專利名稱：一種含基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1與免疫球蛋白－Fc段雙重活性的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)-重組基因工程領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及用重組基因工程與細(xì)胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)一種含基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與免疫球蛋白-Fc段雙重生物活性的全新的多肽蛋白質(zhì)(SDF1-Fc)。
背景技術(shù)：
腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是影響臨床療效及腫瘤患者預(yù)后的一大因素。在生物學(xué)上腫瘤轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞從原發(fā)的部位脫落后再遷移、擴(kuò)散至身體其它部位并形成新的病灶的過程。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑與炎癥反應(yīng)時(shí)的炎癥細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞)的遷移途徑非常相似兩者均伴有一穿透血管管壁或淋巴管管壁的關(guān)鍵步驟。腫瘤細(xì)胞/炎癥反應(yīng)細(xì)胞經(jīng)穿透血管管壁或淋巴管管壁而達(dá)到遷移部位是一主動(dòng)、耗能和多步驟的過程，并受多種因素影響(1)。近年的研究證明腫瘤細(xì)胞能在較短時(shí)間里(一般歷程2-4小時(shí))完成穿透血管壁或淋巴管管壁再定向遷移(即趨化)到身體其它部位的關(guān)鍵是體內(nèi)特定組織能在一定的時(shí)間里不斷分泌多種趨化因子(2)(chemokines)，而待遷移的腫瘤細(xì)胞或炎癥反應(yīng)細(xì)胞則表達(dá)其相應(yīng)的特異性受體(即趨化因子受體)(3-4)。
趨化因子是一類結(jié)構(gòu)性相似、分子量為8-11 Kda的蛋白質(zhì)多肽； 由多種組織細(xì)胞分泌表達(dá)(2)。在結(jié)構(gòu)上，趨化因子均含有保守的半胱氨酸殘基，而以半胱氨酸殘基形成的二硫鍵在維持其蛋白質(zhì)三級(jí)構(gòu)象及生物活性上起關(guān)鍵作用。依其蛋白質(zhì)多肽順序中前面兩個(gè)半胱氨酸的位置，趨化因子可分為三大類即C-C，C-X-C和C-X3-C趨化因子。在目前已知的40多個(gè)趨化因子中，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1，SDF-1)在腫瘤及炎癥細(xì)胞遷移過程中最為特殊與重要(5-9)。SDF-1(又名為CXCL12，結(jié)構(gòu)上屬于C-X-C家族成員)由多種組織的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)及分泌；其已知的唯一天然受體是CXCR4(10-13)。SDF1通過與CXCR4結(jié)合產(chǎn)生傳導(dǎo)和趨化信號(hào)，進(jìn)而誘導(dǎo)CXCR4表達(dá)陽性的細(xì)胞發(fā)生變型、變長(zhǎng)直至完成穿透血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，最終達(dá)到新的組織部位。與其他趨化因子受體一樣，CXCR4也是屬于7次跨膜結(jié)構(gòu)域G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，其表達(dá)具組織細(xì)胞特異性(9-12)。此外，多種惡性腫瘤如乳腺癌，前列腺癌，淋巴瘤，白血病及多發(fā)性骨髓瘤等癌細(xì)胞具有CXCR4的高水平表達(dá)；而伴有CXCR4過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞常發(fā)生轉(zhuǎn)移(13-17)。近年更有實(shí)驗(yàn)表明如抑制或降低腫瘤細(xì)胞表達(dá)CXCR4的水平，則可達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的效果。例如美國DNAX研究所成員Muller A.et al.于2002年報(bào)道通過向?qū)嶒?yàn)小鼠體內(nèi)注射抗人CXCR4單克隆抗體方式，取得降低人乳腺癌細(xì)胞MCF7上的CXCR4的表達(dá)水平，并進(jìn)而達(dá)到抑制該乳腺癌細(xì)胞向肺、骨髓等臟器的轉(zhuǎn)移、積聚與生長(zhǎng)(14)。
CXCR4同時(shí)亦是人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)侵入靶細(xì)胞如CD4+T細(xì)胞的最重要輔助受體之一(18)。在HIV1/CD4+T細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入SDF1，可競(jìng)爭(zhēng)性地拮抗HIV-1與CD4+T細(xì)胞膜上CXCR4結(jié)合，從而保護(hù)T細(xì)胞免遭HIV-1病毒的(19-20)。
近來的研究揭示SDF-1可分為三個(gè)主要功能區(qū)即N-端趨化因子功能區(qū)，中端β片層結(jié)構(gòu)區(qū)和C-端α螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)(21-22)。N-端區(qū)是SDF-1與CXCR4結(jié)合與活化的主要結(jié)構(gòu)關(guān)鍵；C末端α螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于維持SDF-1的構(gòu)象和生物活性起著重要的作用(21-22)。但天然的SDF1體內(nèi)含量低，且分子量小、穩(wěn)定性差，故其分離提取與應(yīng)用受到限制。而某些經(jīng)修飾改造的趨化因子如去C端α螺旋的突變產(chǎn)物SDF-1/54R(23，杜軍等中國發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?3146833.0)雖保留有與CXCR4的親和結(jié)合的力及誘導(dǎo)CXCR4內(nèi)在化，但因喪失SDF-1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)和趨化作用，其應(yīng)用范圍也有一定的限制。因此，開發(fā)研究出一種既保持有如天然SDF-1樣的生物活性，又具有高度穩(wěn)定及便于分離提取等其他特征的SDF-1結(jié)構(gòu)變體或以其衍生物以替代天然SDF-1應(yīng)具有更為廣泛的使用價(jià)值。
本發(fā)明報(bào)道了一種含基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與免疫球蛋白-Fc段雙重生物活性的全新的蛋白質(zhì)(SDF1-Fc)。本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白質(zhì)通過采用重組DNA方法將SDF1基因與免疫球蛋白-Fc段基因相連，定向插入到表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞里進(jìn)行表達(dá)而生產(chǎn)。本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白為抗體樣大分子物質(zhì)，便于檢測(cè)分離；可廣泛用于如體內(nèi)外檢測(cè)SDF-1的配體或受體及用于干預(yù)腫瘤細(xì)胞/炎癥反應(yīng)細(xì)胞的遷移及HIV病毒感染等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是選取在腫瘤細(xì)胞及炎癥反應(yīng)細(xì)胞遷移過程中起著非常重要作用的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1，SDF-1)及其唯一的天然受體CXCR4為靶點(diǎn)，以基因工程/細(xì)胞工程為手段開發(fā)生產(chǎn)出基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與免疫球蛋-Fc段相連的蛋白質(zhì)(SDF1-Fc)。本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白質(zhì)為抗體樣大分子物質(zhì)，具有如基因序列表1所示的氨基酸序列。本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白穩(wěn)定性強(qiáng)及便于檢測(cè)分離，具有較為廣泛的用途。
