專利名稱：桑葉總黃酮的治療用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及桑葉總黃酮的用途。
背景技術：
胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是亞細胞、細胞、組織或機體的一種病理生理狀態(tài)，經(jīng)典定義是指需要超過正常量的胰島素始能在胰島素的效應器官產(chǎn)生正常的生理效應，現(xiàn)代的胰島素抵抗概念則泛指胰島素在周圍組織攝取和清除葡萄糖的作用減低。胰島素的主要靶器官是肝臟、骨骼肌及脂肪組織，主要生理效應包括其介導的葡萄糖的攝取及處理(糖的氧化及貯存)，促進蛋白質(zhì)和脂肪合成，抑制糖異生，抑制脂肪分解和酮體生成等。胰島素抵抗是2型糖尿病的重要病因和顯著特征。它也在糖耐量異常、肥胖、高血壓、異常脂質(zhì)血癥、動脈粥樣硬化等的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。臨床工作中常見到上述造成心、腦血管疾病的多種危險因素集聚于一個個體的狀態(tài)，將這種狀態(tài)稱為代謝綜合征或胰島素抵抗綜合征。醫(yī)學界已把伴有胰島素抵抗的糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、腦卒中稱為“死亡五重奏”，這可怕的五重奏可能是21世紀威脅人類健康與生命安全的頭號殺手。因此，改善胰島素抵抗或增加胰島素敏感性的藥物學研究具有重要的臨床意義。近來直接針對提高胰島素敏感性或改善胰島素抵抗的藥物的應用倍受關注，目前首推胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物。經(jīng)體內(nèi)、外實驗研究證實，該類藥能提高肌、脂肪細胞對葡萄糖的攝取及利用，抑制肝葡萄糖輸出，這類藥物的臨床應用在2型糖尿病的治療史上具有重要意義。但是此類藥物具有不同程度的肝臟毒性(如曲格列酮有導致肝壞死的報道)和其它不良反應，如水腫、腹瀉、上呼吸道感染、體重增加、頭痛、頭暈、心衰危險等。且由于上市不久，其安全性尚有待進一步臨床考驗。
桑葉為?？浦参锷５娜~，其藥用價值最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，桑葉性寒、味苦，歸肺、肝經(jīng)，具有祛風清熱、涼血明目等功效。《本草經(jīng)疏》記載桑葉性味苦、甘、寒，甘所以益血，寒所以涼血，甘寒結(jié)合，故下氣而益陰，又能明目而止咳，有補益之功?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，桑葉含有黃酮、多糖、生物堿等多種成分，它具有抗凝、降血壓、降血脂、降血糖、抑菌、抗腫瘤、延緩衰老等多種作用。
Claudia等發(fā)現(xiàn)多種天然藥物中黃酮類化合物有抗糖尿病作用。最近研究發(fā)現(xiàn)桑葉總黃酮可以降低四氧嘧啶糖尿病大鼠的血糖水平，但其降糖機理尚不明確。此外，研究表明桑葉總黃酮及其成分如蕓香苷、槲皮素、異槲皮素、二氫山茶等還具有抗氧化、降血漿膽固醇、降血壓、抗炎、解痙、抗?jié)?、抑制蛋白非酶促糖基化等作用，但尚未見其改善胰島素抵抗的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供桑葉總黃酮在制藥中的新用途。
本發(fā)明的技術方案是桑葉總黃酮具有作為治療胰島素抵抗藥物的作用。
桑葉總黃酮從中藥桑葉中提取，將其用于治療胰島素抵抗，即口服桑葉總黃酮以治療胰島素抵抗，其劑量為700mg桑葉總黃酮/日，每日分兩次口服，桑葉總黃酮可以制成膠囊、片劑或顆粒劑等藥劑學上所說的各種口服劑型。
本發(fā)明治療胰島素抵抗有其優(yōu)越性，其能夠改善胰島素抵抗所致的血糖升高，具有顯著改善胰島素抵抗的效果，也具有增加2型糖尿病患者胰島素敏感性的作用。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，以下用桑葉總黃酮的體內(nèi)實驗和體外實驗研究結(jié)果來說明其在改善胰島素抵抗中的功效作用。
