專利名稱：狗膽粉及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及狗膽粉及其在制藥中的新用途，特別涉及狗膽粉在制備防治肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狗膽是犬科動物狗的膽汁，對狗膽的應(yīng)用《本草綱目》中早有記載，“凡氣血痛及傷損者，熱酒服半個，淤血盡下。治刀箭瘡，去腸中膿水，耵耳出膿，拔白換湯不換黑，血?dú)鈹z痛，反胃吐食，痞塊疳積，赤白下痢”。作為藥材民間應(yīng)用已久，具有清肝明目，止血消腫之功效。近代，狗膽作為一種傳統(tǒng)中藥材被收編于《中藥大詞典》中，但對狗膽的研究、利用甚少。查閱文獻(xiàn)，迄今為止國內(nèi)外尚未見狗膽在抗肝纖維化方面的研究報道，更沒有發(fā)現(xiàn)利用狗膽在制備防治肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種狗膽粉及其新用途，尤其是在制備防治肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)際上，本發(fā)明涉及的一種狗膽粉，通過以下方法步驟制得提供新鮮狗膽囊并取膽汁，經(jīng)100目篩過濾，在60℃下干燥，經(jīng)研磨后再過100目篩，最后消毒。
本發(fā)明的狗膽粉涉及在制備防治肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將狗膽粉的藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
一、狗膽粉對二甲基亞硝胺(Dimethylnitrosamine，DMN)誘發(fā)大鼠肝纖維化的防治作用(一)狗膽粉對二甲基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝纖維化的抑制作用本實(shí)驗(yàn)用DMN制備大鼠肝纖維化模型，以類似品—熊膽為藥物對照，進(jìn)一步證明狗膽抑制肝纖維化的作用。
1材料和方法1.實(shí)驗(yàn)動物S-D雄性大白鼠，體重160-180g。
2.試劑及藥物二甲基亞硝胺(DMN)；直接紅(Direct Red 80)；免疫組化單克隆抗體ED1(Serotec.co.uk)和αSMA(Dako，Denmak)。
本發(fā)明的狗膽粉；熊膽粉(吉林省延邊熊廠提供的明月山牌)。
3.動物模型制作將60只動物隨機(jī)分為6組，中毒組(10只)1％DMN(生理鹽水稀釋)1ml/kg連續(xù)3天/周，腹腔內(nèi)注射共4周，同時用生理鹽水2cc/d灌胃共4周。狗膽1、2、3組(每組10只)1％DMN腹腔內(nèi)注射，劑量、時間同上，同時用狗膽小劑量(400mg/kg)、中劑量(600mg/kg)、大劑量(800mg/kg)，每日灌胃共4周。熊膽組(10只)1％DMN腹腔內(nèi)注射，劑量、時間同上，同時用熊膽400mg/kg/d灌胃共4周。對照組(10只)注射用生理鹽水1ml/kg連續(xù)3天/周，腹腔內(nèi)注射共4周，同時用生理鹽水2cc/d灌胃共4周。實(shí)驗(yàn)第4周末麻醉大鼠，心臟采血離心處理，處死動物后立即取肝臟。
4.血清AST、ALT、總蛋白、總膽固醇的測定血清AST、ALT的測定采用Reiman氏方法，血清總蛋白的測定采用Biuret法，血清總膽固醇的測定采用酶法，全部Kit購自Eiken Chemical(Tyoko，Japan)公司，嚴(yán)格按Kit說明書進(jìn)行操作，利用分光光度計(Ultraspec 4050，LKB，Switzerland)測定吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算AST、ALT值，總蛋白、總膽固醇含量。
5.病理檢查大鼠肝/體重的檢測處死前測量動物的體重，采血后立即取肝臟稱重量，計算肝/體重百分比。稱重后于肝左葉相同部位取組織二塊，經(jīng)10％的中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片行H-E、直接紅染色(0.1％直接紅picric acid飽和液)，光鏡下觀察肝組織的病理變化及纖維組織增生程度，。直接紅染色的切片利用CMIAS真彩色病理圖象分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué))進(jìn)行膠原纖維的定量分析。觀察條件物鏡10倍，每張切片隨機(jī)選4個視野，圖象采集、分割處理，參數(shù)統(tǒng)計分析，得出目標(biāo)總面積/統(tǒng)計場總面積之比值。免疫組織化學(xué)染色切片厚4～5μm，常規(guī)脫蠟至水，用ABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，ED1工作濃度為1∶500，α-SMA工作濃度為1∶50。
6.統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)取均值行t檢驗(yàn)。
2結(jié)果1.血清AST、ALT、總蛋白、總膽固醇檢測結(jié)果見下表1。
表1 各組實(shí)驗(yàn)動物4周后血清生化指標(biāo)的檢測結(jié)果(

