專利名稱：抑癌蛋白及其基因和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及人類抑癌蛋白(腫瘤抑制蛋白)、編碼該蛋白的基因，以及所述蛋白和基因(及其突變體或衍生物)的在生物醫(yī)藥(包括人類腫瘤抑制藥物和生物制劑)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病，目前全球大約有2000萬人患有癌癥。估計到2020年將增至3000萬、每年癌癥新發(fā)病例數(shù)將從1000萬升至1500萬。全球每年有710萬人死于癌癥(占總死亡率的12.5％)。目前我國每年新增惡性腫瘤患者約106萬人，死亡人數(shù)約有154萬，癌癥死亡人數(shù)以每年60萬的速度增加，并呈持續(xù)增長趨勢。癌癥位居我國各類死因首位，每5個死亡人數(shù)中，有1個死于癌癥。雖然傳統(tǒng)治療方法對很多早期癌癥治療效果較好，但到目前為止還沒有有效的手段來治療中晚期癌癥。
癌癥的傳統(tǒng)治療方法主要是外科手術(shù)、放射線治療、化學(xué)藥物治療等方法，但這些方法都有其局限性。外科手術(shù)無法治療侵入性及轉(zhuǎn)移性癌癥，還可能促使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；放射線治療會造成正常細(xì)胞傷害，對轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞無法逐-治療；化學(xué)藥物治療毒性通常都太強，對正常細(xì)胞造成傷害。而利用抑癌基因來治療癌癥的基因治療方法是現(xiàn)在國際上攻克癌癥的主要研究方向，各國都投入了大量資金和人力、物力。世界上的基因治療臨床試驗始自1990年，迄今全球涉足基因治療領(lǐng)域的專業(yè)化公司已有近百家，基因治療臨床方案達(dá)700多個。在抑癌基因通過其產(chǎn)物—抑癌蛋白抑制癌基因的表達(dá)達(dá)到治療癌癥的目的。抑癌蛋白的作用靶向性強，對正常細(xì)胞沒有影響，并且效果較理想，因此抑癌蛋白、基因是一種很有發(fā)展前途的在腫瘤抑制藥物和生物制劑中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抑癌蛋白，該蛋白能有效地抑制肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌的生長。
本發(fā)明還涉及編碼蛋白作為制備治療或預(yù)防肝細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及編碼蛋白作為制備治療或預(yù)防結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種抑癌基因，該基因可有效地抑制肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌的生長。
本發(fā)明還涉及編碼基因作為制備治療或預(yù)防肝細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及編碼基因作為制備治療或預(yù)防結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明人在用乙型肝炎病毒(HBV)的X蛋白(HBx)作為誘餌，通過酵母雙雜交技術(shù)從人的肝細(xì)胞cDNA文庫中篩選出一種與HBx蛋白相互作用的人類蛋白，通過對其研究和編碼基因的DNA序列測定和分析后確定該蛋白和基因是以前未發(fā)現(xiàn)的蛋白和基因(見參考文獻(xiàn)Jianlin Zhang，Weiguang Zhao，KailangWu，Ke Wang，Xue Zhang，Chunfang，Gu，Yah Li，Ying Zhu，and Jianguo Wu.(2004).Human hepatitis B virus X protein promotes cell proliferation and inhibits cellapoptosis through interacting with a serine protease Hepsin.Archive of virology，150(4)，721-741.)。通過對其功能的研究發(fā)現(xiàn)他們是一種抑癌蛋白和抑癌基因，新鑒定的yueF基因的核苷酸序列和YueF蛋白的氨基酸序列，以人的肝細(xì)胞cDNA文庫為模板，用設(shè)計的引物進(jìn)行PCR將yueF基因擴增出來，并克隆到pCMV-flag-2C載體上，送測序公司進(jìn)行測序。根據(jù)yueF基因的核苷酸序列推測出YueF蛋白的氨基酸序列。
一種抑癌蛋白(腫瘤抑制蛋白)，其特征在于具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列(及其突變序列或衍生序列)。該蛋白可用于制備抑制腫瘤生長的藥物，也可用于制備抑制腫瘤生長的藥物組合物和其它生物制劑。
