專利名稱：鮑魚菇提取物和提取方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然菇類抗氧化活性成分的提取，特別是一種鮑魚菇提取物和提取方法及其應(yīng)用。該提取物具有天然抗氧化活性，可以制成抗氧化劑，用于防治疾病，并且可作為提高機(jī)體免疫力，延年益壽的保健品。
背景技術(shù)：
從目前研究結(jié)果來看，氧自由基不僅與衰老、個體發(fā)育以及細(xì)胞分化有關(guān)，而且與人類大部分常見的主要疾病均有關(guān)，從人類死亡率最高的心腦血管疾病到人類最可怕的殺手—癌癥和艾滋病，以及人口老齡化社會所面對的最大挑戰(zhàn)—神經(jīng)退行性疾病，無一不和自由基有著密切的關(guān)系。通過保持自由基平衡或者除去過多的自由基可以達(dá)到防病治病的目的。但是目前人工合成的抗氧化劑，具有一定的毒性和誘變性，而且使用上受到很大程度的限制，所以國內(nèi)外研究人員正在從植物、真菌(菇類)、海洋生物中尋找安全、低毒、高效的天然抗氧化劑。比如香菇(Lentinus edodes)和草菇(Volvariellavolvacea)的甲醇和水的粗提物具有自由基清除和抑制大鼠紅細(xì)胞溶血的作用；云芝多糖(PSK)、靈芝多糖等從六種蘑菇中提取的具有抗癌活性的多糖，具有清除超氧自由基和羥自由基的作用。
鮑魚菇(Pleurotus abalonus)屬側(cè)耳科，側(cè)耳屬，又名臺灣平菇，臺灣黑鮑菇，它是熱帶和亞熱帶地區(qū)一種大型的木生食用菌，其營養(yǎng)豐富，富含高蛋白、低脂肪和適當(dāng)?shù)睦w維素，肉質(zhì)肥厚、脆嫩可口、風(fēng)味獨(dú)特，頗受人們的喜歡。國內(nèi)主要是把其作為一種食用菇類，國內(nèi)外都尚未見到鮑魚菇提取物作為體內(nèi)抗氧化劑以及提取工藝方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鮑魚菇提取物和提取方法及其應(yīng)用，該提取物包括多糖類和蛋白類，具有天然抗氧化活性，可以制成抗氧化劑，用于防治疾病，并且可以提高機(jī)體免疫力，作為延年益壽的保健品。該菇類資源豐富，提取容易，安全無毒，可以用于天然保健品開發(fā)。
本發(fā)明提取物總有效成分為乙醇沉淀DEAE洗脫物(P0.5)，占提取物總重量的8.5％(其他成分主要為單糖及纖維素)，其中，有效成分為兩種復(fù)合物糖蛋白1(P0.5a)以及糖蛋白2(P0.5b-1)，P0.5a主要含多糖82.64％，蛋白0.63％；P0.5b-1主要含多糖45.48％，蛋白12.63％。分子量分別為P0.5a為120,000，P0.5b-1為13,000。
本發(fā)明鮑魚菇提取物的提取方法是經(jīng)過下述的步驟1)將100～200g干燥的鮑魚菇子實(shí)體用500ml蒸餾水浸泡，回流條件下提取，提取液冷卻至室溫，離心分離，取上清液-40℃冷凍干燥，得干粉；所述的回流提取是提取2～4小時。
2)干粉溶解于80％的乙醇溶液中，于4℃過夜，離心，棄上清，-40℃將沉淀冷凍干燥，得干粉；3)將制得的干粉溶解于10mM，pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，上樣于陰離子交換纖維素層析柱，然后分別用200ml的10mM Tris-HCl，0.1N NaCl，0.5N NaCl，1N NaCl依次洗脫，洗脫速度為每3分鐘收集2ml，于-40℃冷凍干燥，收集產(chǎn)物P0.5；4)產(chǎn)物P0.5上樣于葡聚糖凝膠Sephadex G-200層析柱，用400ml蒸餾水洗脫，洗脫速度為每10分鐘收集2ml，-40℃冷凍干燥，得到P0.5a；5)將P0.5b上樣于葡聚糖凝膠Sephadex G-75層析柱，用400ml蒸餾水洗脫，洗脫速度為每6分鐘收集2ml，-40℃冷凍干燥，得到P0.5b-1。
