專(zhuān)利名稱(chēng)：透皮給藥增強(qiáng)劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及非擴(kuò)散的經(jīng)皮或透皮給藥。特別地，本發(fā)明是關(guān)于一種識(shí)別并篩選多肽的方法，該多肽能夠增強(qiáng)和/或方便任意治療性制劑和/或藥物的透皮，這些治療性制劑和/或藥物包括任何多肽，蛋白質(zhì)，多聚核苷酸、寡聚核苷酸(反義寡聚核苷酸制劑)、核酶、雙鏈RNA(dsRNAs)、小干擾RNA(siRNAs)、RNA干擾、基因治療載體、疫苗和任何常規(guī)藥物。本發(fā)明還涉及增強(qiáng)這些治療性制劑和藥物的經(jīng)皮或透皮給藥的組合物和方法。
背景技術(shù)：
作為人體最大的器官，皮膚提供了一個(gè)無(wú)痛并且合適的系統(tǒng)性給藥的介體(Prausnitz etal.，2004，Nature Rev.Drug Discov.3115；Thomas and Finnin，2004，Drug Discov.Today 9697；and Zaffaroni，1991，Ann.N.Y.Acad.Sci.618405)。然而，外來(lái)的分子，特別是大的親水分子，通過(guò)皮膚的穿透力是非常低的，這主要是由于角質(zhì)層的阻擋。角質(zhì)層是皮膚外表面由表皮細(xì)胞組成的獨(dú)特的富脂基質(zhì)分層結(jié)構(gòu)(Scheuplein and Blank，1971，Physiol.Rev.51702)。
許多化學(xué)滲透增強(qiáng)劑被用來(lái)試圖打開(kāi)皮膚屏障，但大多數(shù)效果不理想(Williams andBarry，2004，Adv.Drug Deliv.Rev.56603；Purdon et al.，2004，Crit.Rev.Ther. Drug CarrierSyst.2197；Kanikkannan et al.，2000，Curr.Med.Chem.7593；and Finnin and Morgan，1999，J.Pharm.Sci.88955)。如果沒(méi)有物理方法的幫助，化學(xué)透皮增強(qiáng)劑難以有效地將親水性藥物(特別是分子量＞500Da的藥物)透過(guò)未破壞的皮膚進(jìn)入到血液循環(huán)，并達(dá)到治療所需的血藥水平(Bos and Meinardi，2000，Exp.Dermatol.9165)。此外現(xiàn)有的化學(xué)透皮增強(qiáng)劑容易導(dǎo)致皮膚損傷、發(fā)炎、過(guò)敏、系統(tǒng)毒性等，在臨床上的使用大大受到限制。常用的物理方法有離子電滲(Kalia et al.，2004，Adv.Drug Deliv.Rev.56619；Hirvonen et al.，1996，Nat.Biotechnol.141710)、超聲(Lavon and Kost，2004，Drug Discov.Today 9670；Mitragotri et al.，1995，Science 269850)、微針(McAllister et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.10013755；Prausnitz，2004，Adv.Drug Deliv.Rev.56581)等，已證明對(duì)多種藥物有增進(jìn)透皮的效果。但物理方法有許多不足，包括需要特別儀器，成本高，劑型靈活性差，不同程度上有疼痛感，不適合家庭使用等。找到一個(gè)新奇的透皮增強(qiáng)物能克服這些限制是具有重大意義的，它能改變透皮給藥的現(xiàn)狀。
體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)的方法已被用來(lái)識(shí)別并篩選組織和器官的靶向多肽(Pasqualiniand Ruoslahti，1996，Nature 380364；Arap et al.，1998，Science 279377；Raffii et al.，2003，Cancer Cell 4331；Kolonin et al.，2004，Nature Med.10625)。通常，噬菌體展示技術(shù)描述了一種篩選技術(shù)，其中有多種(通常＞109)肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體病毒的外殼上并形成噬菌體文庫(kù)，噬菌體的遺傳物質(zhì)編碼這些多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸殘基(Sidhu et al.，2003，Chembiochem.414；Ferrer et al.，1999，J.Pept.Res.54，32；BouHamdan et al.，1998，J.Biol.Chem.2738009)，從而形成了每個(gè)不同的蛋白質(zhì)序列和編碼它的DNA的連接關(guān)系。通過(guò)體內(nèi)或體外平板上進(jìn)行的淘選過(guò)程(Whaley et al.，2000，Nature，405，665)，可以快速地找到與某種器官、組織或靶分子(如抗體、酶、細(xì)胞表面受體蛋白等)有特異性相互作用的肽或蛋白質(zhì)。在一個(gè)最簡(jiǎn)單的淘選方式中，將包被了靶向物質(zhì)的平板(或珠)與噬菌體展示多肽文庫(kù)一起進(jìn)行孵育，然后洗去沒(méi)有結(jié)合的噬菌體，并洗脫出特異結(jié)合的噬菌體。洗脫出的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，并且通過(guò)附加結(jié)合/擴(kuò)增循環(huán)，富集沉積池以利于序列結(jié)合。在3-4輪篩選后，用DNA測(cè)序和ELISA來(lái)表征單獨(dú)的克隆。然而體內(nèi)噬菌體展示的方法還沒(méi)有用于篩選有透皮能力的多肽。
已知許多藥物分子(Grama and Bouwstra，2002，J.Controlled Release 83253；Grams etal.，2004，J.Controlled Release 98367)，微球體(Rolland et al，1993，Pharm.Res.101783)和脂質(zhì)體(Li and Hoffman，1995，Nature Med.1795；Hoffman，1997，J.Drug Targeting 567)可以從毛孔滲入，毛囊逐漸被認(rèn)為是一個(gè)重要的藥物透皮通道(Lauer et al.，1995，Pharm.Res.12179；Agarwal et al.，2000，Methods Find.Exp.Clin.Pharmacol.22129)。
一類(lèi)可滲透膜的肽，稱(chēng)為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs；Joliot and Prochiantz，2004，NatureCell Biol.16189)，有報(bào)道能增進(jìn)蛋白質(zhì)和多肽藥物分子的表皮輸運(yùn)(Rothbard et al.，2000，Nature Med.61253；Schutze-Redelmeier et al.，2004，Vaccine 221985；Lopes et al.，2005，Pharm.Res.22750；Lim et al.，2003，J.Cosmet.Sci.54483)。然而PTDs只能局部性而不是系統(tǒng)性輸運(yùn)藥物，并且需要與被輸運(yùn)藥物聯(lián)系在一起(通常是共價(jià)相連)才能達(dá)到使藥物透過(guò)膜或表皮的效果。
因此，很需要開(kāi)發(fā)出新型的能克服上述諸多不足的透皮增強(qiáng)劑，從而有效增強(qiáng)和/或方便藥物穿過(guò)皮膚，使得進(jìn)入體循環(huán)的藥物量增加或者到達(dá)靶器官、組織和細(xì)胞的藥物量增加。此外，新型透皮增強(qiáng)劑應(yīng)不會(huì)導(dǎo)致皮膚損傷、發(fā)炎、過(guò)敏、系統(tǒng)毒性等，并能用于大分子量藥物如多肽、蛋白質(zhì)和核苷酸的透皮給藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種方法，通過(guò)噬菌體展示文庫(kù)篩選出具有增強(qiáng)透皮給藥能力的多肽。本發(fā)明的方法包括如下步驟(a)在動(dòng)物或人皮膚上任意區(qū)域涂用一個(gè)噬菌體展示多肽庫(kù)；(b)從上述動(dòng)物或人的循環(huán)系統(tǒng)、器官、組織以及細(xì)胞中回收噬菌體顆粒；(c)擴(kuò)增回收的噬菌體用于體內(nèi)篩選，進(jìn)行至少兩個(gè)循環(huán)；和(d)隨機(jī)挑選噬菌體平板、測(cè)序，以識(shí)別插入的編碼表達(dá)多肽的核苷酸序列。在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，應(yīng)用本發(fā)明的方法識(shí)別出的多肽具有編碼一個(gè)展示多肽CSSSPSKHC(TD-2，SEQ ID NO1)的核苷酸序列。攜帶該展示多肽的噬菌體顯示出能持續(xù)穿過(guò)皮膚屏障并到達(dá)血液以及其它組織的能力。