一種抑癌基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列(及其突變序列或衍生序列)，編碼的抑癌蛋白(及其突變蛋白或衍生蛋白)。該基因可用于制備抑制腫瘤生長的藥物，也可用于制備抑制腫瘤生長的藥物組合物和其它生物制劑。
本發(fā)明技術(shù)方案如下1、抑癌基因的分離、鑒定及表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和純化1)抑癌基因的克隆引物設(shè)計和合成用乙型肝炎病毒(HBV)的X蛋白(HBx)作為誘餌，通過酵母雙雜交技術(shù)(見參考文獻(xiàn)Jianlin Zhang，Weiguang Zhao，Kailang Wu，Ke Wang，Xue Zhang，Chunfang，Gu，Yan Li，Ying Zhu，andJianguo Wu.(2004).Human hepatitis B virus X protein promotes cellproliferation and inhibits cell apoptosis through interacting with a serine proteaseHepsin.Archive of virology，150(4)，721-741.)，從人的肝細(xì)胞cDNA文庫中篩選出一種與HBx蛋白相互作用的人類蛋白，該蛋白具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。將該蛋白命名為岳飛(YueF)、編碼該蛋白的基因相應(yīng)地命名為yueF。針對該基因設(shè)計一對PCR引物上游引物5’-GCTTAAGCTTCGATGGCTGCAAGTGGCCGAGGTCTC-3’，下游引物5’-CGTTCGGTACCTCTTCCTGGGTCAGAGCTGGTTC-3’，并送大連寶生物合成。
2)抑癌基因PCR擴增以人肝細(xì)胞cDNA文庫作為模板，用合成的一對引物進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)入循環(huán)94℃ 1min，64℃ 1min，72℃ 1.5min 35個循環(huán)；72℃延伸10min。將編碼YueF蛋白的整個開放閱讀筐的DNA片段擴增出來。用1％瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用Qiagen公司提供的DNA純化回收試劑盒純化。
3)抑癌基因克隆和測序?qū)⒒厥盏腄NA片段用HindIII和KpnI兩個酶消化后連于質(zhì)粒pCMV-flag-2C(購自Promega公司)，得到抑癌基因的真核表達(dá)載體pCMV-YueF質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α(華美生物技術(shù)有限公司)，篩選陽性克隆。陽性菌株及其質(zhì)粒保存?zhèn)溆茫⑺蜕虾ＨA諾并測序。獲得SE QID NO1所示的核苷酸序列。
2、抑癌蛋白的氨基酸序列根據(jù)抑癌基因的核苷酸序列推測抑癌蛋白(YueF蛋白質(zhì))具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列與在GenBank中(登錄號BC0061310)所登錄的人體第10條染色體上的第33個開放閱讀筐(Homosapiens chromosome 10 open reading frame 33)及其編碼的蛋白序列完全相同。
3、抑癌基因的真核表達(dá)載體pCMV-YueF質(zhì)粒純化將陽性克隆接種于濃度為50μg/ml的氨芐抗菌素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至600nm吸光度值為1～2時用博大泰克公司提供的超純質(zhì)粒提取試劑盒純化pCMV-YueF質(zhì)粒。
上述LB液體培養(yǎng)基為1升水中溶解蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。
4、抑癌蛋白的表達(dá)與純化1)抑癌蛋白的原核表達(dá)載體的構(gòu)建用BamHI和XhoI兩個內(nèi)切酶將YueF基因從pCMV-YueF質(zhì)粒上切下來并克隆到原核表達(dá)載體pET28a(購于Novagen公司)上得到Y(jié)ueF的原核表達(dá)載體pET28a-YueF，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(購于Novagen公司)篩選陽性克隆并送上海華諾測序證實。
2)抑癌蛋白的制備和純化將上述pET28a-YueF的陽性菌株接種于濃度為50μg/ml的氨芐抗菌素的YT液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至600nm吸光度值為1～2，加入異丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)使其濃度為0.5mol/L誘導(dǎo)，37℃振蕩培養(yǎng)4～6小時，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘收集菌體，超聲破碎1分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS pH7.4)重懸，再12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清取沉淀，如此反復(fù)洗滌5次，即得到純化抑癌蛋白包涵體。