本發(fā)明的具體內(nèi)容如下1.含SDF1-Fc重組基因的表達(dá)載體的構(gòu)建。
構(gòu)建含SDF1-Fc重組基因的表達(dá)載體的具體技術(shù)與操作方法與一般重組基因工程相同。鑒于SDF1-Fc蛋白具有分子量大、含二硫鍵(S_S)及糖基，其生產(chǎn)方式以采用由真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌性表達(dá)生產(chǎn)為理想。細(xì)胞分泌性表達(dá)生產(chǎn)SDF1-Fc蛋白的一大優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)的蛋白可集聚于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，便于回收分離。
保證細(xì)胞分泌性表達(dá)生產(chǎn)SDF1-Fc蛋白的一大關(guān)鍵因素是需要一段信號(hào)肽(signalpeptide)以引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)穿透內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并最終分泌到細(xì)胞外間質(zhì)。信號(hào)肽的編碼來源可來自SDF-1基因本身、免疫球蛋白基因、或其他外源基因如IL-2等基因。本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白中的免疫球蛋白Fc段可以來自于IgG、IgM、IgA或IgD任一型。根據(jù)融合蛋白的主要用途不同，SDF1-Fc重組基因的構(gòu)建可以是全人源的(即SDF-1及Fc基因來只于人)、全鼠源的(即SDF-1及Fc基因來只于鼠)、或人鼠相嵌的(即SDF-1及Fc基因可來源于人和鼠)。
SDF1-Fc重組基因表達(dá)載體的具體構(gòu)建可分為兩大部分1)克隆獲得免疫球蛋白-Fc段基因，并將其定向插入到真核細(xì)胞表達(dá)載體，獲得含免疫球蛋-Fc段基因的過渡載體，2)克隆獲得SDF1基因，并將其與含免疫球蛋白-Fc段基因的過渡載體相連，從而獲得帶SDF1-Fc重組基因的表達(dá)載體。
1a.免疫球蛋白-Fc段基因的克隆擴(kuò)增及其表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白的免疫球蛋白-Fc段基因編碼可以從人類cDNA或基因組DNA庫中以逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)或PCR擴(kuò)增獲得。用于PCR的上、下游引物可參照已報(bào)道的免疫球蛋白-Fc段基因的核苷酸序列以體外合成方式獲得?？寺～@得的基因片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切處理后，再用T4連接酶將其與經(jīng)相應(yīng)的酶切處理的表達(dá)載體相連，經(jīng)轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌擴(kuò)增，再經(jīng)提取質(zhì)粒DNA及酶切鑒定，即獲得含免疫球蛋白-Fc段基因的表達(dá)載體?？捎糜谡婧思?xì)胞表達(dá)SDF1-Fc基因的載體包括pcDNA3.1(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN(Clonetech)等。該類表達(dá)載體的特征是包括真核細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子hCMV啟動(dòng)子、5’LTR及polyA等序列在內(nèi)。
1b.SDF1基因的克隆擴(kuò)增及SDF1-Fc重組基因表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白中的SDF-1基因編碼可從人類cDNA或基因組DNA庫中以RT-PCR或PCR擴(kuò)增方法獲得。用于PCR的上、下游引物可參照已報(bào)道的SDF1基因核苷酸序列以體外合成方式獲得。擴(kuò)增獲得的SDF-1基因片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切處理，再用T4連接酶將其定向插入到上述的含免疫球蛋-Fc段基因的表達(dá)載體中，從而獲得帶SDF1-Fc重組基因的載體。理想的SDF1-Fc重組基因的連接順序(從5‘到3‘)是SDF1-Fc。重組的SDF1-Fc基因保持有維一開放讀框(open-reading frame，ORF)。該ORF的編碼起始于SDF-1的信號(hào)肽，終止于免疫球蛋白Fc端CH3區(qū)。
2.SDF1-Fc融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)生產(chǎn)SDF1-Fc蛋白的表達(dá)生產(chǎn)以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中為理想。常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞有CHO，COS-7，Hela，HEK-293等。保證SDF1-Fc融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效穩(wěn)定表達(dá)的關(guān)鍵因素是1)高效地將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)；2)篩選與擴(kuò)增出高表達(dá)細(xì)胞株。
將SDF1-Fc表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)有兩種主要方式即瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞因可進(jìn)一步用于篩選與擴(kuò)增高表達(dá)細(xì)胞株，在本發(fā)明實(shí)施中為優(yōu)選。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的方法包磷酸鈣法；陽離子脂質(zhì)體法；病毒介導(dǎo)法及電穿孔法等。
SDF1-Fc基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞里的表達(dá)可以用免疫組化方法進(jìn)行檢測(cè)；也可以通過免疫印跡試驗(yàn)及ELISA方法直接定性及定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)液中的SDF1-Fc融合蛋白。經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)及分泌SDF1-Fc蛋白后，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則轉(zhuǎn)入含篩選藥物如G418的培養(yǎng)液中進(jìn)行篩選。篩選出的表達(dá)細(xì)胞株再擴(kuò)增培養(yǎng)，并收集其培養(yǎng)上清液。收集的培養(yǎng)液用于分離提取SDF1-Fc蛋白。