)

***與中毒組比較p＜0.001，*與中毒組比較p＜0.052.肝/體重比檢測結(jié)果見下表2。
表2 各組實(shí)驗(yàn)動物4周后肝/體重百分比(

)

***與中毒組比較p＜0.0013.肝組織纖維組織增生圖象分析結(jié)果見下表3。
表3各組實(shí)驗(yàn)動物4周后肝組織膠原纖維面積密度％(

)


▲▲與中霉組比較P＜0.01，**與熊膽組比較P＜0.01。
4.病理學(xué)觀察結(jié)果如下對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無明顯變性、壞死，個別標(biāo)本中見門管區(qū)內(nèi)少量炎細(xì)胞浸潤。
中毒組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹、變性，部分肝細(xì)胞胞漿濃縮，核深染，可見較多再生的肝細(xì)胞，肝細(xì)胞灶狀或片狀壞死，門管區(qū)內(nèi)大量纖維組織增生，形成較粗的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，形成彌漫性假小葉的7/9只。
熊膽組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞變性，并可見較多的點(diǎn)狀、灶狀壞死，門管區(qū)內(nèi)較多纖維組織增生，形成較細(xì)的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，形成彌漫性假小葉的4/9只。
狗膽各組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞輕度變性、個別標(biāo)本中偶見點(diǎn)狀壞死，門管區(qū)內(nèi)纖維組織增生，形成纖細(xì)的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，僅有個別動物形成假小葉。狗膽3種不同劑量組之間病理變化及纖維組織增生程度無明顯差異。
免疫組化染色結(jié)果對照組ED1+細(xì)胞在門管區(qū)、肝小葉中央靜脈周圍和肝實(shí)質(zhì)內(nèi)少量散在分布。α-SMA+細(xì)胞在門管區(qū)的各種血管壁上分布，肝小葉中央靜脈壁有少量陽性表達(dá)，肝細(xì)胞間無陽性細(xì)胞分布。中毒組ED1+、α-SMA+細(xì)胞在增生的纖維間隔間大量彌漫分布，肝實(shí)質(zhì)間散在分布。熊膽組ED1+、α-SMA+細(xì)胞分布同上，但數(shù)量比中毒組減少。狗膽各組ED1+、α-SMA+細(xì)胞分布與熊膽組相似，但數(shù)量比熊膽組少，狗膽三個不同劑量組兩種陽性細(xì)胞的數(shù)量相似。
結(jié)論DMN是一種具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性的化學(xué)物質(zhì)，DMN在微粒體代謝后形成乙醛，從而損傷肝細(xì)胞，并使核酸和蛋白質(zhì)甲基化，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。DMN可使肝細(xì)胞變性、壞死，4周后形成與人類酒精性肝硬化相似的病理所見，并有停藥后仍維持肝硬化幾個月的特點(diǎn)。
本實(shí)驗(yàn)的血清AST、ALT值和總蛋白的含量檢測結(jié)果看，狗膽和熊膽均有較好的降酶及增加血清總蛋白作用，而狗膽的作用優(yōu)于熊膽，但熊膽組有較好的降低血清膽固醇的作用。本實(shí)驗(yàn)肝/體重比、肝纖維組織的圖象檢測結(jié)果，狗膽組與熊膽組比較有顯著差異，狗膽3個組之間纖維組織增生程度無明顯差異；肝組織病理觀察表明，中毒組肝細(xì)胞排列紊亂，失去正常結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞彌漫性變性，可見較多灶狀、片狀壞死。熊膽組病變比中毒組輕，但仍可見較多肝細(xì)胞變性，可見較多的點(diǎn)狀、灶狀壞死。狗膽組肝細(xì)胞輕度變性，偶見點(diǎn)狀壞死。上述結(jié)果從病理學(xué)角度上進(jìn)一步證實(shí)了狗膽對肝細(xì)胞的保護(hù)作用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中血清AST、ALT的檢測、肝/體重比、肝纖維組織圖象分析結(jié)果及肝組織的病理檢查結(jié)果，狗膽粉具有較好的抑制DMN誘發(fā)的肝纖維化的作用，其作用優(yōu)于熊膽。
