專利名稱：：預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及預(yù)防家禽傳染病的疫苗，尤其涉及一種預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
：雞新城疫、雞呼吸型和腎型傳染性支氣管炎對養(yǎng)雞業(yè)危害十分嚴重，目前僅有相應(yīng)的單項滅活苗，如雞新城疫滅活苗、傳染性支氣管炎(單價)滅活苗，需要單獨分別注射，使用很不方便，防疫成本高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種可預(yù)防雞新城疫、呼吸型和腎型傳染性支氣管炎的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法。本發(fā)明采用以下述技術(shù)方案來實現(xiàn)上述目的預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，選用毒種為新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M^和H化9腎型變異株，制備二聯(lián)疫苗的步驟如下(1)、將新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41和HN99腎型變異株稀釋后接種SPF雞胚尿囊腔內(nèi)，收取胚液，作為毒種；(2)、將LaSota株、Mw株和,99株毒種稀釋后分別接種易感雞胚尿囊腔，分別收獲LaSota株、M41株和HN99株雞胚病毒尿囊液；(3)、將病毒尿囊液分別濃縮；(4)、濃縮病毒液分別加入滅活劑滅活，然后等量混合，用乳化法制成單相油乳劑滅活疫苗。所述的乳化法為將體積份數(shù)92—95份的獸用白油、5—8份的司本-80和占獸用白油與司本-80總重量1%—3%的硬脂酸鋁混合、加熱熔化并滅菌后冷卻為油相；將3種滅活濃縮病毒液等量混合并充分振蕩，加入占其體積百分比4%—5%的吐溫-80混合為水相；按水相與油相體積比1:3—4的比例，乳化制成單相油乳劑滅活疫苗。滅活劑為體積百分比濃度O.1%—0.2%的甲醛水溶液，滅活時間為12一24小時。雞腎型傳染性支氣管炎HN99株病毒為新分離鑒定的病毒，其具有以下特征(1)在電鏡下見有冠狀病毒粒子，直徑90105nm，有囊膜，周圍有長約18nm的梨狀突出，呈放射狀排列；(2)、發(fā)病雞癥狀除呼吸道癥狀外，大部份死雞均有腎臟腫大、尿酸鹽沉積、花斑腎等病變；(3)、病毒分離物對NDVLaSota株病毒的繁殖產(chǎn)生干擾-,(4)、病毒分離物對1%雞紅細胞不產(chǎn)生凝集；(5)、回歸SPF雞試驗可出現(xiàn)呼吸道癥狀和腎腫、花斑腎等病變；(6)、特異性血清中和結(jié)果證明，病雞的病毒分離物與HN99陽性血清呈陽性反應(yīng)，而與NDVLaSota株、IBDVB^株、AIVH具株均呈陰性反應(yīng)；(7)、將HN99株陽性血清與EID5。的Mw株、Holte株、Gray株、T株和地方分離株湖北株、哈爾濱株、山東株、北京株、上海株、天津株等病毒做血清中和試驗，結(jié)果顯示，HNg9株陽性血清與T株、湖北株、天津株和山東株呈陽性反應(yīng)，與其他株病毒均呈陰性反應(yīng)。本發(fā)明選用毒種為新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41和HN99腎型變異株，其中HN99腎型變異株為新分離鑒定的病毒，該病毒株免疫原性良好，能有效預(yù)防雞腎型傳染性支氣管炎傳染病，保護率達到80100%;該病毒株特異性強，專門預(yù)防雞腎型傳染性支氣管炎，這是其他病毒株不能替代的。疫苗制備還應(yīng)用了超濾濃縮技術(shù)，打一針該疫苗可預(yù)防雞新城疫、呼吸型傳染性支氣管炎、腎病變型傳染性支氣管炎等三種傳染病，和現(xiàn)有的打三針單項疫苗才能預(yù)防這三種傳染病比較，該發(fā)明經(jīng)濟使用，簡化了免疫程序，降低了防疫成本。