本發(fā)明中還提供了多肽及其類(lèi)似物的化學(xué)合成，這些類(lèi)似物包括體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)識(shí)別鑒定出的氨基酸序列。包括含有噬菌體展示肽的氨基酸序列的特定多肽及其類(lèi)似物，顯示出增強(qiáng)或方便藥物透皮或經(jīng)皮給藥的能力，這些藥物包括多肽、蛋白質(zhì)、多聚核苷酸、寡聚核苷酸(反義寡聚核苷酸制劑)、核酶、雙鏈RNA(dsRNAs)、小干涉RNAs(siRNAs)、基因治療載體和常規(guī)藥物。任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的這些多肽或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)技術(shù)，包括但不限于通過(guò)諸如重組技術(shù)等標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)表達(dá)肽或蛋白質(zhì)、從自然原料中分離肽或蛋白質(zhì)、或者化學(xué)合成這些肽或蛋白質(zhì)等，都包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，合成出一個(gè)序列為ACSSSPSKHCG(TD-1，SEQ ID NO2)的多肽。TD-1包括了TD-2的序列，即來(lái)源于噬菌體M13外殼蛋白上的TD-2序列加上兩個(gè)末端氨基酸A和G。在另一個(gè)實(shí)施例中，TD-1的多肽類(lèi)似物也被合成出來(lái)。這些多肽類(lèi)似物包括TD-4(ACSSSPSDHCG，SEQ ID NO3)，它是TD-1的一個(gè)單獨(dú)的氨基酸被替換(K→D)；TD-10(ACSSSSSKHCG，SEQ ID NO4)有一個(gè)在TD-1上的突變點(diǎn)(P→S)和TD-11(SSSPSKH，SEQ ID NO5)是由TD-1和/或TD-2序列中的7個(gè)氨基酸組成。已經(jīng)證實(shí)這些多肽及其類(lèi)似物具有增強(qiáng)或便于具有代表性的藥物的透皮給藥功能。在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，本發(fā)明證明了TD-1能夠提高或便于胰島素通過(guò)毛孔滲透的透皮給藥效果。
本發(fā)明也提供了編碼諸如多肽TD-2(SEQ ID NO1)、TD-1(SEQ ID NO2)、TD-10(SEQ ID NO4)、或者是它們的部分的分離的核苷酸、同系物和類(lèi)似物，或者在嚴(yán)格條件下雜交為編碼SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或者是它們的部分所示的氨基酸序列的核苷酸序列，都具有透皮給藥增強(qiáng)劑的功能。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了核苷酸、同系物和類(lèi)似物，包括編碼SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO4所示氨基酸序列、它們的部分、或者是它們的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種透皮給藥組合物，包括至少一種可達(dá)到治療疾病有效劑量的藥物活性試劑或藥物，和至少一種本發(fā)明中已識(shí)別的透皮給藥增強(qiáng)劑。組合物中提供的透皮給藥增強(qiáng)劑包括通過(guò)體內(nèi)噬菌體展示識(shí)別的氨基酸序列，既可以通過(guò)化學(xué)合成，也可以用本領(lǐng)域熟知的任何常規(guī)方式制備。在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，透皮給藥組合物含有一種透皮給藥增強(qiáng)劑，所述增強(qiáng)劑具有TD-2(SEQ ID NO1)，TD-1(SEQ ID NO2)，TD-10(SEQID NO4)所示的或其類(lèi)似物的多肽序列。
本發(fā)明的透皮給藥組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或者含有任何可接受的物質(zhì)的賦形劑，和/或一種或多種本領(lǐng)域熟知的添加劑。本發(fā)明的透皮給藥組合物也可制成溶液和/或適于局部和/或透皮給藥的劑型，和/或透皮貼片方式。
本發(fā)明也提供了一種非擴(kuò)散的方法，用于增強(qiáng)和/或方便一種所需藥物活性試劑和/或藥物的透皮或者經(jīng)皮給藥。這些方法包括本發(fā)明的至少一個(gè)透皮給藥增強(qiáng)劑與所需用量的至少一種所需的藥物活性試劑和/或藥物聯(lián)合給藥的步驟。為達(dá)到最大透過(guò)量，透皮給藥增強(qiáng)劑與藥物的劑量比例的變化取決于多種因素。在一個(gè)特定的較佳實(shí)施例中，透皮給藥增強(qiáng)劑和藥物的劑量比例是1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1，3∶1，3.5∶1，4∶1，4.5∶1，5∶1，5.5∶1，6∶1，6.5∶1，7∶1，7.5∶1，8∶1，8.5∶1，9∶1，9.5∶1，10∶1或更大。通過(guò)與本發(fā)明的透皮給藥增強(qiáng)劑聯(lián)合給藥，與沒(méi)有同透皮給藥增強(qiáng)劑聯(lián)合給藥相比，所需活性制劑或藥物穿透動(dòng)物或人的皮膚或者其他身體表面的效果有了極大的增強(qiáng)或便利。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，公開(kāi)了一種透皮給藥組合物，該組合物包括至少一種透皮給藥增強(qiáng)劑和至少一種所需的藥物活性制劑或藥物的混合物溶液，施用于動(dòng)物預(yù)先選好的皮膚表面上。
本發(fā)明還提供了一種增強(qiáng)了藥物局部給藥或者透皮給藥的藥物給藥系統(tǒng)，該藥物給藥系統(tǒng)包括(a)至少一個(gè)含有一種藥物和一種透皮給藥增強(qiáng)劑的藥庫(kù)，該透皮給藥增強(qiáng)劑的量能夠有效增強(qiáng)一定數(shù)量的所述藥物穿透皮膚或身體表面，以達(dá)到治療效果而不會(huì)造成傷害；(b)一個(gè)工具，用于維持所述系統(tǒng)中藥物和透皮給藥增強(qiáng)劑向皮膚或機(jī)體表面的輸送關(guān)系，并且形成機(jī)體表面-系統(tǒng)接觸面；和(c)一個(gè)襯底層，用于在所述工具的使用過(guò)程中作為外表面。
通過(guò)與本發(fā)明的透皮給藥增強(qiáng)劑的聯(lián)合給藥，一個(gè)很大范圍內(nèi)的藥物的透皮給藥都可以得到增強(qiáng)和/或變得便利。下面列舉了一些實(shí)施例。本發(fā)明提供了屬于能夠通過(guò)透皮給藥方式達(dá)到治療作用的藥物，它們能與本發(fā)明的透皮增強(qiáng)劑聯(lián)合給藥。


圖1說(shuō)明了噬菌體的透皮活性。顯示了從每毫升血中回收的噬菌體的平均值和SEM(標(biāo)準(zhǔn)誤差)。圖1A顯示了帶有TD-2肽的噬菌體和帶有對(duì)照肽AP-1的隨機(jī)噬菌體之間的比較結(jié)果。(n＝16.***，P＜0.001)。圖1B顯示了TD-1對(duì)帶有TD-2肽的噬菌體透皮活性的抑制作用。帶有展示肽TD-2的噬菌體和不同量的肽之間有局部聯(lián)合作用。試驗(yàn)中以AP-1為對(duì)照(n≥4)。
圖2顯示了大鼠體內(nèi)系統(tǒng)的胰島素透皮給藥。圖2A顯示了125I-胰島素的給藥。將125I-胰島素(5,000,000cpm)與不同劑量0，4，8，16微克的TD-1對(duì)正常鼠局部聯(lián)合給藥。聯(lián)合給藥后，測(cè)量了不同時(shí)間點(diǎn)全血的放射量。圖2B和2C顯示了治療水平的胰島素和TD-1的聯(lián)合給藥。豬胰島素(70μg)分別和500μgTD-1、500μgAP-1、0.5％SLA/PP、或無(wú)其他物質(zhì)對(duì)鏈霉素誘導(dǎo)的糖尿病老鼠進(jìn)行局部聯(lián)合給藥。附加兩組對(duì)照樣，分別是僅用500μg TD-1局部給藥或者皮下注射14μg胰島素。在給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)，測(cè)量血清胰島素濃度(圖2B)和血糖水平(圖2C)。血糖水平是與初始水平(0小時(shí))相比而定義的。顯示了平均值和SEM(血糖n＝6，胰島素n≥3)。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。圖2D和2E是TD-1肽的劑量響應(yīng)。豬胰島素(70μg)和不同劑量的TD-1對(duì)鏈霉素誘導(dǎo)的糖尿病老鼠進(jìn)行局部聯(lián)合給藥。測(cè)量了給藥前和處理5小時(shí)后的血清胰島素(圖2D)和血糖濃度(圖2E)。圖中顯示了平均值和SEM(血糖n＝6，胰島素n≥3)。圖2F和2G顯示了胰島素的劑量響應(yīng)。TD-1(500μg)和不同劑量的豬胰島素對(duì)鏈霉素誘導(dǎo)的糖尿病老鼠進(jìn)行局部聯(lián)合給藥。測(cè)量了給藥前和處理5小時(shí)后的血清胰島素(圖2F)和血糖水平(圖2G)。圖中顯示了平均值和SEM(血糖n＝6，胰島素n≥3)。
圖3顯示了人生長(zhǎng)激素的透皮給藥結(jié)果。重組人生長(zhǎng)激素(500μg，純度＞95％)，分別和100μg TD-1，500μg TD-1，100μg AP-1，或者生理鹽水對(duì)經(jīng)地塞米松處理的老鼠進(jìn)行局部聯(lián)合給藥。給藥后，用酶聯(lián)免疫試劑盒來(lái)檢測(cè)不同的時(shí)間點(diǎn)血清中生長(zhǎng)激素水平。圖中顯示了平均值和SEM(n≥3)。*P＜0.05。
圖4說(shuō)明了與TD-1一起局部聯(lián)合給藥能促進(jìn)阿樸嗎啡(APO)的透皮給藥。APO(0.8mg/kg)和TD-1(2.0mg/kg)以及AP-1(2.0mg/kg)聯(lián)合給藥。*P＜0.05***P＜0.0005(n≥3)。
圖5顯示了APO和TD-1透皮給藥分段分析結(jié)果。APO(0.8mg/kg)與TD-1(2.0mg/kg)聯(lián)合給藥。測(cè)量下面不同時(shí)間間隔APO誘導(dǎo)的陰莖勃起的次數(shù)0-30min，30-60min，60-90min and 90-120min。平均值和SEM如圖所示。(n＝32)，**P＜0.005，***P＜0.0005。結(jié)果表明APO誘導(dǎo)的陰莖勃起大部分是發(fā)生在APO透皮給藥后的第2個(gè)小時(shí)內(nèi)。