(二)狗膽粉在對二甲基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝纖維化的治療作用用1％二甲基亞硝胺腹腔注射4周誘發(fā)肝纖維化的模型后進(jìn)行治療。將60只大鼠隨機(jī)分為狗膽組(3種不同劑量)、熊膽組、中毒組及對照組。觀察各組大鼠肝/體重比、血清AST、ALT值，總蛋白、總膽固醇含量。肝組織標(biāo)本行直接紅染色，經(jīng)病理圖象分析系統(tǒng)測定肝組織內(nèi)膠原纖維的面積。免疫組化采用ABC方法，觀察肝組織內(nèi)ED1、α-SMA陽性細(xì)胞的數(shù)量及分布。
1材料和方法1.實(shí)驗(yàn)動物S-D雄性大白鼠，體重160-180g。
2.試劑及藥物(1)二甲基亞硝胺(DMN)；直接紅(Direct Red80)；免疫組化單克隆抗體ED1(Serotec.co.uk)和αSMA(Dako，Denmak)。
(2)本發(fā)明的狗膽粉；熊膽粉(吉林省延邊熊廠提供的明月山牌)。
3.動物模型制作將60只動物隨機(jī)分為6組，中毒組(10只)1％DMN(生理鹽水稀釋)1ml/kg連續(xù)3天/周，腹腔內(nèi)注射共4周，第5周開始用生理鹽水2cc/d灌胃共3周。狗膽1、2、3組(每組10只)1％DMN腹腔內(nèi)注射，劑量、時間同上，第5周開始用狗膽小劑量(400mg/kg)、中劑量(600mg/kg)、大劑量(800mg/kg)，每日灌胃共3周。熊膽組(10只)1％DMN腹腔內(nèi)注射，劑量、時間同上，第5周開始用熊膽400mg/kg/d灌胃共3周。對照組(10只)注射用生理鹽水1ml/kg連續(xù)3天/周，腹腔內(nèi)注射共4周，第5周開始用生理鹽水2cc/d灌胃共3周。實(shí)驗(yàn)第7周末麻醉大鼠，心臟采血離心處理，處死動物后立即取肝臟。
4.血清AST、ALT、總蛋白、總膽固醇的測定血清AST、ALT的測定采用Reiman氏方法，血清總蛋白的測定采用Biuret法，血清總膽固醇的測定采用酶法，全部Kit購自Eiken Chemical(Tyoko，Japan)公司，嚴(yán)格按Kit說明書進(jìn)行操作，利用分光光度計(Ultraspec 4050，LKB，Switzerland)測定吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算AST、ALT值，總蛋白、總膽固醇的含量。
5.病理檢查大鼠肝/體重的檢測處死前測量動物的體重，采血后立即取肝臟稱重量，計算肝/體重百分比。稱重后于肝左葉相同部位取組織二塊，經(jīng)10％的中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片行H-E、直接紅染色(0.1％直接紅picric acid飽和液)，光鏡下觀察肝組織的病理變化及纖維組織增生程度，肝纖維化分級分為4級未見明顯纖維間隔形成者為“-”，有纖細(xì)的纖維間隔形成，但尚未形成假小葉“+ ”，肝組織部分區(qū)域形成假小葉(50％以下)“++”，肝組織內(nèi)形成彌漫性假小葉“+++”。
直接紅染色的切片利用CMIAS真彩色病理圖象分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué))進(jìn)行膠原纖維的定量分析。觀察條件物鏡10倍，每張切片隨機(jī)選4個視野，圖象采集、分割處理，參數(shù)統(tǒng)計分析，得出目標(biāo)總面積/統(tǒng)計場總面積之比值。免疫組織化學(xué)染色切片厚4～5μm，常規(guī)脫蠟至水，用ABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，ED1工作濃度為1∶500，α-SMA工作濃度為1∶50。
6.統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)取均值行t檢驗(yàn)。
2結(jié)果
1.血清AST、ALT、總蛋白、總膽固醇檢測結(jié)果見下表4。
表4 各組實(shí)驗(yàn)動物7周后血清生化指標(biāo)的檢測結(jié)果