本發(fā)明所述的雞傳染性支氣管炎病毒株于2006年5月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱CGMCC，保藏編號CGMCCNo.1729，分類命名雞腎型傳染性支氣管炎病毒，英文名稱為AvainnephropathogenicInfectiousbronchitisvirusHN99Strain，拉丁文名禾爾為TarpeiapuHi，保藏單位地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，郵編100080。具體實施例方式預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，選用毒種為新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41和HN99腎型變異株，制備二聯(lián)疫苗的步驟如下1、毒種的來源(1)雞新城疫采用LaSota株，效檢用強毒為F48E9，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。毒種的標準及保存方法同"中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程"(以下均簡稱"規(guī)程")中"雞新城疫低毒力活疫苗制造及檢驗規(guī)程"1項的規(guī)定。(2)傳染性支氣管炎制造及檢驗均采用標準強毒M"株和地方分離株麗99株，均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。標準強毒Mw株和地方分離株麗99株毒力及毒種標準如下病毒含量M^株和麗99株毒種對10日齡SPF雞胚尿囊腔內(nèi)接種的感染劑量均》1065EID5。/0.lml。感染判定標準是按接種后雞胚在24144小時內(nèi)全部或部分死亡，存活的雞胚以胎兒出現(xiàn)失水、蜷縮、發(fā)育小或腎腫、尿酸鹽沉積等特異性病痕為標準。免疫原性免疫攻毒法毒價》10"EIDs。/0.lml的M"株和,99株易感雞胚尿囊毒，經(jīng)滅活后，分別按1:3(水相油相)的比例制成油乳劑滅活疫苗，按每羽份免疫15日齡SPF雞8只，三周后，連同條件相同的對照雞4只，分別攻擊M"株和麗99株強毒，每只雞氣管注射M^株或HN的株強毒尿囊液各0.2ml，觀察10天，對照雞全部發(fā)病，免疫雞保護6/8以上，或免疫雞全部保護，對照雞發(fā)病3/4。病毒分離試驗上述免疫雞和對照雞攻毒后67天采集氣管、肺臟和腎臟拭子，處理后分別接種雞胚，進行病毒分離，分離不到病毒的雞判為保護。免疫雞》8/10分離不到病毒，而對照雞》8/10的雞分離到病毒。純凈毒種按"中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準"(以下均簡稱"標準")的附錄301頁檢驗，無細菌、霉菌及支原體和外源病毒污染。特異性M,'株和朋99株毒種分別與M4,株和HN99株型特異性血清中和后，接種雞胚不引起死亡或感染。保存在-15"C以下，濕毒保存期6個月，M"株凍干毒為3年，HN99株暫定為2年，-8(TC以下凍干毒至少可保存IO年。2、試驗用雞二聯(lián)苗安全試驗、檢驗用雞，均采用SPF雞或易感雞。3、攻擊用強毒及攻毒方法NDVF4sE9株強毒，用前以SPF胚傳2代，毒價ELD5。為10—770.lml，肌肉或皮下注射。IBVMu株強毒，用SPF雞胚傳2代，其毒價》10"EID5。/0.lml，對l-7日齡SPF雛雞，以10倍稀釋的強毒氣管內(nèi)滴入0.2ml，觀察10天，80%以上的雛雞出現(xiàn)典型的支氣管炎等癥狀為發(fā)病標準。IBV麗99株強毒，對雞胚的毒價》10"EID5。/0.lml。攻毒時將毒種作IO倍稀釋，對17日齡SPF雞IO只氣管內(nèi)滴入O.2ml，觀察10天，80%以上的雛雞出現(xiàn)咳嗽，甩鼻等支氣管炎癥狀或支氣管、肺臟充血或出血，或有腎腫、尿酸鹽沉積等發(fā)病癥狀。