢測(cè)采用半定量RT-PCR分析。技術(shù)路線1)半定量RT-PCR按TRIzol總RNA抽提試劑盒提取總RNA。電泳鑒定RNA的質(zhì)量，紫外光分光光度計(jì)定量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(40μl)組成DEPC處理水17μl，Oligo(dT)2μl，dNTP(10mmol/l)2μl，總RNA4μl，5×first-strand buffer8μl，DTT4μl，RNasin 1μl，逆轉(zhuǎn)錄酶2μl(試劑購自Invitrogen公司)。
PCR反應(yīng)體系按常規(guī)(試劑購自Invitrogen公司)。FAK基因PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性10min，95℃ 10s、55℃ 45s、72℃ 60s，共25個(gè)循環(huán)。用軟件gene runner輔助設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程公司合成，引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物大小如下β-actin作為內(nèi)對(duì)照。引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物大小如下β-actin上游引物5’-CAGAGCAAGAGAGGCATCC-3’下游引物5’-CTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’擴(kuò)增片段217bp擴(kuò)增產(chǎn)物用含0.5μg/mlEB1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用chemimage軟件分析。
半定量RT-PCR檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染目的片段組的FAK mRNA水平下調(diào)。轉(zhuǎn)染RNAi-FAK組的減少70％(p＜0.01)，陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無義干擾片段的k562細(xì)胞)中的FAK mRNA與未轉(zhuǎn)染組之間沒有顯著性差異(p＞0.05)。見圖1，結(jié)果表明，我們所選取的siRNA有效地抑制了FAK基因的轉(zhuǎn)錄。
2.FAK蛋白表達(dá)檢測(cè)FAK蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)采用Western-Blot技術(shù)。收集細(xì)胞后加入裂解液各200μl，經(jīng)8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，蛋白封閉液封閉膜4℃過夜；一抗為鼠抗人FAK單克隆抗體(1∶500稀釋)，室溫?fù)u床孵育2小時(shí)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體(1∶1000稀釋)，室溫孵育1h，化學(xué)熒光顯色。actin作為內(nèi)對(duì)照，一抗為鼠抗人actin單克隆抗體(1∶500稀釋)，其余條件同F(xiàn)AK。
Western-Blot檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染目的片段組的FAK蛋白水平下降。轉(zhuǎn)染RNAi-FAK的k562中FAK蛋白減少68.5％(p＜0.01)，陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無義干擾片段的k562)中的FAK蛋白水平與未轉(zhuǎn)染組之間沒有顯著性差異(p＞0.05)。見圖2，結(jié)果表明，所選取的siRNA有效地抑制了FAK基因的表達(dá)。
3.干擾FAK基因后k562細(xì)胞增殖的檢測(cè)采用四唑鹽(MTT)染色法來測(cè)定細(xì)胞的增殖。計(jì)數(shù)2000個(gè)細(xì)胞用200μl完全培養(yǎng)基種入96孔板中，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)，加入20g/ml的MTT，孵育4小時(shí)，離心去除上清，每孔加入150μl二甲基亞楓，劇烈震蕩10分鐘，測(cè)定OD490。
轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞在同等條件下培養(yǎng)48小時(shí)，以MTT染色法測(cè)定細(xì)胞的增殖程度。發(fā)現(xiàn)干擾FAK可以有效的抑制k562細(xì)胞的增殖。見圖3，通過MTT比色法，發(fā)現(xiàn)所選取siRNA有效地抑制了k562細(xì)胞的增殖。
4.干擾FAK基因后k562細(xì)胞凋亡的檢測(cè)采用磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法)方法檢測(cè)細(xì)胞耐藥性。在加入20μg/ml阿糖胞苷作用48小時(shí)后，檢測(cè)FAK基因被干擾后耐藥性的改變。檢測(cè)方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。收集細(xì)胞后每管(2-3)×105個(gè)細(xì)胞，用100μl labeling solution重懸，各加入Annexin V和PI1μl，避光室溫反應(yīng)15min，然后每管補(bǔ)300μl labeling solution，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