2.肝纖維化的分級見表5表5各組實(shí)驗(yàn)動物7周后肝纖維化的分級

3.肝/體重比檢測結(jié)果見下表6。
表6 各組實(shí)驗(yàn)動物7周后肝/體重百分比

4.肝組織纖維組織增生圖象分析結(jié)果見下表7。
表7 DMN7周狗膽抗肝纖維化的作用

5.病理學(xué)觀察結(jié)果如下對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無明顯變性、壞死，個別標(biāo)本中見門管區(qū)內(nèi)少量炎細(xì)胞浸潤。
中毒組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹、變性，部分肝細(xì)胞胞漿濃縮，核深染，可見較多再生的肝細(xì)胞，肝細(xì)胞灶狀或片狀壞死，門管區(qū)內(nèi)大量纖維組織增生，形成較粗的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，形成彌漫性假小葉的6只。
熊膽組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞變性，并可見較多的點(diǎn)狀、灶狀壞死，門管區(qū)內(nèi)較多纖維組織增生，形成較細(xì)的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，形成彌漫性假小葉的4/8只。
狗膽各組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞輕度變性、個別標(biāo)本中偶見點(diǎn)狀壞死，門管區(qū)內(nèi)纖維組織增生，形成纖細(xì)的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，僅有個別動物形成假小葉。隨著狗膽劑量的增加病理變化及纖維組織增生程度減輕。
免疫組化染色結(jié)果對照組ED1+細(xì)胞在門管區(qū)、肝小葉中央靜脈周圍和肝實(shí)質(zhì)內(nèi)少量散在分布。α-SMA+細(xì)胞在門管區(qū)的各種血管壁上分布，肝小葉中央靜脈壁有少量陽性表達(dá)，肝細(xì)胞間無陽性細(xì)胞分布。中毒組ED1+、α-SMA+細(xì)胞在增生的纖維間隔間大量彌漫分布，肝實(shí)質(zhì)間散在分布。
熊膽組ED1+、α-SMA+細(xì)胞分布同上，但數(shù)量比中毒組減少。狗膽各組ED1+、α-SMA+細(xì)胞分布與熊膽組相似，但數(shù)量比熊膽組少，隨著狗膽劑量的增加兩種陽性細(xì)胞的數(shù)量減少。
結(jié)論本實(shí)驗(yàn)的血清AST、ALT值和總蛋白的含量檢測結(jié)果看，狗膽和熊膽均有降酶及增加血清總蛋白作用，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異，而熊膽組有較好的降低血清膽固醇的作用。本實(shí)驗(yàn)肝/體重比、肝纖維組織的圖象檢測結(jié)果，狗膽組與熊膽組比較有顯著差異，隨著狗膽劑量的增加差異更顯著；肝組織病理觀察表明，中毒組肝細(xì)胞排列紊亂，失去正常結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞彌漫性變性，可見較多灶狀、片狀壞死。熊膽組病變比中毒組輕，但仍可見較多肝細(xì)胞變性，可見較多的點(diǎn)狀、灶狀壞死。狗膽組肝細(xì)胞輕度變性，偶見點(diǎn)狀壞死。上述結(jié)果從病理學(xué)角度上進(jìn)一步證實(shí)了狗膽對肝細(xì)胞的保護(hù)作用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中血清AST、ALT的檢測、肝/體重比、肝纖維組織圖象分析結(jié)果及肝組織的病理檢查結(jié)果，狗膽具有較好的治療DMN誘發(fā)的肝纖維化的作用，作用優(yōu)于熊膽，隨著劑量的增加其治療效果更好。
二、狗膽對四氯化碳誘發(fā)大鼠肝纖維化防治作用本實(shí)驗(yàn)用四氯化碳(CCl4)制備大鼠肝纖維化模型，以類似品熊膽為藥物對照，進(jìn)一步證實(shí)狗膽抗肝纖維化的作用1材料和方法1.實(shí)驗(yàn)動物S-D雄性大白鼠(清潔級)，體重160-180g。
2.試劑及藥物CCl4；直接紅(Direct Red 80)；免疫組化單克隆抗體ED1，單克隆抗體α-SMA；血清ALT、AST、ALP、TP(總蛋白)、TB(總膽紅素)檢測試劑；免疫組化單克隆抗體ED1，單克隆抗體α-SMA。