1、桑葉總黃酮改善實驗性2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗1.1動物及分組處理清潔級近交系雄性4周齡Wistar大鼠，體重180-190g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，適應性喂養(yǎng)2周，明暗周期為12小時，室溫控制在22-28℃，隨機分成四組A組(正常對照組)喂以常規(guī)飼料，B組(模型對照組)、C組(治療組)及D組(陽性藥物對照組)喂以高脂膳食。高脂膳食配方脂肪熱比為59％(其中豬油占39％)，蛋白質(zhì)熱比為21％(其中酪蛋白占31％)，碳水化合物熱比為20％(其中玉米淀粉占30％)，此外附加必需維生素及礦物質(zhì)。每只大鼠每天供給的總熱量約310kJ，與正常對照組大鼠自由進食攝取的能量基本相同。高脂飲食一個月后，B、C、D三組大鼠按25mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，復制出2型糖尿病大鼠模型。于STZ注射后第三個月起，C組開始喂飼桑葉總黃酮(100mg/kg劑量灌胃，以蒸餾水溶解配制)，D組喂飼吡格列酮(20mg/kg劑量灌胃)，A、B組給予等體積生理鹽水灌胃作為對照，每日一次，連續(xù)6周。
1.2方法1.2.1胰島素抑制試驗實驗時，大鼠過夜禁食。以1％戊巴比妥鈉按20mg/kg劑量麻醉，在大鼠右頸動脈和左頸靜脈分別置入PE50導管，40U/ml肝素鹽水管內(nèi)保留抗凝。手術完成麻醉清醒后2小時，在可以自由活動狀態(tài)下，以微量注射儀從頸靜脈中以20ul/min的體積持續(xù)灌注葡萄糖(0.22mmol/kg/min)、胰島素(30mmol/kg/min)和生長抑素(920pmol/kg/min)共150min。灌注液以0.5％BSA生理鹽水配制。
在該實驗條件下，持續(xù)灌注30-60min后，血中葡萄糖及胰島素水平達到穩(wěn)態(tài)平衡。以灌注90、120和150min時3點血糖及胰島素平均值作為穩(wěn)態(tài)血糖(steady-state plasma glucose，SSPG)、穩(wěn)態(tài)胰島素(steady-state plasmainsulin，SSPI)值，以衡量胰島素敏感性的程度。
1.2.2高胰島素正常血糖鉗夾技術(簡稱鉗夾試驗)按上述方法在大鼠右頸動脈和左頸靜脈分別置入PE50導管。將準備好的大鼠頸靜脈導管接上三通管的一端，三通管的另兩端分別接上輸注胰島素或葡萄糖的輸液管。頸動脈導管則接一裝有肝素生理鹽水(濃度為40U/ml)的注射器，每10min推動1次注射器沖洗導管，以保證導管通暢。靜置30min后，將連接頸動脈導管的注射器取下，取血1滴，用One Touch II微型血糖儀測定基礎血糖值。然后以恒定的速度(10mU/kg/min)輸注胰島素(丹麥諾和諾得公司產(chǎn)品，濃度為40U/ml，用生理鹽水稀釋，使用前新鮮配制)。以后每5min測定血糖1次。當血糖低于5mmol/L時開始輸注10％葡萄糖。調(diào)整葡萄糖輸注速率使血糖控制在4.5-5.5mmol/L水平。60min后，當連續(xù)三次血糖值均在上述范圍時，即認為達到了穩(wěn)定狀態(tài)。計算血糖維持在4.5-5.5mmol/L穩(wěn)態(tài)時的葡萄糖輸注率(GIR)。
1.3結(jié)果1.3.1桑葉總黃酮對2型糖尿病大鼠空腹血糖和血漿胰島素的影響(見表1)桑葉總黃酮喂食后，C組無論是空腹血糖還是血漿胰島素都要比B組明顯降低；藥物干預后，C組和D組血糖及血漿胰島素比較，均無顯著性差異(p＞0.05)。
1.3.2桑葉總黃酮對2型糖尿病大鼠胰島素抑制試驗SSPG、SSPI的影響(見表2)胰島素抑制試驗結(jié)果顯示，C組、D組的SSPG、SSPI均明顯低于B組(P均＜0.05)；C組與D組比較無論是SSPG還是SSPI均無顯著性差異(p＞0.05)。
1.3.3桑葉總黃酮對2型糖尿病大鼠鉗夾試驗葡萄糖輸注率的影響(見表3)鉗夾試驗結(jié)果顯示，C組、D組的GIR均顯著高于B組(p均＜0.05)；C組與D組比較GIR無顯著性差別(p＞0.05)。
1.4結(jié)論①本研究通過高脂膳食加小劑量STZ腹腔注射可成功復制出具有胰島素抵抗特征的2型糖尿病模型(B組的GIR顯著低于A組)。