上述YT液體培養(yǎng)基為1升水中溶解蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g。
5、抑癌基因的抑制肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌試驗1)抑癌基因的表達(dá)質(zhì)粒溶液配制將純化好的抑癌基因的表達(dá)質(zhì)粒用滅菌的去離子水配制成0.1μg-1μg/μL溶液。
2)荷瘤裸鼠模型建立選取4～6周齡(體重在18～20克之間)的SPF級裸鼠，用培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG2(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心)或腸癌細(xì)胞CT26(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心)注射裸鼠的背部，細(xì)胞HepG2注射量為6×106個/只。處理過的裸鼠繼續(xù)在SPF條件下飼養(yǎng)2周后，任其注射部位長出腫瘤，形成荷瘤裸鼠。
3)再將荷瘤裸鼠分為2組，每組選6只動物進(jìn)行抑瘤實驗。第一組，將30μg的實驗質(zhì)粒(pCMV-YueF)直接注射到每只荷瘤裸鼠的腫瘤體內(nèi)；第二組，將30μg的對照質(zhì)粒(pCMV-flag-2C)直接注射到每只荷瘤裸鼠的腫瘤體內(nèi)。
4)抑瘤實驗處理后，將荷瘤裸鼠正常飼養(yǎng)并觀察其腫瘤生長情況。在抑瘤實驗處理30天后，殺死荷瘤裸鼠，剝離出腫瘤并稱重，按下列公式計算抑瘤率抑瘤率＝(1-治療組腫瘤重量/對照組腫瘤重量)×100％。結(jié)果見表1。
表1

6、抑癌蛋白的抑制肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌試驗1)抑癌蛋白溶液的配制將純化的抑癌蛋白包涵體溶解在1.5mol/L的尿素溶液中配制成1g/L抑癌蛋白溶液。
2)荷瘤裸鼠模型的建立選取4～6周齡(體重在18～20克之間)的SPF級裸鼠，用培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG2(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心)或腸癌細(xì)胞CT26(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心)注射裸鼠的背部，細(xì)胞HepG2注射量為6×106個/只。處理過的裸鼠繼續(xù)在SPF條件下飼養(yǎng)2周后，任其注射部位長出腫瘤，形成荷瘤裸鼠。
3)抑癌蛋白的抑瘤實驗將荷瘤裸鼠分為2組，每組6只動物進(jìn)行抑瘤實驗。第一組，按荷瘤裸鼠的體重每公斤注射0.1g抑癌蛋白的量將抑癌蛋白直接注射到每只荷瘤裸鼠的腫瘤體內(nèi)；第二組，按荷瘤裸鼠的體重每公斤注射0.1L的尿素溶液直接注射到每只荷瘤裸鼠的腫瘤體內(nèi)作為對照。以后每周注射一次，共注射4次。
4)觀察和結(jié)果抑瘤實驗處理后，將荷瘤裸鼠正常飼養(yǎng)并觀察其腫瘤生長情況。將純化的抑癌基因表達(dá)載體質(zhì)粒和純化的抑癌蛋白配制成一定濃度的制劑，用該制劑直接注射肝細(xì)胞癌和腸癌的裸鼠模型，在正常飼養(yǎng)30天后，殺死荷瘤裸鼠，剝離出腫瘤稱重，并計算抑瘤率，抑瘤率＝(1-治療組腫瘤重量/對照組腫瘤重量)×100％。結(jié)果見表1。
表1

發(fā)明優(yōu)點和效果本發(fā)明提供一種新的抑癌基因和抑癌蛋白，它們能有效抑制肝細(xì)胞癌和直腸癌等腫瘤的生長。其最大的優(yōu)點是抑瘤效率高，特異性強，對正常細(xì)胞無毒性，是極具潛在臨床應(yīng)用價值的生物制劑，為癌癥的有效治療提供了新的藥物和方法。
具體實施例方式
實施例下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)實驗條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，2002)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1.抑癌基因的分離、鑒定及表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和純化1)抑癌基因的克隆引物設(shè)計和合成用乙型肝炎病毒(HBV)的X蛋白(HBx)作為誘餌，通過酵母雙雜交技術(shù)(見參考文獻(xiàn)Jianlin Zhang，Weiguang Zhao，Kailang Wu，Ke Wang，Xue Zhang，Chunfang，Gu，Yan Li，Ying Zhu，andJianguo Wu.