專利名稱：一種低分子量肝素鈉及其親和層析制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種低分子肝素鈉(LMWH)及其制備方法，特別是，公開了一種低分子肝素鈉(LMWH)及其酶解親和層析制備方法。
背景技術(shù)：
肝素鈉(heparin)是廣泛存在于動(dòng)物器官(如牛、羊的小腸黏膜及肺組織等)的一種葡萄胺聚糖，具有抗凝、抗過敏、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)血脂等多種生物學(xué)功能，但長期使用會(huì)有許多負(fù)面影響，如出血和誘導(dǎo)血小板減少等。低分子量肝素鈉(Low Molecular Weight Heparin，LMWH)是一種天然的抗凝血和抗血栓藥物，是普通肝素鈉(heparin)的衍生物，是分離普通肝素鈉得到的一組分。在應(yīng)用中，克服了出血和誘導(dǎo)血小板減少的負(fù)面影響。是近十年來深受醫(yī)藥界關(guān)注的新一代肝素鈉類抗血栓藥物，具有抗血栓作用優(yōu)于肝素鈉，抗凝血作用低于肝素鈉，生物利用度高，體內(nèi)半衰期長，出血傾向小，服用后易吸收等特點(diǎn)，為今后取代肝素鈉的一種新生物制品。
本發(fā)明產(chǎn)品采用通過清真宰牲的牛羊腸黏膜為基礎(chǔ)原料，適合于在中東及穆斯林國家銷售及使用，為穆斯林國家及世界各國醫(yī)藥界十分需求的制品。
本產(chǎn)品的制造工藝采用以清真牛羊腸黏膜為主要原料生產(chǎn)的粗制肝素鈉，然后再進(jìn)行生物酶的解聚和親和層析的純化。國內(nèi)外報(bào)道低分子肝素鈉生產(chǎn)大多采用精品肝素鈉，本發(fā)明起始原料為粗制肝素鈉，降低了工業(yè)成本，提高了收率，穩(wěn)定了質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種低分子肝素鈉，在工藝技術(shù)上，克服現(xiàn)有技術(shù)大多采用化學(xué)降解，造成產(chǎn)品殘留毒素及分子量均一性差、生產(chǎn)成本高、工業(yè)化生產(chǎn)條件繁瑣的缺陷.本發(fā)明采用生物酶降解低分子肝素鈉后，利用親和層析技術(shù)專一分離出具有較高生物活性物質(zhì)的(溶血栓特性的)低分子量肝素鈉片段，得到了一種純度大于80％以上的低分子肝素鈉。
本發(fā)明的另一目的是提供了一種低分子肝素鈉的酶解聚后親和層析制備方法，在原料選擇上，不采用豬腸黏膜為主原料，而是采用源于清真牛羊腸黏膜的粗品肝素鈉為主要原料，既適應(yīng)了向穆斯林國家的醫(yī)藥界供應(yīng)藥用原料的渠道，又降低了成本；并且采用生物酶降解及親和層析分離純化技術(shù)，工藝簡單、無殘留毒素、無三廢污染。
——本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明公開了一種低分子肝素鈉，具有平均分子量在3500-4000之間，低分子量的含有量在80％-85％。溶血栓生物活性每毫克在100-125國際單位之間，同時(shí)Fxa與FIIa的比值在3.0-4.0之間的一種新穎的低分子肝素鈉，是一種高效、低副作用、抗Fxa半衰期長、生物利用度高、用途廣泛的低分子肝素鈉。本發(fā)明還公開了一種低分子肝素鈉的酶解親和層析制備方法，采用源于牛羊腸黏膜(清真)的粗品肝素鈉為主要原料，并用生物酶和親和層析分離純化，獲得低分子肝素鈉。本制備方法簡單、成本、易操作、無三廢，收率大于80％。
本發(fā)明還公開了一種低分子肝素鈉的酶解聚后親和層析制備方法，依次包括如下步驟(1)以來源于牛羊(清真)腸黏膜的低分子肝素鈉為主要原料，用木瓜酶進(jìn)行酶解；