4、EID5、HI、HA測定方法HI、HA測定方法參照"規(guī)程"附錄40頁。EIDs。的測定方法同"規(guī)程"附錄47頁。5、制苗用毒種制備和生產(chǎn)用種子批的建立(1)NDVUSota株制苗用毒種制備和種子批的建立同"規(guī)程"中"雞新城疫低毒力活疫苗制造及檢驗規(guī)程"的2.1項。(2)IBVM^株和HNM株的制苗用毒種制備和種子批的建立。毒種繁殖將毒種用滅菌生理鹽水稀釋100倍，尿囊腔內(nèi)接種10-11日齡SPF雞胚，每胚O.lml。接種后3072小時，收取活胚和死胚胚液，選擇經(jīng)檢驗無菌，對雞胚毒價》10"EID5。，對1%雞紅細胞凝集試驗為陰性的胚液作毒種用，注明收獲日期、毒種代次。毒種鑒定按前述項目進行，應(yīng)符合規(guī)定。毒種保存在-15r以下條件，使用期不超過6個月。毒種繼代不超過3代。6、制苗用病毒液的制備及檢驗(1)NDVLaSota株病毒液的制備及檢驗同"規(guī)程"中"雞新城疫低毒力活疫苗制造及檢驗規(guī)程"2.2、2.3、2.4項。(2)IBVMw株和HN99株病毒液的制備及檢驗制苗用材料選擇發(fā)育良好的1011日齡易感雞胚作為制苗用材料。雞胚接種將Mw株和HN99株毒種分別用滅菌生理鹽水稀釋至10—2103，分別接種易感雞胚尿囊腔，每胚O.lml，接種后密封針孔，置37"C繼續(xù)孵育，停止翻蛋。孵育與觀察雞胚接種后，30小時前照蛋1次，棄去死胚，以后每隔48小時照蛋一次，死亡的雞胚隨時挑出，至72小時不論死亡與否，全部取出，氣室向上，置于28"C，冷卻1224小時。收獲分別收獲M"株和朋99株雞胚液。將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌方法剝除氣室部位卵殼，剪破絨毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黃破裂)，吸取雞胚液，每若干個胚的胚液混合為一組，置于滅菌瓶中，每毫升加入青霉素、鏈霉素各1000單位，放28'C感作412小時。在收獲胚液的同時應(yīng)逐個檢查雞胚，凡胎兒腐敗，胚液混濁及有任何污染可疑者棄去不用。雞胚病毒液的檢驗經(jīng)處理后的Mw株和麗99株雞胚病毒液，分別按照"規(guī)程"附錄50頁進行無菌檢查(可不移植)，應(yīng)無菌生長；胚液對1%雞紅細胞應(yīng)無凝集；對10日齡易感雞胚尿囊腔內(nèi)接種EIDs。應(yīng)《10—"A),lml。符合以上規(guī)定的方可作為制苗用病毒液。7、病毒液的濃縮與滅活(1)濃縮設(shè)備使用美國密理博公司的MINI-PELLICON標準超濾設(shè)備。該設(shè)備由兩部分裝置組成。其一是病毒尿囊液預(yù)過濾裝置，此裝置使用平板式293圓盤過濾器，該濾器用316L不銹鋼制造，全不銹鋼接口。運行成本低，病毒液殘留體積很小，可夾持預(yù)過濾及除菌過濾膜數(shù)片。由于NDVLaSota株和IBVM"株、麗99株雞胚尿囊液的黏度高，采用常規(guī)的除菌濾膜流量很低，時間長會導(dǎo)致病毒液丟毒，因此，使用0.45"m孔徑的MILLIPORE的AP2529325型號專用預(yù)過濾膜，對病毒尿囊液進行粗濾，可濾除尿囊液中的雜質(zhì)和很多微生物。結(jié)合生產(chǎn)后期的病毒滅活步驟，可達到無菌效果。其二是病毒液超過濾濃縮裝置，該裝置使用316L不銹鋼膜包夾具及管路，全部采用衛(wèi)生接口，內(nèi)外表面電拋光處理。動力裝置使用不銹鋼蠕動泵和硅膠蠕動泵管。超濾濃縮使用分子量為500K-800K的超濾膜包，可截留ND、IB等病毒粒子。此超濾膜包采用低蛋白吸附改良纖維材料，其蛋白吸附量僅為國際通用的聚醚砜材料的1/41/5。本超濾裝置的進液口和回流口及透過口均配有隔膜壓力表及隔膜閥，可控制系統(tǒng)的壓力，保證超濾濃縮過程的安全和高效。同時膜包夾具為直立式結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)排放容易，殘留體積小，再加上最后用滅菌生理鹽水沖洗、頂洗病毒液，使病毒液損耗極小。