藥物本發(fā)明狗膽粉；熊膽粉(吉林省延邊熊廠提供的明月山牌)。
3.動物模型制作實(shí)驗(yàn)1將46只動物隨機(jī)分為5組，對照組(6只)注射用生理鹽水1ml/kg/2次/周，腹腔內(nèi)注射共12周，同時用生理鹽水2cc/d灌胃共12周。中毒組(10只)50％CCl4(橄欖油稀釋)1ml/kg 2次/周，腹腔內(nèi)注射共12周，同時用生理鹽水2cc/d灌胃共12周。狗膽組小劑量(400mg/kg)、中劑量(600mg/kg)、大劑量(800mg/kg)，每組10只；50％CCl41ml/kg2次/周腹腔內(nèi)注射，劑量、時間同上，同時用狗膽小劑量、大劑量每日灌胃共12周。熊膽組(10只)50％CCl41ml/kg 2次/周腹腔內(nèi)注射，劑量、時間同上，同時用熊膽400mg/kg/d灌胃共12周。實(shí)驗(yàn)第12周末用乙醚麻醉大鼠，心臟采血離心處理，處死動物后立即取肝臟。
實(shí)驗(yàn)2將46只動物隨機(jī)分為5組，對照組(6只)注射用生理鹽水1ml/kg/2次/周，腹腔內(nèi)注射共8周，第9周開始用生理鹽水2cc/d灌胃共4周。中毒組(10只)50％CCl4(橄欖油稀釋)1ml/kg 2次/周，腹腔內(nèi)注射共8周，第9周開始用生理鹽水2cc/d灌胃共4周。狗膽組小劑量(400mg/kg)、中劑量(600mg/kg)、大劑量(800mg/kg)，每組10只；50％CCl41ml/kg 2次/周腹腔內(nèi)注射，劑量、時間同上，第9周開始用狗膽小劑量、大劑量每日灌胃共4周。熊膽組(10只)50％CCl41ml/kg2次/周腹腔內(nèi)注射，劑量、時間同上，第9周開始用熊膽400mg/kg/d灌胃共4周。實(shí)驗(yàn)第12周末用乙醚麻醉大鼠，心臟采血離心處理，處死動物后立即取肝臟。
4.血清生化指標(biāo)的檢測血清AST、ALT的測定采用Reiman-Rankel氏方法，ALP采用kind-King法(改良的K-K法)，血清總蛋白采用Biuret法，血清總膽紅素采用Evelyn-Malloy法，嚴(yán)格按Kit說明書進(jìn)行操作，利用分光光度計(Ultraspec 4050，LKB，Switzerland)在490nm測定吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算AST、ALT、ALP值，總蛋白、總膽紅素的含量。
5 .病理學(xué)檢查(1)大鼠肝/體重比的檢測處死前測量動物的體重，采血后立即取肝臟稱重量，計算肝/體重百分比。
(2)肝組織病理學(xué)觀察稱重后于肝左葉相同部位取二塊組織，經(jīng)10％的中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片作H-E染色觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)變化，直接紅染色(0.1％直接紅picric acid飽和液)，觀察肝組織內(nèi)纖維組織增生程度。
(3)肝纖維化的分級0級無纖維化；I級匯管區(qū)纖維組織增生，有纖細(xì)的纖維間隔進(jìn)入肝組織內(nèi)，形成匯管區(qū)-匯管區(qū)的纖維間橋。II級在I級的基礎(chǔ)上肝組織可見個別假小葉。III級匯管區(qū)纖維組織明顯增生，纖維間隔較粗，肝組織部分區(qū)域(50％)形成大的假小葉。IV級匯管區(qū)纖維組織大量增生，纖維間隔粗大，肝組織內(nèi)形成彌漫性、大小不等的假小葉。
(4)膠原纖維的定量分析直接紅染色的切片利用CMIAS真彩色病理圖象分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué))進(jìn)行膠原纖維的定量分析。觀察條件物鏡4倍，每張切片隨機(jī)選2個視野，圖象采集、分割處理，參數(shù)統(tǒng)計分析，得出目標(biāo)總面積/統(tǒng)計場總面積之比值。
(5)免疫組織化學(xué)染色切片厚4～5μm，常規(guī)脫蠟至水，用ABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，ED1工作濃度為1∶100，α-SMA工作濃度為1∶50。
6.統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)取均值行t檢驗(yàn)。
結(jié)果1.血清生化指標(biāo)的檢測結(jié)果見下表。
實(shí)驗(yàn)1 大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果