3.SDF1-Fc蛋白的分離提取及其理化與生物活性鑒定SDF1-Fc蛋白可以用免疫親和層析柱法從收集的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液中分離提取。用于分離提取SDF1-Fc融合蛋白的常用免疫親和層析柱有protein-A或protein-G親和層析柱。如以Protein-G免疫親和層析法柱分離提取SDF1-Fc融合蛋白，其操作步驟如下取收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)離心及以0.45μm濾膜過濾后，將濾液上樣置Protein G-親合層析柱，SDF1-Fc融合蛋白因其Fc段與protein-G的非共價(jià)的耦聯(lián)，被特異吸附于親合層吸柱中。層吸柱先以PBS洗脫去除雜蛋白，再以低pH液(如pH2.7，0.1M甘氨酸)洗脫被吸附的蛋白。再經(jīng)調(diào)節(jié)pH至7.0及對(duì)PBS透析后即獲得純化的SDF1-Fc蛋白。
分離提取的SDF1-Fc蛋白可以用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)，結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色或免疫印跡試驗(yàn)及ELISA等方法加以鑒定。
本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白的一大特征是其保持有與SDF-1的天然受體CXCR4相特異結(jié)合的生物活性。鑒定SDF1-Fc蛋白與CXCR4相結(jié)合的一方法如下先以含CXCR4基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO細(xì)胞，24-48h后，轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞經(jīng)1×PBS液漂洗及以固定后，分別加入含SDF1-Fc融合蛋白或Fc蛋白，25℃孵育1-2h，以PBS液洗脫，再加入酶標(biāo)記的抗人IgG-Fc抗體，25℃孵育1-2h，再以PBS液洗脫，然后加入顯色液，室溫至顯色，于顯微鏡下觀察顯色結(jié)果。如加入SDF1-Fc融合蛋白的孔有顯色陽性的細(xì)胞，而加入Fc蛋白的孔里細(xì)胞應(yīng)無顯色，證明SDF1-Fc融合蛋白保持有與CXCR4受體相特異結(jié)合的生物活性。
4.SDF1-Fc蛋白的應(yīng)用本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白因具有SDF1與免疫球蛋白-Fc段的雙重生物活性，可作為SDF-1的替代物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，廣泛用于如體內(nèi)外檢測(cè)CXCR4受體的表達(dá)；用于體內(nèi)外吸附、分離清除CXCR4陽性的細(xì)胞/組織及用于干預(yù)HIV病毒感染等。其具體的應(yīng)用說明如下4a.SDF1-Fc蛋白作為試劑用于體內(nèi)外檢測(cè)CXCR4的表達(dá)水平已知的SDF-1的唯一天然受體是CXCR4。本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白可作為試劑用于體內(nèi)外檢測(cè)及CXCR4的表達(dá)水平。被檢測(cè)的CXCR4分子可以是以膜蛋白形式表達(dá)于細(xì)胞/組織中，或以流離降級(jí)的可溶性分子存在于體液(如血清、血漿、唾液等)，或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。
作為檢測(cè)試劑，SDF1-Fc蛋白可有標(biāo)記處理的及未標(biāo)記處理的兩種主要形式存在。常用于標(biāo)記SDF1-Fc蛋白的標(biāo)記物包括酶(如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，微過氧化物酶)；熒光素(異硫氰酸熒光素，F(xiàn)ITC)；生物素-抗生物素及膠體金等。經(jīng)標(biāo)記的SDF1-Fc蛋白，可作為試劑直接用免疫酶組化、免疫熒光或免疫印跡等方法來進(jìn)行體內(nèi)外檢測(cè)CXCR4的表達(dá)。如以辣根過氧化物酶標(biāo)記的SDF1-Fc蛋白為試劑，用免疫酶組化方法來體外檢測(cè)腫瘤組織病理切片中的CXCR4的表達(dá)為例，其步驟如下取腫瘤組織病理切片及正常組織切片，去蠟處理，1×PBS液漂洗及固定后，加入辣根過氧化物酶記的SDF1-Fc融合蛋白，25℃孵育1-2h，以PBS液洗脫，然后加入顯色液，室溫靜置至顯色，再于顯微鏡下觀察切片顯色結(jié)果。根據(jù)顯色結(jié)果并與正常組織切片相比較，可判斷腫瘤組織CXCR4的表達(dá)水平。
未標(biāo)記處理的SDF1-Fc蛋白也可與其他已標(biāo)記的試劑合并作為試劑盒成分，用于體外檢測(cè)CXCR4的表達(dá)。其他標(biāo)記的試劑可以是酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白Fc段抗體，酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的protein-A/protein-G蛋白，酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的抗人CXCR4抗體等。如以未標(biāo)記的SDF1-Fc融合蛋白與酶標(biāo)記的鼠抗人CXCR4單克隆抗體合并組成試劑盒，用夾心ELISA法來檢測(cè)體液(如血清、細(xì)胞懸液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液)中的CXCR4的表達(dá)水平為例，其檢測(cè)步驟如下先用SDF1-Fc蛋白包被ELISA板，4℃過夜，經(jīng)1×PBS液漂洗及2％BSA液室溫封閉1～2h后，分別加入待檢的樣品如血清，37℃孵育1-2h，經(jīng)PBS液洗脫后，再加入酶標(biāo)記的鼠抗人CXCR4抗體，37℃孵育1-2h，PBS液洗脫后，加入顯色液，室溫至顯色，再以酶聯(lián)免疫儀測(cè)定特定波長(zhǎng)處各孔的吸光值。根據(jù)OD值并與CXCR4正常參照物相比較，可估測(cè)待檢的樣品中流離或降級(jí)的CXCR4水平。
4b.SDF1-Fc蛋白用于體內(nèi)外吸附及分離CXCR4表達(dá)陽性細(xì)胞與組織SDF1-Fc蛋白可作為SDF1的替代物，用于體內(nèi)外吸附與分離CXCR4表達(dá)陽性的細(xì)胞與組織。如用SDF1-Fc蛋白體外吸附分離CXCR4表達(dá)陽性的細(xì)胞與組織為例，可先將SDF1-Fc融合蛋白吸附在適當(dāng)?shù)墓滔噍d體上(固相載體包括如細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)皿，硝酸纖維素膜等)，再加入含CXCR4表達(dá)陽性的細(xì)胞或組織，4℃孵育1-2h，再以1×PBS液洗脫，即達(dá)到吸附與分離CXCR4表達(dá)陽性細(xì)胞或組織成分的目的。
分離純化后的SDF1-Fc蛋白還可通過先浸置與吸附于醫(yī)用紗布或綁帶上，再貼于如外傷、炎癥或外科手術(shù)創(chuàng)面，達(dá)到吸引CXCR4表達(dá)陽性細(xì)胞遷移至傷口處的目的。
4c.SDF1-Fc蛋白用于干預(yù)HIV病毒感染人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)通過其外膜蛋白gp120與其靶細(xì)胞表面的CD4+受體與CXCR4輔助受體的相互作用而吸附并進(jìn)入靶細(xì)胞，而產(chǎn)生感染。SDF-1及其衍生物因其與CXCR4分子的高親和力結(jié)合，可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制HIV外膜蛋白gp120與CXCR4受體的相互結(jié)合，從而阻止HIV與感染靶細(xì)胞融合。本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白既保持與CXCR4分子的高親和力結(jié)合的活性，又有如免疫球蛋白樣的在體內(nèi)外半衰期長(zhǎng)，穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)及Fc段介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)功能(ADCC)及補(bǔ)體激活效應(yīng)功能。因此，在阻止HIV外膜蛋白gp120與CXCR4受體的相互結(jié)合上，SDF1-Fc蛋白應(yīng)是一理想的大分子生物拮抗劑，可用于開發(fā)成為干預(yù)HIV病毒感染的醫(yī)藥制劑。