(2)超濾濃縮工藝方法粗濾將病毒尿囊液先用滅菌的100目/cm2的不銹鋼漏斗濾過，除去大顆粒雜質(zhì)，或用30005000rpm/min的離心機離心30min，去除沉渣，吸取上清液至一消毒的容器內(nèi)。預(yù)過濾將293圓盤平板濾器及管道等高壓蒸汽消毒(12rC，30min)，把盛有病毒液的容器通過管道與濾器連接充入除菌的空氣加壓后，(一般控制在0.05upa)，病毒液在一定壓力下通過平板濾器的濾膜，從出口流出。用消毒的容器收集從平板濾器濾過后流出的病毒液，完成預(yù)過濾。超濾濃縮先將超濾裝置用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，然后用1N濃度的氫氧化鈉溶液浸泡過夜12小時以上，使用時先用消毒的蒸鎦水反復(fù)沖洗，將NaOH沖洗干凈，使沖洗后的廢棄液近中性。然后將預(yù)過濾的病毒液容器通過消毒管道與超濾裝置連接，開啟蠕動泵，使其流量達到4L/分鐘，這樣高的流速保證超濾膜包較長的使用壽命和最佳的超濾效果。經(jīng)超濾濃縮的病毒液盛入密閉的容器內(nèi)，并反復(fù)循環(huán)通過超濾裝置，直至達到要求的濃縮終點。(3)濃縮效果測定3種病毒濃縮前和濃縮后，用測血凝價HA或EIDM、TCIDs。等方法進行檢查，并確定濃縮終點。濃縮終點的確定以抗原量表示如下NDV濃縮終點的確定"雞新城疫滅活疫苗制造及檢驗規(guī)程"中規(guī)定，單相油苗中LaSota株尿囊液的病毒含量為108QEID5。，由此可知，二聯(lián)苗中LaSota株的濃縮終點的病毒含量應(yīng)》3X10"EID5。。IBVM"株和HN99株濃縮終點的確定從"M"株和HI^株免疫原性、保存期測定"試驗可知，IBVM^株或,99株單相油苗中的病毒含量為10">EID5(,，由此可知，二聯(lián)苗中M"株或麗99株的濃縮終點的病毒含量為應(yīng)》3X10fiOEID5O。3種病毒液按上述濃縮終點進行濃縮，濃縮后的病毒應(yīng)達到濃縮終點的要求，同時對濃縮過程中的廢棄液應(yīng)隨時抽樣進行檢查，檢査其EIDs。應(yīng)為零值。(4)濃縮病毒液的滅活與檢驗濃縮后的3種病毒液，分別加入10%的甲醛水溶液，使其最終濃度為O.1%，當(dāng)苗溫升至37""C時開始計算滅活時間，共滅活16小時。滅活后的3種病毒液，分別接種雞胚，進行HA、EIDs。測定，證明病毒已徹底滅活。同時按"規(guī)程"P50頁方法作無菌檢驗。證明無細菌生長者，方可作為制苗抗原。8、二聯(lián)苗的乳化與分裝(1)油相制備獸用白油為杭州煉油廠生產(chǎn)，司本-80為上海大眾制藥廠生產(chǎn)，硬脂酸鋁為上海遠航化工廠生產(chǎn)。以上三種成份混合、加熱熔化至透明，經(jīng)高壓滅菌后冷卻備用。(2)水相制備經(jīng)檢驗合格后的3種滅活濃縮病毒液，等量混合并充分振蕩均勻，加入滅菌冷卻后的吐溫-80(上海大眾制藥廠生產(chǎn))，混合均勻備用。(3)疫苗的乳化應(yīng)用"規(guī)程"(P8485)方法，把水相、油相混合后用膠體磨或與勻漿泵配合使用的方法，進行乳化。乳化工具膠體磨JTM50為沈陽新光機械廠制造，勻漿泵為上海東華機械廠制造。使用前先用0.5%甲醛溶液浸泡消毒8小時以上，用前以滅菌的熱蒸餾水沖洗干凈。用后用熱水反復(fù)沖洗，徹底消除殘留油苗。具體乳化法為將體積份數(shù)92—95份的獸用白油、5—8份的司本-80和占獸用白油與司本-80總重量1%—3%的硬脂酸鋁混合、加熱熔化并滅菌后冷卻為油相；將3種滅活濃縮病毒液等量混合并充分振蕩，加入占其體積百分比4%—5%的吐溫-80混合為水相；按水相與油相體積比1:3—4的比例，乳化制成單相油乳劑滅活疫苗。各實施例具體成分配比如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>三批疫苗0203、0204、0205，分別作如下試驗。(1)二聯(lián)苗的物理性狀檢驗劑型將三批二聯(lián)苗滴于冷水表面，不分散為W/0型，分散為0/W型。