專(zhuān)利名稱(chēng)：一種含麝香酮的凍干粉針劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醒腦靜凍干粉針劑及其制備方法，屬于中藥制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
缺血性中風(fēng)，占中風(fēng)病的53.6％，主要是腦動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)上的血栓形成所致(即腦梗塞)。隨著對(duì)缺血性中風(fēng)病理生理過(guò)程的深入理解及新的治療方法的改進(jìn)和發(fā)展，“腦病發(fā)作”(Brain attack)這一概念已經(jīng)日益受到重視。最初的缺血與腦組織損傷的每個(gè)小時(shí)都將迅速增加不可逆腦損害的程度，有越來(lái)越多的人認(rèn)識(shí)到中風(fēng)是一種與心肌梗塞相似的、同樣需要給以急救的疾病。近年來(lái)根據(jù)“治療時(shí)間窗”概念，制定出缺血性中風(fēng)發(fā)生后在一定時(shí)間內(nèi)給予相應(yīng)的合理治療方案，以達(dá)到腦組織損傷最少和獲得最佳的預(yù)后。而其中超早期治療(中風(fēng)癥狀發(fā)作后6小時(shí)內(nèi)行可能有效的治療)，尤為重要。中醫(yī)藥在治療缺血性中風(fēng)的臨床和基礎(chǔ)研究方面取得了可喜的成績(jī)，如能夠介入缺血性中風(fēng)超早期治療并深入進(jìn)行研究，有著廣闊的前景和重要的意義。歷代醫(yī)家均認(rèn)為中風(fēng)不僅為四大重癥之首，亦為中醫(yī)急癥之首，在理論探索、臨床辨證論治、急救等方面有極為豐富的成果和經(jīng)驗(yàn)。近20年來(lái)，不少醫(yī)家為提高本病的療效，致力于研制開(kāi)發(fā)使用方便、療效確實(shí)的新藥，取得了不少成果。如將具有活血化瘀作用的中成藥精制純化成注射劑，如復(fù)方丹參注射液，復(fù)方川芎注射液，紅花液、脈絡(luò)寧、冠心II號(hào)注射液等，無(wú)論對(duì)缺血性中風(fēng)還是出血性中風(fēng)均可應(yīng)用。
近年來(lái)，隨著對(duì)缺血性腦中風(fēng)機(jī)理研究的深入，已證實(shí)腦缺血后再灌注繼發(fā)性損傷對(duì)腦神經(jīng)的損傷是缺血性中風(fēng)后腦損傷的重要機(jī)制，因此，臨床上治療重點(diǎn)已經(jīng)逐漸轉(zhuǎn)移到如何預(yù)防和減輕缺血后再灌注引起的腦神經(jīng)損傷，研制和開(kāi)發(fā)有效的具有腦神經(jīng)保護(hù)作用的缺血性腦中風(fēng)治療藥物已經(jīng)成為新藥研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。中風(fēng)分閉、脫證，首見(jiàn)于李中梓，中風(fēng)神昏竅閉當(dāng)以開(kāi)竅法救急，這是共識(shí)，但如何開(kāi)竅歷代認(rèn)識(shí)并未統(tǒng)一。有人主張芳香開(kāi)竅，有主張豁痰開(kāi)竅，有的認(rèn)為勿需單用開(kāi)竅藥，應(yīng)以活血化瘀為主。中醫(yī)界對(duì)中風(fēng)的認(rèn)識(shí)，自1964年上海中醫(yī)學(xué)院主編《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》教材開(kāi)始，將閉證分為為陰閉和陽(yáng)閉，并提出陰閉治以蘇合香丸，陽(yáng)閉治以至寶丹，此后安宮牛黃丸治療陽(yáng)閉應(yīng)用更為普遍?，F(xiàn)在安宮牛黃丸已成為治療中風(fēng)閉證的主要用藥，并對(duì)其治療中風(fēng)的劑型改革、作用機(jī)理、給藥途徑等幾方面進(jìn)行了探索，取得了較大進(jìn)展。第三軍醫(yī)大學(xué)根據(jù)安宮牛黃丸研制的醒腦靜注射液近年來(lái)常用于中風(fēng)的治療。北京中醫(yī)藥大學(xué)的制藥和臨床學(xué)家根據(jù)原安宮牛黃丸研制成功清開(kāi)靈注射液，現(xiàn)也廣泛應(yīng)用于中風(fēng)的臨床治療，并成為國(guó)家中醫(yī)藥管理局推薦的中風(fēng)急癥必備中成藥。還有人制成安腦丸、安宮牛黃散、牛黃至寶丹、牛黃清熱散等治療中風(fēng)急癥者。
近年來(lái)，由于開(kāi)竅藥的劑型改進(jìn)，靜脈滴注醒腦靜注射液和清開(kāi)靈注射液等在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越多，擴(kuò)大了中藥給藥途徑，提高了臨床療效。但近年來(lái)，中藥尤其是中藥注射劑的臨床安全性問(wèn)題日益引起社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。特別是目前臨床上某些常用的中藥注射液品種，由于各種原因?qū)е滤幤贩€(wěn)定性較差，屢有不良反應(yīng)的報(bào)道，有進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)的必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種中藥“醒腦靜”凍干粉針制劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種中藥“醒腦靜”凍干粉針劑的制備方法。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，麝香酮含量為0.1mg～3mg/瓶。優(yōu)選的醒腦靜凍干粉針中，麝香酮含量為0.15mg～1.8mg/瓶。最佳的醒腦靜凍干粉針中，麝香酮含量為0.2mg～1.8mg/瓶。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，龍腦含量為1.0mg～5.6mg/瓶。優(yōu)選的醒腦靜凍干粉針中，龍腦含量為1.4mg～4.7mg/瓶。最佳的醒腦靜凍干粉針中，龍腦含量為1.8mg～4.7mg/瓶。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，梔子苷含量為1.0mg～6.0mg/瓶。優(yōu)選的醒腦靜凍干粉針中，梔子苷含量為1.5mg～5.6mg/瓶。最佳的醒腦靜凍干粉針中，梔子苷含量為1.8mg～5.6mg/瓶。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，郁金揮發(fā)油含量為郁金揮發(fā)油含量為0.000005ml～0.011245ml/瓶。優(yōu)選的醒腦靜凍干粉針中，郁金揮發(fā)油含量為0.000055ml～0.002245ml/瓶。最佳的醒腦靜凍干粉針中，郁金揮發(fā)油含量為0.000075ml～0.001245ml/瓶。
本發(fā)明凍干粉針，每瓶粉針劑中固形物重量0.43～0.45g。
本發(fā)明凍干粉針，每瓶粉針劑中固形物重量0.44g。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針，其特征在于，熾灼殘?jiān)?.5％(g/ml)，重金屬含量≤10ppm，砷鹽≤2ppm。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針，其特征在于，蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、草酸鹽、樹(shù)脂、不溶性微粒、鉀離子符合中國(guó)藥典2000年版一部粉針劑項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，對(duì)麝香酮含量、梔子苷含量、龍腦含量、郁金揮發(fā)油含量而言，只要有一個(gè)有效成分含量在本發(fā)明規(guī)定的范圍內(nèi)，是本發(fā)明醒腦靜凍干粉針的保護(hù)范圍。
優(yōu)選的本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，對(duì)麝香酮含量、梔子苷含量、龍腦含量、郁金揮發(fā)油含量而言，麝香酮含量、梔子苷含量、龍腦含量、郁金揮發(fā)油含量中的兩種或者幾種有效成分含量在本發(fā)明規(guī)定的范圍內(nèi)，是本發(fā)明醒腦靜凍干粉針的保護(hù)范圍。
最佳的本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，對(duì)麝香酮含量、梔子苷含量、龍腦含量、郁金揮發(fā)油含量而言，麝香酮含量、梔子苷含量、龍腦含量、郁金揮發(fā)油含量在本發(fā)明規(guī)定的范圍內(nèi)，是本發(fā)明醒腦靜凍干粉針的保護(hù)范圍。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針?biāo)幬锟梢詫⒃纤庽晗?、郁金、梔子、冰片采用中藥制劑常規(guī)方法制備。對(duì)原料藥有效成分可以采用以下方法水提法、水提醇沉法、醇提水沉、萃取法、浸漬法、滲漉法、回流提取法、連續(xù)回流提取法、大孔樹(shù)脂吸附法制備。也可將這些原料藥粉碎成粉末混合均勻制成散劑沖服；也可以將這些藥物一起水煎，然后濃縮水煎液，制成口服液；也可以將本發(fā)明藥物所用原料藥粉碎，將原料藥粉碎成分與輔料混合均勻，直接壓片。本發(fā)明可以采用上述提取方法、制成任何一種藥劑學(xué)上所說(shuō)的劑型；如片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、軟膏劑、硬膏劑、噴霧劑、滴丸、軟膠囊、注射液、凍干粉針劑等制劑形式，但優(yōu)選采用下述方法提取原料藥，并制備成凍干粉針劑。
本發(fā)明所述的醒腦靜凍干粉針制劑，其特征在于，包括如下步驟a.取如下重量份原料藥組分麝香15～90、郁金60～300、梔子60～300、冰片1～6；b.以上四味，郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子用3～14倍量50～99.5％乙醇回流提取1～5次，每次1～10小時(shí)，濾過(guò)，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.10～1.25左右的浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值為1～4，煮沸0.5～3小時(shí)，冷卻，冷藏12～36小時(shí)后離心，離心液用正丁醇萃取2～8次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.35(50℃)左右的浸膏，干燥得梔子提取物；麝香用1～8倍量70～99.5％乙醇回流提取1～6小時(shí)，提取液備用；取羥丙基-β-環(huán)糊精，加水使溶解，取郁金揮發(fā)油滴加入羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中密閉超聲，得郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物；取羥丙基-β-環(huán)糊精，加水使溶解，攪拌，保溫備用；取處方量冰片，加入到上述麝香提取液中，攪拌使溶解，得揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液；將揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液緩慢滴加至羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，攪拌，回收乙醇至盡后，濾過(guò)，得冰片麝香HP-β-CD包合物；將梔子提取物粉碎，加注射用水使溶解，用NaOH調(diào)pH，煮沸，冷藏，濾過(guò)，濾過(guò)液與郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物及冰片麝香HP-β-CD包合物混合，加甘露醇，用注射用水補(bǔ)足體積；用NaOH調(diào)pH值，煮沸，加入活性炭，保溫，粗濾脫炭，用注射用水調(diào)節(jié)體積，凍干，即得凍干粉針劑。