(2)所得酶解加入抗凝血酶(Fxa抑制劑)，常溫靜置后迅速冷卻至5℃-10℃；(3)將所得酶解液調(diào)至PH7.4±0.1后，通過伴刀豆球蛋白sephrose親和層析柱，收集下柱流出液；(4)所得下柱流出液繼續(xù)冷卻至3℃，調(diào)至PH1.7-1.9，靜置后過濾收集清液；(5)所得清液調(diào)至-11后，加入過氧化氫，升溫至25℃，保溫24小時(shí)；(6)次日用出菌板壓濾收集清液；(7)清液加入無菌、無內(nèi)毒素的藥用乙醇，攪拌后靜置過夜；(8)次日離心收集沉淀物，脫水后，進(jìn)入真空干燥36小時(shí)，即得低分子肝素鈉成品。
本發(fā)明對(duì)來源于牛羊?yàn)樵系拇制犯嗡剽c(heparin)，采用木瓜蛋白酶(papain)，來源于caricapapara公司0.2-0.4U/mg裂解。加入自制抗凝血酶(fxa抑制劑)，孵育30分鐘。通過刀豆球蛋白sephrose親和層析柱收集穿過峰，酸化、堿化除菌后真空干燥得專一分子量的低分子量肝素鈉精品(一)工藝路線肝素鈉粗品(從?；蜓蛑蝎@得)→(木瓜酶)酶解→酶解液→加入抗凝血↑ ↑↑(80-100u/mg SH) (0.2-0.4u/mg) 從牛血中提取酶(自制)37℃孵育30分鐘→過刀豆球蛋白→sephrose親和析柱→收集穿過峰→酸化、堿化→無菌過濾→真空干燥→低分子肝素鈉精品(二)工藝過程(按以下次序進(jìn)行)1、將從清真宰牲場取出的牛羊腸黏膜制成每毫克含有普通肝素鈉效價(jià)為80單位-100單位的粗制品，按重量10倍量加入含有1％氯化鈉的純水中，不斷攪拌使其全部溶解，再繼續(xù)攪拌1小時(shí)，用布氏漏斗過濾的清液。
2、清液用2當(dāng)量氫氧化鈉調(diào)PH7.8-8.8，然而在不斷攪拌中加入木瓜酶(每百萬單位粗品肝素鈉加入1000毫克木瓜酶)，緩緩升溫至40℃-45℃，保溫26小時(shí)。
3、酶解液經(jīng)過布氏漏斗過濾后，用2當(dāng)量鹽酸調(diào)PH至6.5-6.8，然后再不斷攪拌下加入抗凝血酶(fxa抑制劑)，(每百萬單位粗品肝素鈉加入250毫克fxa抑制劑)，37℃保溫靜置30分鐘，(fxa抑制劑活力2500U/mg)。
4、加入fxa抑制劑的酶液，迅速置于5℃冷室中，使其冷卻至5℃-10℃后調(diào)整PH7.4±0.1后，通過刀豆球蛋白sehrose親和層析柱，流速為60me/cm2/分。(凝膠柱體積為每千萬單位粗品肝素鈉0.75升)。收集下柱流出峰(LMWH在230nm處有一特定吸收值)。
5、收集下柱流出液，繼續(xù)冷卻至3℃，用2當(dāng)量鹽酸調(diào)PH1.7-1.9，產(chǎn)生乳白色的沉淀物，靜置30分鐘，即用布氏漏斗真空過濾收集清液。
6、清液用5當(dāng)量氫氧化鈉調(diào)PH至11后，加入3％過氧化氫，升溫至25℃，保溫24小時(shí)(若PH降至9以下，須不斷調(diào)整至11左右)。
7、次日用除菌板框壓濾收集清液。
8、清液加入無菌、無內(nèi)毒素的藥用乙醇(每升清液用0.85升乙醇)攪拌15分鐘后，靜置過夜。
9、次日虹吸廢乙醇，離心收集沉淀物，用無水乙醇脫水2-3次后，進(jìn)入真空干燥箱干燥36小時(shí)即得低分子肝素鈉成品。
10、成品按EP2002版進(jìn)行全項(xiàng)化驗(yàn)。
本發(fā)明成功地用牛羊腸黏膜為起始原料的粗品肝素鈉，采用木瓜酶進(jìn)行解聚，然后通過刀豆球蛋白sephrose親和層析柱純化所得的低分子肝素鈉成品，經(jīng)藥品測(cè)試中心的檢測(cè)，低分子肝素鈉的溶血栓(Fxa)因子活力單位穩(wěn)定在100-125國際單位/每毫克?？鼓?FIIa)的活力單位在25-50國際單位/每毫克。平均分子量3500-5500范圍內(nèi)，占總產(chǎn)品的68-88％之間。本發(fā)明成品Fxa與FIIa的比值在3.0-4.0之間，最終產(chǎn)品可達(dá)到無菌、無內(nèi)毒素的注射規(guī)格。
低分子肝素鈉是一類很有前途的抗血栓藥物，在歐洲有取代肝素鈉之勢(shì)。本發(fā)明制造的低分子肝素鈉為高效、低副作用、抗Fxa半衰期長、生物利用度高。低分子肝素鈉一般以它的納鹽、鉀鹽或者鈣鹽存在。