ALT熊膽組、狗膽1組與中毒組比較P＜0.01，狗膽2組與中毒組比較P＜0.05。AST熊膽組、狗膽各組與中毒組比較P＜0.01。ALP熊膽組、狗膽各組與中毒組比較ALP值下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義。TP熊膽組、狗膽2組與中毒組比較P＜0.01，TB熊膽組、狗膽各組與中毒組比較TB值下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)2 大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果

ALT熊膽組與中霉組比較P＜0.05。AST狗膽2組與中毒組比較P＜0.05。ALP熊膽組、狗膽各組與中毒組比較ALP值無統(tǒng)計學(xué)意義。TP狗膽各組與中毒組比較P＜0.01，TB熊膽組與中毒組比較P＜0.05。
2.病理學(xué)檢查結(jié)果(1)大鼠肝/體重比實(shí)驗(yàn)1由于CCl4導(dǎo)致肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性，注射CCl4的大鼠肝臟體積增大，重量比對照組明顯增高，中毒組大部分形成彌漫性肝硬化，大量纖維組織增生，肝臟體積相對縮小，重量減輕，熊膽組與中毒組相似，狗膽組肝/體重比與中毒組和熊膽組比較有顯著性差異，見下表。
實(shí)驗(yàn)1 大鼠肝/體重比(X±SD)

*P＜0.001狗膽組間無顯著性差異實(shí)驗(yàn)2由于CCl4腹腔注射到第8周末，第9周開始停止注射CCl4，第12周末中毒組肝組織內(nèi)脂肪變性消失，肝纖維化減輕，肝臟重量接近恢復(fù)正常，狗膽組肝/體重比略高于中毒組與熊膽組，但統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異。
實(shí)驗(yàn)2 大鼠肝/體重比X±SD

(2).肝組織的病理學(xué)變化實(shí)驗(yàn)1對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞無變性、壞死，個別標(biāo)本中門管區(qū)內(nèi)有少量炎細(xì)胞浸潤。
中毒組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞明顯腫脹，胞漿內(nèi)可見彌漫性、大小不等的脂肪空泡，可見點(diǎn)狀、灶狀壞死，門管區(qū)內(nèi)大量纖維組織增生，粗大的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，大部分形成彌漫性、大小不等的假小葉(5/6)。
熊膽組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞脂肪變性較中毒組輕，門管區(qū)內(nèi)較多纖維組織增生，形成較粗的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，形成大的假小葉(4/6)。
狗膽各組肝小葉結(jié)構(gòu)輕度紊亂，肝細(xì)胞輕度脂肪變性，門管區(qū)內(nèi)纖維組織增生，形成纖細(xì)的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，個別形成假小葉。
實(shí)驗(yàn)2對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞無變性、壞死，個別標(biāo)本中門管區(qū)內(nèi)有少量炎細(xì)胞浸潤。
中毒組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞脂肪變性消僅見失輕度變性，偶見點(diǎn)狀壞死，門管區(qū)內(nèi)纖維組織增生，纖維間隔纖細(xì)，染色淡，細(xì)胞成分少，與實(shí)驗(yàn)1組的中毒組比較，肝纖維化開始恢復(fù)。
熊膽組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞輕度變性，門管區(qū)內(nèi)纖維組織較中毒組少，纖維間隔纖細(xì)，染色淡，細(xì)胞成分少。
狗膽各組肝小葉輕度結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞輕度變性，門管區(qū)內(nèi)纖維組織較熊膽組少，纖維間隔纖細(xì)，染色淡，細(xì)胞成分少。
(3).肝纖維化的分級實(shí)驗(yàn)1中毒組纖維間隔粗大，深入肝組織內(nèi)，大部分形成彌漫性、大小不等的假小葉。熊膽組形成較粗的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，大部分形成大的假小葉。狗膽各組纖細(xì)的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，個別形成彌漫性假小葉，見下表。
實(shí)驗(yàn)1 肝纖維化的分級

實(shí)驗(yàn)2中毒組與實(shí)驗(yàn)1中毒組比較肝纖維化減輕，匯管區(qū)纖維組織減少，淡染，肝內(nèi)纖維間隔變細(xì)，深入肝組織內(nèi)，一半形成大的假小葉。熊膽組和狗膽各組形成纖細(xì)的纖維間隔深入肝組織內(nèi)，個別形成大的假小葉，見下表。
實(shí)驗(yàn)2 肝纖維化的分級