粘度用出口內(nèi)徑1.2毫米的lml吸管，在室溫條件下吸取lml二聯(lián)苗，計算垂直放出0.4ml所需的時間。穩(wěn)定性將二聯(lián)苗以3000rpm離心15分鐘，觀察疫苗分層情況。將疫苗放37"C條件下經(jīng)21天，觀察疫苗分層情況。(2)無菌檢驗按"規(guī)程"附錄50頁的方法對三批二聯(lián)苗進行無菌檢驗。(3)安全試驗用3周齡的SPF雞，肌肉注射二聯(lián)苗2ml(4羽份)，觀察二周，并進行解剖，記錄試驗雞的反應(yīng)情況和剖檢情況。(4)效力檢驗ND效力檢驗每批疫苗用1月齡SPF雞15只(NDHI〈1:4)，其中10只各皮下或肌肉注射二聯(lián)苗20ixl，另5只不免疫作為對照，3周后，每只雞肌肉注射ND強毒F48E9/E2，劑量為105ELD5Q，觀察14天，記錄免疫雞與對照雞存活與死亡情況。IB效力試驗每批疫苗用3周齡SPF雞16只，皮下或肌肉注射二聯(lián)苗一羽份(0.3ml)，另外8只不免疫作為對照。三周后其中8只免疫雞連同對照雞4只，氣管內(nèi)滴入Mw含毒尿囊液(EIDs?！?0670.lml)O.2ml，觀察1周，記錄免疫雞與對照雞的反應(yīng)和死亡情況。另外8只免疫雞和4只對照雞氣管內(nèi)滴入麗99株病毒液EID5?！?0670.lml)O.2ml，觀察1周，記錄免疫雞與對照雞的反應(yīng)和剖檢情況。(5)二聯(lián)苗不同免疫劑量試驗取上述二聯(lián)苗三批，每批苗分別按0.1，0.2，0.3，0.4的劑量，分別免疫3周齡非免疫雞，3周后照上述方法測定免疫雞抗體水平，并攻擊強毒，觀察并記錄免疫雞和對照雞的抗體水平、反應(yīng)和病變情況。10、二聯(lián)苗的實驗室檢驗結(jié)果(1)二聯(lián)苗物理性狀檢驗結(jié)果劑型02030205三批二聯(lián)苗檢驗樣品滴于冷水表面，基本不分散，為W/0(油包水)型。粘度用出口內(nèi)徑1.2毫米的1毫升吸管，在室溫條件下吸取3批二聯(lián)苗各lml，垂直放出0.4ml所需的時間均在8秒以內(nèi)，符合"規(guī)程"中"雞新城疫滅活疫苗制造及檢驗規(guī)程"中關(guān)于油乳劑的粘度要求。穩(wěn)定性3批二聯(lián)苗以3000rpm離心30分鐘，疫苗不分層、不破乳。二聯(lián)苗在28X:保存一年，2(TC25。C保存半年，疫苗不分層，37°C放一個月不分層，二個月疫苗表面有2mm左右的油層，搖蕩后即成均勻的乳劑。結(jié)果如表l。表l二聯(lián)苗物理性狀檢驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(3)安全試驗用3周齡的SPF雞，肌肉注射二聯(lián)苗2ml(4羽份)。疫苗注射后部分試驗雞出現(xiàn)短時間精神不振，12小時后即恢復(fù)正常。共觀察3周，所有試驗雞精神良好，吃喝正常。三周后捕殺，所有臟器未見異常變化。注射局部有少量未吸收的疫苗，但無腫脹潰爛。試驗證明疫苗安全，結(jié)果如表3。表3二聯(lián)苗安全檢驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注"-"表示無反應(yīng)，"±"表示有少量未吸收疫苗。(4)效力試驗ND效力試驗每批疫苗用1月齡SPF雞10只，其中5只皮下注射，5只肌肉注射，劑量為二聯(lián)苗20W，另5只不免疫作為對照，34周后，每只雞肌肉注射ND強毒F48E9/E2，105ELD5。，觀察14天，對照雞全部死亡，三批疫苗免疫雞全部保護，達到"規(guī)程"中"雞新城疫油乳劑滅活疫苗制造及檢驗規(guī)程"的效力檢驗標準。IB效力試驗每批疫苗用3周齡SPF雞16只，皮下和肌肉注射各8只，每只劑量0.3ml，三周后其中8只免疫雞(4只肌肉注射，4支皮下注射)連同條件相同的對照雞4只，氣管內(nèi)注射M^含毒尿囊液(EK10-"/0.lml)0.2ml，觀察二周，結(jié)果免疫雞保護7/8以上。