(2004).Human hepatitis B virus X protein promotes cellproliferation and inhibits cell apoptosis through interacting with a serine proteaseHepsin.Archive of virology，150(4)，721-741.)，從人的肝細(xì)胞cDNA文庫中篩選出一種與HBx蛋白相互作用的人類蛋白，該蛋白具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。申請人將該蛋白命名為岳飛(YueF)、編碼該蛋白的基因相應(yīng)地命名為yueF。針對該基因設(shè)計一對PCR引物上游引物5’-GCTTAAGCTTCGATGGCTGCAAGTGGCCGAGGTCTC-3’，下游引物5’-CGTTCGGTACCTCTTCCTGGGTCAGAGCTGGTTC-3’，并送大連寶生物合成。
2)抑癌基因PCR擴增以人肝細(xì)胞cDNA文庫作為模板，用合成的一對引物進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)入循環(huán)94℃ 1min，64℃ 1min，72℃ 1.5min 35個循環(huán)；72℃延伸10min。將編碼YueF蛋白的整個開放閱讀筐的DNA片段擴增出來。用1％瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用Qiagen公司提供的DNA純化回收試劑盒純化。
3)抑癌基因克隆和測序?qū)⒒厥盏腄NA片段用HindIII和KpnI兩個酶消化后連于質(zhì)粒pCMV-flag-2C(購自Promega公司)，得到抑癌基因的真核表達(dá)載體pCMV-YueF質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α(華美生物技術(shù)有限公司)，篩選陽性克隆。陽性菌株及其質(zhì)粒保存?zhèn)溆?，并送上海華諾并測序。獲得SEQID NO1所示的核苷酸序列。
實施例2.抑癌蛋白的分離、鑒定1、根據(jù)抑癌基因的核苷酸序列推測抑癌蛋白(YueF蛋白質(zhì))具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列與在GenBank中(登錄號BC0061310)所登錄的人體第10條染色體上的第33個開放閱讀筐(Homo sapienschromosome 10 open reading frame 33)及其編碼的蛋白序列完全相同。
實施例3.抑癌蛋白的制備和純化1)抑癌蛋白的原核表達(dá)載體的構(gòu)建用BamHI和XhoI兩個內(nèi)切酶將YueF基因從pCMV-YueF質(zhì)粒上切下來并克隆到原核表達(dá)載體pET28a(Novagen)上得到Y(jié)ueF的原核表達(dá)載體pET28a-YueF，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(購于Novagen公司)篩選陽性克隆并送上海華諾測序證實2)抑癌蛋白的制備和純化將上述pET28a-YueF的陽性菌株接種于濃度為50μg/ml的氨芐抗菌素的YT液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至600nm吸光度值為1～2，加入異丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)使其濃度為0.5mol/L誘導(dǎo)，37℃振蕩培養(yǎng)4～6小時，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘收集菌體，超聲破碎1分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS pH7.4)重懸，再12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清取沉淀，如此反復(fù)洗滌5次，即得到純化抑癌蛋白包涵體。
上述YT液體培養(yǎng)基為1升水中溶解蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g。
實施例4.抑癌基因的抑瘤試驗1)抑癌基因的表達(dá)質(zhì)粒溶液配制將純化好的抑癌基因的表達(dá)質(zhì)粒用滅菌的去離子水配制成0.1μg-1μg/μL溶液。
2)荷瘤裸鼠模型建立選取4～6周齡(體重在18～20克之間)的SPF級裸鼠，用培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG2(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心)或腸癌細(xì)胞CT26(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心)注射裸鼠的背部，細(xì)胞HepG2注射量為6×106個/只。處理過的裸鼠繼續(xù)在SPF條件下飼養(yǎng)2周后，任其注射部位長出腫瘤，形成荷瘤裸鼠。