(4).膠原纖維面密度實(shí)驗(yàn)1中毒組肝組織內(nèi)大量纖維組織增生，膠原纖維面密度明顯增高，熊膽組纖維組織增生減少，膠原纖維面密度與中毒組比較有顯著性差異，狗膽組纖維增生明顯減少，與熊膽組比較有顯著性差異，狗膽組間無顯著性差異，見下表。
實(shí)驗(yàn)1 大鼠膠原纖維面密度X±SD

**P＜0.001狗膽組間無顯著性差異實(shí)驗(yàn)2中毒組肝組織內(nèi)仍有較多纖維組織增生，但比實(shí)驗(yàn)1的中毒組肝纖維化減輕，熊膽組與中毒組比較纖維組織減少，膠原纖維面密度有顯著性差異，狗膽組與熊膽組比較也有顯著性差異，狗膽組間無顯著性差異，見下表。
實(shí)驗(yàn)2.大鼠肝膠原纖維面密度X±SD

**P＜0.001狗膽組間無顯著性差異(5).免疫組化染色結(jié)果實(shí)驗(yàn)1ED1對照組ED1+細(xì)胞在門管區(qū)、肝小葉中央靜脈周圍和肝實(shí)質(zhì)內(nèi)散在分布。
中毒組ED1+細(xì)胞在匯管區(qū)增生的纖維組織及纖維間隔內(nèi)大量分布，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)明顯增多。
熊膽組ED1+細(xì)胞在匯管區(qū)增生的纖維組織、纖維間隔及肝實(shí)質(zhì)內(nèi)分布。但其數(shù)量較中毒組少。
狗膽各組ED1+細(xì)胞分布同上，但數(shù)量比熊膽組少，隨著狗膽劑量的增加ED1+細(xì)胞的數(shù)量減少。
α-SMA對照組α-SMA+細(xì)胞在門管區(qū)的各種血管壁上分布，肝小葉中央靜脈壁有少量陽性表達(dá)，肝細(xì)胞間無陽性細(xì)胞分布。中毒組α-SMA+細(xì)胞在匯管區(qū)增生的纖維組織、纖維間隔內(nèi)大量分布，且靠近肝細(xì)胞分布。熊膽組α-SMA+細(xì)胞分布同上，但數(shù)量比中毒組減少。
狗膽各組α-SMA+細(xì)胞分布與熊膽組相似，但數(shù)量減少。除了對照組，中毒組、熊膽組及狗膽組大鼠間匯管區(qū)增生的纖維組織及纖維間隔內(nèi)α-SMA陽性表達(dá)是不均勻的。
實(shí)驗(yàn)2ED1對照組ED1+細(xì)胞在門管區(qū)、肝小葉中央靜脈周圍和肝實(shí)質(zhì)內(nèi)散在分布。中毒組ED1+細(xì)胞在匯管區(qū)增生的纖維組織及纖維間隔內(nèi)大量分布，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)明顯增多。熊膽組ED1+細(xì)胞在匯管區(qū)增生的纖維組織、纖維間隔及肝實(shí)質(zhì)內(nèi)分布。但其數(shù)量較中毒組少。狗膽各組ED1+細(xì)胞分布同上，但數(shù)量比熊膽組少。
α-SMA對照組α-SMA+細(xì)胞在門管區(qū)的各種血管壁上分布，肝小葉中央靜脈壁有少量陽性表達(dá)，肝細(xì)胞間無陽性細(xì)胞分布。
中毒組α-SMA+細(xì)胞分布同上，匯管區(qū)增生的纖維組織及纖維間隔內(nèi)無陽性細(xì)胞表達(dá)。
熊膽組及狗膽各組α-SMA+細(xì)胞分布同上，匯管區(qū)增生的纖維組織及纖維間隔內(nèi)無陽性細(xì)胞表達(dá)。
結(jié)論CCl4是經(jīng)典肝毒性物質(zhì)，在體內(nèi)形成Free radical，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，并影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而損傷肝細(xì)胞，CCl4可直接損傷肝臟，引起肝細(xì)胞脂肪變性、中央靜脈周圍肝細(xì)胞壞死，長期慢性中毒可導(dǎo)致肝纖維組織增生，形成肝纖維化及肝硬化。在動物實(shí)驗(yàn)中單投CCl46周可形成肝纖維化，12-15周可發(fā)生肝硬化，目前CCl4誘發(fā)的肝纖維化、肝硬化動物模型仍被廣泛應(yīng)用，但此模型一旦停止攻擊可以恢復(fù)。