M41株對照雞全發(fā)病，發(fā)病雞有咳嗽、甩頭等典型支氣管炎癥狀，2只雞解剖后支氣管、肺臟有充血、出血等病變，另外8只免疫雞和對照雞4只，氣管內(nèi)注射麗99株含毒尿囊液(EID5Q《1(T70.lml)，觀察二周，結(jié)果免疫雞全保護，對照雞3/4發(fā)病，發(fā)病雞有咳嗽、呼吸快、甩頭等支氣管炎癥狀，其中1只雞有腎腫、1只雞支氣管、肺臟充血和出血的解剖癥狀。符合"國家質(zhì)量標準"中"雞傳染性支氣管炎滅活疫苗"效力檢驗標準的要求。詳細結(jié)果見表4。表4二聯(lián)苗效力試驗疫苗效檢免疫劑量免疫ND攻毒前抗體攻毒對照結(jié)批號項目(ml)雞數(shù)HI(L0g2)保護情況果ND0.02108.510/100/5活合格0203M410.387/84/4發(fā)病HN990.388/83/4發(fā)病ND0.02108.2510/100/5活合格0204M410.388/84/4發(fā)病HN990.388/83/4發(fā)病ND0.02108.510/100/5活各格0205M410.387/84/4發(fā)病HN卵0.388/83/4發(fā)病注攻毒劑量NDV:FE9-E2，105ELD5()，肌肉注射。IBV:M"E4和,99株，含毒尿囊液(EK1(T65/0.lml)氣管內(nèi)滴入0.2ml，并施行冷剌激。11、二聯(lián)苗不同免疫劑量的效力試驗用二聯(lián)苗0203、0204、0205三批疫苗，分別用0.1、0.2、0.3、0.4的免疫劑量，按照第2.6.4項效力檢驗的方法，免疫試驗雞。21天后，采血測定NDHI,并分別攻擊ND、IBM"和,99強毒，觀察攻讀結(jié)果。如<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>從表5的結(jié)果可以看出，三批二聯(lián)苗免疫O.l0.4ml，試驗雞攻毒后，免疫試驗雞ND攻毒后，保護7/1010/10，IBM^和HN^攻毒保護6/88/8，攻毒結(jié)果均達到"規(guī)程"和"標準"的規(guī)定標準。12、二聯(lián)苗實驗室試驗結(jié)果分析(1)IBVM"株和朋99株基礎(chǔ)種毒代數(shù)為最高代次Es，生產(chǎn)用種毒最高代次為第3代；凍干毒在-18"C以下，保存期至少3年，生產(chǎn)用毒種(雞胚尿囊液)在-15"C以下保存，不超過6個月。(2)二聯(lián)苗制苗用病毒液的制備用"規(guī)程"中的方法測定，NDVLaSota株雞胚尿囊液的病毒含量》10"EID5。，HA》1:640;IBVM"株、麗99株雞胚尿囊液的病毒含量^Ur。EID5。。三種病毒液經(jīng)無菌檢驗均無菌生長，符合制苗的要求。(3)二聯(lián)苗3種病毒液的濃縮試驗結(jié)果二聯(lián)苗中3種病毒液用美國密里博超濾裝置濃縮病毒的工藝是可行的。選用適宜孔徑的超濾膜包，用測定病毒含量或HA的方法，按照予先設(shè)計的濃縮終點，可以達到濃縮NDV、IBV3種病毒液的目的。濃縮后的廢棄液，采用檢査EIDs。的方法，證明濃縮后的排放液中不含病毒，濃縮效果較為理想。(4)二聯(lián)苗濃縮病毒液的滅活試驗證實，3種濃縮病毒液，采用0.1%甲醛溶液，在37T條件下滅活16小時后，LaSota株、M41株、HN9g株病毒滅活液0.2ml接種雞胚，結(jié)果雞胚在規(guī)定時間內(nèi)，全部健活，3種病毒液經(jīng)滅活后均失去活性，證明滅活徹底。(5)二聯(lián)苗的乳化與分裝二聯(lián)苗三種滅活后的病毒液等量混合后，按照水相油相為l:3的比例，用膠體磨分別乳化后，再經(jīng)勻漿機充分乳化并混合均勻，可以制備出理想的單相油乳劑滅活疫苗。13、疫苗的田間試驗田間試驗中使用的產(chǎn)品批數(shù)、批號0203、0204、0205三批試驗時間和地點鄭州市滎陽雞場2002年6月份主要試驗內(nèi)容和結(jié)果三批二聯(lián)苗分別免疫羅曼90日齡和210日齡產(chǎn)蛋雞各1000只，每只肌肉注射O.5ml。