3)再將荷瘤裸鼠分為2組，每組選6只動物進(jìn)行抑瘤實驗。第一組，將20μg-30μg的實驗質(zhì)粒(pCMV-YueF)直接注射到每只荷瘤裸鼠的腫瘤體內(nèi)；第二組，將20μg-30μg的對照質(zhì)粒(pCMV-flag-2C)直接注射到每只荷瘤裸鼠的腫瘤體內(nèi)。
4)抑瘤實驗處理后，將荷瘤裸鼠正常飼養(yǎng)并觀察其腫瘤生長情況。在抑瘤實驗處理30天后，殺死荷瘤裸鼠，剝離出腫瘤并稱重，按下列公式計算抑瘤率抑瘤率＝(1-治療組腫瘤重量/對照組腫瘤重量)×100％。結(jié)果見表1。
實施例5.抑癌基因(組合物)的應(yīng)用1)抑癌蛋白溶液的配制將純化的抑癌蛋白包涵體溶解在1.5mol/L的尿素溶液中配制成1g-10g/L抑癌蛋白溶液。
2)荷瘤裸鼠的制備選取12只4～6周齡(體重在18～20克之間)的SPF級裸鼠，用培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG2(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心)或腸癌細(xì)胞CT26(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心)注射裸鼠的背部，細(xì)胞HepG2注射量為6×106個/只。處理過的裸鼠繼續(xù)在SPF條件下飼養(yǎng)2周后，任其注射部位長出腫瘤，形成荷瘤裸鼠。
3)抑癌蛋白的抑瘤實驗將荷瘤裸鼠分為2組，每組6只動物進(jìn)行抑瘤實驗。第一組，按荷瘤裸鼠的體重每公斤注射0.01g抑癌蛋白的量將抑癌蛋白直接注射到每只荷瘤裸鼠的腫瘤體內(nèi)；第二組，按荷瘤裸鼠的體重每公斤注射0.01L的尿素溶液直接注射到每只荷瘤裸鼠的腫瘤體內(nèi)作為對照。以后每周注射一次，共注射4次。
4)觀察和結(jié)果抑瘤實驗處理后，將荷瘤裸鼠正常飼養(yǎng)并觀察其腫瘤生長情況。在抑瘤實驗處理30天后，殺死荷瘤裸鼠，剝離出腫瘤并稱重，按下列公式計算抑瘤率抑瘤率＝(1-治療組腫瘤重量/對照組腫瘤重量)×100％。結(jié)果見表1。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>抑癌蛋白及其基因和用途<130>抑癌蛋白及其基因和用途<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1746<212>DNA<213>大腸桿菌<400>1atggctgcaa gtggccgagg tctctgcaag gctgtggccg cctctccctt cccggcgtgg60agacgagata acacggaagc caggggaggt ctgaagcctg agtatgatgc ggtggtgata120ggagcaggac acaacggact ggtggctgca gcgtacctgc agagactggg ggtgaacacc180gccgtcttcg agaggcgcca tgtgatcggg ggtgcagctg tcactgagga gatcatccca240gggtttaagt tctcccgtgc gtcctacctg ctcagcctgc tgaggccgca gatttacact300gatctggagc tgaagaaaca tgggctgagg cttcatcttc gaaaccccta ctccttcacc360cccatgctgg aagagggtgc aggcagcaag gtgcccaggt gccttctgct gggcacagac420atggcagaaa accagaagca gatcgcccag ttctcccaga aggatgccca ggtctttccc480aaatatgagg agttcatgca tcgcttggca ttagccattg accctctgct ggatgcggcc540cccgtggaca tggcggcctt ccagcatggc tccttgctgc aaaggatgag gtcgctctcc600accctcaagc ccctgctgaa ggcaggccgc atcctgggag cccagcttcc ccgatattat660gaggtcctca cagctcccat taccaaggtg ctggatcagt ggttcgagtc tgagccttta720aaagccactc tagccacaga tgcagtgatt ggagccatga caagtcccca cactccgggg780agtgggtatg tgctgctgca ccatgtgatg gggggcctgg agggaatgca gggggcctgg840ggctacgtcc aggggggcat gggtgccctc tctgatgcga tcgcaagctc agccaccaca900catggagcaa gcatcttcac tgaaaagaca gtggcgaagg tgcaggtgaa cagtgaaggc960tgtgttcaag