實(shí)施例1稱取用羊腸黏膜為起始原料的肝素鈉鈉粗品1億單位(單位效價(jià)為每毫克120國際單位)1.2公斤加入12升純水，再加入氯化鈉100克，不斷攪拌，使其溶解。攪拌1-2小時(shí)，用布氏漏斗，真空過濾，得清液約11.8升，用2當(dāng)量氫氧化鈉(約25毫升)調(diào)PH7.9，加入100克木瓜酶攪拌，使其溶解，并逐漸升溫到40℃-42℃。保溫26小時(shí)(每小時(shí)攪拌10分鐘)，用布氏漏斗，真空過濾后，用2當(dāng)量鹽酸調(diào)PH6.8，加入抗凝血酶(Fxa抑制劑)因子25克，使溫度保持37℃(30分鐘)。溶解后，經(jīng)過布氏漏斗過濾，得清液12.5升，迅速置于5℃冷室中，使其冷卻到6℃±1℃。調(diào)PH到7.4±0.1后，通過直徑2.2cm的內(nèi)含半刀斗球蛋白sephhrose親和層析柱1.5升(流速3me/cm2/分鐘)用紫光監(jiān)測(cè)儀在波長230nm收集下柱流出峰，共計(jì)7.6升。冷卻到1℃-3℃，用2當(dāng)量鹽酸調(diào)PH1.9，溶液產(chǎn)生乳白色沉淀物靜置30分鐘后，即用布氏漏斗真空過濾，收集清液，不間斷地用2當(dāng)量氫氧化鈉調(diào)PH至11.0±0.1，加入3％過氧化氫升溫至25℃，保溫24小時(shí)。第二天用除菌板，真空布氏漏斗無菌過濾，收集純清液8升。加入預(yù)先備好-10℃ 95％藥用乙醇6.8升，攪拌25分鐘，靜置過夜。第二天，虹吸出廢乙醇，離心收集沉淀物，用無水乙醇脫水3次后進(jìn)入真空干燥箱真空干燥36小時(shí)，得LMWH成品682克。經(jīng)化驗(yàn)Fxa活力單位為每毫克119.25國際單位，F(xiàn)IIa活力單位為每毫克33國際單位，F(xiàn)xa比FIIa的比值3.61，平均分子量3800。2000-8000分子量占總83％，產(chǎn)品質(zhì)量經(jīng)EP2002版全項(xiàng)化驗(yàn)合格，收率81.33％。
實(shí)施例2稱取用牛羊腸黏膜為起始原料的肝素鈉鈉粗品10億單位(單位效價(jià)每毫克100國際單位)10公斤加入100升純水，再加入氯化鈉1公斤，不斷攪拌，使其溶解。攪拌1-2小時(shí)，用布氏漏斗，真空過濾，得清液約106.9升，用2量氫氧化鈉(200毫升)調(diào)PH8.5，加入1千克木瓜酶不斷攪拌，使其溶解，并逐漸升溫至43℃-45℃。保溫26小時(shí)(每小時(shí)攪拌10分鐘)，用布氏漏斗，真空過濾后，用2當(dāng)量鹽酸調(diào)PH至6.6，然后加入抗凝血(Fxa抑制劑)因子250克，使溫度保持37℃(30分鐘)。溶解后經(jīng)過布氏漏斗過濾，得清液105.1升，迅速置于5℃冷室中，使其冷卻到5℃-10℃后，調(diào)整PH至7.4±0.1后，通過直徑為20cm的，內(nèi)含刀豆球蛋白sephhrose親和層析柱15升(流速為60me/cm2/分)，用紫外監(jiān)測(cè)儀在波長230nm收集下柱流出峰，共計(jì)98升。繼續(xù)冷卻到3℃±，用2當(dāng)量鹽酸調(diào)PH1.9，溶液產(chǎn)生乳白色沉淀物靜置30分鐘后，即用布氏漏斗真空過濾收集清液，不間斷地用2當(dāng)量氫氧化鈉調(diào)PH至11.0，再加入3％過氧化氫升溫至25℃保溫24小時(shí)。第二天用除菌板板框壓濾，收集純清液100升，加入預(yù)先備好的-10℃無菌、無內(nèi)毒素的95％的藥用乙醇85升攪拌15分鐘，靜置過夜。第二天，虹吸出廢乙醇，離心收集沉淀物，用無水乙醇脫水3次后進(jìn)入真空干燥箱干燥36小時(shí)，即得低分子肝素鈉成品7.62公斤。經(jīng)化驗(yàn)檢出Fxa活力單位為每毫克122.50國際單位，F(xiàn)IIa活力單位為每毫克32.58國際單位，F(xiàn)xa比FIIa比值為3.76，平均分子量為3650，2000-8000分子量占84.5％，產(chǎn)品完全符合EP2002版中的伊諾型低分子量肝素鈉，收率達(dá)88.6％。