圖6顯示TD-1對(duì)APO的劑量響應(yīng)。APO(0.8mg/kg)分別與劑量為0mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg、2.0mg/kg和3.2mg/kg的TD-1聯(lián)合給藥給。測(cè)量給藥后上述劑量配比下APO誘導(dǎo)的陰莖勃起次數(shù)。平均次數(shù)和SEM如圖所示(n＝32)，*P＜0.05。
圖7表明了APO與TD-1聯(lián)合給藥時(shí)的劑量響應(yīng)。TD-1(0.8mg/kg)分別與不同劑量0mg/kg、0.08mg/kg、0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg和1.6mg/kg的APO聯(lián)合給藥。測(cè)量給藥后上述劑量配比下APO誘導(dǎo)的陰莖勃起次數(shù)。平均值和SEM如圖所示(n＝14)，*P＜0.05。
圖8說(shuō)明了TD-1促進(jìn)PT-141的透皮給藥結(jié)果。PT-141(160μg/kg)分別與TD-1(240μg/kg)和AP-1(240μg/kg)聯(lián)合給藥。分別測(cè)量在觀察的1小時(shí)內(nèi)PT-141誘導(dǎo)的陰莖勃起、追逐和騎跨次數(shù)。平均數(shù)和SEM如圖所示(n＝6)，*P＜0.001。
圖9顯示了促進(jìn)透皮給藥的TD-1的序列特異性。TD-1的多肽類(lèi)似物TD-4、TD-10和TD-11都是用傳統(tǒng)的化學(xué)方法合成。TD-1(500μg)和它的類(lèi)似肽TD-4(500μg)、TD-10(500μg)和TD-11(500μg)分別與胰島素(70μg)共同溶解在100μl生理鹽水中聯(lián)合給藥。檢測(cè)了聯(lián)合給藥前和給藥5小時(shí)后血清中胰島素和全血中血糖水平，分別如圖9A和9B所示。圖中顯示了平均值和SEM(血糖水平n＝6，血清胰島素水平n≥3)。
圖10顯示了TD-1的隨時(shí)間衰減的影響，說(shuō)明了TD-1促進(jìn)蛋白類(lèi)藥物透皮給藥的可能機(jī)制。TD-1(500μg)溶解在100μl生理鹽水中，局部給藥并停留5分鐘。然后用過(guò)量的生理鹽水仔細(xì)清洗皮膚。在延遲0分鐘，5分鐘，15分鐘和60分鐘后，用豬胰島素(70μg溶解在100μl生理鹽水)處理同樣的皮膚區(qū)域。檢測(cè)TD-1處理前和胰島素給藥后5小時(shí)的血清中胰島素水平和全血中血糖水平。以TD-1(500μg)與胰島素(70μg)聯(lián)合給藥為對(duì)照。圖中顯示了平均值和SEM(血糖n＝6，胰島素n≥3)。
圖11A到11H顯示了TD-1促進(jìn)胰島素-FITC從毛囊中滲透的情況。一前一后地顯示了可見(jiàn)光和熒光顯微圖。圖11A和11E顯示了胰島素-FITC(10μg)和TD-1(100μg)聯(lián)合給藥時(shí)的滲透情況。圖11B和11F展示的是胰島素-FITC(10μg)和AP-1(100μg)聯(lián)合給藥時(shí)的滲透情況。圖11D和11H展示的是胰島素-FITC(10μg)和0.5％SLA/PP溶解在生理鹽水中聯(lián)合給藥時(shí)的滲透情況。圖11C和11G展示的是胰島素-FITC(10μg)單獨(dú)溶解在生理鹽水中給藥時(shí)的滲透情況。圖中顯示了聯(lián)合給藥兩小時(shí)后皮膚縱切(圖A-D)和橫切(圖E-H)部分的顯微照片。圖11I到11L說(shuō)明了TD-1對(duì)胰島素-FITC從毛孔滲透的隨時(shí)間衰減的影響。TD-1(100μg)局部給藥5分鐘，然后用過(guò)量的生理鹽水清洗。等待一段時(shí)間，即0(I)、5(J)、15(K)或60(L)分鐘后，再用胰島素-FITC(10μg)在同樣的皮膚位置給藥。圖中顯示了皮膚的橫切圖。放大倍數(shù)為×200。(橫杠間隔＝100μm)。
圖12顯示了胰島素-FITC從毛孔滲透的情況。胰島素-FITC(10μg)和TD-1(100μg)在SD-處理后的老鼠的裸露腹部皮膚上聯(lián)合給藥。0分鐘(A)、30分鐘(B)、60分鐘(C)、2小時(shí)(D)、5小時(shí)(E)和24小時(shí)(F)后，用可見(jiàn)光和熒光顯微鏡觀察皮膚橫向切片(大約在皮膚表面以下600μm處)。放大倍數(shù)為×200。(橫杠間隔＝100μm)。
圖13顯示了用可見(jiàn)光和熒光顯微鏡觀察到的FITC標(biāo)記的TD-1(TD-1-FITC)從毛囊滲透的情況。A和C分別用皮膚橫切和縱切切片顯示了TD-1-FITC從毛囊滲透的情況，而B(niǎo)和D分別用皮膚橫切和縱切切片顯示了對(duì)照肽SC-1-FITC從毛囊滲透的情況。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明有以下關(guān)于其首選設(shè)備的詳細(xì)描述以及包含在其中的例子作為參考，將更易于理解。然而，在揭露和描述本發(fā)明中涉及的多肽、化合物、合成物及方法之前，有必要了解本發(fā)明并不僅僅適用于某一種核酸、多肽或蛋白質(zhì)，也不僅僅只適用于某一種細(xì)胞類(lèi)型、宿主細(xì)胞，條件和方法等，當(dāng)然，照那樣的話(huà)，可能會(huì)有所改變，且此中大量的修改變化將會(huì)在此項(xiàng)成熟的藝術(shù)中顯現(xiàn)出來(lái)。另外，也要了解僅用于此處描述專(zhuān)門(mén)設(shè)備的術(shù)語(yǔ)，這些限制并不是有意的。還要了解用在說(shuō)明和要求中的“一”可以一個(gè)或者更多，這取決于用該詞的上下文。因此，例如，涉及到的“一個(gè)細(xì)胞”可以指至少有一個(gè)細(xì)胞被利用。
本發(fā)明描述的是這樣一種方法，即應(yīng)用試管內(nèi)的噬菌體展示庫(kù)篩選來(lái)識(shí)別能提高透皮傳輸能力的展示肽。正如此處所用，“噬菌體展示庫(kù)”是指經(jīng)過(guò)基因工程化的噬菌體集合體通過(guò)表達(dá)一系列的多肽在其表面展示出來(lái)?！罢故倦摹庇梢粋€(gè)氨基酸連續(xù)序列組成，它包括在噬菌體表面展示的蛋白質(zhì)。而術(shù)語(yǔ)“多肽”是指至少由三個(gè)氨基酸用肽鍵連接起來(lái)的鏈，此鏈可以是線(xiàn)型的，有分支的，環(huán)形的或結(jié)合物。
本發(fā)明也供應(yīng)增強(qiáng)透皮治療劑運(yùn)送的化合物，它包括一種展示肽和與之對(duì)應(yīng)的治療方法組成。正如此處所用，這些展示肽通常都是由大約3到100個(gè)氨基酸殘基，應(yīng)該說(shuō)是3到20個(gè)氨基酸殘基，更確切的說(shuō)是由8到12個(gè)氨基酸殘基組成。在此，“氨基酸殘基”包含任何天然氨基酸，氨基酸衍生物或材料中已知氨基酸的模擬物。因此，噬菌體展示肽包含的氨基酸序列至少含有發(fā)現(xiàn)于天然蛋白中的20種氨基酸中的一種，或至少一種修飾過(guò)的或材料中已知的特殊氨基酸或以后要得到的氨基酸。
噬菌體庫(kù)的研究對(duì)象是用基因工程的方法表達(dá)不同氨基酸的大量展示肽，在使用該對(duì)象之后，是收集和鑒定該研究對(duì)象中的噬菌體顆粒。此處，“研究對(duì)象”是指哺乳動(dòng)物，如老鼠，兔子，人。噬菌體顆粒通常是從一個(gè)或多個(gè)器官組織，細(xì)胞，血液，尿，或其他各種體液中收集而來(lái)，在其中的一個(gè)首選方案中，噬菌體顆粒往往從一個(gè)或多個(gè)器官、組織、細(xì)胞、血液、尿液，或其他不同的體液中收集。在其中的一個(gè)首選方案中，在動(dòng)物皮膚噬菌體庫(kù)的論題制定之后，從血液循環(huán)中收集噬菌體顆粒，正是了那些包含多肽的噬菌體顆?？梢源┻^(guò)動(dòng)物皮膚進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。
從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上收集到的噬菌體顆粒表面表達(dá)的肽序列，能通過(guò)“平板生物技術(shù)”分離(Pasqualini and Ruoslahti，1996，Mol Psychiatry.1(6)423；Pasqualini，1999，J Nucl Med.40(5)883-8)，即在纖毛陽(yáng)性菌中，噬菌體顆粒能在生物平板上進(jìn)行體外繁殖。細(xì)菌不會(huì)被噬菌體所溶解，反而會(huì)分泌多拷貝的噬菌體以展示插入肽。執(zhí)行多輪的生物倒平板。插入展示肽的氨基酸序列是由噬菌體基因組中插入肽相對(duì)應(yīng)的DNA序列決定。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白化學(xué)技術(shù)，識(shí)別肽可生產(chǎn)成為合成肽(Arap et al.，1998，Science 279(5349)377-80)。
某些肽庫(kù)包含編碼肽的DNA序列，這些序列被插入到編碼噬菌體蛋白質(zhì)的基因中，其余的肽序列所給的某些部分由20種氨基酸隨機(jī)組合，另一部分則不是隨機(jī)組合。此處所描述的能增強(qiáng)透皮給藥的多肽的鑒定方法，是指噬菌體展示庫(kù)的體內(nèi)分配。以前，體內(nèi)篩選研究主要是小鼠的隨機(jī)肽庫(kù)，它與FUSE5載體中的基因III膜蛋白一起表達(dá)為融合蛋白(Pasqualini and Ruoslahti，1996，Mol Psychiatry.1(6)423)。在已知庫(kù)中給出的單克隆的數(shù)量和多樣性對(duì)于體內(nèi)成功篩選是一個(gè)有意義的因素。人們都更愿意用初始庫(kù)，這樣更不會(huì)表達(dá)過(guò)多的有缺陷的噬菌體克隆(Koivunen et al.，1999，J Nucl Med.140(5)883-8)。