本發(fā)明的提取方法是經(jīng)過下述具體的步驟1)將100～200g干燥的鮑魚菇子實(shí)體切碎，用500ml蒸餾水浸泡，回流條件下提取2～4小時，提取液傾出，冷卻至室溫后離心，取上清液-40℃冷凍干燥，即得干粉。
2)取2g干粉溶解于50ml雙蒸水中，再加入無水乙醇至終濃度為80％的乙醇溶液，于4℃過夜，離心，棄上清，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃將沉淀冷凍干燥，得干粉(P)。
3)取制得的干粉50mg溶于5ml Tris-HCl緩沖液中(10mM，pH8.0)，上樣于陰離子交換纖維素層析柱(DEAE)，然后分別用200ml的10mM Tris-HCl，0.1N NaCl，0.5NNaCl，1N NaCl依次洗脫，洗脫速度為每3分鐘收集2ml，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃冷凍干燥，收集產(chǎn)物(P0.5)。
4)經(jīng)分離得到的活性物質(zhì)上樣于層析柱(葡聚糖凝膠Sephadex G-200)，用400ml蒸餾水洗脫，洗脫速度為每10分鐘收集2ml，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃冷凍干燥，得到P0.5a和P0.5b。
5)將分離得到的活性物質(zhì)(P0.5b)上樣于層析柱(葡聚糖凝膠Sephadex G-75)，用約400ml蒸餾水洗脫，洗脫速度為每6分鐘收集2ml，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃冷凍干燥，得到P0.5b-1。
本發(fā)明鮑魚菇子實(shí)體提取物不僅對機(jī)體紅細(xì)胞溶血有顯著抑制作用和對組織脂質(zhì)過氧化有很強(qiáng)的抑制作用外，而且具有高效清除超氧陰離子的活性，是一種高效抗氧化劑，P0.5b-1的抗氧化活性要強(qiáng)于P0.5a。通過防止機(jī)體過量的自由基產(chǎn)生和清除產(chǎn)生的自由基，提高機(jī)體抗病能力，預(yù)防與自由基有關(guān)的各種疾病的發(fā)生達(dá)到延緩衰老的作用。
本發(fā)明具有抗氧化活性的特點(diǎn)，可以制成抗氧化劑，用于防治疾病，提高機(jī)體免疫力，以及作為延年益壽的保健品。并且可以用于天然保健品開發(fā)，該真菌資源豐富，提取容易，安全無毒。


圖1是P經(jīng)DEAE陰離子交換纖維素柱層析的洗脫曲線。
圖2是P0.5及Vc抑制SAM鼠體外紅細(xì)胞溶血曲線。
圖3是P0.5及BHA體外抑制SAM鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化作用曲線。
圖4是P0.5及BHA體外抑制SAM鼠腎勻漿脂質(zhì)過氧化作用曲線。
圖5是P0.5b-1純化產(chǎn)物經(jīng)HPLC純度鑒定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.鮑魚菇子實(shí)體提取物制備與純化1)干燥的鮑魚菇子實(shí)體切碎150g，水浸泡500ml，回流條件下提取2～4小時，提取液傾出，冷卻至室溫后離心，取上清液-40℃冷凍干燥，即得干粉。
2)取2g干粉溶解于50ml雙蒸水中，再加入無水乙醇至終濃度為80％的乙醇溶液，于4℃過夜，離心，棄上清，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃將沉淀冷凍干燥，得干粉(P)。
3)取制得的干粉50mg溶于5ml Tris-HCl緩沖液中(10mM，pH8.0)，上樣于陰離子交換纖維素層析柱(DEAE)，然后分別用200ml的10mM Tris-HCl，0.1N NaCl，0.5NNaCl，1N NaCl依次洗脫，洗脫速度為每3分鐘收集2ml，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃冷凍干燥，收集產(chǎn)物(P0.5)。