優(yōu)選的醒腦靜凍干粉針制劑的制備方法，其特征在于，步驟b中，郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子用5～10倍量60～85％乙醇回流提取2～3次，每次1～2小時(shí)，濾過(guò)，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.12～1.20左右的浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值為2～4，煮沸0.5～2小時(shí)，冷卻，冷藏18～30小時(shí)后離心，離心液用正丁醇萃取3～5次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.15～1.30(50℃)左右的浸膏，干燥得梔子提取物；麝香用1～4倍量80～99.5％乙醇回流提取2～4小時(shí)。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針的制備方法過(guò)程中，可以將上述有效成分完全混合或者對(duì)揮發(fā)油、麝香提取物、冰片粉碎物中的一種或幾種進(jìn)行包合，制備成醒腦靜凍干粉針的有效成分；將上述成分按照凍干粉針劑的制備方法，制備成凍干粉針劑。
本發(fā)明藥物中，麝香辛溫，氣香走竄，性辛味溫，主歸心經(jīng)。具有開(kāi)竅醒神，活血通經(jīng)，止痛等功效。為治療神志昏迷之要藥。臨床常用于邪蒙心竅、神志昏迷的治療，如熱病神昏痙厥、中風(fēng)痰厥、氣厥、中惡等卒然昏迷等癥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，本品有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸中樞及心臟的作用，故常用以作為急救藥品，治療各種熱病神昏、中風(fēng)神昏等病癥。
冰片為龍腦香科植物龍腦香的樹(shù)脂加工品。也有用菊科植物艾納香(大艾)葉經(jīng)蒸餾后冷卻所得的結(jié)晶品(稱(chēng)為艾片)，以及用松節(jié)油等制成的人工合成品(稱(chēng)機(jī)制冰片)。冰片性辛，味苦、微寒，與歸心、脾、肺經(jīng)；主要具有回蘇開(kāi)竅，清熱止痛的功效。臨床用于神昏痙厥治療。冰片有開(kāi)竅醒神之功效，但不及麝香，二者常相須為用，麝香常與冰片配伍，可加強(qiáng)辛散走竄、開(kāi)竅回蘇的作用。
郁金味辛、苦，性寒。主歸肝、膽、心經(jīng)。功能活血行氣止痛，常用治氣滯血瘀之胸、脅、腹痛。婦女痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)屬肝郁有熱、氣滯血瘀者，亦常應(yīng)用本品；治胸脅損傷、胸悶疼痛，也可選用。郁金又能解郁開(kāi)竅、清心，治痰蒙心竅、熱病昏迷；又能利膽退黃，治肝膽濕熱之黃疸、膽石癥等；且能涼血，順氣降火，而治氣火上逆之出血證。對(duì)雜病癲癇、癲狂亦可選用本品。
梔子味苦，性寒，歸心、肝、肺、胃經(jīng)，具有瀉火除煩，涼血解毒的功效。主要用于熱病煩熱。本品苦寒清降，清瀉三焦火邪，有清心除煩之效?，F(xiàn)代研究證實(shí)，梔子含梔子素、梔子甙、去羥梔子甙和藏紅花素、藏紅花酸、熊果酸等。梔子煎劑及醇提取液有利有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降壓及止血的作用。本發(fā)明中麝香、冰片開(kāi)竅醒神，梔子主瀉心包之火清熱解毒，助麝香內(nèi)透包絡(luò)。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，梔子苷含量照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VID)測(cè)定。
色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1％磷酸(15∶85)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為238nm。理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。
對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取梔子苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，搖勻，即得。
供試品溶液的制備精密稱(chēng)取本品0.2g，置25ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，即得。
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針產(chǎn)品中，梔子以梔子苷(C17H24O10)計(jì)，含量為1.0mg～6.0mg/瓶。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，龍腦和麝香酮含量照氣相色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI E)測(cè)定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱INNOWAX(30m×0.53mm)，柱溫100℃，保持2分鐘，開(kāi)始以每分鐘15℃的速度升至200℃，保持15分鐘。汽化室溫度250℃；檢測(cè)器溫度250℃；檢測(cè)器FID氫火焰離子化檢測(cè)器，氫氣流量30ml/min；空氣流量300ml/min；載氣；高純度氮?dú)猓惠d氣流量20ml/min；進(jìn)樣方式分流比5∶1。理論板數(shù)按龍腦峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。
對(duì)照品溶液的制備分別精密稱(chēng)取龍腦、麝香酮對(duì)照品適量，分別加二甲基甲酰胺制成每1ml各含0.05mg、0.005mg的溶液，搖勻，即得。
供試品溶液的制備取本品2瓶?jī)?nèi)容物，研碎，精密稱(chēng)取0.1g，置10ml量瓶中，先加蒸餾水1ml，振搖使溶解后，靜置半小時(shí)，再加二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。
測(cè)定法精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1μl，注入氣相色譜儀，測(cè)定，即得。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針產(chǎn)品中，以龍腦(C10H18O)計(jì)，含量為1.0mg～5.6mg/瓶。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針產(chǎn)品中，以麝香酮(C16H30O)計(jì)，含量為0.1mg～3mg/瓶。
本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，藥物有效成分的含量，梔子以梔子苷(C17H24O10)計(jì)、冰片以龍腦(C10H18O)計(jì)、麝香以麝香酮(C16H30O)計(jì)、郁金以郁金揮發(fā)油計(jì)，其有效成分含量最低不能低于各有效成分最低含量。
優(yōu)選的本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，藥物有效成分的含量，梔子以梔子苷(C17H24O10)計(jì)、冰片以龍腦(C10H18O)計(jì)、麝香以麝香酮(C16H30O)計(jì)、郁金以郁金揮發(fā)油計(jì)，含量在本發(fā)明規(guī)定的范圍內(nèi)。
最佳的本發(fā)明醒腦靜凍干粉針中，藥物有效成分的含量，梔子以梔子苷(C17H24O10)計(jì)，不得少于1.8mg/瓶；含冰片以龍腦(C10H18O)計(jì)，不得少于1.8mg/瓶；含麝香以麝香酮(C16H30O)計(jì)，不得少于0.2mg/瓶；郁金以郁金揮發(fā)油計(jì)，不得少于0.2mg/瓶。
以上組成在生產(chǎn)時(shí)可按照相應(yīng)的比例增大或減少，如大規(guī)模生產(chǎn)可以以公斤或以噸為單位，小規(guī)模生產(chǎn)也可以以克為單位，重量可以增大或減小，但各組成之間的生藥材料重量配比比例不變。
以上各組成中的單味中藥，可以單獨(dú)或同時(shí)被適當(dāng)?shù)木哂邢嗤幮?、功效的中藥替換，替換后中藥制劑及其藥物作用不變。
本發(fā)明為醒腦靜注射液二次開(kāi)發(fā)的品種，克服了主含揮發(fā)油的溶液型注射劑醒腦靜注射液因揮發(fā)油在水溶液中的微量過(guò)飽和，或因外界條件(如光、空氣)的影響而使揮發(fā)油氧化，從而出現(xiàn)乳光現(xiàn)象，造成制劑的澄明度不合格，質(zhì)量不穩(wěn)定的缺點(diǎn)；再則克服了醒腦靜注射液中有效成分含量或者是有效成分含量配比不確定的缺點(diǎn)。本發(fā)明凍干粉針可有效保證其貯藏質(zhì)量。
為了更好的理解本發(fā)明，以下通過(guò)本發(fā)明藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)例來(lái)進(jìn)一步闡述發(fā)明藥物的有益效果，下面試驗(yàn)旨在進(jìn)一步說(shuō)明藥物的作用，而非對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)驗(yàn)例1醒腦靜凍干粉針與醒腦靜注射液對(duì)比試驗(yàn)試驗(yàn)樣品醒腦靜凍干粉針(天津天士力制藥集團(tuán) 生產(chǎn)批號(hào)030806、030816)；醒腦靜注射液(無(wú)錫山禾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)生產(chǎn)批號(hào)030202、030803)方法將醒腦靜注射液和醒腦靜凍干粉針同置于37℃恒溫濕箱中，進(jìn)行加速破壞試驗(yàn)，每隔1個(gè)月抽樣檢查一次(水針檢查澄明度)，共放置3個(gè)月，按外形、色澤、澄明度、PH值檢查，冰片以龍腦計(jì)(C10H18O)的檢查，其結(jié)果如表1、表2。
表1 醒腦靜注射液37℃加速破壞試驗(yàn)結(jié)果