在首選方案中，用到了一個(gè)Ph.D.TM-C7C噬菌體展示肽庫(kù)，該庫(kù)是新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(Mass，MA)提供的預(yù)制隨機(jī)肽庫(kù)之一。預(yù)制隨機(jī)肽庫(kù)，即Ph.D.庫(kù)，已用于無(wú)數(shù)應(yīng)用軟件，包括抗原決定部位的繪制(Ph.D.TM-C7C噬菌體展示肽庫(kù)工具箱[online]，[2005-09-01，重新得到]。重獲于網(wǎng)絡(luò)<URL:http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp>)，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)接觸鑒定(Rozinov and Nolan，1998，Chem.Biol.5713-28)，酶抑制劑(Rodi et al.，1999，J.Mol.Biol.285197-203)和GroEL GroEL(Kraft etal.，1999，J.Boil.Chem.2741970-85)，HIV(Koolpe et al.，2002，J.Biol.Chem.27746974-79；Mummert et al.，2000，J.Exp.Med.192769-79；Hetian et al.，2002，J.Biol.Chem.27743137-142；White et al，2001，Hypertension 37449-55)，半導(dǎo)體表面(Azzazy and Highsmith，2002，Clin.Biochem.35425-45)和小分子熒光團(tuán)(Binetruy-Tournaire et al.，2000，EMBO J.191525-33)以及藥物(Kragler et al.，2000，EMBO J.192856-68)肽配基的發(fā)現(xiàn)。生物活性受體配基已被平板抗純化受體(Gazouli et al.，2002，J.Pharmacol.Exp.Ther.303627-32；Romanczuk et al.，1999，Hum.Gene Ther.102615-26；Nicklin et al.，2000，Circulation 102231-37；Jost et al.，2001，F(xiàn)EBS Lett.489263-69)和逆完整細(xì)胞(Rasmussen et al.，2002，Cancer Gene Ther.9606-12；Tinoco et al.，2002，J.Biol.Chem.27736351-356；Stratmann etal.，2002，J.Clin.Microbiol.404244-50；Mourez et al.，2001，Nat.Biotechnol.19958-61)。針對(duì)專(zhuān)一細(xì)胞型的多肽已被體外倒平板分離，并用于特定細(xì)胞基因轉(zhuǎn)運(yùn)(Rodi et al.，2002，Curr.Opin.Chem.Biol.692-96；Lee et al.，2002，Arthritis Rheum.462109-20；Duerr et al.，2004，J.Virol.Methods 116177-80；Parmley et al.，1988，Gene 73305-18)。孢子模型的配基(Berggard et al.，2002，J.Biol.Chem.27741954-59)和細(xì)菌細(xì)胞也被這個(gè)系統(tǒng)所識(shí)別，包括在體內(nèi)和體外都可專(zhuān)門(mén)抑制炭疽熱的肽(Chen and Sigler，1999，Cell 99757-68)。組織特異性肽已經(jīng)通過(guò)體內(nèi)平板技術(shù)分離了，即將噬菌體注入動(dòng)物活體，獲得的相應(yīng)器官和從每種組織中分離出來(lái)的噬菌體(Biorn et al.，2004，Biochemistry 431928-38；Ferrer andHarrison，1999，J.Virol.735795-5802)。
Ph.D.-C7C庫(kù)的隨機(jī)片斷與一對(duì)Cys殘基側(cè)面相接，它在用二硫鍵進(jìn)行噬菌體裝配的過(guò)程中被氧化，導(dǎo)致展示肽以環(huán)狀呈現(xiàn)。該庫(kù)比較復(fù)雜，有多達(dá)20億的單克隆，該庫(kù)中的隨機(jī)肽序列在小衣殼蛋白PIII的N端表達(dá)，結(jié)果每個(gè)病毒有5個(gè)拷貝的展示肽。Ph.D.-C7C庫(kù)中的第一個(gè)隨機(jī)位置由Ala-Cys領(lǐng)先，該庫(kù)在展示肽和pIII之間還包含了一個(gè)短序列(Gly-Gly-Gly-Ser)(Ph.D.TM-C7C展示肽庫(kù)工具箱[online]，[重獲于2005-09-01]，獲于網(wǎng)絡(luò)<http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp>)。
在某個(gè)配置中，本發(fā)明提供了通過(guò)小鼠體內(nèi)噬菌體展示可以增強(qiáng)任何藥物和/或藥物活性劑的透皮給藥的多肽鑒定。在本發(fā)明中，其他的哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)，也可作為體內(nèi)噬菌體展示的研究對(duì)象，在首選配置中，多肽鑒定包括噬菌體展示肽庫(kù)的應(yīng)用，如PH.D.TM-C7C噬菌體展示庫(kù)，位于小鼠腹部皮膚。噬菌體顆粒在小鼠的血液循環(huán)中復(fù)原，并通過(guò)至少兩輪體內(nèi)篩選擴(kuò)大。篩選出的噬菌體斑再被隨機(jī)檢出，并測(cè)序，以識(shí)別首選方案中展示與噬菌體表面的多肽片段的編碼核苷酸序列。應(yīng)該指出的是，這里所用的噬菌體文庫(kù)能夠被用于動(dòng)物和人的任何皮膚，并且透皮的噬菌體能夠從動(dòng)物或人的身體循環(huán)、器官、組織、細(xì)胞中重新獲得恢復(fù)，如果噬菌體能穿越皮膚屏障到達(dá)這些組織。在首選方案中，證實(shí)了展示肽中包含了CSSSPSKHC(TD-2，SEQ ID NO1)。在論題制定之后，載有這種肽的噬菌體顯示出一直穿過(guò)皮膚障礙到達(dá)血液的能力。
本發(fā)明也提供了通過(guò)體內(nèi)噬菌體展示方法識(shí)別的氨基酸序列組成的多肽和類(lèi)似物。這種肽及類(lèi)似物顯示出提高和/或方便任何藥物，包括多肽、蛋白質(zhì)、多聚核苷酸、寡聚核苷酸(反義寡聚核苷酸制劑)、核酶、雙鏈RNA(dsRNAs)、小干涉RNAs(siRNAs)、RNA干涉、基因治療載體和常規(guī)藥物的透皮或經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)。在此處，術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”是指兩個(gè)有相同或相似功能的氨基酸，但它們是從不同的生物個(gè)體中發(fā)展而來(lái)。術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”也指不同生物體功能相似的器官或結(jié)構(gòu)而進(jìn)化起源各異。此外，此處的術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”還指母體化合物的結(jié)構(gòu)衍生物，它們通常只有單個(gè)元素的差異。在這里，“類(lèi)似物”這個(gè)詞指的是文章中基于對(duì)篩選的透皮肽的任何修改所得到得肽，包括不止是對(duì)一個(gè)或多個(gè)氨基酸側(cè)鏈的改變，或是一個(gè)或多個(gè)氨基酸被另外的氨基酸替代。
菌體展示方法鑒定展示肽是以氨基酸序列位基礎(chǔ)，任何多肽以及他們的類(lèi)似物，他們的序列可以通過(guò)任何已知的技術(shù)合成，但這些技術(shù)包括不限制于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)的表達(dá)重組，常規(guī)的肽或蛋白凈化和分離方法，或者是化學(xué)合成方法。與核苷及多肽的序列相應(yīng)的多種基因可通過(guò)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)查到，如國(guó)際生物技術(shù)信息基因銀行中心和由基因銀行翻譯得到的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(國(guó)際生物技術(shù)信息中心[網(wǎng)上]，.[查看2005-09-01]。也可查看這個(gè)網(wǎng)頁(yè)，URL:http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。另外，為商業(yè)準(zhǔn)備的蛋白多肽也可以利用這個(gè)技術(shù)的得知。
因本發(fā)現(xiàn)鑒定的展示肽都相當(dāng)短，故鑒定的展示肽的插入片段的多肽及其類(lèi)似物的氨基酸序列可用化學(xué)合成法或常規(guī)的方法合成。各種自動(dòng)合成器也可用各種商業(yè)用途并與眾所周知的草案一致。短的多肽，如6到35或50個(gè)氨基酸的多肽，都能用這些方法合成。另外，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的核苷酸編碼的蛋白及其類(lèi)似物用DNA重組技術(shù)合成后，能插入表達(dá)的載體，并能進(jìn)入和轉(zhuǎn)染適合的宿主細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下能表達(dá)。
也許可以用模擬肽為多肽和本發(fā)明類(lèi)似物的合成做準(zhǔn)備。模擬物是組成肽的分子，這些分子是組成肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬元素(Johnson等人在1993年生物工藝學(xué)和藥劑學(xué)報(bào)道，Pezzuto等人，Eds，Chapman和Hall在紐約也提到)。希望用這個(gè)模擬肽分子之間的交互作用類(lèi)似與普通的分子，并且可以用于產(chǎn)生二級(jí)肽分子結(jié)構(gòu)，這些二級(jí)肽不僅具有許多正常功能而且還擁有一些改變的甚至是改進(jìn)的特性。