4)經(jīng)分離得到的活性物質(zhì)上樣于層析柱(葡聚糖凝膠Sephadex G-200)，用400ml的蒸餾水洗脫，洗脫速度為每10分鐘收集2ml，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃冷凍干燥，得到P0.5a和P0.5b。
5)將分離得到的活性物質(zhì)(P0.5b)上樣于層析柱(葡聚糖凝膠Sephadex G-75)，用約400ml蒸餾水洗脫，洗脫速度為每6分鐘收集2ml，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃冷凍干燥，得到P0.5b-1。
2.提取物成分確定經(jīng)過上述DEAE陰離子交換纖維素柱分離出1種活性成份P0.5，經(jīng)葡聚糖凝膠Sephdex G-200層析柱將P0.5純化出P0.5a和P0.5b兩種大分子活性成份，然后利用葡聚糖凝膠Sephdex G-75對P0.5b進(jìn)一純化，得到P0.5b-1和P0.5b-2，其中P0.5b-1具有顯著的抗氧化活性。P中活性成份P0.5，P0.5a和P0.5b-1的收率見表1。
表1P活性成份純化結(jié)果


經(jīng)多糖含量測定(蒽酮比色法Kawagishi，H.，Nomura，A.，Mizuno，T.，Kimura，A.，Chiba，S.Isolation and characterization of a lectin from Grifola frondosa fruiting bodies.Biochemical & Biophysical.Acta，1990，134247～252)發(fā)現(xiàn)，P0.5a主要成分為多糖，糖含量高達(dá)82.64％，P0.5b-1含有45.48％的多糖。對活性成份進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定(改良Lowry法Y.Orii and T.E.King.On the nature of the three intermediate species formed after reactionof reduced cytochrome oxidase with oxygen Journal of Biological Chemistry，1976，2517487～7493)，使用上海分析儀器總廠生產(chǎn)的752紫外光柵分光光度計。測定結(jié)果表明P0.5a含有少量蛋白，占0.63％，P0.5b-1含有12.63％的蛋白。結(jié)果見表2。
表2P0.5、P0.5a、P0.5b中多糖及蛋白含量測定

經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)鑒定純度。使用島津LC-10AT HPLC儀，采用TSK gelWxlb凝膠柱，緩沖液為0.1M PB+0.3M NaCl，測定吸收波長為230nm，測得結(jié)果P0.5a以多糖為主，含有極微量的蛋白。P0.5b-1為單一峰，見附圖5，而且在P0.5、P0.5a、P0.5b-1三種抗氧化活性成分中，活性最高。
3.分子量的確定方法為標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線的制作將四種凝膠過濾分子量Marker(表1)各10mg溶于1mL去離子水中，小心上樣于已用去離子水平衡好的葡聚糖凝膠(Sephadex G-200)凝膠過濾層析柱(2.5×100cm)，然后用去離子水洗脫，流速為3ml/10min，3ml/管進(jìn)行自動分步收集。測定每管在280nm處的光吸收值。以分子量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，藍(lán)色葡聚糖2000(Dextran Blue2000)的洗脫體積為外水體積(V0)，各物質(zhì)洗脫體積Ve-V0為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線。