gagttgtgct ggaagatggc acagaggtga gaagcaaaat ggtgctgtcc1020aacacatcac cgcagatcac cttcctgaag ctgacgccac aggagtggct tcctgaggag1080ttcctggaga gaatctctca gctggacacc cggtcgcctg tcaccaagat caatgtggcc1140gtagacaggc tgcccagctt cctggcggcc cccaatgctc ccaggggcca gccgctgccc1200catcaccaat gctccatcca cctgaactgt gaagacaccc tcctccttca tcaggccttt1260gaagatgcca tggatggcct gtcttcccac aggcctgtga ttgagctctg catcccttcc1320tcgctggacc ccaccctggc tccccctggc tgccatgtag tctccctctt cactcagtac1380acgccctata cgctggctgg aggcaaggcc tgggacgagc aggagagaga cgcttatgca1440gacagagtgt ttgattgcat cgaggtctat gcccctggct tcaaggactc tgtggttggc1500agagacatcc tcacaccacc agatttggag agaatcttcg ggcttcctgg agggaacata1560ttccactgcg ccatgtccct ggaccagctc tacttcgccc gccccgtgcc cctgcattct1620ggctaccgct gccctctcca gggcctgtat ctctgtggaa gtggggctca tcctggagga1680ggtgtgatgg gagctgctgg gcgaaatgca gcacatgtgg cctttaggga cctcaagagc1740atgtga 1746<210>2<211>581
<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2Met Ala Ala Ser Gly Arg Gly Leu Cys Lys Ala Val Ala Ala Ser Pro1 5 10 15Phe Pro Ala Trp Arg Arg Asp Asn Thr Glu Ala Arg Gly Gly Leu Lys20 25 30Pro Glu Tyr Asp Ala Val Val Ile Gly Ala Gly His Asn Gly Leu Val35 40 45Ala Ala Ala Tyr Leu Gln Arg Leu Gly Val Asn Thr Ala Val Phe Glu50 55 60Arg Arg His Val Ile Gly Gly Ala Ala Val Thr Glu Glu Ile Ile Pro65 70 75 80Gly Phe Lys Phe Ser Arg Ala Ser Tyr Leu Leu Ser Leu Leu Arg Pro85 90 95Gln Ile Tyr Thr Asp Leu Glu Leu Lys Lys His Gly Leu Arg Leu His100 105 110Leu Arg Asn Pro Tyr Ser Phe Thr Pro Met Leu Glu Glu Gly Ala Gly115 120 125Ser Lys Val Pro Arg Cys Leu Leu Leu Gly Thr Asp Met Ala Glu Asn130 135 140Gln Lys Gln Ile Ala Gln Phe Ser Gln Lys Asp Ala Gln Val Phe Pro145 150 155 160Lys Tyr Glu Glu Phe Met His Arg Leu Ala Leu Ala Ile Asp Pro Leu165 170 175Leu Asp Ala Ala Pro Val Asp Met Ala Ala Phe Gln His Gly Ser Leu180 185 190Leu Gln Arg Met Arg Ser Leu Ser Thr Leu Lys Pro Leu Leu Lys Ala195 200 205Gly Arg Ile Leu Gly Ala Gln Leu Pro Arg Tyr Tyr Glu Val Leu Thr210 215 220Ala Pro Ile Thr Lys Val Leu Asp Gln Trp Phe Glu Ser Glu Pro Leu225 230 235 240Lys Ala Thr Leu Ala Thr Asp Ala Val Ile Gly Ala Met Thr Ser Pro245 250 255His Thr Pro Gly Ser Gly Tyr Val Leu Leu His His Val Met Gly Gly260 265 270Leu Glu Gly Met Gln Gly Ala Trp Gly Tyr Val Gln Gly Gly Met Gly275 280 285Ala Leu Ser Asp Ala Ile Ala Ser Ser Ala Thr Thr His Gly Ala Ser290 295 300Ile Phe Thr Glu Lys Thr Val Ala Lys Val Gln Val Asn Ser Glu Gly305 310 315 320Cys Val Gln Gly Val Val Leu Glu Asp Gly Thr Glu Val Arg Ser Lys