在一個(gè)優(yōu)化的設(shè)備裝置中，具有ACSSSPSKHCG(TD-1，SEQ ID NO2)結(jié)構(gòu)肽的合成依賴(lài)與PH-1的序列，與其連接的A和G來(lái)源與M13的外殼蛋白。在另一個(gè)優(yōu)化裝置中Ttd-1的類(lèi)似肽也在合成。這些肽包括TD-1有一個(gè)單獨(dú)的氨基酸發(fā)生(K--D)的突變從而成為T(mén)D-4(ACSSSPSDHCG，SEQ ID NO3)，TD-10(ACSSSSSKHCG，SEQ ID NO4)是由TD-1發(fā)生一個(gè)特有位點(diǎn)的突變(P→S)形成，另外TD-11(SSSPSKH，SEQ ID NO5)也是由TD-1內(nèi)部的第七個(gè)氨基酸發(fā)生突變形成。具有增強(qiáng)或者有利于透過(guò)皮膚轉(zhuǎn)運(yùn)功能的代表肽藥物也有提供。
本發(fā)明同時(shí)提供包含氨基酸序列的融合肽，下面來(lái)加以介紹。被用于此的熔接肽包括對(duì)應(yīng)與TD-2(SEQ ID NO1)，TD-1(SEQ ID NO2)，TD-10(SEQ ID NO10)的氨基酸序列，對(duì)于全部或者大部分具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽或者蛋白來(lái)說(shuō)，其中的類(lèi)似物在N或者C終點(diǎn)更有利于連接。在這里二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽或者蛋白是指具有一定氨基酸序列并且不是完全等同于TD-2(SEQ ID NO1)，TD-1(SEQ ID NO2)，TD-10(SEQ ID NO10)，或者里面的類(lèi)似物，例如，肽或者蛋白不同于TD-2(SEQ ID NO1)，TD-1(SEQ ID NO2)，TD-10(SEQ ID NO10)，或者說(shuō)這里的類(lèi)似物來(lái)源于相同的或者不同的生物體。至于熔接肽，實(shí)施連接目的是表明組成PH-1(SEQ ID NO1)，TD-1(SEQ ID NO2)，TD-10(SEQ IDNO10)氨基酸，其中的氨基酸以及二級(jí)肽和蛋白被一一合成，從而每一個(gè)序列都有預(yù)期的功能再而形成有用的序列。
例如，融合也許可以利用從其它種類(lèi)得來(lái)的前導(dǎo)序列準(zhǔn)許異源宿主中蛋白的重組表達(dá)。融合的另一個(gè)作用包括免疫活性區(qū)的增加，如抗體的抗原決定簇，這有利于融合肽的純化。在融合連接處或其附近的分裂部位的包含物便于純化后外來(lái)肽的移除。其他的有用融合包括功能區(qū)域的連接，如酶的活性部位，糖基化區(qū)域，細(xì)胞目標(biāo)信號(hào)，或跨膜區(qū)域。在首選方案中，本發(fā)明中的融合蛋白由肽和/或類(lèi)似物組成，這些類(lèi)似物是由從體內(nèi)噬菌體展示中識(shí)別得到的展示肽的氨基酸序列組成，它與治療蛋白或肽相連接。蛋白或肽的例子可能會(huì)將融合肽并入，包括細(xì)胞生長(zhǎng)抑制蛋白，細(xì)胞殺傷蛋白，前細(xì)胞凋亡劑，抗血管收縮劑，激素，細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，多肽藥劑，抗體，F(xiàn)ab片段抗體，抗原，蛋白受體，酶，外源凝集素，MHC蛋白，細(xì)胞粘著蛋白和結(jié)合蛋白。這些例子并不意味著受限制，我們預(yù)想，事實(shí)上在本發(fā)明的范圍內(nèi)任何蛋白或肽都能并入由本發(fā)明中的肽或類(lèi)似物組成的融合肽。此外，在某些方案中，與沒(méi)有與肽和類(lèi)似物相融合的非融合蛋白或肽相比，本發(fā)明中的融合蛋白顯示出增強(qiáng)透皮滲透的能力，這正如此處所揭露。
在本申請(qǐng)中，合成融合肽/蛋白質(zhì)的方法對(duì)這些技術(shù)都是熟悉的。這種肽/蛋白可以被制成，如使用雙功能交叉連接試劑的化學(xué)聯(lián)結(jié)法，完全混合肽/蛋白的全基因組蛋白合成法，或標(biāo)準(zhǔn)DNA重組技術(shù)，它涉及到本發(fā)明中的一個(gè)DNA序列編碼的肽，正如此處所透露，與DNA序列編碼的第二個(gè)多肽或蛋白質(zhì)相結(jié)合，表達(dá)出可用的完整的肽/蛋白。如，編碼TD-2(SEQ ID NO1)，TD-1(SEQ ID NO2)，TD-10(SEQ ID NO10)多肽序列的DNA片段，或按傳統(tǒng)技術(shù)將其類(lèi)似物聯(lián)結(jié)在一起，如用平端或粘端作為聯(lián)結(jié)的終止點(diǎn)，酶的消化作用可以提供適宜的終止點(diǎn)，適當(dāng)?shù)奶畛湔扯?，堿性磷酸酶處理可以避免不合需求的聯(lián)結(jié)和酶的聯(lián)結(jié)。在另一項(xiàng)配置中，通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)包括DNA自動(dòng)合成器可以合成融合基因。可作為選擇的，基因片段的PCR擴(kuò)增可以使用引物來(lái)進(jìn)行，那樣可引起懸于兩段保守及基因片段間的互補(bǔ)，然后經(jīng)過(guò)退火和再擴(kuò)增產(chǎn)生空想出來(lái)的基因序列(如，見(jiàn)于Current Protocols in Molecular Biology，Eds.Ausubel et al.，1992，John Wiley & Sons)。再者，許多表達(dá)載體都已用于商業(yè)用途，并已經(jīng)編碼了融合部分(如GST polypeptide)。TD-2(SEQID NO1)，TD-1(SEQ ID NO2)，TD-10(SEQ ID NO10)的核苷酸編碼肽，或其類(lèi)似物可被克隆為這樣一個(gè)載體，即將融合部分與TD-2(SEQ ID NO1)，TD-1(SEQ ID NO2)，TD-10(SEQ ID NO10)編碼肽聯(lián)結(jié)，或就是類(lèi)似物本身。
在一個(gè)首選方案中，本發(fā)明中的多肽和類(lèi)似物可被分離或純化。蛋白質(zhì)純化技術(shù)在該材料中介紹得十分詳細(xì)。在同一水平上，這些技術(shù)涉及到細(xì)胞均質(zhì)化和初級(jí)分餾，組織或器官中的肽和非肽片斷。用層析和電泳技術(shù)可進(jìn)一步純化肽/蛋白質(zhì)，以達(dá)到部分或全部純化(或同質(zhì)純化)。特別適用于預(yù)制純肽分析方法是離子交換層析，凝膠排阻層析，親和層析，免疫親和層析和等電聚焦。純化多肽的一個(gè)特效方法是快速蛋白液相色譜(FPLC)或高效液相色譜(HPLC)。
一種純化的多肽是指從其他組分中分離出來(lái)的化合物，肽或蛋白質(zhì)純化的程度與其可獲得的天然狀態(tài)有關(guān)。肽的分離純化也指從某天然環(huán)境中釋放出來(lái)，一般說(shuō)來(lái)，“純化”是指一種多肽組分經(jīng)過(guò)分餾除去其他成分，而且這種多肽能夠充分地保持其天然生物活性。此處用到了術(shù)語(yǔ)“純化完全”，這個(gè)名稱(chēng)是指這種肽在混合物中在很大比例，如占到約50％，60％，70％，80％，90％，95％，或更多。
對(duì)多肽的純化程度定量的諸多方法已為學(xué)術(shù)界所知。如，決定活性片段的具體活性，或用SDS/PAGE分析估計(jì)片段中的多肽數(shù)量。許多適用于肽/蛋白純化的技術(shù)在我們這個(gè)領(lǐng)域都是十分成熟的技術(shù)。這些包括，硫酸銨沉淀，PEG，相似抗體，或熱變性，接下來(lái)是離心；色譜，如離子交換，凝膠過(guò)濾，反相，羥基磷灰石和親和色譜；等電聚焦；凝膠電泳；以及這些技術(shù)與其他技術(shù)的結(jié)合。正如學(xué)術(shù)界一般所知，大家都相信各種純化步驟的順序是可改變的，或某個(gè)步驟是可省略的，它依然是制備純化肽/蛋白的適宜方法。
一般，我們不要求肽和其類(lèi)似物總是要在純化狀態(tài)。事實(shí)上，人們都在思考，充分純化的蛋白產(chǎn)品在某些方案中用得較少。而在重組中通過(guò)使用較少的純化步驟得到的部分純品就可達(dá)到要求，或采用相同純化方案的不同形式。展示相對(duì)而言純化率較低的方法可能對(duì)蛋白產(chǎn)品的總體恢復(fù)或保持表達(dá)蛋白的活力有利。本發(fā)明企圖得到由多肽和藥物可攜帶載體組成的合成物。
在某些方案中，本發(fā)明的肽和其類(lèi)似物可能與成像制劑結(jié)合，這種制劑含有但不受限于熒光，或/和放射性同位技術(shù)結(jié)合，它同樣包含但不受限于125I，這樣都可用于成像，診斷和/或治療目的。許多合適的成像制劑和放射性同位素已為學(xué)術(shù)界所知，正如使它們聯(lián)結(jié)上多肽的方法。
本發(fā)明也通過(guò)體內(nèi)噬菌體展示法鑒定了單核苷酸/核苷，同源物和由編碼肽序列的核苷酸序列組成的類(lèi)似物。在此處，“核苷酸/核苷”可能來(lái)源于基因組DNA，互補(bǔ)DNA(cDNA)或合成DNA。術(shù)語(yǔ)“核苷酸/核苷”還包括線(xiàn)形或分支形，單鏈或雙鏈，化學(xué)修飾過(guò)的RNA/DNA，或RNA/DNA的雜交鏈。我們預(yù)想，在本發(fā)明范圍內(nèi)可能由長(zhǎng)達(dá)3-100或更多的核苷殘基組成，確切的說(shuō)是9-60個(gè)核苷殘基，更確切的說(shuō)，是24-36個(gè)核苷殘基。它需要結(jié)合一個(gè)表達(dá)載體，核苷酸也可能由天然內(nèi)顯子或來(lái)源于其他基因的內(nèi)顯子組成。稀有堿基，如肌苷，5-甲基胞嘧啶，6-甲基胞嘧啶，次黃嘌呤等也可用到。