4d.SDF1-Fc蛋白用于建立腫瘤細(xì)胞或炎癥細(xì)胞的體外遷移模型并以該模型開展抗腫瘤細(xì)胞遷移或抗炎癥反應(yīng)細(xì)胞遷移藥物成分的篩選本發(fā)明中的SDF1-Fc蛋白可作為SDF-1的替代物用于建立模擬SDF-1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞或炎癥細(xì)胞體外遷移模型。遷移模型的建立可采用微孔隔離膜雙層培養(yǎng)板方式。微孔雙層培養(yǎng)板中的隔離膜的孔經(jīng)大小為4-10um，腫瘤細(xì)胞或炎癥細(xì)胞在無趨化因子條件下不會(huì)自由穿透隔離膜。而在有SDF-1趨化因子或SDF1-Fc融合蛋白的介導(dǎo)下，置于隔離膜上層的腫瘤細(xì)胞將發(fā)生變型、變長(zhǎng)等一系列變化，直至穿透隔離膜微孔，達(dá)到向趨化因子集聚部位(培養(yǎng)板下層)的遷移。完成遷移的細(xì)胞可在顯微鏡下觀察及計(jì)數(shù)。
建立起的SDF1-Fc融合蛋白介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞體外遷移模型可進(jìn)一步用于進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞遷移抗炎癥細(xì)胞遷移藥物成分的快速篩選。被篩選的物質(zhì)成分可包括抗體及各種蛋白質(zhì)、多肽、中草藥提取物及各種小分子化合物等。如以該遷移模型從中草藥提取物中篩選抗腫瘤細(xì)胞遷移藥物成分為例，其方法如下先將CXCR4表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞如HL60細(xì)胞置于微孔隔離膜上層，將SDF1-Fc融合蛋白加入下層各孔。其中一孔不加SDF1-Fc融合蛋白為陰性對(duì)照；一孔只加SDF1-Fc融合蛋白為陽性對(duì)照；其余各孔依次加入不同溶度的待篩選的中草藥提取物。37℃共孵育4-24h，期間在顯微鏡下觀察各孔中的完成穿透微孔隔離膜的腫瘤細(xì)胞并計(jì)數(shù)。各孔結(jié)果經(jīng)與只加SDF1-Fc蛋白的陽性對(duì)照組的計(jì)數(shù)結(jié)果相對(duì)比，可推斷被篩選藥物的拮抗/抑制腫瘤遷移的相對(duì)活性。根據(jù)拮抗/抑制腫瘤遷移的比例，被篩選的成分可歸為無拮抗/抑制(抑制腫瘤遷移的比例在25％以下)；低度拮抗/抑制(25-50％)，中度拮抗/抑制(50-75％，)及高度拮抗/抑制(75％以上)。對(duì)具有中度以上拮抗/抑制的成分可再對(duì)其進(jìn)行包括藥物結(jié)構(gòu)分析、體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物毒理與藥理等一系列臨床前研究。
依同法，建立的SDF1-Fc融合蛋白介導(dǎo)的遷移模型可用于抗炎癥反應(yīng)細(xì)胞遷移藥物成分的快速篩選。


圖1構(gòu)建的含SDF1-Fc重組基因的表達(dá)質(zhì)粒(pQY-SDFIg)圖譜。
圖1中的SDF1為人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 cDNA；Ig為人免疫球蛋白Fc段cDNA。
圖2內(nèi)切酶酶切鑒定SDF1-Fc重組基因表達(dá)質(zhì)粒結(jié)果(1.5％瓊脂糖電泳圖譜)。
其中泳道條帶1為100 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)(購自Promga)，泳道條帶2為pQY-SDF1Ig質(zhì)粒經(jīng)HinDIII及XhoI雙酶切產(chǎn)物；泳道條帶3為pQY-SDF1Ig質(zhì)粒經(jīng)HinD III及BamH I雙酶切產(chǎn)物；泳道條帶4為250 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)(購自上海博光生物技術(shù)有限公司)。
圖3免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)SDF1-Fc重組基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。
圖3a為CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染含SDF1-Fc重組基因質(zhì)粒的顯色結(jié)果；圖3b為CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的顯色結(jié)果。
圖4免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting)鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中的SDF1-Fc融合蛋白。
圖中的Marker為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，see-blue2 markers(Invitrogen)。樣品條帶1為空白對(duì)照轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上清液樣品；樣品條帶2為pQY-SDF1Ig轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上清液樣品之1號(hào)；樣品條帶3為pQY-SDF1Ig轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上清液樣品之2號(hào)。
圖5以SDF1-Fc蛋白質(zhì)為試劑用于檢測(cè)CXCR4基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。
圖5a為CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染含CXCR4-GFP重組基因質(zhì)粒的顯色結(jié)果；圖5b為CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染含GFP對(duì)照基因質(zhì)粒的顯色結(jié)果。
本發(fā)明
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一含SDF1-Fc重組基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.人類免疫球蛋白IgG-Fc段(IgG-Fc)基因片段的克隆。
采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法從健康人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中克隆獲得人類免疫球蛋白IgG-Fc段基因片段(IgG-Fc)。其具體實(shí)施如下取健康人外周血5mL，經(jīng)Ficol分理出單核細(xì)胞(PBMCs)，以TRIzol試劑(Invitrogen)按常規(guī)方法從分理出的單核細(xì)胞(PBMCs)中提取總RNA。再取1μg總RNA，加入到逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)液里(總體積為20μL，包括5×buffer 4μL、Oligo(dT)引物2μL及10mmol/L dNTP 8μL，RNasin 1μL，反轉(zhuǎn)錄酶5U～10U)，經(jīng)70℃變性10分鐘，42℃1小時(shí)，42℃30分鐘，70℃15分鐘，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)終止，合成得到cDNA。用于PCR擴(kuò)增人免疫球蛋白IgG1-Fc段的上下游引物序列如下