本實(shí)驗(yàn)的血清AST、ALT值和總蛋白的含量檢測結(jié)果看，狗膽和熊膽均有較好的降酶及增加血清總蛋白作用，而狗膽的作用優(yōu)于熊膽，但熊膽有較好的降低血清膽固醇的作用。肝/體重比、肝纖維組織的圖象檢測結(jié)果，實(shí)驗(yàn)1的狗膽組與熊膽組比較有顯著差異，狗膽組間無明顯差異；肝組織病理觀察表明，中毒組肝組織的正常結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性，脂肪空泡大小不一，可見散在的灶狀、片狀壞死。熊膽組病變比中毒組輕，但仍可見較多肝細(xì)胞脂肪變性，可見點(diǎn)狀、灶狀壞死。狗膽組肝細(xì)胞輕度脂肪變性，偶見點(diǎn)狀壞死。肝纖維化的分級結(jié)果看中毒組匯管區(qū)大量纖維組織增生，并形成粗大的纖維間隔，絕大多數(shù)形成彌漫性肝硬化(5/6)，熊膽組肝纖維化與中毒組比較減輕，而狗膽組僅有個別形成彌漫性肝硬化。實(shí)驗(yàn)2停止攻擊4周后肝組織內(nèi)無脂肪變性，肝重量恢復(fù)接近正常，狗膽組肝/體重比略高于中毒組，但統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異。除了對照組，中毒組肝纖維化減輕，但仍可見纖維間隔尚未完全恢復(fù)，纖維組織的圖象檢測結(jié)果中毒組仍有較多的纖維組織，熊膽組與中毒組比較纖維組織有顯著性差異，狗膽組與熊膽組比較也有顯著性差異。肝組織病理觀察表明，中毒組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞輕度變性，膠原纖維淡染，自然吸收一部分，纖維間隔變細(xì)，纖維化程度減輕，但仍有一半形成大的假小葉，而熊膽組和狗膽組肝纖維化比中毒組輕，僅有個別形成大的假小葉。上述結(jié)果從病理學(xué)角度進(jìn)一步證實(shí)了狗膽抗肝纖維化的作用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中血清AST、ALT檢測、肝/體重比、肝組織的病理變化、肝纖維化的分級、肝纖維組織定量分析結(jié)果，狗膽具有良好的預(yù)防和治療CCl4誘發(fā)大鼠肝纖維化的作用，其作用優(yōu)于熊膽。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1狗膽粉通過以下方法步驟制得提供新鮮狗膽囊并取膽汁，經(jīng)100目篩過濾，在60℃下干燥，經(jīng)研磨后再過100目篩，最后用紫外線消毒30分鐘。在無菌條件下，把狗膽粉裝入膠囊，每粒膠囊0.25g，包裝10粒/板，一盒4板。用法及用量一次1-2粒、一日2次，口服。
實(shí)施例2狗膽粉的制備方法同實(shí)施例1，制備的狗膽粉與蟲草菌絲、丹參等重量配制膠囊，每粒膠囊0.25g，包裝10粒/板，一盒4板。用法及用量一次1-2粒、一日2次，口服。另外，狗膽粉也可與其它具有抗肝纖維化作用的中藥材等量配制復(fù)方制劑膠囊，提高防治肝纖維化的效果。
權(quán)利要求
1.一種狗膽粉，通過以下方法步驟制得提供新鮮狗膽囊并取膽汁，經(jīng)100目篩過濾，在60℃下干燥，經(jīng)研磨后再過100目篩，最后消毒。
2.狗膽粉在制備防治肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種狗膽粉，通過以下方法步驟制得提供新鮮狗膽囊并取膽汁，經(jīng)100目篩過濾，在60℃下干燥，經(jīng)研磨后再過100目篩，最后消毒。本發(fā)明還公開了狗膽粉的新用途，即狗膽粉在制備防治肝纖維化的藥物中的應(yīng)用，尤其是狗膽粉在制備對狗膽粉在對二甲基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝纖維化藥物的防治作用；狗膽粉在制備對四氯化碳誘發(fā)大鼠肝纖維化藥物的防治作用。
文檔編號A61K9/14GK1994325SQ20061001650
公開日2007年7月11日 申請日期2006年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日
發(fā)明者樸東明 申請人:樸東明