“單”核苷酸分子是指從其他現(xiàn)有的天然核酸分子(如編碼其他多肽的序列)中充分分離出來(lái)的個(gè)體。確切的說(shuō)，“單”核酸是與復(fù)制子中天然核酸側(cè)面相接的一些序列的釋放(如，定位于核酸5’和3’末端的序列)。如，一個(gè)克隆的核酸被看成是分離出來(lái)的。如果一個(gè)核酸被人為的選擇，或定位于它的非天然部位，或把它通過(guò)農(nóng)桿菌感染法導(dǎo)入細(xì)胞，則認(rèn)為該核苷酸是被分離了。另外，“單”核酸分子，如一個(gè)cDNA分子，可以從與它有著天然聯(lián)系的細(xì)胞材料中釋放出來(lái)，或用重組技術(shù)生產(chǎn)的培養(yǎng)基，或化學(xué)合成時(shí)的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。
在此處，“同源體”被定義為有相似或完全相同核酸序列或氨基酸序列的兩個(gè)核酸或肽。更進(jìn)一步說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“同源體”包括由于基因編碼退化因此編碼相同氨基酸序列而與核苷序列不同的核酸分子。在一個(gè)首先方案中，同源物包括等位基因變量，orthologs，paralogs，agonists，和編碼TD-2(SEQ ID NO1)。
在本專(zhuān)利中，這個(gè)“orthologs”引用了兩個(gè)來(lái)自不同物種的核苷酸，但是它們又是由同一個(gè)古老的基因演化來(lái)的物種進(jìn)化而來(lái)的。一般說(shuō)來(lái)orthologs編碼的肽能發(fā)揮相同或相似的作用。更特別的是專(zhuān)利中的orthologs表達(dá)的一般可以展示至少80-85％，更多適宜的是85-90％，或者是90-95％，并且大多適宜在95％，96％，97％，98％，其中99％是一致的，甚至100％順序是一致的，TD-2(SEQ ID NO1)，TD-1(SEQ ID NO2)，TD-10(SEQ IDNO4)會(huì)表達(dá)所有的或部分的的氨基酸序列而其中的analogs將會(huì)表達(dá)這些肽的功能。確切的說(shuō)，此項(xiàng)發(fā)明中的orthologs是透皮增強(qiáng)劑。更確切的說(shuō)，現(xiàn)在的ortholog能夠提高或便于任何藥物的透皮。同樣的在這里，“paralogs”涉及了兩種核苷酸，它們與內(nèi)部的一個(gè)基因組的復(fù)制是有關(guān)系的。Paralogs通常有不同的功能，但是這些功能是有一定聯(lián)系的(Tatusov et al.，1997，Science 278(5338)631-637)。
正如上面規(guī)定的，此專(zhuān)利包括TD-2(SEQ ID NO1)，TD-1(SEQ ID NO2)，TD-10(SEQ ID NO4)，和它們的同源體與類(lèi)似物。為了確定兩個(gè)氨基酸的序列的同源序列的百分比(例如一個(gè)SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、或SEQ ID NO4的序列和它的一個(gè)突變異種)，這些序列排列在一起以便于進(jìn)行最佳的比較目的(例如能在一段多肽序列中引進(jìn)一些缺口以和其他的多肽或者核苷酸進(jìn)行結(jié)合)。這時(shí)在相應(yīng)位置上的氨基酸殘基片段就能進(jìn)行對(duì)比。當(dāng)一段序列上的一個(gè)氨基酸片段的位置(例如一段序列是SEQ ID NO1、SEQID NO2或SEQ ID NO4)被另一段其它序列中相應(yīng)位置的相同氨基酸殘基占據(jù)后(例如一個(gè)由多肽序列選擇出來(lái)的突變異種SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4)，這時(shí)在那個(gè)位置上的分子就被確定了。同樣類(lèi)型的對(duì)比也能在兩個(gè)核苷酸序列中進(jìn)行。
兩個(gè)序列的同一性的百分比能確定序列中的同一位置上的數(shù)量(例如序列的相似度＝相似位置的數(shù)量/所有的位置的數(shù)量×100)。適宜的情況是，本文中包括單獨(dú)的氨基酸同源體至少在大約50-60％，適宜的至少在大約60-70％，更加適宜的至少在大約70-75％，75-80％，80-85％，85-90％或90-95％，最適宜的至少在大約96％、97％、98％、99％或者在整個(gè)SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4序列中展示的氨基酸序列。在其他的具體情況下，同源體的氨基酸序列至少有5個(gè)相近的氨基酸片段，更適宜的情況是有8個(gè)相近的氨基酸片段，更適宜的情況是在SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4序列中有至少11個(gè)相近的氨基酸片段。在另外一種具體情況下，氨基酸同族體有至少5，6，7，8，9，10，11鄰近的氨基酸殘基的序列相似性，更適宜的是8，9，10，11鄰近的氨基酸殘基的序列相似，最好是11鄰近的氨基酸殘基的序列相似，這些氨基酸殘基是SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中的序列。
在另外一個(gè)首選的具體情況下，本專(zhuān)利中一個(gè)單獨(dú)的核苷酸同源體包含了一個(gè)核苷序列，這個(gè)核苷序列至少有大約在40-60％，適宜的至少大約在60-70％，更適宜的至少大約在70-75％，75-80％，80-85％，85-90％或90-95％，甚至有些至少在大約95％、96％、97％、98％、99％或者更多的核苷序列編碼的氨基酸序列，它們是在SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中的。
本專(zhuān)利中編碼氨基酸序列TD-2、TD-1或TD-10的單獨(dú)氨基酸的同源體在SEQ IDNO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中展示出來(lái)了，分別地，它的一部分，至少有90％，更適宜的是，和SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列有大約95％相同，它們的作用是作為透皮增強(qiáng)劑。
兩個(gè)核苷酸序列或者多肽序列的相似百分比在本文章中都是已表明。例如，Vector NTI6.0(PC)軟件包(InforMax，7600 Wisconsin Ave.，Bethesda，MD 20814)可以用來(lái)確定兩個(gè)核苷酸或者多肽序列的相似度。在這種方法中，一個(gè)15個(gè)殘基的缺口和一個(gè)有6.66的缺口延伸被用來(lái)確定兩個(gè)核苷酸之間的相似度。一個(gè)10個(gè)氨基酸殘基的缺口和一個(gè)有0.1的缺口延伸被用來(lái)確定兩個(gè)多肽之間的相似度。所有其他的參數(shù)都是默認(rèn)的設(shè)置。對(duì)于多重排列來(lái)說(shuō)(Clustal W algorithm)，需要10個(gè)氨基的缺口，缺口延伸是0.05with blosum62matrix。當(dāng)比較一個(gè)DNA序列和一個(gè)RNA序列的時(shí)候，序列相似性的作用就發(fā)揮了，胸腺嘧啶核苷相當(dāng)于一個(gè)尿嘧啶核苷。
在另一方面，本專(zhuān)利中提供了一個(gè)單獨(dú)的的核苷酸與一個(gè)核苷序列的比較，此核苷能和SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中的編碼氨基酸序列的核苷雜交，并且是分別在劇烈的條件下進(jìn)行。更顯著的是，本專(zhuān)利中一個(gè)單獨(dú)的核苷酸分子要至少有15個(gè)核苷的長(zhǎng)度，在劇烈條件下和一個(gè)核酸分子雜交，此核苷酸分子由SEQ ID NO1、SEQ IDNO2或SEQ ID NO4.中編碼的氨基酸序列的一個(gè)核苷序列組成。在其他的具體情況下，核酸長(zhǎng)度至少要有15，18，21，24，30，33，或者更多的核苷。更適宜的是，本專(zhuān)利中的一個(gè)單獨(dú)的核酸同源體由一個(gè)核苷序列組成，次核苷序列時(shí)在劇烈條件下與SEQ ID NO1、SEQID NO2或SEQ ID NO4中編碼氨基酸序列的核苷進(jìn)行雜交，其功能是作為透皮增強(qiáng)劑。
在這里，關(guān)于DNA雜交形成DNA點(diǎn)，“劇烈條件“這個(gè)詞涉及在10×Denhart’s溶液，6×SSC，0.5％SDS，和100μg/ml變性salmon sperm DNA中60℃過(guò)夜雜交，DNA點(diǎn)不斷地在62℃用3×SSC/0.1％SDS每次洗滌30分鐘，接著用1×SSC/0.1％SDS洗滌，最后用0.1×SSC/0.1％SDS洗滌。此專(zhuān)利中，在一個(gè)具體情況下，“劇烈條件”這個(gè)詞組涉及65℃在6×SSC溶液中雜交。在另一個(gè)條件下，“極度劇烈條件”涉及在10×Denhart’s溶液，6×SSC，0.5％SDS，and 100μg/ml變性salmon sperm DNA中65℃過(guò)夜雜交。DNA點(diǎn)不斷地在65℃用3×SSC/0.1％SDS每次洗滌30分鐘，接著用1×SSC/0.1％SDS洗滌，最后用0.1×SSC/0.1％SDS洗滌。核苷酸雜交的方法在Meinkoth and Wahl，1984，Anal.Biochem.138267-284；Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2，Ausubel et al.，eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1995；and Tijssen，1993，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2，Elsevier，New York，1993.中有描述。