表2 醒腦靜凍干粉針37℃加速破壞試驗(yàn)結(jié)果

注速溶指20秒內(nèi)溶解，溶液澄明；結(jié)果表明醒腦靜凍干粉針具有成型好，質(zhì)量穩(wěn)定，速溶，澄明，使用方便等特點(diǎn)。本發(fā)明中冰片以龍腦計(jì)(C10H18O)(mg/瓶)的含量在規(guī)定范圍內(nèi)。醒腦靜粉針每瓶固形物含量約0.44g。
實(shí)驗(yàn)例2 醒腦靜凍干粉針?lè)€(wěn)定性試驗(yàn)資料取本發(fā)明注射用醒腦靜凍干粉兩批次

檢查項(xiàng)目和檢查方法如下澄明度 照《澄明度檢查細(xì)則和判斷標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定檢查，每瓶?jī)?nèi)容物加注射用水20ml使溶解，應(yīng)符合規(guī)定。
pH值取本品2瓶?jī)?nèi)容物，加注射用水5ml使溶解，依法測(cè)定(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VIIG)，pH值應(yīng)為4.5～6.5。
水分取本品，依法測(cè)定(中國(guó)藥典2000年版一部附錄IX H水分測(cè)定法第三法)，含水量不得過(guò)5.0％。
蛋白質(zhì)取本品1瓶，加注射用水2.5ml使溶解，量取1ml，加鞣酸試液1～3滴，不得出現(xiàn)混濁。
鞣質(zhì)取本品1瓶，加注射用水2.5ml使溶解，量取1ml，加稀醋酸1滴，再加氯化鈉的明膠試液4～5滴，不得出現(xiàn)渾濁或沉淀。
熾灼殘?jiān)”酒?瓶?jī)?nèi)容物，精密加水5ml使溶解，精密量取4ml，置已熾灼至恒重的坩堝中，蒸干，依法檢查(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄IXJ)。遺留殘?jiān)坏眠^(guò)1.5％(g/ml)。
重金屬取本品1g，照熾灼殘?jiān)鼫y(cè)定法(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄IXJ)操作所得的遺留殘?jiān)?，依法檢查(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄IXE第二法)，含重金屬不得過(guò)百萬(wàn)分之十。
砷鹽取本品1g，照熾灼殘?jiān)鼫y(cè)定法(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄IXJ)操作所得的遺留殘?jiān)?，依法檢查(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄IXF第一法)，含砷量不得過(guò)百萬(wàn)分之草酸鹽取本品一瓶，加注射用水2.5ml使溶解，依法檢查《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄I XS)，不得出現(xiàn)渾濁或沉淀。
樹(shù)脂取本品2瓶?jī)?nèi)容物，加注射用水5ml使溶解，加鹽酸1滴，放置30分鐘，應(yīng)無(wú)絮狀物析出。
不溶性微粒取本品1瓶?jī)?nèi)容物，加注射用水250ml使溶解，用注射用水做空白，照顯微計(jì)數(shù)法(中國(guó)藥典2000年一部附錄IXR)，每1ml中含10μm以上微粒不得過(guò)20粒，含25μm以上微粒不得過(guò)2粒。
無(wú)菌取本品1瓶，加注射用水2.5ml使溶解，取1ml，依法檢查(中國(guó)藥典2000年版一部附錄XIII B)，應(yīng)符合規(guī)定。
熱原取本品1瓶?jī)?nèi)容物，用生理鹽水注射液20ml使溶解，按家兔體重每1kg注射3ml，依法檢查(中國(guó)藥典2000年版一部附錄XIIIA)，應(yīng)符合規(guī)定。
異常毒性取本品1瓶?jī)?nèi)容物，加生理鹽水注射液20ml使溶解，依法檢查(《中國(guó)藥典》2000年版二部附錄XIC)。按靜脈注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定。
鉀離子取本品1瓶?jī)?nèi)容物，加注射用水2.5ml使溶解，依法檢查(《中國(guó)藥典》2000年版一部附錄IXS)，應(yīng)符合規(guī)定。
有機(jī)溶媒殘留量測(cè)定按中國(guó)藥典2000年版一部附錄氣相色譜法和乙醇測(cè)定法測(cè)定。藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)報(bào)告一樣品名稱(chēng)注射用醒腦靜凍干粉 批號(hào)030806 生產(chǎn)日期2003年8月6日

藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)報(bào)告二樣品名稱(chēng)注射用醒腦靜凍干粉 批號(hào)030819 生產(chǎn)日期2003年8月19日


實(shí)驗(yàn)例3注射用醒腦靜凍干粉的主要藥效學(xué)試驗(yàn)研究試驗(yàn)?zāi)康?/b>觀察醒腦靜凍干粉對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血和昏迷動(dòng)物模型的影響，并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究以判定其療效，為該藥的臨床應(yīng)用提供藥效學(xué)依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)藥品受試藥物注射用醒腦靜凍干粉，由北京神農(nóng)壇醫(yī)藥科技有限公司提供，規(guī)格342.5mg/瓶，批號(hào)030807。使用時(shí)用生理鹽水配制成所需濃度。
對(duì)照藥 醒腦靜注射液，云南大理藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)030421，國(guó)藥準(zhǔn)字Z53021639；香丹注射液，江蘇康怡制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)030710-1，國(guó)藥準(zhǔn)字Z32020159；尼莫地平注射液，德國(guó)拜耳公司產(chǎn)品，批號(hào)BH20020394，國(guó)藥準(zhǔn)字J20020102。安定注射液(地西泮注射液)，江西濟(jì)川制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)001123，國(guó)藥準(zhǔn)字H32021652。氯化鈉注射液，江西制藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號(hào)030710-1。
2.實(shí)驗(yàn)試劑氯代三苯基四氮唑(紅四氮唑或TTC)，F(xiàn)luka產(chǎn)品，瑞士分裝，批號(hào)RA11881，規(guī)格10g/瓶，白色粉末，用生理鹽水配置成2％溶液備用；多聚甲醛，天津市化學(xué)試劑研究所生產(chǎn)，批號(hào)20020308，規(guī)格10g/瓶；水合氯醛，五聯(lián)化工廠(中國(guó)上海)，批號(hào)w20021122，規(guī)格250g/瓶；磷酸氫二鈉，廣州新成化工廠提供，批號(hào)20020308，規(guī)格500g/瓶；磷酸二氫鈉，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)20020308，規(guī)格500g/瓶；氨基甲酸乙酯(烏來(lái)糖)，上海三浦化工有限公司，批號(hào)20030812；戊巴比妥鈉，上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品，批號(hào)F20020915；ADP，Sigma公司產(chǎn)品，終濃度為35μmol/L；SOD、MDA試劑盒均有南京建成生物生物工程公司產(chǎn)品，批號(hào)20040521、20040528；士的寧，Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)44H0910；紅星二鍋頭，北京釀酒總廠，56度。
3.實(shí)驗(yàn)儀器DH-150人工動(dòng)物呼吸機(jī)，浙江大學(xué)儀器廠產(chǎn)品；電熱恒溫干燥箱，長(zhǎng)沙醫(yī)療器械廠；BI2000醫(yī)學(xué)圖象系統(tǒng)，四川省成都泰盟科技有限公司；RM-6000型四道生理多導(dǎo)儀為日本光電公司產(chǎn)品，所用插件分別為浮地式生物電放大器(AT-601G)、載波放大器(AP-621G)、血壓記錄器(AP-611G)、心率計(jì)數(shù)器(AT-601G)、MF-1200型電磁流量計(jì)為日本光電公司產(chǎn)品；TYXN-91型智能血小板聚集儀，上海伯奧生物科技有限公司；YSD-4G藥理生理實(shí)驗(yàn)多用儀，安徽蚌埠醫(yī)學(xué)院儀器廠研制；LDZ5-2離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；System CA-530血凝儀(日本)；尼龍線，活力牌，直徑為0.205或0.235mm，由臺(tái)灣產(chǎn)；微型動(dòng)脈夾等。
4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，合格證號(hào)2001A030；清潔級(jí)SD大鼠，雄性體重240～280g，合格證號(hào)2001A029；新西蘭大白兔，體重1.5～2.5kg，雌雄不限，合格證號(hào)2001A033；雜種犬，11～14kg，雌雄兼有；以上均由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。沙土鼠，體重60～80g，雌雄各半，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(浙)2003-0002。
飼養(yǎng)條件動(dòng)物進(jìn)入動(dòng)物飼養(yǎng)房后，小鼠每籠放養(yǎng)10只，大鼠每籠放養(yǎng)5只，兔每籠1只，飼養(yǎng)3天后啟用，由專(zhuān)人飼養(yǎng)管理。動(dòng)物室燈光12小時(shí)照明，通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備良好，室溫控制在25±1℃，相對(duì)濕度為40～50％。實(shí)驗(yàn)室按常規(guī)定期消毒。
劑量設(shè)置通過(guò)醒腦靜凍干粉對(duì)小鼠對(duì)自發(fā)活動(dòng)、戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間及小鼠凝血時(shí)間的影響等試驗(yàn)得出144mg/kg為較佳有效劑量，正式試驗(yàn)取其1/2為低劑量，2倍為高劑量，低、中、高劑量分別為72、144、288mg/kg。通過(guò)體表面積折算得，大鼠低、中、高劑量分別為50、100、200 mg/kg；沙土鼠低、中、高劑量分別為50、100、200mg/kg；犬低、中、高劑量分別為15、30、60mg/kg。
醒腦靜注射液，人用量為10-20ml/天，取中間劑量15ml/天，通過(guò)體表面積換算，小鼠約為1.95ml/kg，大鼠或沙土鼠約為1.35 ml/kg，犬為0.40ml/kg。香丹注射液香丹注射液，人用量為20 ml/天，通過(guò)體表面積換算，小鼠約為2.6ml/kg，大鼠或沙土鼠約為1.8ml/kg，犬為0.53 ml/kg。尼莫地平注射液，大鼠或沙土鼠約為0.3mg/kg/次，犬為0.1mg/kg/次。
藥物稀釋方法、給藥途徑及體積取同一批號(hào)的各實(shí)驗(yàn)所用藥品，用生理鹽水配制，每日現(xiàn)配制現(xiàn)用。給藥途徑靜脈注射或腹腔注射。各種單位給藥容積分別為小鼠為0.15ml/10g體重；沙土鼠為1.0ml/100g體重；大鼠為0.4ml/100g；犬為3.0ml/kg體重。
數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 表示。計(jì)量數(shù)據(jù)由SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及組間檢驗(yàn)。
方法與結(jié)果1.對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈栓線法局灶性腦缺血(MCAO)模型的影響1.1方法分組及給藥取雄性SD大鼠，按隨機(jī)分組原則分成7組，分別為假手術(shù)組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、醒腦靜凍干粉低(50mg/kg)、中(100mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量組、醒腦靜注射液(1.35 ml/kg)組和尼莫地平注射液(0.3mg/kg)組。
藥物用生理鹽水配制成相應(yīng)的濃度，使給藥體積均為0.2ml/100g大鼠。造模前0.5h先靜脈注射給藥1次；造模后6h和12h分別進(jìn)行第2、3次給藥，即總共給藥3次。模型組和假手術(shù)組大鼠給予生理鹽水，給藥時(shí)間及體積同上。
造模方法 將大鼠用10％水合氯醛3.5ml/mg腹腔注射(ip)麻醉后，頸正中切口，分離、結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及其分支動(dòng)脈。在頸內(nèi)動(dòng)脈近端備線、遠(yuǎn)端放置動(dòng)脈夾，頸總動(dòng)脈分叉處切口，插入4～0尼龍線，其深度為17～20mm，栓線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，入顱至大腦前動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈所有血流來(lái)源。撤掉動(dòng)脈夾，扎緊備線，剪去多余線頭，傷口以碘伏消毒，最后縫合皮膚，手術(shù)完畢回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不插線外，其余步驟同上。其余各組大鼠按上述手術(shù)方法造模。
造模成功的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)后動(dòng)物清醒后有明顯手術(shù)側(cè)(即左側(cè))Horner癥(左側(cè)眼瞼下垂，眼球凹陷)及手術(shù)側(cè)(即左側(cè))偏癱體癥(不能完全伸展左前肢，行走時(shí)向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈)。依上述標(biāo)準(zhǔn)將能夠存活24h的大鼠確定為最后的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分及快速斷頭取腦。
觀察指標(biāo)
(1)行為學(xué)評(píng)分對(duì)造模成功存活24h的大鼠，觀察其行為學(xué)變化，然后參照Z(yǔ)ea Longa的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)下)進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)評(píng)分。
0分無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分向?qū)?cè)傾倒；4分不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。
(2)腦含水量測(cè)定神經(jīng)病學(xué)評(píng)分后，快速斷頭取鼠大腦。取左側(cè)半腦后半部分分別稱(chēng)濕重，置120℃烤箱烘干至恒重，按以下公式計(jì)算腦組織含水量。
腦組織含水量(％)＝(濕重-干重)/濕重×100％。
(3)腦組織勻漿測(cè)定生化指標(biāo)迅速斷頭取腦，取左側(cè)半腦前半部分放于液氮中保存待測(cè)。從液氮中取出半腦稱(chēng)取100mg，后置于9倍的生理鹽水中，用研磨器于冰塊上研磨，制成100％(W/V)腦勻漿液，3500rpm/min，離心10min。
檢測(cè)腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的水平或含量。
檢測(cè)方法MDA測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，SOD活力檢測(cè)采用黃嘌呤氧化法。
(4)腦梗塞范圍的測(cè)定造模后24h每組取8只大鼠，快速取全腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冰凍25分鐘。然后冠狀切四刀，將全腦切成五片。第一刀位于腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處，第二刀位于視交叉，第三到在漏斗部，第四到在漏斗柄與葉尾極之間。接著迅速將腦片置2％紅四氮唑(TTC)中，避光，37℃溫孵30分鐘，其間每隔7～8min翻動(dòng)一次，染色后以4％多聚甲醛固定。染色結(jié)果正常組織呈紅色，梗塞組織呈白色。拍照并用BI2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)計(jì)算腦梗塞面積百分比。
1.2結(jié)果1.2.1行為學(xué)評(píng)分結(jié)果經(jīng)過(guò)腦梗塞的大鼠麻醉清醒后即有偏癱樣癥狀出現(xiàn)。主要表現(xiàn)為不同程度的手術(shù)對(duì)側(cè)前肢內(nèi)收，肩內(nèi)旋，肌張力降低，推右肩向?qū)?cè)移動(dòng)，抵抗阻力降低，還出現(xiàn)不停地向一側(cè)轉(zhuǎn)圈，甚至有些動(dòng)物出現(xiàn)向?qū)?cè)傾倒或不能自主活動(dòng)現(xiàn)象。
由表1結(jié)果可見(jiàn)，與模型組比較，術(shù)后24h的行為評(píng)分醒腦靜凍干粉50、100、200mg/kg三組、醒腦靜注射液(1.35ml/kg)組和尼莫地平注射液(0.3mg/kg)組均有明顯降低MCAO大鼠的行為學(xué)評(píng)分，統(tǒng)計(jì)分析有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)。術(shù)后模型組動(dòng)物的一般狀態(tài)較差，活動(dòng)減少，大多數(shù)動(dòng)物體重有所下降，而各藥物治療組動(dòng)物一般狀況均有明顯的改善。
表1 對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響(