上游引物(hIg-F)(30 bases-GAG GGA TCC CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT)及下游引物(hIg-R)(30 bases-GTC AGA TCT TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA)。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR擴(kuò)增用的Taq酶購自大連TAKARA生物公司。PCR的反應(yīng)總體積為50μL(包括上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)終產(chǎn)物cDNA 2μL，10×Taq酶buffer 5μL、上，下游引物各2μL，10mmol/L dNTP 1μL，RNasin 1μL，Taq酶5U，去離子水37μL)。PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min后，然后94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸5min。
PCR產(chǎn)物純化及酶切取PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳，待引物二聚體與擴(kuò)增片段分離后，切下擴(kuò)增片段(擴(kuò)增的人類免疫球蛋白IgG1-Fc段為長(zhǎng)度780 bp的cDNA基因外顯子部分序列)，再經(jīng)BamH I和Bg1 II酶切及回收純化后，用20μ去離子水溶解，置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> DNA重組連接及轉(zhuǎn)化感受宿主菌采用以T4 DNA連接酶的方法將上述酶切后的DNA與經(jīng)同樣酶切處理的表達(dá)載體pcDNA3.1(Invitrogen)DNA體外相連。連接反應(yīng)體系總體積為20μL(包口10×T4 DNA連接酶-ATP buffer 2μL、酶切后的PCR擴(kuò)增片段5μL(1μg)，上述酶切后的表達(dá)載體載體2μl(1μg)，T4連接酶1μl，去離子水10μl)。在16℃條件下連接16h后，取2μl連接反應(yīng)物在4℃條件下轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌宿主菌DH5a(50μl/管)30分鐘。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將感受細(xì)菌接種于LB/agar培養(yǎng)板(含100μg/ml Amp)，37℃孵育過夜。
重組質(zhì)粒DNA的提取及酶切鑒定從含Amp篩選平板上挑取菌落，接種于3ml LB培養(yǎng)基中(含100μg/ml Amp)，37℃振搖過夜。第2天，經(jīng)離心收集細(xì)菌，采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA。提取的質(zhì)粒DNA再經(jīng)HinD III和Bgl II酶切，進(jìn)行電泳鑒定，從而獲得含免疫球蛋白Fc片段的質(zhì)粒pQY-Fc2.人類基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與免疫球蛋白-Fc段重組融合基因(SDF1-Fc)表達(dá)載體的構(gòu)建采用RT-PCR技術(shù)從人健康人外周血單核細(xì)胞cDNA基因庫中克隆出全長(zhǎng)為284 bp的人類基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 cDNA(含該基因外顯子大部分序列)。用于PCR擴(kuò)增SDF1a的上下游引物序列如下上游引物(SDF1-F)(36 bases-GCG AAG CTT GGC GCC ATG AAC GCC AAG GTC GTG GTC)；及下游引物(SDF1-R)(36 bases-GCG GGA TCC AGC TTT CTC CAG GTA CTC CTG AAT CCA)。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR的反應(yīng)總體積為50μl(包括上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)終產(chǎn)物cDNA 2μl，10×Taq酶buffer 5μl、上，下游引物各2μl，10mmol/L dNTP 1μl，RNasin 1μl，Taq酶5U，去離子水37μl)。PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min后，然后94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸5min。
PCR產(chǎn)物純化及酶切取10μl PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖電泳分離后，切下擴(kuò)增片段(含長(zhǎng)為284 bp的人類SDF1 cDNA)，再經(jīng)回收純化，用HinD III和BamH I酶切，反應(yīng)完畢后再回收純化，用20μl去離子水溶解后，置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> DNA重組連接及轉(zhuǎn)化感受宿主菌采用以T4 DNA連接酶的方法將上述酶切后的SDF1cDNA與經(jīng)同樣酶切處理的含人類免疫球蛋白IgG-Fc段的表達(dá)載體pQY-Fc體外相連接。連接反應(yīng)體系總體積為20μl(包括10×T4 DNA連接酶-ATP buffer 2μl、酶切后的PCR擴(kuò)增片段5μl(1μg)，上述酶切后的表達(dá)載體載體2μl(1μg)，T4連接酶1μl，去離子水10μl)。在16℃條件下連接16h后，取2μl連接反應(yīng)物在4℃條件下轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌宿主菌DH5a(50μl/管)30分鐘。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將感受細(xì)菌接種于LB/agar培養(yǎng)板(含100μg/ml Amp)，37℃孵育過夜。
重組質(zhì)粒DNA的提取及酶切鑒定從含Amp篩選平板上挑取菌落，接種于3ml LB培養(yǎng)基中(含100μg/ml Amp)，37℃振搖過夜。第2天，經(jīng)離心收集細(xì)菌，采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA。含SDF1-Fc重組基因表達(dá)質(zhì)粒(pQY-SDF1Ig)DNA圖譜如圖1所示。
提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)HinD III和Xho I雙內(nèi)切酶酶切，或經(jīng)HinD III和BamH I雙內(nèi)切酶酶切后，再進(jìn)行電泳鑒定。酶切結(jié)果如圖2所示HinD III和Xho I雙酶切后獲得一片斷，電泳位置在1.0kb；HinD III和BamH I雙酶切后獲得一片斷，電泳位置在250 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)的上端。該酶切結(jié)果與圖1的pQY-SDF1Ig質(zhì)粒圖譜酶切位點(diǎn)相符合。對(duì)酶切證明含SDF1-Fc重組基因的質(zhì)粒再經(jīng)測(cè)序鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒含有方向及序列均正確的SDF1-Fc重組基因。所含的SDF1-Fc重組基因的核苷酸序列見所附的基因序列2；其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列見所附基因序列3。