采用20μg/ml阿糖胞苷作為凋亡誘導(dǎo)劑。Annexin V/P I結(jié)果顯示，阿糖胞苷作用48小時(shí)后，轉(zhuǎn)染目的片段組細(xì)胞的凋亡率為75.16±5.61％，陰性對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率36.84±9.28％，轉(zhuǎn)染組的凋亡率明顯高于未轉(zhuǎn)染組(p＜0.01)，對(duì)照組的凋亡率與未轉(zhuǎn)染組無顯著性差異(p＞0.05)，提示FAK被干擾后能夠降低細(xì)胞耐藥性。
5.干擾FAK基因后k562細(xì)胞周期的檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。在去血清作用48小時(shí)后，收集細(xì)胞，檢測(cè)FAK基因被干擾后細(xì)胞周期的變化。收集細(xì)胞后70％(體積分?jǐn)?shù))乙醇4℃固定過夜；加入RNA酶至50μg/ml，37℃水浴消化30min，然后加入400μlPI(50μg/ml)，室溫存放15min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
各組k562細(xì)胞經(jīng)去血清處理48小時(shí)后，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。各組細(xì)胞在各個(gè)細(xì)胞周期的比例數(shù)如表1所示。結(jié)果提示FAK被抑制后，G0/G1期細(xì)胞比例較未轉(zhuǎn)染組增高(p＜0.05)，陰性對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組沒有顯著性差異(p＞0.05)?？梢?，F(xiàn)AK被干擾后，細(xì)胞周期被推遲，抑制細(xì)胞的生長。
表1

*p＜0.05
6.干擾FAK基因后k562細(xì)胞分化的改變采用聯(lián)苯胺染色法測(cè)定細(xì)胞的分化程度。5×10-7M阿糖胞苷作用48小時(shí)后，將細(xì)胞涂片，用聯(lián)苯胺染色的方法檢查細(xì)胞的分化情況，顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)5個(gè)區(qū)域以上。以藍(lán)色細(xì)胞為分子，全部細(xì)胞數(shù)為分母，計(jì)算細(xì)胞的分化率。
各組k562細(xì)胞用阿糖胞苷處理48小時(shí)后，用聯(lián)苯胺染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)FAK被干擾組，陽性細(xì)胞為68.33±4.86％，而對(duì)照組只有39.5±4.77％，提示FAK被干擾后，可以增加細(xì)胞的分化。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，其特征是RNA干擾藥物包括一段序列為5’-GCGAUUAUAUGUUAGAGAU-3’的RNA核苷酸片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，其特征是其針對(duì)的FAK靶點(diǎn)為5’-GCGATTATATGTTAGAGAT-3’---(457-475)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，其特征是所述的RNA核苷酸片段可以是由化學(xué)合成所得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，其特征是所述RNA核苷酸片段可以是由相應(yīng)的DNA片段裝載進(jìn)載體內(nèi)表達(dá)得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，其特征是給藥途徑可采用直接siRNA注射法、脂質(zhì)體包裹siRNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，該藥物主要組分包括一段干擾RNA序列，該序列是針對(duì)FAK基因mRNA選取的一段siRNA序列，稱之為RNAi－FAK，所述RNA干擾藥物為RNAi－FAK核苷酸序列，該RNAi－FAK核苷酸序列為5′－GCGAUUAUAUGUUAGAGAU－3′。其針對(duì)的FAK靶點(diǎn)為5′－GCGATTATATGTTAGAGAT－3’。本發(fā)明采用RNAi技術(shù)，在mRNA水平針對(duì)FAK基因的RNAi，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，推遲細(xì)胞周期，抑制腫瘤耐藥和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化，能有效抑制粘附斑激酶基因的表達(dá)，從而更加高效安全地對(duì)腫瘤進(jìn)行治療。
文檔編號(hào)A61P35/02GK101036789SQ200610013319
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者韓忠朝, 梁琳慧 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所