)

與模型組比較*P＜0.05；**P＜0.011.2.2對(duì)腦組織含水量的影響由表2可見(jiàn)，假手術(shù)組大鼠腦含水量較低，模型組大鼠腦含水量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)； 醒腦靜凍干粉50mg組的腦含水量有所降低，但與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；醒腦靜凍干粉100 mg/kg組和200 mg/kg組則顯著低于模型對(duì)照組(P＜0.01)，醒腦靜注射液組及尼莫地平注射液組大鼠腦含水量也顯著低于模型組大鼠(P＜0.05或P＜0.01)。
表2對(duì)MCAO大鼠腦含水量的影響(

)

與模型組比較*P＜0.05；**P＜0.011.2.3對(duì)腦組織中SOD和MDA含量的影響見(jiàn)表3，模型組腦組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯提高，與假手術(shù)相比較均有顯著性差異(P＜0.01)。醒腦靜凍干粉各劑量組與模型對(duì)照組比較，SOD活性明顯升高，MDA含量顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)；兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組也使損傷腦組織中SOD明顯升高，MDA顯著下降。
表3 對(duì)MCAO大鼠腦組織中SOD和MDA含量的影響(

,n＝8)

與模型組比較*P＜0.05；**P＜0.011.2.4對(duì)大鼠腦梗塞范圍的影響由于TTC染色適合于腦缺血24～48h內(nèi)檢測(cè)腦梗塞情況，故本實(shí)驗(yàn)是大鼠發(fā)生腦梗塞后24h利用TTC染色技術(shù)檢查腦梗塞程度(見(jiàn)附圖
一)。由表4可以看出，模型組大鼠腦缺血再灌注24h后腦組織梗塞面積占腦總面積的33.39±8.51％。與模型組大鼠相比，醒腦靜凍干粉50mg/kg、100mg/kg及200mg/kg大鼠腦梗塞面積分別縮小12.1％(P＞0.05)、30.5％(P＜0.05)及37.7％(P＜0.01)、醒腦靜注射液組和尼莫地平注射液組大鼠腦梗塞面積亦較模型組大鼠分別縮小32.6％(P＜0.05)及38.9％(P＜0.01)。假手術(shù)組動(dòng)物未見(jiàn)腦梗塞發(fā)生。
表4對(duì)MCAO大鼠腦梗死面的影響(

)

與模型組比較*P＜0.05；**P＜0.012對(duì)沙土鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用2.1方法分組和給藥取沙土鼠70只，按雌雄各半和隨機(jī)原則分成7組，每組10只分別為假手術(shù)組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、醒腦靜凍干粉低(50mg/kg)、中(100mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量組、醒腦靜注射液(1.35ml/kg)組和尼莫地平注射液(0.3mg/kg)組。給藥體積均為1ml/100g沙土鼠。
造模前30min進(jìn)行第一次給藥(舌靜脈注射)，造模后6h和12h進(jìn)行第二和第三次給藥(腹腔注射)，總共給藥3次。模型組和假手術(shù)組沙土鼠同樣方式給予注射生理鹽水，給藥時(shí)間、體積及方法同實(shí)驗(yàn)組。
模型復(fù)制 以10％水合氯醛(3.5ml/kg，i.p.)麻醉沙土鼠。將麻醉沙土鼠仰臥固定，沿頸正中線作約1.5cm皮膚切口，分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈并穿縫線，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷血流50min然后再恢復(fù)血流24h，造成沙土鼠腦缺血再灌注損傷模型?？p合皮膚傷口，手術(shù)完畢回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組沙土鼠只分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎；其余各組沙土鼠按上述手術(shù)方法造模。
觀察指標(biāo)(1)腦含水量測(cè)定沙土鼠造模后24h快速取全腦，取左側(cè)腦后半部分(以視交叉為界)稱(chēng)濕重及玻片重，置120℃烤箱內(nèi)烘干4h至恒重，用電子天平稱(chēng)取標(biāo)本干重。根據(jù)以下公式計(jì)算腦含水量[2]腦含水量(％)＝(濕重-干重)×100％/濕重(2)腦組織勻漿SOD和MDA測(cè)定腦組織勻漿液的制備迅速斷頭取腦，取左側(cè)半腦前小半部分放于液氮中保存待測(cè)。從液氮中取出半腦稱(chēng)取100mg，后置于9倍的生理鹽水中，用研磨器于冰塊上研磨，制成100％(W/V)腦勻漿液，3500轉(zhuǎn)/min，離心10min。
檢測(cè)方法MDA測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，SOD活力檢測(cè)采用黃嘌呤氧化法。
2.2結(jié)果2.2.1腦組織含水量測(cè)定結(jié)果由表5可見(jiàn)，腦缺血再灌注24小時(shí)后模型組沙土鼠腦組織含水量明顯升高，與假手術(shù)組相比差異非常顯著(P＜0.01)；而醒腦靜凍干粉50 mg/kg組、100 mg/kg組及200mg/kg組與模型組對(duì)比均有顯著性差異或非常顯著(P＜0.05或P＜0.01)，其中醒腦靜凍干粉200mg/kg組沙土鼠腦組織含水量則與假手術(shù)組相接近。與模型組比較，尼莫地平注射液沮及醒腦注射液組沙土鼠的腦組織含水含量也明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。
表5 醒腦靜凍干粉對(duì)沙土鼠全腦缺血再灌注損傷腦組織含水量測(cè)定(