注射后共觀察14日，所有注射雞均無全身癥狀出現(xiàn)，吃食、飲水正常，210日齡產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率未受影響。少數(shù)雞因注射時抓雞有應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)天不產(chǎn)蛋，但次日即恢復(fù)正常。所有免疫雞的注射部位反應(yīng)正常，無紅腫或潰爛現(xiàn)象。說明三批二聯(lián)苗對開產(chǎn)前母雞和正在產(chǎn)蛋的雞使用后無不良的全身癥狀和局部癥狀出現(xiàn)，產(chǎn)蛋率不受影響。試驗證明，三批二聯(lián)苗使用安全。三批二聯(lián)苗免疫后第三周，采血測定抗體，NDHI(iQg2)由原來的7.08.25升至9.011.5，IB中和抗體價由原來的1:8升至1:161:32。試驗證明，三批二聯(lián)苗免疫三周后，NDHI、IB中和抗體上升到較高的水平。4個月后回訪客戶，免疫雞均未發(fā)生ND、IB這二種傳染病。三批二聯(lián)苗免疫7日齡非免疫雛雞各500只，每雞注射0.3ml，注射后觀察14日，所有免疫雞均未出現(xiàn)任何全身癥狀和局部癥狀，免疫雛雞飲食、精神正常，發(fā)育正常，注射部位未有紅腫、潰爛等異常情況，證明二聯(lián)苗對雛雞安全性良好。上述三批二聯(lián)苗免疫雛雞二周后按"規(guī)程"和"標準"的方法，分別用,F』9強毒105ELD5。的劑量和IBVM"株和麗99株強毒尿囊液0.2ml分別以肌肉注射和氣管滴入法進行攻擊，結(jié)果三批二聯(lián)苗ND免疫雛雞均全保護，對照死亡5/5，傳支M"和HN99均保護8/8，對照3/4發(fā)病，證明二聯(lián)苗對雛雞免疫效果較好。14、二聯(lián)苗中試生產(chǎn)及檢驗結(jié)果按照"農(nóng)業(yè)部獸用新生物制品管理辦法"的要求，在完成實驗室的基礎(chǔ)上，在北京獸醫(yī)生物藥品廠進行了二聯(lián)苗的中間試產(chǎn)，共試制二聯(lián)苗6批，并參照"中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程"(以下簡稱"規(guī)程")和"中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準"(以下簡稱"國標")的方法對6批疫苗進行了安全試驗、效力試驗、物理性狀檢測、無菌檢驗等，各項檢驗結(jié)果均達到了"規(guī)程"和"國標"的要求。詳細結(jié)果見表6、7、8。表6二聯(lián)苗中試物理性狀檢驗及無菌檢驗<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表7:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注(一)表示無異常反應(yīng)。表8二聯(lián)苗中試生產(chǎn)效力檢驗<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>15、二聯(lián)苗大面積區(qū)域性試驗利用中試生產(chǎn)的6批二聯(lián)苗，在河南省漯河市陽光禽業(yè)有限公司、南陽市蒲山種雞場、南陽市馮樓種雞場、康佳種雞場、漯河市日日紅禽業(yè)有限公司等5個種雞場，進行了大面積的區(qū)域性試驗。共注射羅曼、海蘭、海賽、AA等品種的種雞46000只。注射后觀察23周，注射雞的精神、采食、飲水都正常，注射當(dāng)日產(chǎn)蛋率因應(yīng)激反應(yīng)下降23個百分點，次日即恢復(fù)正常。注射部位基本無腫脹、潰爛、發(fā)炎等情況。注射后NDHl較注射前上升34l。g2，從區(qū)域性試驗用戶的反應(yīng)情況，證明二聯(lián)苗安全性好，效力可靠。詳細結(jié)果見表9。表9二聯(lián)苗區(qū)域性試驗情況疫苗批號試驗雞場注射品種、曰齡注射數(shù)量(只)局部反應(yīng)全身反應(yīng)注射前NDHIG。