權(quán)利要求
1.一種低分子肝素鈉，其特征在于，平均分子量在3500-4000之間，低分子量的含有量大于80％-85％之間。溶血栓的生物活性每毫克在100-125國際單位之間，F(xiàn)xa與FIIa的比值在3.0-4.0之間。
2.本發(fā)明還公開了一種低分子肝素鈉的酶解聚后親和層析制備方法，依次包括如下步驟(1)以來源于牛羊(清真)腸黏膜的低分子肝素鈉為主要原料，用木瓜酶進(jìn)行酶解；(2)所得酶解加入抗凝血酶(Fxa抑制劑)，常溫靜置后迅速冷卻至5℃-10℃；(3)將所得酶解液調(diào)至PH7.4±0.1后，通過伴刀豆球蛋白sephrose親和層析柱，收集下柱流出液；(4)所得下柱流出液繼續(xù)冷卻至3℃，調(diào)至PH1.7-1.9，靜置后過濾收集清液；(5)所得清液調(diào)至-11后，加入過氧化氫，升溫至25℃，保溫24小時(shí)；(6)次日用出菌板壓濾收集清液；(7)清液加入無菌、無內(nèi)毒素的藥用乙醇，攪拌后靜置過夜；(8)次日離心收集沉淀物，脫水后，進(jìn)入真空干燥36小時(shí)，即得低分子肝素成品。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的低分子肝素鈉起始原料為從牛羊(清真)腸黏膜制成的粗制品，他是在PH7.8-8.8之間用木瓜蛋白酶，在40℃-45℃解聚26小時(shí)。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的酶解液經(jīng)過布氏漏斗過濾清后，調(diào)PH6.5-6.8后加入Fxa抑制劑，37℃保溫30分鐘。
5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述親和層析柱，為伴刀豆球蛋白sephrose親和層析柱，其所用的緩沖體系為PH7.40.05Mtris緩沖體系。
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所得清液調(diào)PH至11加入過氧化氫，升溫25℃，保溫24小時(shí)，然后用除菌板壓濾收集清液，用無菌、無內(nèi)毒素的藥用乙醇沉淀，脫水真空干燥36小時(shí)的低分子肝素鈉成品。
7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所得低分子肝素鈉為無菌、無內(nèi)毒，透光率在260nm≤0.20、280nm≤0.15的可用于靜脈注射的藥用原料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低分子肝素鈉，具有抗凝、抗過敏、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)血脂等多種生物學(xué)功能，是一種高效、低副作用、抗FXa半衰期長、生物利用度高、用途廣泛的低分子肝素鈉。本發(fā)明還公開了一種低分子肝素鈉的酶解親和層析制備方法，采用源于牛羊腸黏膜(清真)的粗品肝素為主要原料，并用生物酶降解和親和層析分離純化，獲得低分子肝素鈉。本制備方法簡單、易操作、無三廢，產(chǎn)得率高、成本低。
文檔編號(hào)A61K9/08GK1803853SQ20061002358
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2006年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月24日
發(fā)明者蘇翰, 蘇有錄, 唐甜, 周鈺, 韓彬 申請(qǐng)人:上海阿敏生物技術(shù)有限公司