)


與模型組比，*P＜0.05；**P＜0.012.2.2腦組織勻漿SOD和MDA含量測(cè)定見(jiàn)表6，模型組腦組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯提高，與假手術(shù)相比較均有顯著性差異(P＜0.01)。醒腦靜凍干粉各劑量組與模型對(duì)照組比較則SOD活性明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)；醒腦靜凍干粉100mg/kg組和200 mg/kg組MDA含量顯著下降(P＜0.01)，50mg/kg組則下降不明顯。尼莫地平注射液及醒腦靜注射液陽(yáng)性對(duì)照組則與醒腦靜100mg/kg組作用相近。
表6 醒腦靜凍干粉對(duì)沙鼠全腦缺血再灌注損傷腦組織SOD和MDA的影響(

)

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.013醒腦靜凍干粉對(duì)犬腦循環(huán)的影響3.1方法取健康合格雜種犬36條，雌雄兼用，隨機(jī)分成6組。即空白對(duì)照組、醒腦靜凍干粉低(15mg/kg)、中(30mg/kg)、高(60mg/kg)劑量組，醒腦靜注射液(0.40ml/kg)組，尼莫地平(100μg/kg)。用戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉后，切開(kāi)氣管，插入氣管套管，以保證呼吸通暢。分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外靜脈，結(jié)扎頸外靜脈，套上4mm探頭以MFV-1200型電磁血流量計(jì)(日本光電產(chǎn))記錄頸內(nèi)動(dòng)脈血流量。分離一側(cè)股動(dòng)脈和股靜脈并插管，動(dòng)脈插管與壓力換能器相連，經(jīng)AP-601G放大器測(cè)量股動(dòng)脈血壓，靜脈插管為滴注給藥備用。標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)程導(dǎo)聯(lián)與AB-601G生物電放大器相連，記錄心電圖。用心電R波觸發(fā)AT-601G心率計(jì)測(cè)量心率。以RM-6000型四導(dǎo)生理記錄儀(日本光電公司)記錄上述各項(xiàng)指標(biāo)。
在各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定后記錄5分鐘作對(duì)照，然后按各組劑量靜脈滴注給藥，對(duì)照組給予等容積的生理鹽水，給藥后分別在5、10、15、30、45、60、90、120以及180min測(cè)定收縮壓(SAP)、舒張壓(DAP)、平均動(dòng)脈血壓(MAP)、心率(HR)、心電圖的P-R間期(s)、Q-T間期(s)、T波幅值(mv)、頸內(nèi)動(dòng)脈流量(ml/min)、腦血流量(CBF)和腦血管阻力(mmHg·ml/min·100g)等指標(biāo)。
3.2結(jié)果從表7、表8及表9結(jié)果可見(jiàn)，給醒腦靜凍干粉15mg/kg、30 mg/kg及60mg/kg對(duì)犬SAP、DAP、MAP、HR都無(wú)明顯影響，但在給藥30分鐘內(nèi)，這三個(gè)組犬的頸內(nèi)動(dòng)脈流量及CBF均升高，CVR則降低，以給藥15分鐘變化最明顯，其中頸內(nèi)動(dòng)脈流量分別升高21.5％(P＞0.05)、34.2％(P＜0.05)及65.7％(P＜0.01)，CBF分別升高21.5％(P＞0.05)、32.3％(P＜0.05)及64.9％(P＜0.01)，CVR則分別降低16.7％(P＞0.05)、25.2％(P＜0.05)及39.6％(P＜0.01)。尼莫地平0.1mg/kg后5～180分鐘內(nèi)實(shí)驗(yàn)犬的SAP、DAP、MAP、HR都明顯降低，一般于給藥10～15分鐘降至最低，較給藥前分別降低17.0％(P＜0.01)、36.7％(P＜0.01)及26.0％(P＜0.01)；在5～30分鐘內(nèi)犬頸內(nèi)動(dòng)脈血流量、CBF顯著增加，給藥10～15分鐘達(dá)最大值，分別較給藥前升高65.7％(P＜0.01)及84.5％(P＜0.01)，腦血管阻力則下降57.1％(P＜0.01)。給醒腦凈注射液后15～30分鐘，犬的SAP、DAP、MAP均有所降低，分別降低19.6％(P＜0.05)、31.3％(P＜0.05)及26.0％(P＜0.05)，于給藥15分鐘后頸內(nèi)頸內(nèi)動(dòng)脈血流量及CBF分別升高55.9％(P＜0.05)及55.7％(P＜0.05)，CVR則降低52.0％(P＜0.01)。醒腦靜凍干粉、尼莫地平及醒腦凈對(duì)犬正常心率及二導(dǎo)聯(lián)心電圖無(wú)明顯影響。
表7 對(duì)犬動(dòng)脈收縮壓(SAP)、舒張壓(DAP)、平均壓(MBP)的影響(

n＝6)

與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01
表8 對(duì)犬心率(HR，次/min)、心電圖P-R間期(s)和Q-T間期(s)的影響(

n＝6)

與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01
表9對(duì)犬頸內(nèi)動(dòng)脈血流量、腦血流量(CBF)和腦血管阻力(CVR)的影響( )

與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01
4.醒腦靜凍干粉對(duì)凝血時(shí)間、血小板聚集和血栓形成的影響4.1.對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響方法昆明種小鼠60只，體重18～22g，雌雄兼用，按體重和性別隨機(jī)分成5組，給藥容積為0.15ml/10g體重。分別給予靜脈注射生理鹽水溶液，醒腦靜凍干粉低(72mg/kg)、中(144mg/kg)、高(288mg/kg)，香丹注射液(2.6ml/kg)，醒腦靜注射液1.95ml/kg。給藥后20min，用毛細(xì)玻璃管自眼球取血，每15秒截?cái)嘁还?jié)毛細(xì)管，觀察記錄毛細(xì)管內(nèi)出現(xiàn)凝血絲的時(shí)間，此即為凝血時(shí)間。
結(jié)果由表10可見(jiàn)，醒腦靜凍干粉72 mg/kg、144 mg/kg、288 mg/kg均可明顯的延長(zhǎng)小鼠凝血的時(shí)間，與生理鹽水組相比，醒腦靜凍干144 mg/kg、288 mg/kg均有有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.0表10醒腦靜凍干粉對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響(

n＝10)

4.2對(duì)體外血小板聚集的影響家兔頸總動(dòng)脈放血，用硅化試管取血，以3.8％枸櫞酸鈉(1/10血量)抗凝，800rpm/min離心10分鐘，吸出上層富血小板血漿(PRP)，再以3000rpm/min離心，取出貧血小板血漿(PPP)。用PPP將透光度調(diào)到100，然后以PRP調(diào)零，加攪拌棒、加生理鹽水或醒腦靜凍干粉(0.5mg、1.0mg、2.0mg/ml)及陽(yáng)性對(duì)照藥香丹注射液(0.12ml/ml)和醒腦靜注射液(0.05ml/ml)，37℃溫育。將PRP移至測(cè)定孔，加入ADP(終濃度為35μmol/L)，觀察5min最大聚集程度，儀器為T(mén)YXN-91型智能血小板聚集儀。計(jì)算血小板聚集百分率(Platelet aggregation，PAG)或抑制聚集百分率。
由下表11可見(jiàn)，醒腦靜凍干粉0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml對(duì)ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集均有明顯的抑制作用，且呈一定的劑量依賴(lài)性。
表11對(duì)ADP誘導(dǎo)的體外家兔血小板聚集(PAG)的影響(

n＝10)


與緩沖液對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.014.3對(duì)大鼠動(dòng)-靜脈旁路血栓形成的影響SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，10％水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射(ip)麻醉固定，分別從舌下靜脈給予醒腦靜凍干粉200、100、50mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照藥給予香丹注射液(2.6 ml/kg)和醒腦靜注射液(1.95ml/kg)，對(duì)照組給予等容積的生理鹽水。給藥后20min，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈和左側(cè)頸外靜脈。在聚乙烯管中段放入一根長(zhǎng)6cm 4號(hào)絲線，用肝素生理鹽水溶液(50μl/ml)充滿聚乙烯管。當(dāng)聚乙烯管的一端插入左頸外靜脈后，另一端塑料管注入肝素(50μl/ml)0.2ml抗凝，然后再將此端插入右側(cè)頸總動(dòng)脈。打開(kāi)動(dòng)脈夾，讓血液從右側(cè)頸總動(dòng)脈流入管內(nèi)，返回左側(cè)頸外靜脈，開(kāi)放血液15min后，中斷血流，迅速取出聚乙烯管中的血栓在分析天平上稱(chēng)重，求出血栓抑制率。
血栓抑制率＝(對(duì)照組血栓濕重-給藥組血栓濕重)/對(duì)照組血栓濕重×100％表12醒腦靜凍干粉對(duì)大鼠頸總動(dòng)-靜脈搭橋形成血栓影響(

n＝10)