表1凝膠過濾分子量Marker

2)樣品的葡聚糖凝膠(Sephadex G-200)分子篩凝膠柱層析將經(jīng)過DEAE-cellulose陰離子纖維素交換柱層析分離得到的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)一步上樣于葡聚糖凝膠(Sephadex G-200)分子篩凝膠柱層析，并以與標(biāo)準(zhǔn)品Marker相同的條件進(jìn)行洗脫，收集。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品相對分子量。經(jīng)此步，即可對活性成分進(jìn)行進(jìn)一步的純化，又可根據(jù)洗脫體積對活性物質(zhì)分子量進(jìn)行初步估算。經(jīng)過計算得到P0.5a分子量為120KD，P0.5b-1分子量為13KD。
4.鮑魚菇子實(shí)體提取物抗氧化活性測定結(jié)果見附圖2，3，4。
5.為了更好的理解本發(fā)明，下面用動物實(shí)驗(yàn)來說明鮑魚菇子實(shí)體提取物活性成份在小鼠體內(nèi)的抗氧化效果及對小鼠延緩衰老的作用，來說明本發(fā)明的特點(diǎn)。
機(jī)體在正常的生理?xiàng)l件下，自由基的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡，這是因?yàn)榇嬖谥宄杂苫拿复俜磻?yīng)和非酶促反應(yīng)的防御系統(tǒng)。如果防御系統(tǒng)功能下降，體內(nèi)產(chǎn)生自由基的水平會隨之增高，很容易與其他物質(zhì)生成新的自由基，而且往往以連鎖方式進(jìn)行下去，對組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，破壞細(xì)胞內(nèi)各種生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本發(fā)明將P0.5提取物作用于小鼠體內(nèi)第一，通過提高內(nèi)源性抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)的活性，消除并防止自由基的產(chǎn)生；第二，該提取物本身所含有的抗氧化成份直接清除體內(nèi)已有自由基代謝產(chǎn)物(過氧化脂質(zhì)LPO或丙二醛MDA)，減少自由基對各種抗氧化酶的滅活作用，維持機(jī)體生理平衡，使機(jī)體免受損害，起到防病和延緩衰老的效果。
本發(fā)明鮑魚菇子實(shí)體提取物抗氧化活性的測定方法如下1)細(xì)胞水平測定采用紅細(xì)胞溶血測定法。
給藥小鼠摘眼球取血，制備10％紅細(xì)胞懸液，加入等體積自由基引發(fā)劑2，2-偶氮-雙-(2-脒基丙烷)氯化二氫(AAPH)，引起紅細(xì)胞膜磷脂發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，釋放出血紅蛋白，于540nm測定上清液的吸光值，按下式計算抑制率抑制率(％)＝(1-A/B)×100％APBS反應(yīng)管吸光值 B完全溶血吸光值2)組織水平測定 采用硫代巴比妥酸(TBA)法。
將小鼠的肝組織勻漿后加入TBA，100℃加熱15分鐘，不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)物之一丙二醛產(chǎn)生，丙二醛與TBA反應(yīng)產(chǎn)生紅色物質(zhì)，在535nm處測定光吸收，抗氧化活性按下式計算抑制率(％)＝(A-A1)/A×100％A對照吸光值，A1試樣體系吸光值3)組織中SOD酶活性測定 采用亞硝酸鹽法黃嘌呤氧化酶(XO)與其底物次黃嘌呤或黃嘌呤反應(yīng)產(chǎn)生O2-·，與羥胺反應(yīng)生成NO2-·，在酸性條件下繼而與對氧基苯磺酸和N-萘二氨基乙烯發(fā)生顯色反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物，SOD酶抑制該反應(yīng)。由抑制的程度確定SOD酶活力。通過波長550nm處比色，計算酶活力。