用以上描述的方法，和文章中其它已知的技術(shù)，文章中一個(gè)常用的技術(shù)分離透皮增強(qiáng)劑的一個(gè)同源物，此透皮增強(qiáng)劑由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中展示的氨基酸序列組成。這些同源物的一些是等位基因的變化體。在這里，“等位基因突變體”涉及包含多態(tài)性的核苷序列，這些核苷序列不用改變功能活性就能導(dǎo)致SEQ ID NO1、SEQID NO2或SEQ ID NO4中氨基酸序列的改變。這些等位基因突變體可以導(dǎo)致SEQ IDNO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4編碼的核苷酸中的1-5％變異。
此外，使核苷酸序列中發(fā)生突變來(lái)進(jìn)一步鑒定此項(xiàng)技術(shù)，這些核苷酸序列編碼SEQ IDNO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4，或它們的類(lèi)似物中的氨基酸序列。例如，在非必要的氨基酸殘基中，一個(gè)序列可以編碼SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4，或它們的類(lèi)似物中的氨基酸序列，這個(gè)序列核苷替代導(dǎo)致的氨基酸的替代。非必要的氨基酸殘基可以在不改變它形成的肽的活性的條件下，發(fā)生替代或改變。相反，一個(gè)“必需”氨基酸殘基是這些肽活性所必需的，例如，這些能提高或方便藥物透皮的肽。
因此，本專(zhuān)利的另一方面是關(guān)于編碼透皮增強(qiáng)劑的核酸分子的。透皮增強(qiáng)劑中包含透皮增強(qiáng)活性非必需的氨基酸，這些氨基酸發(fā)生變化不會(huì)影響其活性。改變SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4，或它們的類(lèi)似物中的氨基酸序列，可以得到一系列透皮增強(qiáng)肽的衍生物，它們只是有氨基酸序列的差別。然而，改變以后仍有透皮活性的衍生物會(huì)在這里闡述。在一項(xiàng)具體的研究中，單獨(dú)的核酸分子由編碼肽的核苷酸序列組成，其中肽由至少與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4，或它們的類(lèi)似物的氨基酸序列50％相同的氨基酸組成。肽由與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4，或它們的類(lèi)似物的氨基酸序列至少50％相同是很適宜的。至少有60-70％相似更有效了，70-75％，75-80％，80-85％，85-90％或90-95％相似也更有效，與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4，或它們的類(lèi)似物的氨基酸序列有96％，97％，98％或99％相同是最有效的。本專(zhuān)利中，透皮增強(qiáng)劑類(lèi)似物揭示它們也參與透皮給藥的增強(qiáng)。
編碼透皮增強(qiáng)劑的核苷酸與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4，或它們的類(lèi)似物的氨基酸序列有序列相似性。通過(guò)替代、插入、或刪除編碼SEQ ID NO1、SEQ IDNO2或SEQ ID NO4，或它們的類(lèi)似物的肽序列的核苷酸可以產(chǎn)生這些透皮增強(qiáng)劑的衍生物。這些衍生物中，都是一個(gè)或更多的氨基酸發(fā)生替代、插入、或刪除，這些變化引入編碼的多肽和(或)氨基酸側(cè)鏈被替代的多肽。編碼SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQID NO4，或它們的類(lèi)似物的肽序列的核苷酸通過(guò)常用技術(shù)使其發(fā)生變異，例如位置變異和PCR介導(dǎo)的變異。一個(gè)或多個(gè)推測(cè)的非必需氨基酸殘基中有保守氨基酸的替代。“保守氨基酸替代”是一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)側(cè)鏈相似的氨基酸殘基替代。
含有相似氨基酸側(cè)鏈的氨基酸家族在文章中有定義。這些氨基酸家族包括堿性側(cè)鏈(如，賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈(如，天氡氨酸、谷氨酸)，極性側(cè)鏈(如，甘氨酸、天氡酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β分支側(cè)鏈(如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)，和芳香族側(cè)鏈(酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸)。因此，在透皮增強(qiáng)肽中的一個(gè)推測(cè)的非必需氨基酸殘基被相同的側(cè)鏈家族中的另一個(gè)氨基酸殘基替代。在另一項(xiàng)具體研究中，透皮增強(qiáng)劑的整個(gè)或部分肽序列中隨機(jī)發(fā)生突變，例如浸透突變和合成突變，合成突變通過(guò)對(duì)增強(qiáng)透皮給藥的活性來(lái)篩選，鑒定突變體保持提高透皮活性。接下來(lái)的編碼SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中肽序列的核苷酸序列的變異，重組表達(dá)的肽和肽活性能通過(guò)分析藥物透皮活性來(lái)確定。
本專(zhuān)利中的核苷可通過(guò)很多方法產(chǎn)生，如基因預(yù)備，cDNA預(yù)備，體外合成，RT-PCR，和體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄。這些肽包含噬菌體展示的肽，它們的變種和變異，或融合肽/蛋白。編碼適當(dāng)氨基酸序列的核苷酸序列編碼這些肽。編碼一個(gè)需要的氨基酸序列的核苷酸的設(shè)計(jì)和產(chǎn)生，在文章中是基于標(biāo)準(zhǔn)的密碼子的方法來(lái)進(jìn)行。編碼每個(gè)氨基酸的密碼子的篩選可能被改變，使宿主細(xì)胞核苷酸的表達(dá)最佳化。不同種類(lèi)的宿主細(xì)胞的密碼子的參數(shù)選擇在文章中已提到。
本專(zhuān)利進(jìn)一步提供了透皮給藥合成物使至少一種制劑或藥物在有效劑量上有藥物療效，不論是在局部或系統(tǒng)上，并且至少在足夠劑量的透皮增強(qiáng)劑可以提高或便于藥物制劑和藥物經(jīng)皮膚或人和動(dòng)物的其它體表給藥。如上述，透皮增強(qiáng)劑是體內(nèi)噬菌體展示得到肽序列組成的合成物。在一個(gè)適宜的情況下，透皮給藥合成物是由含有TD-2(SEQ ID NO1)，TD-1(SEQ ID NO2)，TD-10(SEQ ID NO4)或它們類(lèi)似物的肽序列的肽組成。
在這里我們習(xí)慣使用一些術(shù)語(yǔ)藥學(xué)活性制劑，治療制劑，活性制劑，或藥物交替的使用指的是化學(xué)材料或復(fù)合物能夠?qū)е吕硐氲乃幚韺W(xué)與生理學(xué)效應(yīng)和那些治療效果，預(yù)防效果與美容效果制劑。術(shù)語(yǔ)也包含可以接受，活性的藥理學(xué)衍生物和在這里特別提到這些活性制劑的類(lèi)似物，包括鹽類(lèi)，脂類(lèi)，胺類(lèi)，原料藥，主動(dòng)代謝物，復(fù)合物的配體，類(lèi)似物與其它。當(dāng)我們使用一些術(shù)語(yǔ)藥學(xué)活性制劑，活性制劑，藥物，可以被理解為申請(qǐng)者想要包括可以接受，活性的藥理學(xué)鹽類(lèi)，脂類(lèi)，胺類(lèi)，原料藥，主動(dòng)代謝物，復(fù)合物，類(lèi)似物與其它，在這里這些被共同理解為可以接受藥理學(xué)衍生物。術(shù)語(yǔ)活性制劑傾向于指的是那些沒(méi)有毒性有藥學(xué)或類(lèi)似藥物的特性的美容活性制劑，當(dāng)應(yīng)用于皮膚表面時(shí)有益的改善了皮膚的生物學(xué)功能。
在這里當(dāng)我們習(xí)慣使用藥學(xué)活性制劑可以是適合局部或透皮釋放的一些能夠?qū)е吕硐氲木植炕蛳到y(tǒng)的效果復(fù)合物或傳統(tǒng)藥物。一些物質(zhì)包括許多復(fù)合物或藥物能夠正常的通過(guò)包括皮膚在內(nèi)的身體表面和其它膜系統(tǒng)。而令我們感興趣是活性制劑可以包括更多的種類(lèi)與可以仿效的得到有趣的種類(lèi)老年癡呆藥物；止痛制劑如鎮(zhèn)靜劑；麻醉劑；抗粉刺劑；抗憂(yōu)慮藥；抗風(fēng)濕藥；抗心律失常藥；平喘藥和其它呼吸系統(tǒng)藥物；抗生素包括抗細(xì)菌制劑；抗癌制劑，包括抗腫瘤藥；副交感神經(jīng)拮抗劑；抗驚厥藥；抗糖尿病藥(如胰島素)；抗痢疾藥；止吐藥；抗真菌藥；青光眼治療制劑；驅(qū)蟲(chóng)藥；抗組胺制劑；抗高血脂藥；抗高血壓藥；抗感染藥如抗生素和抗病毒藥；抗炎藥；治療偏頭痛制劑；抗嘔吐藥；抗腫瘤藥，鎮(zhèn)靜劑；治療帕金森氏制劑；止氧藥；安定藥；退熱藥；抗風(fēng)濕制劑；抗驚厥藥；抗結(jié)核藥；止吐藥；抗?jié)兯帲豢共《緞?；抗憂(yōu)慮藥；促進(jìn)飲食藥與抑制飲食藥；注意力不集中或不高度集中藥；良性前列腺肥大藥；b受體阻滯藥；抗心律失常藥；骨密度調(diào)制劑；心血管藥包括鈣離子拮抗劑；中樞神經(jīng)藥；中樞神經(jīng)藥刺激藥；降脂藥；咳嗽與感冒制劑；包括抗充血藥；利尿藥；性功能障礙藥；脂肪酸；胃腸制劑；基因藥物；補(bǔ)血藥；止血藥；中草藥；細(xì)胞溶解酶；催眠藥；骨鈣化不全藥；血糖過(guò)低藥；免疫抑制劑；白三烯抑制劑；有絲分裂抑制劑；肌肉松弛藥，抗成癮藥，尼古丁，營(yíng)養(yǎng)制劑，例如，維生素，微量元素，必需氨基酸和脂肪酸，運(yùn)動(dòng)病藥，鎮(zhèn)痛促進(jìn)藥，副交感神經(jīng)阻滯藥，肽類(lèi)藥物，前列腺素，生理心理制激藥，鎮(zhèn)靜藥，復(fù)合胺拮抗物，組胺受體拮抗劑與激動(dòng)劑，類(lèi)固醇和其他代謝制劑例如，生衰激素；擬交感神經(jīng)藥；甲狀腺素制劑；催產(chǎn)藥；催產(chǎn)拮抗藥；Tourette’s綜合癥制劑；鎮(zhèn)定劑；血管擴(kuò)張素包括冠狀動(dòng)脈，外周與腦血管擴(kuò)張藥；疣制劑和其類(lèi)似物和調(diào)節(jié)劑/藥物。