與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01由上表12可見(jiàn)，醒腦靜凍干粉200mg/kg和100mg/kg組均能明顯抑制大鼠血栓形成(與對(duì)照組比較，P＜0.01或P＜0.05)。
5.醒腦靜凍干粉對(duì)實(shí)驗(yàn)性昏迷的影響5.1醒腦靜凍干粉對(duì)高血氨性肝昏迷的影響昆明種小鼠50只，體重18～22g，隨機(jī)分成5組，每組10只，用藥組分別腹腔注射給予醒腦靜凍干粉72mg/kg、144mg/kg、288mg/kg，醒腦靜注射液1.95ml/kg，對(duì)照組給予等容量的生理鹽水。連續(xù)給藥3d后，末次給藥后10min各組均腹腔注射2.5％NH4Cl，每5min一次，每次5ml/kg，觀察動(dòng)物中毒癥狀，記錄動(dòng)物死亡時(shí)間和NH4Cl致死用量。
由下表13可見(jiàn)，醒腦靜凍干粉144mg/kg、288 mg/kg劑量組以及醒腦靜注射液(1.95 ml/kg)組均能明顯延長(zhǎng)高血氨性昏迷小鼠的存活時(shí)間和增加NH4Cl致死量。提示醒腦靜凍干粉與醒腦靜注射液對(duì)高血氨性肝昏迷均有良好的防治作用。
表13醒腦靜凍干粉對(duì)高血氨性肝昏迷的影響(

n＝10)