4)全血CAT酶活性測定采用紫外速率直接法CAT可分解H2O2生成H2O和O2，H2O2在240nm處有吸收峰，測定反應(yīng)中H2O2在一定時間內(nèi)吸光度降低來表示CAT活性。取小鼠新鮮血20μl與5ml蒸餾水中，制成1∶250溶血液，即為待測樣品。將溶血液與H2O2混合后在240nm處測定吸光值的變化。
計算公式2.3×1000a30b×log(A0/A30)]]>a250×15 b全血Hb濃度(g/L)5)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性測定，采用DTNB直接法GSH-Px可特異性地催化GSH與過氧化物的氧化還原反應(yīng)，以單位時間內(nèi)GSH減少的量來表示GSH-Px的活力。在一定條件下GSH與DTNB(5，5’-二硫代對硝基苯甲酸)反應(yīng)生成淺黃色5’-硫代-2-硝基苯甲酸陰離子，在423nm處有最大吸收。
取小鼠全血10μl加入1ml雙蒸水中，制成1∶100溶血液，即為待測樣品，將樣品與GSH混合后加入H2O2，反應(yīng)3分鐘，然后加入NaOH調(diào)pH6.5，再加入DTNB顯色劑，通過測定各管吸光度來測定酶活性。
計算公式全血＝[GSH]非酶管-[GSH]樣品管+[GSH]試劑空白管/3×4μl通過以上方法對三批給藥和對照組小鼠進(jìn)行抗氧化活性測定。測定結(jié)果見表3表3 9月齡小鼠給藥后抗氧化活性測定結(jié)果

通過以上結(jié)果表明，鮑魚菇子實(shí)體提取物對機(jī)體具有提高各種抗氧化酶的活性，是一種有效的抗氧化劑。
實(shí)施例2選擇SAM鼠(天津防病中心提供)雄性、8月齡為實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行分組，給藥組6只，對照組6只，鮑魚菇子實(shí)體提取物(P0.5)加水配成適當(dāng)水溶液，通過灌胃的方式給藥30天，給藥劑量80mg/kg·bw，對照組給以相等劑量的生理鹽水，每日一次。給藥30天之后的實(shí)驗(yàn)小鼠，斷頸處死，取肝組織，制成10％肝勻漿液，離心后取上清液1ml，加入無水乙醇10μl，冰浴30分鐘，加入10％TritonX-100 110μl，冰浴5分鐘。將樣品稀釋200倍加入反應(yīng)體系，測定管加入酶液2ml，10mM的PBS 1ml混勻，在240nm處測定30秒吸光值的變化，計算CAT酶活力。
給藥組6只鼠的CAT酶活力平均為275.1K/g.Hb，對照組6只鼠的CAT酶活力平均為180.2K/g.Hb，給藥組比對照組CAT平均酶活力高94.9K/g.Hb。
實(shí)施例3小鼠壽命實(shí)驗(yàn)選擇SAM鼠10只，均為雄性，有關(guān)資料記載SAM鼠平均壽命為333天，將試驗(yàn)鼠分為兩組，為給藥組5只，對照組5只，給藥濃度30mg/kg·bw，每日一次以口服形式。給藥時間從小鼠10月齡開始(270天之后)一直到小鼠自然死亡為止，見表4。
表4小鼠壽命時間(天)

以上結(jié)果表明，選用SAM鼠作動物實(shí)驗(yàn)，在小鼠9個月之后通過口服鮑魚菇子實(shí)體提取物，可使小鼠壽命由對照組平均341天延長到平均壽命為394天，給藥組比對照組平均壽命增加57天。
權(quán)利要求
1.一種鮑魚菇提取物，其特征在于該提取物總有效成分為乙醇沉淀陰離子交換纖維素層析柱洗脫物P0.5，占提取物總重量的8.5％，其他成分主要為單糖及纖維素；其中，有效成分為兩種復(fù)合物糖蛋白P0.5a和糖蛋白P0.5b-1，P0.5a主要含多糖82.64％，蛋白0.63％；P0.5b-1主要含多糖45.48％，蛋白12.63％；分子量分別為P0.5a為120,000，P0.5b-1為13,000。