②桑葉總黃酮可減輕胰島素抵抗模型大鼠的高胰島素血癥，提示桑葉總黃酮可改善胰島β細胞的代償性高分泌狀態(tài)，并能增加胰島素轉(zhuǎn)運的效率，從而一方面改善胰島素抵抗所致的血糖升高，另一方面降低血漿胰島素水平。
③桑葉總黃酮能明顯改善胰島素抵抗和增加胰島素敏感性。
④桑葉總黃酮與吡格列酮具有相似的增加胰島素敏感性的效果。
2、桑葉總黃酮改善胰島素抵抗HepG2細胞模型的胰島素抵抗。
2.1建立IR的HepG2細胞模型及實驗細胞分組2.1.1HepG2肝癌細胞的培養(yǎng)。HepG2肝癌細胞由重慶醫(yī)科大學超聲研究所提供，按常規(guī)方法培養(yǎng)，用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。消化液采用胰蛋白酶、EDTA消化液，胰蛋白酶終濃度為0.125％，用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞濃度至1×106/ml。
2.1.2胰島素抵抗HepG2肝癌細胞模型復制將培養(yǎng)的HepG2肝細胞懸液用4℃DMEM培養(yǎng)液(含30％小牛血清，50μg/ml青霉素，50U/ml鏈霉素，2mmol/l谷氨酸，12mmol/l碳酸氫鈉及25mmol/l葡萄糖)洗滌一次，以滅活膠原酶，然后用不含小牛血清的DMEM(其余成分同上，且以后使用的培養(yǎng)液均同此)洗滌兩次以除去血清蛋白。將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，并用培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)至1.5×106/2ml為宜。經(jīng)37℃，5％CO2至少孵育5h，再用培養(yǎng)液洗滌一次。然后加入1ml新配制的含有或不含有5×10-7mol/L人胰島素的培養(yǎng)液(不加胰島素者為對照)于37℃，5％CO2孵育16h，再用不含胰島素的培養(yǎng)液洗滌2次，共20min。
2.1.3實驗細胞分組將培養(yǎng)板中的細胞隨機分成下列幾組正常對照組細胞常規(guī)培養(yǎng)未加任何處理藥物加對照組常規(guī)培養(yǎng)加藥物桑葉總黃酮100μg/ml；模型對照組IR HepG2肝癌細胞未加任何處理；模型處理組IR HepG2肝癌細胞加藥物桑葉總黃酮100μg/ml。
2.2方法2.2.1細胞的葡萄糖攝取率的檢測及IR HepG2肝癌細胞模型鑒定2.2.1.1IR HepG2肝癌細胞模型鑒定采用3H-D-葡萄糖摻入實驗即葡萄糖攝取率評價細胞的胰島素敏感性，按文獻進行。將經(jīng)過16小時孵育的細胞加入1ml DMEM培養(yǎng)液(分別含Ong/ml，10ng/ml，100ng/ml人胰島素)于37℃預孵育半小時，然后加入3H-D-葡萄糖(3μCi/ml培養(yǎng)液)于37℃，5％CO2條件下孵育1小時，并通過加入冰冷的磷酸緩沖液快速洗滌細胞以終止反應。細胞用0.5ml、20％KOH融解后，轉(zhuǎn)移至玻璃試管中。取出100μl細胞融解液測定蛋白質(zhì)濃度。向玻璃試管中加入2倍體積冷乙醇(660μl/ml)溶液洗滌兩次。離心后棄去上清液，將沉淀物(糖原)倒置沉積在直徑2厘米的濾紙片上。濾紙片經(jīng)4℃，660μl/ml乙醇攪拌洗滌四次，共3h。將濾紙片烤干后，置于10ml閃爍液中用液體閃爍儀測定放射性計數(shù)。
2.2.1.2細胞的葡萄糖攝取率的檢測根據(jù)3H-D-葡萄糖的比放射性，細胞融解液的蛋白質(zhì)濃度及糖原的放射性計數(shù)，可計算出3H-D-葡萄糖摻入率，單位為nmol葡萄糖/mg蛋白質(zhì)/h。
2.2.2殘余125I-胰島素結(jié)合率測定將各組細胞分別置于含10-7mol/L胰島素的DMEM培養(yǎng)液中孵育24h。棄培養(yǎng)液，于4℃條件下，用預冷的PH4.0的DMEM培養(yǎng)液及0.01mol/L PBS分別沖洗5次。每孔中加2ml含3uCi125I-胰島素的DMEM培養(yǎng)液，4℃孵育3h。棄培養(yǎng)液用0.01mol/L PBS沖洗5次，每孔中加入0.25％胰酶1ml，室溫消化25min，用含15％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止反應。吹打細胞并移入測試管中，用1ml PBS洗5次，洗液一并加入測試管中，2000rpm離心10min。棄上清，測沉淀放射計數(shù)。用10-7mol/L胰島素與125I胰島素競爭結(jié)合后的殘余125I-胰島素結(jié)合量作為非特異性結(jié)合。未用胰島素刺激的HepG2細胞殘余125I-胰島素結(jié)合量作為對照。