g2)注射后NDHI(bg2)0601漯河市陽光種雞場海蘭、1102000無異常反應(yīng)精神、飲食正常6.09.0康佳種雞場海賽、1253000無異常反應(yīng)精神、飲食正常8910130602漯河市陽光種雞場海蘭、1102000無異常反應(yīng)精神、飲食正常6.09.00603南陽蒲山種雞場海蘭、開產(chǎn)刖3000無異常反應(yīng)精神、飲食正常67911康佳種雞場海賽、1253000無異常反應(yīng)精神、飲食正常8910130604南陽蒲山種雞場海蘭、開產(chǎn)前3000無異常反應(yīng)精神、飲食正常679110605漯河日R紅種雞場AA、185000無異常反應(yīng)精神、飲食正常68810南陽馮樓種雞場羅曼開產(chǎn)后半年10000無異常反應(yīng)精神、飲食和產(chǎn)蛋正常91110140606南陽馮樓種雞場羅曼開產(chǎn)后半年10000無異常反應(yīng)精神、飲食和產(chǎn)蛋正常9111014漯河日日紅種雞場AA、185000無異常反應(yīng)精神、飲食正常68810權(quán)利要求1、預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，選用毒種為新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41和HN99腎型變異株，制備二聯(lián)疫苗的步驟如下(1)、將新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41和HN99腎型變異株稀釋后接種SPF雞胚尿囊腔內(nèi)，收取胚液，作為毒種；(2)、將LaSota株、M41株和HN99株毒種稀釋后分別接種易感雞胚尿囊腔，分別收獲LaSota株、M41株和HN99株雞胚病毒尿囊液；(3)、將病毒尿囊液分別濃縮；(4)、濃縮病毒液分別加入滅活劑滅活，然后等量混合，用乳化法制成單相油乳劑滅活疫苗。2、如權(quán)利要求l所述的預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述的乳化法為將體積份數(shù)92—95份的獸用白油、5—8份的司本-80和占獸用白油與司本-80總重量1%—3%的硬脂酸鋁混合、加熱熔化并滅菌后冷卻為油相；將3種滅活濃縮病毒液等量混合并充分振蕩，加入占其體積百分比4%—5%的吐溫-80混合為水相；按水相與油相體積比1:3—4的比例，乳化制成單相油乳劑滅活疫苗。3、如權(quán)利要求1或2所述的預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，滅活劑為體積百分比濃度0.1%—0.2%的甲醛水溶液，滅活時間為12—24小時。全文摘要本發(fā)明涉及預(yù)防家禽傳染病的疫苗，尤其涉及一種預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，選用毒種為新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M₄₁株和HN₉₉腎型變異株制備二聯(lián)滅活疫苗，制備步驟如下將兩種病毒稀釋后分別接種SPF雞胚尿囊腔內(nèi)，收取活胚和死胚的胚液作為毒種，稀釋后分別接種易感雞胚的尿囊腔，分別收獲病毒尿囊液，然后通過超濾裝置濃縮，濃縮后病毒液分別加入甲醛水溶液滅活后混合，用乳化法制成疫苗。使用本發(fā)明可同時預(yù)防雞新城疫、雞腎型和呼吸型傳染性支氣管炎，可減少打針次數(shù)，降低防疫成本，使用方便，經(jīng)濟實用。文檔編號A61K39/12GK101099864SQ200610018069公開日2008年1月9日申請日期2006年7月3日優(yōu)先權(quán)日2006年7月3日發(fā)明者崔保安,張素梅,徐端紅,莉王,王學(xué)斌,舒德廣,高文明,魏占勇申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)