實(shí)施例二SDF1-Fc重組基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)生產(chǎn)1.SDF1-Fc重組基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CHO細(xì)胞不含有內(nèi)源性SDF1基因表達(dá)，可用于體外轉(zhuǎn)染及表達(dá)SDF1-Fc重組基因。CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染采用Fugen6(Roche)介導(dǎo)的方法。其步驟如下取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞，胰酶/5mM EDTA常規(guī)消化后，以2×104細(xì)胞/孔接種24-孔塑料培養(yǎng)板，37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜。第2天，在100μL無血清的DMEM培養(yǎng)基加入2μLFugen6與不同量的SDF1-Fc質(zhì)粒及陰性對(duì)照空載體DNA(1-2μg)混勻，制備成Fugen6-DNA混合液，室溫放置15min后，緩慢滴加至CHO細(xì)胞中，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4-6h后，加入1ml DMEM-5％胎牛血清/孔，培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48～72h后，收集培養(yǎng)細(xì)胞上清，并用免疫組化方法檢測(cè)SDF1-Fc蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。
2.免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)SDF1-Fc重組基因在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的表達(dá)在轉(zhuǎn)染48-72h后，CHO細(xì)胞經(jīng)1×PBS液漂洗及90％甲醇4℃下固定20min后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG-Fc段多克隆抗體(抗體購自Sigma，以1∶200稀釋，300ul/孔)，37℃孵育1h，再以PBS液洗脫3次，然后加入顯色底物(鄰苯二胺及3％H202)，室溫靜置，至顯色反應(yīng)出現(xiàn)后再于顯微鏡下觀察顯色結(jié)果。如圖3示，含SDF1-Fc重組基因載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞樣品孔里有5-10％的細(xì)胞顯色呈陽性反應(yīng)(圖3a)；而以空載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞樣品孔未見顯色陽性細(xì)胞(圖3b)。此結(jié)果說明SDF1-Fc重組基因在轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞里成功表達(dá)。
實(shí)施例三以免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting)鑒定與檢測(cè)轉(zhuǎn)染SDF1-Pc融合蛋白為經(jīng)一步鑒定與檢測(cè)轉(zhuǎn)染SDF1-Fc融合蛋白，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液用免疫印跡試驗(yàn)方法來檢測(cè)其中的SDF1-Fc融合蛋白含量。其步驟如下取含SDF1-Fc重組基因載體或空載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的上清液，上樣于10％SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行電泳分離。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，取下凝膠，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜(30 V，4℃，16h)，再以1％BSA封閉，室溫1～2h后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記-山羊抗人IgG-Fc多克隆抗體(抗體購自Sigma，1∶1000稀釋)，37℃孵育1h。膜經(jīng)充分漂洗后，加入顯色液(鄰苯二胺，3％H202)，至顯色條帶出現(xiàn)后，蒸餾水漂洗終止反應(yīng)。免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果如圖4示在非變性樣品中，SDF1-Fc重組基因載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上清液呈陽性反應(yīng)，泳帶在分子質(zhì)量為65-70kd左右的位置，這與預(yù)期的雙倍體SDF1-Fc蛋白的分子量大小相符。而空載體轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)上清液檢測(cè)結(jié)果為陰性。免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞分泌表達(dá)SDF1-Fc蛋白；而表達(dá)的SDF1-Fc蛋白保持有免疫球蛋白Fc段抗原活性，可被抗人IgG-Fc抗體識(shí)別。
實(shí)施例四SDF1-Fc蛋白作為試劑用于檢測(cè)細(xì)胞/組織中的CXCR4的表達(dá)水平本發(fā)明的SDF1-Fc蛋白因具有SDF-1生物活性(即特異識(shí)別與結(jié)合CXCR4受體)及免疫球蛋白Fc段(抗體樣活性)雙重活性，故可作為抗體樣試劑用于體內(nèi)外檢測(cè)CXCR4的表達(dá)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，以SDF1-Fc蛋白為第1抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)的山羊抗人IgG-Fc段多克隆抗體為第2抗體，兩者合并使用以檢測(cè)細(xì)胞/組織中的CXCR4的表達(dá)。其步驟如下取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞，胰酶/5mM EDTA常規(guī)消化后，以2×104細(xì)胞/孔接種24-孔塑料培養(yǎng)板，37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜。第2天，在100μL無血清的DMEM加入2μLFugen6與不同量的含CXCR4-GFP質(zhì)粒及GFP對(duì)照質(zhì)粒DNA(1μg)混勻，制備成Fugen6-DNA混合液，室溫放置15min后，緩慢滴加至CHO細(xì)胞中，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4-6h后，加入3ml DMEM-5％胎牛血清/孔繼速培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染48h后，以1×PBS液漂洗及90％甲醇4℃下固定CHO細(xì)胞20min，再加入含SDF1-Fc融合蛋白(1∶200稀釋，300ul/孔)，37℃孵育1h后，以PBS液洗脫3次，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG-Fc段多克隆抗體(Sigma，1∶200稀釋，300ul/孔)，37℃再孵育1h后，以PBS液洗脫3次，然后加入顯色液(鄰苯二胺-3％H202)，室溫5-10min至顯色反應(yīng)出現(xiàn)，于顯微鏡下觀察顯色結(jié)果。如圖5示在加入含SDF1-Fc蛋白及酶標(biāo)記的山羊抗人IgG-Fc抗體后，CXCR4-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)孔有5-10％的細(xì)胞顯色反應(yīng)呈陽性(圖5a)，而GFP對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)孔無顯色陽性細(xì)胞(圖5b)。此結(jié)果說明本發(fā)明中的SDF1-Fc蛋白保持有與CXCR4受體相特異結(jié)合的生物活性，可作為試劑用于定性或定量檢測(cè)細(xì)胞或組織中的CXCR4受體的表達(dá)。
參考文獻(xiàn).