與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01結(jié)果將大鼠用水合氯醛麻醉，然后從左側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處切口，插入4-0尼龍線，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈，入顱至大腦前動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈所有血流來(lái)源，導(dǎo)致一側(cè)腦梗塞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示醒腦靜凍干粉50mg/kg、100mg/kg及200 mg/kg三組術(shù)后發(fā)生腦梗塞24h的大鼠的行為評(píng)分均較模型組明顯降低，差異顯著或非常顯著(P＜0.05或P＜0.01)。醒腦靜凍干粉100mg/kg組和200mg/kg組大鼠腦組織含水量顯著低于模型組(P＜0.01)。醒腦靜凍干粉三個(gè)治療組腦組織的SOD活性明顯高于模型組，其MDA的含量亦顯著低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)。
醒腦靜凍干粉50mg/kg、100mg/kg及200mg/kg使大鼠腦梗塞面積分別縮小12.1％(P＞0.05)、30.5％(P＜0.05)及37.7％(P＜0.01)。顯示上述劑量的醒腦靜對(duì)MCAO大鼠腦組織和神經(jīng)細(xì)胞的病理?yè)p傷有良好的改善作用，尤以中、高劑量較為明顯。提示醒腦靜凍干粉對(duì)大鼠腦缺血再灌注24h后腦組織梗塞有劑量依賴(lài)性的防治作用。
本研究顯示醒腦靜凍干粉100mg/kg及200mg/kg對(duì)大鼠腦缺血再灌注24h后腦組織梗塞的防治作用與醒腦靜注射液1.35ml/kg或尼莫地平注射液0.3mg/kg相似。
以水合氯醛(3.5ml/kg，i.p.)麻醉沙土鼠。用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷左側(cè)頸總動(dòng)脈血流50min然后再恢復(fù)血流24h，造成沙土鼠腦缺血再灌注損傷模型。醒腦靜凍干粉50mg/kg組、100mg/kg組及200mg/kg組沙土鼠腦組織含水量與模型組相比明顯減少(P＜0.05或P＜0.01)。腦缺血再灌注24小時(shí)后模型組沙土鼠腦組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯提高，醒腦靜凍干粉50mg/kg組、100mg/kg組及200mg/kg組的SOD活性分別升高29.3％(P＞0.05)、51.5％(P＜0.01)及72.1％(P＜0.01)，MDA含量分別降低19.3％(P＞0.05)、36.7％(P＜0.01)及48.1％ (P＜0.01)。本研究顯示醒腦靜凍干粉200mg/kg對(duì)沙土鼠單側(cè)腦缺血性再灌注致腦組織和神經(jīng)細(xì)胞的病理?yè)p傷的改善作用與尼莫地平注射液0.3mg/kg或醒腦靜注射液1.35ml/kg相似。
綜上所述，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈插入尼龍線阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈所有血流來(lái)源，導(dǎo)致一側(cè)腦梗塞，或用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷左側(cè)頸總動(dòng)脈血流50min然后再恢復(fù)血流24h，造成沙土鼠腦缺血再灌注損傷模型，醒腦靜凍干粉50mg/kg、100mg/kg及200mg/kg均有劑量依賴(lài)性的保護(hù)作用，使動(dòng)物腦水腫液減少、腦組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯提高、腦組織缺血再灌注病理?yè)p傷減輕、腦梗塞范圍縮小，其作用隨用藥劑量的增加而加強(qiáng)。在犬的腦血流動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)顯示，醒腦靜凍干粉50mg/kg、100mg/kg及200mg/kg能在不影響犬的血壓與心率的情況下，升高頸內(nèi)動(dòng)脈血流量、腦組織血流量、降低腦血管阻力，上述作用亦隨用藥劑量的增加而加強(qiáng)。此外，醒腦靜凍干粉還能明顯延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間。醒腦靜凍干粉防治腦組織缺血再灌注損傷與其選擇性地增加腦動(dòng)脈血流、改善腦組織微循環(huán)有關(guān)。醒腦靜凍干粉144mg/kg及288 mg/kg能較明顯地對(duì)抗高血氨性肝昏迷和酒精性昏迷等作用，提示本品對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的興奮作用，此作用對(duì)本品用于腦組織缺血再灌注損傷引起昏迷、肝昏迷、酒精性昏迷病人奠定的良好的藥理作用基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，下述各實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而并非對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1凍干粉針的制備a.取如下重量份原料藥組分麝香15g、郁金60g、梔子60g、冰片1g；b.以上四味，郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子乙醇回流提取，濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇，濃縮成浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值，煮沸，冷卻，冷藏后離心，離心液用正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，濃縮，干燥得梔子提取物；麝香用乙醇連續(xù)回流提取，提取液備用；冰片粉碎備用；按照凍干粉針劑的制備方法，將上述物質(zhì)制備成凍干粉針劑。
實(shí)施例2凍干粉針的制備a.取如下重量份原料藥組分麝香90g、郁金300g、梔子300g、冰片6g；
b.以上四味，郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子乙醇回流提取，濾過(guò)，合并提取液，回收乙醇，濃縮成浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值，煮沸，冷卻，冷藏后離心，離心液用正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，濃縮，干燥得梔子提取物；麝香用乙醇連續(xù)回流提取，提取液備用；冰片粉碎備用；取羥丙基-β-環(huán)糊精，加水使溶解，取郁金揮發(fā)油滴加入羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中密閉超聲，得郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物；取羥丙基-β-環(huán)糊精，加水使溶解，攪拌，保溫備用；取處方量冰片，加入到上述麝香提取液中，攪拌使溶解，得揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液；將揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液緩慢滴加至羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，攪拌，回收乙醇至盡后，濾過(guò)，得冰片麝香HP-β-CD包合物；將梔子提取物粉碎，加注射用水使溶解，用NaOH調(diào)pH，煮沸，冷藏，濾過(guò)，濾過(guò)液與郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物及冰片麝香HP-β-CD包合物混合，加甘露醇，用注射用水補(bǔ)足體積；用NaOH調(diào)pH值，煮沸，加入活性炭，保溫，粗濾脫炭，用注射用水調(diào)節(jié)體積，凍干，即得凍干粉針劑。
實(shí)施例3 凍干粉針的制備a.取麝香37.5g、郁金150g、梔子150g、冰片5g；b.以上四味，郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子用14倍量99.5％乙醇回流提取5次，每次1小時(shí)，濾過(guò)，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.10～1.25左右的浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值為1～4，煮沸3小時(shí)，冷卻，冷藏36小時(shí)后離心，離心液用正丁醇萃取8次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.35(50℃)左右的浸膏，干燥得梔子提取物；麝香用8倍量99.5％乙醇回流提取6小時(shí)，提取液備用；取羥丙基-β-環(huán)糊精70g，加85ml水使溶解，取郁金揮發(fā)油滴加入羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中密閉超聲3小時(shí)，得郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物；取羥丙基-β-環(huán)糊精200g，加700ml水使溶解，攪拌，50℃保溫備用；取處方量冰片，加入到上述麝香提取液中，攪拌使溶解，得揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液；將揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液緩慢滴加至羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，40℃下攪拌4小時(shí)，室溫下繼續(xù)攪拌4小時(shí)，減壓回收乙醇至盡后，濾過(guò)，得冰片麝香HP-β-CD包合物；將梔子提取物粉碎，加注射用水500ml使溶解，用NaOH調(diào)pH為4～6，煮沸10～20分鐘，冷藏30小時(shí)，濾過(guò)，濾過(guò)液與郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物及冰片麝香HP-β-CD包合物混合，加甘露醇80g，用注射用水補(bǔ)足體積至2500ml；用8％NaOH調(diào)pH值至6.0～6.5，煮沸，加入0.2％活性炭，70℃保溫10分鐘，粗濾脫炭，用注射用水調(diào)節(jié)體積至2500ml，除菌濾過(guò)，凍干，即得凍干粉針劑。
實(shí)施例4 凍干粉針的制備a.取麝香麝香60、郁金200、梔子100、冰片2g；b.以上四味，郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子用3倍量50％乙醇回流提取2次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，濾過(guò)，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至40℃時(shí)相對(duì)密度為1.10～1.25左右的浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值為1～4，煮沸0.5小時(shí)，冷卻，冷藏12小時(shí)后離心，離心液用正丁醇萃取2次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.35(50℃)左右的浸膏，干燥得梔子提取物；麝香用2倍量70％乙醇回流提取1小時(shí)，提取液備用；取羥丙基-β-環(huán)糊精75.4g，加100ml水使溶解，取郁金揮發(fā)油滴加入羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中密閉超聲2小時(shí)，得郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物；取羥丙基-β-環(huán)糊精150g，加1200ml水使溶解，攪拌，70℃保溫備用；取處方量冰片，加入到上述麝香提取液中，攪拌使溶解，得揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液；將揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液緩慢滴加至羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，70℃下攪拌4小時(shí)，室溫下繼續(xù)攪拌1小時(shí)，減壓回收乙醇至盡后，濾過(guò)，得冰片麝香HP-β-CD包合物；將梔子提取物粉碎，加注射用水1000ml使溶解，用NaOH調(diào)pH為5～6，煮沸35分鐘，冷藏24小時(shí)，濾過(guò)，濾過(guò)液與郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物及冰片麝香HP-β-CD包合物混合，加甘露醇50g，用注射用水補(bǔ)足體積至2500ml；用12％NaOH調(diào)pH值至6.0～6.5，煮沸，加入0.1％活性炭，75℃保溫20分鐘，粗濾脫炭，用注射用水調(diào)節(jié)體積至2500ml，除菌濾過(guò)，灌封至10ml西林瓶中，每瓶2.5ml，加丁基橡膠塞，凍干，包裝，即得凍干粉針劑。
實(shí)施例5 凍干粉針的制備a.取麝香46.5g、郁金120g、梔子120g、冰片1g；b.以上四味，郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子用9倍量85％乙醇回流提取3次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，第三次1小時(shí)，濾過(guò)，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至65℃時(shí)相對(duì)密度為1.10～1.25左右的浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值為1～4，煮沸2.5小時(shí)，冷卻，冷藏18小時(shí)后離心，離心液用正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.35(50℃)左右的浸膏，干燥得梔子提取物；麝香用5倍量85％乙醇回流提取1～6小時(shí)，提取液備用；
取羥丙基-β-環(huán)糊精62.5g，加100ml水使溶解，取郁金揮發(fā)油滴加入羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中密閉超聲5小時(shí)，得郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物；取羥丙基-β-環(huán)糊精250g，加1000ml水使溶解，攪拌，60℃保溫備用；取處方量冰片，加入到上述麝香提取液中，攪拌使溶解，得揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液；將揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液緩慢滴加至羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，60℃下攪拌3小時(shí)，室溫下繼續(xù)攪拌5小時(shí)，減壓回收乙醇至盡后，濾過(guò)，得冰片麝香HP-β-CD包合物；將梔子提取物粉碎，加注射用水1000ml使溶解，用NaOH調(diào)pH為5～6，煮沸15分鐘，冷藏24小時(shí)，濾過(guò)，濾過(guò)液與郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物及冰片麝香HP-β-CD包合物混合，加甘露醇100g，用注射用水補(bǔ)足體積至2500ml；用10％NaOH調(diào)pH值至6.0～6.5，煮沸，加入0.1％活性炭，80℃保溫10分鐘，粗濾脫炭，用注射用水調(diào)節(jié)體積至2500ml，除菌濾過(guò)，灌封至10ml西林瓶中，每瓶2.5ml，加丁基橡膠塞，凍干，包裝，即得凍干粉針劑。
實(shí)施例6 凍干粉針的制備a.取麝香15.5g、郁金250g、梔子180g、冰片5g；b.以上四味，郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子用5倍量85％乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.12～1.20左右的浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值為2～4，煮沸2小時(shí)，冷卻，冷藏30小時(shí)后離心，離心液用正丁醇萃取5次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.15～1.30(50℃)左右的浸膏，干燥得梔子提取物；麝香用4倍量80％乙醇回流提取4小時(shí)；取羥丙基-β-環(huán)糊精，加水使溶解，取郁金揮發(fā)油滴加入羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中密閉超聲，得郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物；取羥丙基-β-環(huán)糊精，加水使溶解，攪拌，保溫備用；取處方量冰片，加入到上述麝香提取液中，攪拌使溶解，得揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液；將揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液緩慢滴加至羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，攪拌，回收乙醇至盡后，濾過(guò)，得冰片麝香HP-β-CD包合物；將梔子提取物粉碎，加注射用水使溶解，用NaOH調(diào)pH，煮沸，冷藏，濾過(guò)，濾過(guò)液與郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物及冰片麝香HP-β-CD包合物混合，加甘露醇，用注射用水補(bǔ)足體積；用NaOH調(diào)pH值，煮沸，加入活性炭，保溫，粗濾脫炭，用注射用水調(diào)節(jié)體積，凍干，即得凍干粉針劑。