2.權(quán)利要求1所述的鮑魚菇提取物的提取方法，其特征在于它是經(jīng)過下述的步驟1)將干燥的鮑魚菇子水浸泡，回流條件下提取，提取液冷卻至室溫，離心分離，取上清液-40℃冷凍干燥，得干粉；2)干粉溶解于80％的乙醇溶液中，于4℃過夜，離心，棄上清，-40℃將沉淀冷凍干燥，得干粉；3)將制得的干粉溶解于10mM，pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，上樣于陰離子交換纖維素層析柱，然后分別用200ml的10mM Tris-HCl，0.1N NaCl，0.5NNaCl，1N NaCl依次洗脫，洗脫速度為每3分鐘收集2ml，于-40℃冷凍干燥，收集產(chǎn)物P0.5；4)產(chǎn)物P0.5上樣于葡聚糖凝膠Sephadex G-200層析柱，用400ml水洗脫，洗脫速度為每10分鐘收集2ml，-40℃冷凍干燥，得到P0.5a；5)將P0.5b上樣于葡聚糖凝膠Sephadex G-75層析柱，用400ml水洗脫，洗脫速度為每6分鐘收集2ml，-40℃冷凍干燥，得到P0.5b-1。
3.按照權(quán)利要求2所述的鮑魚菇提取物的提取方法，其特征在于步驟1)所述的鮑魚菇與水的重量體積比為1～2∶5。
4.按照權(quán)利要求2所述的鮑魚菇提取物的提取方法，其特征在于步驟1)所述的回流提取是提取2～4小時。
5.按照權(quán)利要求2所述的鮑魚菇提取物的提取方法，其特征在于步驟2)所述的干粉溶解是取干粉溶解于水中，再加入乙醇至乙醇的終濃度為80％。
6.一種權(quán)利要求1所述的鮑魚菇提取物的提取方法，其特征在于是經(jīng)過下述具體的步驟1)干燥的鮑魚菇子實(shí)體切碎，水浸泡，回流條件下提取2～4小時，提取液傾出，冷卻至室溫后離心，取上清液-40℃冷凍干燥，即得干粉。2)取2g干粉溶解于50ml雙蒸水中，再加入無水乙醇至終濃度為80％的乙醇溶液，于4℃過夜，離心，棄上清，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃將沉淀冷凍干燥，得干粉(P)。3)取制得的干粉50mg溶于5ml Tris-HCl緩沖液中(10mM，pH8.0)，上樣于陰離子交換纖維素層析柱(DEAE)，然后分別用200ml的10mM Tris-HCl，0.1NNaCl，0.5N NaCl，1N NaCl依次洗脫，洗脫速度為每3分鐘收集2ml，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃冷凍干燥，收集產(chǎn)物(P0.5)。4)經(jīng)分離得到的活性物質(zhì)上樣于層析柱(葡聚糖凝膠Sephadex G-200)，用400ml的蒸餾水洗脫，洗脫速度為每10分鐘收集2ml，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃冷凍干燥，得到P0.5a和P0.5b。5)將分離得到的活性物質(zhì)P0.5b上樣于層析柱(葡聚糖凝膠Sephadex G-75)，用400ml蒸餾水洗脫，洗脫速度為每6分鐘收集2ml，用真空冷凍干燥機(jī)于-40℃冷凍干燥，得到P0.5b-1。
7.按照權(quán)利要求6所述的鮑魚菇提取物的提取方法，其特征在于步驟1)所述的鮑魚菇與水的重量體積比為1～2∶5。
8.權(quán)利要求1所述的鮑魚菇提取物的應(yīng)用，用于體內(nèi)抗氧化劑的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及鮑魚菇提取物和提取方法及其應(yīng)用。本發(fā)明總有效成分占提取物總量的8.5％，兩種有效成分均為糖蛋白復(fù)合物其中一種P
文檔編號A61P39/00GK1911253SQ20061001370
公開日2007年2月14日 申請日期2006年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月16日
發(fā)明者劉方, 李樂, 傅明, 江荺, 王春玲, 宋敏, 袁芳 申請人:南開大學(xué)