1.Springer T.A.(Review).Traffic signals for lymphocyte recirculation andleukocyte emigrationthe multistep paradigm.Cell.1994，76(2)301-14.
2.Rollins B.J.(Review)Chemokines.Blood.1997，90909-928.
3.Murphy P.M.(Review).The molecular biology of leukocyte chemoattractantreceptors.Ann Rev Immunol.1994，12593.
4.Premack B.A.，and Schall T.J.(Review).Chemokine receptorsGateways toinflammation and infection.Nat Med.1996，21174.
5.Tashiro K.，Tada H.，Heilker R.，Shirozu M.，Nakano T.and Honjo T..Signalsequence trapA cloning strategy for secreted proteins and type I membrane proteins.Science 1993，261600-602.
6.Nagasawa T.et al..Molecular cloning and characterization of a murine pre-B-cellgrowth-stimulating factor/stromal cell-derived factor 1 receptor，a murine homologyof the human immunodeficiency virus l entry coreceptor fusion.Proc Natl.Acad.Sci.USA 1996，9314726-7.Bleul C.C.，F(xiàn)uhlbrigge R.C.，Casasnovas J.M.，Aiuti A.and Springer T.A..A highlyefficacious lymphocyte chemoattractant，stromal cell-derived factor 1(SDF-1).J.Exp.Med.1996，1841101-1106.
8.Aiuti A.，Webb I.J.，Bleul C.，Springer T.A.and Gutierrez-Ramos J.C..TheChemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD34+hematopoietic progenitor cellsand provides a new meehanism to explain the mobilization of CD34+progenitors toperipheral blood.J.Exp.Med.1997，185111-120.
9.Nagasawa T.et al.Defects of B-cell lymphopoiesis and bone marrow myelopoiesisin mice lacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1.Nature.1996.382635-639.
10.Loetscher M.，Geiser T.，O’Reilly T.，Zwahlen R.，Baggiolini M.，Moser B..Cloningof a human seven-transmembrane domain receptor，LESTR，that is highly expressed inleukocytes.J.Biol.Chem.1994，269232-237.
11.Tachibana K.et al.The Chemokine receptor CXCR4 is essential forvascularization of the gastrointestinal tract.Nature.1998.393591-594.
12.Zou Y.R.，Kottmann A.H.，Kuroda M.，Taniuchi I.and Littman D.R.Function ofthe chemokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and in cerebellar development.Nature.1998.393595-598.
13.Mohle R.，Bautz F.，Rafii S.，Moore M.A.，Brugger W.and Kanz L.The Chemokinereceptor CXCR-4 is expressed on CD34+hematopoietic progenitors and leukemia cellsand mediates transendothelial migration induced by stromal cell-derived factor-1.Blood.1998.914523-4530.
14.Muller A.et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis.Nature.2001.41050-6.
15.Darash-Yahana M et al.Role of high expression levels of CXCR4 in tumor growth，vascularization，and metastasis.FASEB J.2004.181240-2.
16.Kim J，et al.Chemokine receptor CXCR4 expression in colorectal cancer patientsincreases the risk for recurrence and for poor survival.J Clin Oncol.2005.232744-53.
17.李彩霞等CXCR4在人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的表達(dá)及對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響?！吨腥A血液學(xué)雜志》2003年第24卷第3期122-125。
18.Feng Y.，Broder C.C.，Kennedy P.E.and Berger E.A.HIV-1 entry cofactorFunctional cDNA cloning of a seven-transmembrane，G protein-coupled receptor.Science.1996.272872-877.
19.Bleul C.C.et al.The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a legend forLESTR/fusion and blocks HIV-1 entry.Nature.1996.382829-833.
20.Oberlin E.et al.The CXC chemokine SDF-1 is the legend for LESTR/fusion andprevents infection by T-cell-line-adapted HIV-1.Nature.1996.382833-836.
21.Crump MP，Gong JH，Loetscher P，Rajarathnam K，Amara A，Arenzana-Seisdedos F，Virelizier JL，Baggiolini M，Sykes BD，Clark-Lewis I.Solution structure and basisfor functional activity of stromal cell-derived factor-1；dissociation of CXCR4activation from binding and inhibition of HIV-1.EMBO J.1997.166996-7007.
22.Elisseeva EL，Slupsky CM，Crump MP，Clark-Lewis I，Sykes BD.NMR studies ofactive N-terminal peptides of stromal cell-derived factor-1.Structural basis forreceptor binding.J Biol Chem.2000.27526799-80523.杜軍；蔡紹暉；蔡紹皙；譚毅；方強(qiáng)；孫澤群“基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α重組突變體的構(gòu)建和制備”.發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?3146833.0.