實(shí)施例7 凍干粉針的制備a.取麝香16.5g、郁金60g、梔子300g、冰片3g；b.郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子用10倍量60％乙醇回流提取2次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，濾過(guò)，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.12～1.20左右的浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值為2～4，煮沸1小時(shí)，冷卻，冷藏18小時(shí)后離心，離心液用正丁醇萃取2次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.15～1.30(50℃)左右的浸膏，干燥得梔子提取物；麝香用2倍量90％乙醇回流提取3小時(shí)；取羥丙基-β-環(huán)糊精42.5g，加90ml水使溶解，取郁金揮發(fā)油滴加入羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中密閉超聲2.5小時(shí)，得郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物；取羥丙基-β-環(huán)糊精150g，加1500ml水使溶解，攪拌，80℃保溫備用；取處方量冰片，加入到上述麝香提取液中，攪拌使溶解，得揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液；將揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液緩慢滴加至羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，80℃下攪拌1.5小時(shí)，室溫下繼續(xù)攪拌2.5小時(shí)，減壓回收乙醇至盡后，濾過(guò)，得冰片麝香HP-β-CD包合物；將梔子提取物粉碎，加注射用水1200ml使溶解，用NaOH調(diào)pH為5～6，煮沸12分鐘，冷藏20小時(shí)，濾過(guò)，濾過(guò)液與郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物及冰片麝香HP-β-CD包合物混合，加甘露醇120g，用注射用水補(bǔ)足體積至2500ml；用4％NaOH調(diào)pH值至6.0～6.5，煮沸，加入0.2％活性炭，40℃保溫13分鐘，粗濾脫炭，用注射用水調(diào)節(jié)體積至2500ml，除菌濾過(guò)，灌封至10ml西林瓶中，每瓶2.5ml，加丁基橡膠塞，凍干，即得凍干粉針劑。
實(shí)施例8 凍干粉針的制備a.取麝香60g、郁金180g、梔子180g、冰片3.5g；b.郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子用7倍量75％乙醇回流提取2次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.12～1.20左右的浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值為2～4，煮沸1.5小時(shí)，冷卻，冷藏25小時(shí)后離心，離心液用正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.15～1.30(50℃)左右的浸膏，干燥得梔子提取物；麝香用3.5倍量85％乙醇回流提取2.5小時(shí)；取羥丙基-β-環(huán)糊精62.5g，加100ml水使溶解，取郁金揮發(fā)油滴加入羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中密閉超聲5小時(shí)，得郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物；取羥丙基-β-環(huán)糊精250g，加1000ml水使溶解，攪拌，60℃保溫備用；取處方量冰片，加入到上述麝香提取液中，攪拌使溶解，得揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液；將揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液緩慢滴加至羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，60℃下攪拌3小時(shí)，室溫下繼續(xù)攪拌5小時(shí)，減壓回收乙醇至盡后，濾過(guò)，得冰片麝香HP-β-CD包合物；
將梔子提取物粉碎，加注射用水1000ml使溶解，用NaOH調(diào)pH為5～6，煮沸15分鐘，冷藏24小時(shí)，濾過(guò)，濾過(guò)液與郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物及冰片麝香HP-β-CD包合物混合，加甘露醇100g，用注射用水補(bǔ)足體積至2500ml；用10％NaOH調(diào)pH值至6.0～6.5，煮沸，加入0.1％活性炭，80℃保溫10分鐘，粗濾脫炭，用注射用水調(diào)節(jié)體積至2500ml，除菌濾過(guò)，灌封至10ml西林瓶中，每瓶2.5ml，加丁基橡膠塞，凍干，包裝，即得凍干粉針劑。
實(shí)施例9 凍干粉針的制備a.取麝香37.5g、郁金150g、梔子150g、冰片5g；b.以上四味，郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子破殼后用8倍量75％乙醇回流提取兩次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，濾過(guò)，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.15左右的浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值為2～3，煮沸1小時(shí)，自然放冷，冷藏24小時(shí)后離心，離心液用等量水飽和的正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.25(50℃)左右的浸膏，真空干燥得梔子提取物；麝香用3倍量95％乙醇連續(xù)回流提取3小時(shí)，提取液備用；取羥丙基-β-環(huán)糊精62.5g，加100ml水使溶解，取郁金揮發(fā)油滴加入羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中密閉超聲5小時(shí)，得郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物；取羥丙基-β-環(huán)糊精250g，加1000ml水使溶解，攪拌，60℃保溫備用；取處方量冰片，加入到上述麝香提取液中，攪拌使溶解，得揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液；將揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液緩慢滴加至羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，60℃下攪拌3小時(shí)，室溫下繼續(xù)攪拌5小時(shí)，減壓回收乙醇至盡后，濾過(guò)，得冰片麝香HP-β-CD包合物；將梔子提取物粉碎，加注射用水1000ml使溶解，用NaOH調(diào)pH為5～6，煮沸15分鐘，冷藏24小時(shí)，濾過(guò)，濾過(guò)液與郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物及冰片麝香HP-β-CD包合物混合，加甘露醇100g，用注射用水補(bǔ)足體積至2500ml；用10％NaOH調(diào)pH值至6.0～6.5，煮沸，加入0.1％活性炭，80℃保溫10分鐘，粗濾脫炭，用注射用水調(diào)節(jié)體積至2500ml，除菌濾過(guò)，灌封至10ml西林瓶中，每瓶2.5ml，加丁基橡膠塞，凍干，包裝，即得凍干粉針劑。
實(shí)施例10 凍干粉針的制備a.取麝香37.5g、郁金150g、梔子150g、冰片5g；b.郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子用6倍量75％乙醇回流提取2次，每次1.5小時(shí)，濾過(guò)，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.12～1.20左右的浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值為2～4，煮沸1.5小時(shí)，冷卻，冷藏25小時(shí)后離心，離心液用正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.15～1.30(50℃)左右的浸膏，干燥得梔子提取物；麝香用4.5倍量85％乙醇回流提取2.5小時(shí)；取羥丙基-β-環(huán)糊精55.5g，加1 00ml水使溶解，取郁金揮發(fā)油滴加入羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中密閉超聲4小時(shí)，得郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物；取羥丙基-β-環(huán)糊精250g，加1000ml水使溶解，攪拌，60℃保溫備用；取處方量冰片，加入到上述麝香提取液中，攪拌使溶解，得揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液；將揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液緩慢滴加至羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，60℃下攪拌3小時(shí)，室溫下繼續(xù)攪拌5小時(shí)，減壓回收乙醇至盡后，濾過(guò)，得冰片麝香HP-β-CD包合物；將梔子提取物粉碎，加注射用水1000ml使溶解，用NaOH調(diào)pH為5～6，煮沸15分鐘，冷藏24小時(shí)，濾過(guò)，濾過(guò)液與郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物及冰片麝香HP-β-CD包合物混合，加甘露醇100g，用注射用水補(bǔ)足體積至2500ml；用10％NaOH調(diào)pH值至6.0～6.5，煮沸，加入0.1％活性炭，80℃保溫10分鐘，粗濾脫炭，用注射用水調(diào)節(jié)體積至2500ml，除菌濾過(guò)，灌封至10ml西林瓶中，每瓶2.5ml，加丁基橡膠塞，凍干，包裝，即得凍干粉針劑。
實(shí)施例11取按照實(shí)施例9方式獲得的凍干粉針，對(duì)每瓶?jī)龈煞坩槃┲泻瑮d子以梔子苷(C17H24O10)計(jì)，進(jìn)行含量測(cè)定；測(cè)定方法照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VID)測(cè)定；色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1％磷酸(15∶85)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為238nm。理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取梔子苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，搖勻，即得；供試品溶液的制備精密稱(chēng)取本品0.2g，置25ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，即得；測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μ1，注入液相色譜儀，測(cè)定，得每瓶含梔子以梔子苷(C17H24O10)計(jì)，不得少于1.8mg。本發(fā)明產(chǎn)品合格。
實(shí)施例12取按照實(shí)施例9方式獲得的凍干粉針，對(duì)每瓶?jī)龈煞坩槃┲泻札埬X(C10H18O)計(jì)，進(jìn)行含量測(cè)定；測(cè)定方法照氣相色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI E)測(cè)定；
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱INNOWAX(30m×0.53mm)，柱溫100℃，保持2分鐘，開(kāi)始以每分鐘15℃的速度升至200℃，保持15分鐘。汽化室溫度250℃；檢測(cè)器溫度250℃；檢測(cè)器FID氫火焰離子化檢測(cè)器，氫氣流量30ml/min；空氣流量300ml/min；載氣高純度氮?dú)猓惠d氣流量20ml/min；進(jìn)樣方式分流比5∶1；理論板數(shù)按龍腦峰計(jì)算應(yīng)不低于2000；對(duì)照品溶液的制備分別精密稱(chēng)取龍腦、麝香酮對(duì)照品適量，分別加二甲基甲酰胺制成每1ml各含0.05mg、0.005mg的溶液，搖勻，即得；供試品溶液的制備取本品2瓶?jī)?nèi)容物，研碎，精密稱(chēng)取0.1g，置10ml量瓶中，先加蒸餾水1ml，振搖使溶解后，靜置半小時(shí)，再加二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得；測(cè)定法精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1μl，注入氣相色譜儀，測(cè)定，得本品每瓶含冰片以龍腦(C10H18O)計(jì)，不得少于1.8mg。本發(fā)明產(chǎn)品合格。
實(shí)施例13取按照實(shí)施例9方式獲得的凍干粉針，對(duì)每瓶?jī)龈煞坩槃┲泻晗阋憎晗阃?C16H30O)計(jì)，進(jìn)行含量測(cè)定；測(cè)定方法照氣相色譜法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VI E)測(cè)定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱INNOWAX(30m×0.53mm)，柱溫100℃，保持2分鐘，開(kāi)始以每分鐘15℃的速度升至200℃，保持15分鐘。汽化室溫度250℃；檢測(cè)器溫度250℃；檢測(cè)器FID氫火焰離子化檢測(cè)器，氫氣流量30ml/min；空氣流量300ml/min；載氣高純度氮?dú)?；載氣流量20ml/min；進(jìn)樣方式分流比5∶1；理論板數(shù)按龍腦峰計(jì)算應(yīng)不低于2000；對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取龍腦、麝香酮對(duì)照品適量，分別加二甲基甲酰胺制成每1ml各含0.05mg、0.005mg的溶液，搖勻，即得；供試品溶液的制備取本品2瓶?jī)?nèi)容物，研碎，精密稱(chēng)取0.1g，置10ml量瓶中，先加蒸餾水1ml，振搖使溶解后，靜置半小時(shí)，再加二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得；測(cè)定法精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1μl，注入氣相色譜儀，測(cè)定，得本品每瓶含麝香以麝香酮(C16H30O)計(jì)，不得少于0.2mg。本發(fā)明產(chǎn)品合格。
權(quán)利要求
1.一種醒腦靜凍干粉針，其特征在于，凍干粉針中麝香酮含量為0.1mg～3mg/瓶。
2.如權(quán)利要求2所述醒腦靜凍干粉針，其特征在于，凍干粉針中麝香酮含量為0.2mg～1.8mg/瓶。
3.如權(quán)利要求1～2任一所述醒腦靜凍干粉針，其特征在于，凍干粉針中梔子苷含量為1.0mg～6.0mg/瓶。
4.如權(quán)利要求3所述醒腦靜凍干粉針，其特征在于，凍干粉針中梔子苷含量為1.8mg～5.6mg/瓶。
5.如權(quán)利要求1～2任一所述醒腦靜凍干粉針，其特征在于，凍干粉針中龍腦含量為1.0mg～5.6mg/瓶。
6.如權(quán)利要求5所述醒腦靜凍干粉針，其特征在于，凍干粉針中龍腦含量為1.8mg～4.7mg/瓶。
7.如權(quán)利要求1～2任一所述醒腦靜凍干粉針，其特征在于，凍干粉針中郁金揮發(fā)油含量為0.000075ml～0.001245ml/瓶。
8.如權(quán)利要求7所述醒腦靜凍干粉針，其特征在于，凍干粉針劑中，每瓶固形物重量0.43～0.45g。
9.如權(quán)利要求1所述醒腦靜凍干粉針，其特征在于，熾灼殘?jiān)?.5％(g/ml)，重金屬含量≤10ppm，砷鹽≤2ppm；蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、草酸鹽、樹(shù)脂、不溶性微粒、鉀離子符合中國(guó)藥典2000年版一部粉針劑項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。
10.一種醒腦靜凍干粉針制劑的制備方法，包括如下步驟a.取如下重量份原料藥組分麝香15～90、郁金60～300、梔子60～300、冰片1～6；b.以上四味，郁金粉碎成粗顆粒，提取揮發(fā)油備用；梔子用3～14倍量50～99.5％乙醇回流提取1～5次，每次1～10小時(shí)，濾過(guò)，合并提取液，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.10～1.25左右的浸膏，浸膏用HCl調(diào)pH值為1～4，煮沸0.5～3小時(shí)，冷卻，冷藏12～36小時(shí)后離心，離心液用正丁醇萃取2～8次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，并濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.35(50℃)左右的浸膏，干燥得梔子提取物；麝香用1～8倍量70～99.5％乙醇回流提取1～6小時(shí)，提取液備用；取羥丙基-β-環(huán)糊精，加水使溶解，取郁金揮發(fā)油滴加入羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中密閉超聲，得郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物；取羥丙基-β-環(huán)糊精，加水使溶解，攪拌，保溫備用；取處方量冰片，加入到上述麝香提取液中，攪拌使溶解，得揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液；將揮發(fā)油-冰片-麝香醇溶液緩慢滴加至羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液中，攪拌，回收乙醇至盡后，濾過(guò)，得冰片麝香HP-β-CD包合物；將梔子提取物粉碎，加注射用水使溶解，用NaOH調(diào)pH，煮沸，冷藏，濾過(guò)，濾過(guò)液與郁金揮發(fā)油HP-β-CD包合物及冰片麝香HP-β-CD包合物混合，加甘露醇，用注射用水補(bǔ)足體積；用NaOH調(diào)pH值，煮沸，加入活性炭，保溫，粗濾脫炭，用注射用水調(diào)節(jié)體積，凍干，即得凍干粉針劑。
全文摘要
本發(fā)明藥物涉及一種含麝香酮的醒腦靜凍干粉針劑及其制備方法，屬于中藥制藥領(lǐng)域。本發(fā)明藥物由麝香、郁金、梔子、冰片經(jīng)過(guò)一定的提取工藝后制成的有效成分組成。本發(fā)明藥物具有很好的穩(wěn)定性，且方法工藝簡(jiǎn)單。本發(fā)明藥物具有清熱瀉火，涼血解毒的功效。主要用于，中醫(yī)辨證屬于中風(fēng)(風(fēng)痰火亢證)，見(jiàn)半身不遂，口舌咼斜，言語(yǔ)謇澀或不語(yǔ)，感覺(jué)減退或消失，頭暈?zāi)垦?，發(fā)病突然，心煩易怒，肢強(qiáng)急，痰多而粘；舌紅，苔黃膩，脈弦滑的癥狀。
文檔編號(hào)A61P7/02GK101085295SQ20061001420
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2006年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者葉正良, 李永強(qiáng), 鄭永鋒, 李瑞明 申請(qǐng)人:天津天士力之驕藥業(yè)有限公司