2.3結(jié)果2.3.1實驗各組HepG2細胞殘余125I-胰島素結(jié)合率的比較(見表4)高于生理濃度(10-7mol/L)的胰島素刺激24小時后，模型對照組HepG2細胞殘余125I-胰島素結(jié)合率明顯低于正常對照組(p＜0.01)，提示胰島素抵抗的HepG2細胞模型復制成功。模型處理組HepG2細胞殘余125I-胰島素結(jié)合率明顯高于模型對照組(p＜0.05)。
2.3.2實驗各組HepG2細胞的3H-D-葡萄糖摻入率的比較(見表5)由表5可見，在培養(yǎng)液中加入胰島素后，模型對照組HepG2細胞的葡萄糖摻入率在各種濃度的胰島素刺激下，均顯著低于正常對照組細胞，提示IR細胞模型復制或建立成功。在不同濃度胰島素刺激下，模型處理組HepG2細胞的葡萄糖攝取率均明顯高于模型對照組。
2.4結(jié)論
①利用高胰島素培養(yǎng)HepG2細胞可成功誘導胰島素抵抗細胞模型。
胰島素抵抗最主要的特征是胰島素刺激的葡萄糖攝取和利用障礙，因此利用3H-D-葡萄糖摻入實驗檢測細胞的葡萄糖攝取率，可以較準確地評價細胞的胰島素敏感性，從而判斷是否存在胰島素抵抗。胰島素受體數(shù)目減少和受體后缺陷是導致肝細胞胰島素抵抗的主要原因。
②桑葉總黃酮能增加胰島素抵抗細胞的葡萄糖攝取率，即能促進葡萄糖轉(zhuǎn)運活動(轉(zhuǎn)化為糖原)從而增加胰島素敏感性，減輕細胞胰島素抵抗。
③桑葉總黃酮能提高胰島素抵抗HepG2細胞的125I-胰島素結(jié)合率，即可增加細胞表面胰島素受體數(shù)目，提示桑葉總黃酮可改善胰島素抵抗和增加胰島素敏感性。
具體實施例方式
方式一按本領域技術人員公知的技術方法制備桑葉總黃酮顆粒劑取桑葉總黃酮200g，以改性淀粉微晶纖維素為填充劑，以甲基纖維素作為粘合劑，制粒，干燥，整粒，分裝成350mg/包，包裝即得。
方式二按本領域技術人員公知的技術方法制備桑葉總黃酮膠囊劑取桑葉總黃酮200g，以改性淀粉微晶纖維素為填充劑，以甲基纖維素作為粘合劑，制粒，干燥，整粒，分裝成350mg/囊，包裝即得。
方式三按本領域技術人員公知的技術方法制備桑葉總黃酮片劑取桑葉總黃酮200g，以改性淀粉微晶纖維素為填充劑，以甲基纖維素作為粘合劑，制粒，干燥，整粒，壓片，350mg/片，包裝即得。
表1治療后各組空腹血糖及血漿胰島素水平的比較

注與B組比較*p＜0.05；**p＜0.01
表2治療后各組胰島素抑制試驗SSPG及SSPI的比較

注與B組比較*p＜0.05；**p＜0.01表3治療后各組鉗夾試驗葡萄糖輸注率的比較

注與B組比較*p＜0.05；**p＜0.01表4實驗各組HepG2細胞125I-胰島素結(jié)合率的比較

注與模型對照組比較，*p＜0.05；**p＜0.01表5實驗各組HepG2細胞3H-D-葡萄糖攝取率的比較

注與模型對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01葡萄糖攝取率的單位為nmol葡萄糖/mg蛋白質(zhì)/h
權(quán)利要求
1.桑葉總黃酮的治療用途，其特征在于桑葉總黃酮具有作為治療胰島素抵抗藥物的作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及桑葉總黃酮的治療用途。本發(fā)明的特征在于桑葉總黃酮具有作為治療胰島素抵抗藥物的作用。根據(jù)體內(nèi)實驗和體外實驗的研究結(jié)果表明，桑葉總黃酮治療胰島素抵抗有其優(yōu)越性，其可以改善胰島素抵抗所致的血糖升高，具有顯著改善胰島素抵抗的效果，也具有增加2型糖尿病患者胰島素敏感性的作用，并且毒性低，副作用小，使用安全。
文檔編號A61K127/00GK101032552SQ20061002042
公開日2007年9月12日 申請日期2006年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月6日
發(fā)明者陳秋 申請人:陳秋