325 330 335Met Val Leu Ser Asn Thr Ser Pro Gln Ile Thr Phe Leu Lvs Leu Thr340 345 350Pro Gln Glu Trp Leu Pro Glu Glu Phe Leu Glu Arg Ile Ser Gln Leu355 360 365Asp Thr Arg Ser Pro Val Thr Lys Ile Asn Val Ala Val Asp Arg Leu370 375 380Pro Ser Phe Leu Ala Ala Pro Asn Ala Pro Arg Gly Gln Pro Leu Pro385 390 395 400His His Gln Cys Ser Ile His Leu Asn Cys Glu Asp Thr Leu Leu Leu405 410 415His Gln Ala Phe Glu Asp Ala Met Asp Gly Leu Ser Ser His Arg Pro420 425 430Val Ile Glu Leu Cys Ile Pro Ser Ser Leu Asp Pro Thr Leu Ala Pro435 440 445Pro Gly Cys His Val Val Ser Leu Phe Thr Gln Tyr Thr Pro Tyr Thr450 455 460Leu Ala Gly Gly Lys Ala Trp Asp Glu Gln Glu Arg Asp Ala Tyr Ala465 470 475 480Asp Arg Val Phe Asp Cys Ile Glu Val Tyr Ala Pro Gly Phe Lys Asp485 490 495Ser Val Val Gly Arg Asp Ile Leu Thr Pro Pro Asp Leu Glu Arg Ile500 505 510Phe Gly Leu Pro Gly Gly Asn Ile Phe His Cys Ala Met Ser Leu Asp515 520 525Gln Leu Tyr Phe Ala Arg Pro Val Pro Leu His Ser Gly Tyr Arg Cys530 535 540Pro Leu Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Gly Ser Gly Ala His Pro Gly Gly545 550 555 560Gly Val Met Gly Ala Ala Gly Arg Asn Ala Ala His Val Ala Phe Arg565 570 575Asp Leu Lys Ser Met580
權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一種分離的基因，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一種分離的蛋白質(zhì)在制備治療或預(yù)防肝細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用。
4.一種分離的蛋白質(zhì)在制備治療或預(yù)防結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。
5.一種分離的基因在制備治療或預(yù)防肝細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用。
6.一種分離的基因在制備治療或預(yù)防結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑癌蛋白及其基因和用途，該蛋白以及基因可有效地抑制肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌的生長，以及在制備治療或預(yù)防結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明抑瘤效率高，特異性強，對正常細(xì)胞無毒性，是極具潛在臨床應(yīng)用價值的生物制劑，為癌癥的有效治療提供了新的藥物和方法。
文檔編號A61K48/00GK1876681SQ20061001914
公開日2006年12月13日 申請日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日
發(fā)明者吳建國, 鄔開朗, 朱應(yīng), 章曉聯(lián), 劉芳, 張建林, 黃靜, 思維, 馬云峰, 徐伊琳 申請人:武漢大學(xué)