附核苷酸或氨基酸序列表基因序列1(SEQ ID NO1)SDF1-Fc蛋白質(zhì)的氨基酸序列表(共298個(gè)氨基酸)1 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala 19Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Ash Cys Ala Leu Gln Ile Val 39Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln 59Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Gly Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 79Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 99Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 119Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 139Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val LeuT hr Val 159Leu His Gln Asp Trp Leu Ash Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vat Ser Ash Lys Ala Leu 179Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys G1y Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 199Tyr Thr Leu Pro Pro Set Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 219Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 239Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Set Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 259Lys Leu Thr Val Asp Lys Set Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 279His Glu Ala Leu His Ash His Tyr Thr Gin Lys Set Leu Set Leu Set Pro Giy Lys . 298基因序列2(SEQ ID NO2)SDF1-Fc重組基因的核苷酸序列(共978個(gè)核苷酸)AAGCTTGCCG CC AACGC CAAGGTCGTG GTCGTGCTGG TCCTCGTGCT GACCGCGCTC60TGCCTCAGCG ACGGGAAGCC CGTCAGCCTG AGCTACAGAT GCCCATGCCG ATTCTTCGAA120AGCCATGTTG CCAGAGCCAA CGTCAAGCAT CTCAAAATTC TCAACACTCC AAACTGTGCC180CTTCAGATTG TAGCCCGGCT GAAGAACAAC AACAGACAAG TGTGCATTGA CCCGAAGCTA240AAGTGGATTC AGGAGTACCT GGAGAAAGCT GGATCCCCCA AATCTTGTGA CAAAACTCAC300ACATGCCCAC CGTGCCCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC360CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG420GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG480CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC540GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC600AACAAAGCCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA660GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATCC CGGGATGAGC TGACCAAGAA CCAGGTCAGC720CTGACCTGCC TGGTCAAAGG CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT780GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCCTTC840TTCCTCTATA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA900TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT960CCGGGTAAA AGATCT978
基因序列3(SEQ ID NO3)SDF1-Fc重組基因的核苷酸序列及其氨基酸編碼序列ATG AAC GCC AAG GTC GTG GTC GTG CTG GTC CTC GTG CTG ACC GCG CTC TGC CTC AGC GAC60Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu Cys Leu Ser Asp20GGG AAG CCC GTC AGC CTG AGC TAC AGA TGC CCA TGC CGA TTC TTC GAA AGC CAT GTT GCC120GlyLys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala40AGA GCC AAC GTC AAG CAT CTC AAA ATT CTC AAC ACT CCA AAC TGT GCC CTT CAG ATT GTA180Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val60GCC CGG CTG AAG AAC AAC AAC AGA CAA GTG TGC ATT GAC CCG AAG CTA AAG TGG ATT CAG240Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln80GAG TAC CTG GAG AAA GCT GGA TCC CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG300Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Gly Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro100TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG360Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys120GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC420Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His140GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG480Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys160ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC540Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val LeuT hr Val180CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC600Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu200CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG660Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val220TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG720Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu240
GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG780Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu260AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC840Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser phe Phe Leu Tyr Ser280AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG900Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met300CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA960His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys . 319
權(quán)利要求
1.一種含基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1與免疫球蛋白-Fc段雙重生物活性的全新的SDF1-Fc蛋白質(zhì)；其特征在于該蛋白質(zhì)具有如基因序列表1所示的氨基酸序列。
2.一種制備權(quán)利要求1的SDF1-Fc蛋白質(zhì)的方法；其步驟包括a)以多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及重組基因工程方法構(gòu)建含有SDF1-Fc重組基因的表達(dá)載體；該表達(dá)載體的特征在于其具有如基因序列表2所示的SDF1-Fc重組基因核苷酸序列；b)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞及鑒定、檢測(cè)SDF1-Fc重組基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的分泌性表達(dá)；c)SDF1-Fc重組基因表達(dá)陽性細(xì)胞的篩選、擴(kuò)增培養(yǎng)及上清液的收集；d)以免疫親和層析柱法從收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離提取SDF1-Fc蛋白質(zhì)。
3.用權(quán)利要求1的SDF1-Fc蛋白質(zhì)為試劑盒成分進(jìn)行體內(nèi)或體外檢測(cè)SDF-1的特異性受體或配體表達(dá)水平的方法；其特征在于被檢測(cè)的受體或配體是以膜蛋白形式表達(dá)于細(xì)胞/組織中，或以流離降級(jí)的可溶性物質(zhì)形式存在于體液(如血清、血漿、唾液等)，或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。
4.用權(quán)利要求1的SDF1-Fc蛋白質(zhì)為吸附劑，體外分離或清除SDF-1特異性受體或配體表達(dá)陽性細(xì)胞或組織的方法。
5.權(quán)利要求3和4所述的特異性受體或配體包括天然的CXCR4及CXCR4變體如CXCR4-GFP重組基因等。
6.一種以權(quán)利要求1的SDF1-Fc蛋白質(zhì)為趨化物而建立的腫瘤細(xì)胞或炎癥反應(yīng)細(xì)胞體外遷移的模型；該模型的特征在于采用帶微孔隔離膜的雙層培養(yǎng)板，腫瘤細(xì)胞或炎癥反應(yīng)細(xì)胞加于隔離膜上層，SDF1-Fc蛋白質(zhì)加于隔離膜下層，微孔隔離膜孔經(jīng)大小為4-10um。
7.一種以權(quán)利要求6所述的體外遷移模型來篩選抗腫瘤細(xì)胞遷移或抗炎癥反應(yīng)細(xì)胞遷移藥物活性成分的方法。
8.用于權(quán)利要求6的被篩選物成分包括各類受體、配體、抗體、融合蛋白、脂肪、糖類、核苷酸、大分子有機(jī)合成物、小分子活性多肽、小分子無機(jī)化學(xué)合成物、活性氨基酸及衍生物、活性胺類物質(zhì)、脂類介質(zhì)、毒素、動(dòng)植物萃取物及代謝產(chǎn)物等。
9.一種以權(quán)利要求1所述的SDF1-Fc蛋白來干預(yù)人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)一重組基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明報(bào)道了一種含基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1與免疫球蛋白－Fc段雙重生物活性的多肽蛋白質(zhì)(SDF1－Fc)及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的SDF1－Fc蛋白質(zhì)為采用重組基因工程與細(xì)胞培養(yǎng)方法制備生產(chǎn)。本發(fā)明的SDF1－Fc蛋白質(zhì)可用于體內(nèi)外檢測(cè)SDF－1的受體如CXCR4的表達(dá)；用于吸附、分離清除CXCR4表達(dá)陽性的組織或細(xì)胞；用于干預(yù)人類免疫缺陷病毒(HIV)與CXCR4的結(jié)合。本發(fā)明的SDF1－Fc蛋白還可替代SDF－1用于建立腫瘤細(xì)胞或炎癥細(xì)胞的體外遷移模型。該體外遷移模型可用于抗腫瘤遷移或抗炎癥細(xì)胞遷移藥物成分的快速篩選。
文檔編號(hào)A61P31/18GK101016339SQ200610023808
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2006年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月9日
發(fā)明者徐一清, 陶飛龍, 胡紅群, 馬玲莎 申請(qǐng)人:上海思坦維生物技術(shù)有限公司