在這里提到的藥學(xué)活性制劑也指的是一些寡聚核苷酸(反義核苷酸制劑)多聚核苷酸(如治療DNA)，核酶、雙鏈RNA(dsRNAs)、小干涉RNAs(siRNAs)、RNA干涉，基因治療載體，使用的疫苗。術(shù)語(yǔ)“反義寡聚核苷酸制劑”指的是短的合成的DNA或RNA片斷，通常指的是寡聚核苷酸，特定的mRNA的互補(bǔ)鏈通過(guò)結(jié)合到mRNA特定序列阻止目標(biāo)mRNA的翻譯。反義寡聚核苷酸用于反義技術(shù)的使用與發(fā)展。術(shù)語(yǔ)“反義技術(shù)”藥物的發(fā)現(xiàn)與建立技術(shù)涉及到設(shè)計(jì)與使用目標(biāo)mRNA的互補(bǔ)鏈抑制特異的疾病蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。事實(shí)上所有的疾病與蛋白質(zhì)產(chǎn)生不足或過(guò)量表達(dá)有關(guān)。傳統(tǒng)的小分字藥物設(shè)計(jì)是與疾病相關(guān)蛋白相互作用并且抑制其功能，相比而言反義技術(shù)設(shè)計(jì)的藥物稱(chēng)謂反義核苷酸在基因水平干涉并且抑制疾病相關(guān)蛋白的產(chǎn)生。反義核苷酸制劑建立在基因信息水平。
作為反義核苷酸制的替代，核糖體酶或雙鏈RNA(dsRNA)，干涉RNA(RNAi)和/或小干涉RNA(siRNA)，也能夠作為透皮釋放的藥學(xué)活性制劑。在這里提到的術(shù)語(yǔ)“核糖體酶”指的是具有核糖核酸酶活性能夠分解RNA底物，具有剪切單鏈核苷酸的能力例如mRNA，核糖體酶能夠用來(lái)剪切mRNA的轉(zhuǎn)錄從而抑制mRNA的翻譯。這里提到的術(shù)語(yǔ)雙鏈RNA含有兩條鏈的雜和RNA。雙鏈RNA在結(jié)構(gòu)上可以是線(xiàn)形的也可以是環(huán)形的，雙鏈RNA可以含有核糖核苷酸，雙核糖核苷酸類(lèi)似物如2’-甲氧核糖核苷酸，或其類(lèi)似物。術(shù)語(yǔ)“干涉RNAi”指的是RNA干涉或轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。術(shù)語(yǔ)“小干涉RNA”指的是小的雙鏈RNA分子(例如21-23核苷)是干涉RNA中調(diào)節(jié)子。干涉RNA被誘導(dǎo)產(chǎn)生通過(guò)導(dǎo)入體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長(zhǎng)的雙鏈RNA片斷(1-2kb)成功的用于減少許多組織器官的基因表達(dá)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，干涉RNA作為小干涉RNA(例如22個(gè)長(zhǎng)的核苷酸)結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的沉默基因復(fù)合體(RISC)，因此能夠結(jié)合任何可以匹備mRNA序列導(dǎo)致了mRNA降解，因而沉默了基因。
在這里提到藥學(xué)活性制劑也包括基因治療中使用的載體或病毒。術(shù)語(yǔ)“基因治療”指的是糾正疾病相關(guān)缺陷基因的技術(shù)。這種技術(shù)可以包括插入一個(gè)正常基因片斷到基因組非特殊位點(diǎn)取代非正?；?；通過(guò)同源重組用正?；蚪粨Q非正常基因修復(fù)非正?；蚧謴?fù)其功能并且改變或調(diào)節(jié)基因表達(dá)和特別的基因功能。在許多基因治療中插入正?；虻交蚪M中取代非正常基因或致病基因。在這里提到的術(shù)語(yǔ)“載體/病毒”指的是一個(gè)載體分子攜帶與釋放“正?！敝委熁虻讲∪说哪繕?biāo)細(xì)胞。因?yàn)椴《驹诎l(fā)病機(jī)制上已進(jìn)化成壓縮并釋放它們的基因進(jìn)入人類(lèi)的細(xì)胞，許多普通的基因治療載體是病毒在遺傳上作了改變攜帶人類(lèi)DNA。在這里基因治療病毒/載體包括逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，與單純皰疹病毒。逆轉(zhuǎn)錄酶病毒指的是一類(lèi)病毒家族從RNA基因組形成雙鏈DNA并且插入宿主染色體中，例如人類(lèi)免疫缺陷病毒是逆轉(zhuǎn)錄酶病毒。腺病毒指的是一類(lèi)雙鏈DNA病毒家族能夠引起人類(lèi)呼吸道、腸道、眼的感染一類(lèi)病毒，例如導(dǎo)致普通感冒的是腺病毒。腺病毒相關(guān)病毒指的是一類(lèi)小的、單鏈DNA病毒它們能夠插入遺傳物質(zhì)在19號(hào)染色體上。單純皰疹病毒指的是一類(lèi)雙鏈DNA病毒家族感染特殊的細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞。單純皰疹病毒I是導(dǎo)致皰疹普通人類(lèi)病原體。
在這里藥學(xué)活性制劑也指疫苗含有削弱或殺死的微生物(如細(xì)菌、病毒等)應(yīng)用于預(yù)防、改善、治療傳染病。在這里提到的“疫苗”產(chǎn)生免疫力防止軀體感染疾病。當(dāng)前疫苗是通過(guò)注射、口服、氣霧劑應(yīng)用。在這里提到的一些普遍應(yīng)用的疫苗和正在研究范圍的疫苗。有趣的疫苗但也不局限于止流感疫苗，甲、乙、丙肝炎病毒疫苗，麻疹—腮腺炎—風(fēng)疹疫苗，破傷風(fēng)—白喉疫苗，水痘疫苗，鼠疫疫苗，和其它疫苗。
應(yīng)用活性制劑也可能是化妝品或美容效果。例如包括一些制劑，復(fù)合物減少皮膚化與化學(xué)損傷，例如，α-羥自由基，α-酮類(lèi)，多羥基增濕劑，膠原，海產(chǎn)提取物和抗氧化劑，如抗壞血酸(維生素C)，α-生育酚(維生素E)，β-維生素E，γ-維生素E，δ-維生素E，ε維生素E，θ1-維生素E，θ2-維生素E，σ-維生素E和視黃醇(維生素A)，和/或可以接受化妝品上的鹽類(lèi)，酯類(lèi)，氨基化合物類(lèi)，或其他衍生類(lèi)似物。另外化妝品制劑包括一些能夠提高皮膚組織的供氧。
在這里應(yīng)用藥學(xué)活性劑“效應(yīng)量”或“治療效應(yīng)量”術(shù)語(yǔ)指的是自己能夠提供有效治療作用但沒(méi)有毒副作用。特別的活性劑或制劑與其類(lèi)似物的有效糧食可以刻變得從一個(gè)個(gè)體到另一個(gè)個(gè)體，依賴(lài)于年齡和個(gè)體的一般條件。因此不可能是有詳細(xì)說(shuō)明準(zhǔn)確的有效量。然而，一個(gè)合適的在個(gè)體中的有效量是能夠被決定常規(guī)實(shí)驗(yàn)。而且，準(zhǔn)確的活性劑效量應(yīng)結(jié)合本發(fā)明成分與劑型在這里不評(píng)論。只要應(yīng)用已準(zhǔn)備好的溶液或制劑足夠的濃度，目的是釋放活性劑在有效的范圍內(nèi)。
在這里提到，“足夠地增加釋放量”術(shù)語(yǔ)指的是無(wú)毒性，無(wú)損傷，但是足夠地增強(qiáng)物能提供理想皮膚通透性和足夠透皮深度，應(yīng)用比率與足夠地藥物釋放，在這里提到“增強(qiáng)皮膚釋放”術(shù)語(yǔ)，指的是已選擇藥理學(xué)活性劑增加了皮膚或粘膜組織的通透性，因此藥物制劑通透皮膚或身體表層屏障的量/率增加相對(duì)于在沒(méi)有適度增強(qiáng)及協(xié)助下的量/率。通過(guò)使用銅皮增強(qiáng)劑增加藥理學(xué)活性劑的頭皮效果可以通過(guò)觀察藥物通過(guò)動(dòng)物活人皮膚的量或在病歷中達(dá)到有效的治療效果。
在這里提到，“預(yù)先確定的面積”皮膚或粘膜組織指的是藥物增強(qiáng)溶液或制劑通過(guò)皮膚或粘膜組織釋放的區(qū)域。是一個(gè)限定的完整的活性皮膚或粘膜組織區(qū)。這些區(qū)域經(jīng)常在5-200cm2比在5-100cm2范圍更常見(jiàn)，尤其在20-60cm2區(qū)。然而，令人感興趣的是藥物通過(guò)皮膚或粘膜組織釋放區(qū)域(面積)顯著地改變依賴(lài)于貼劑構(gòu)造，劑量及其他。
在這里提到，“局部應(yīng)用”術(shù)語(yǔ)是傳統(tǒng)的認(rèn)為釋放藥物或活性制劑到皮膚或粘膜。例如，治療皮膚失調(diào)疾病。一般，局部應(yīng)用提供了一個(gè)局部效應(yīng)，在這里提到“透皮釋放”術(shù)語(yǔ)意味著應(yīng)用藥物在屁股或其他身體表面或個(gè)體屏障以便藥物通過(guò)皮膚或其他組織進(jìn)入到血液循環(huán)，因此提供了系統(tǒng)治療?！巴钙ぁ毙g(shù)語(yǔ)也意味著包括“透粘膜”藥物應(yīng)用，如應(yīng)用藥物(如，舌下粘膜，顛粘膜，陰道，直腸粘膜)在個(gè)體粘膜表面一邊藥物通過(guò)粘膜組織進(jìn)入到血循環(huán)。
藥物活性劑，如果要獲得理想的效果，可能是以鹽、酯、胺前體，衍生物或其他形式。因此提供鹽、酯、胺、前體或衍生物是合適的藥理學(xué)形式?；钚詣}、酯、胺、前體和其他衍生物可以用標(biāo)準(zhǔn)程序如有機(jī)合成和其他描述去準(zhǔn)備，例如，March’s高級(jí)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、機(jī)制與結(jié)拼，5th ed(Wiley-Inter science，2001)。鹽、酯、胺、前體要制劑得到按相關(guān)文獻(xiàn)描述。
本發(fā)明的透皮釋放成分是通過(guò)簡(jiǎn)單的在溶液中混合。本發(fā)明透皮增強(qiáng)子與其它一些活性藥物成分。在這提到溶液是通過(guò)溶解一伙多個(gè)化學(xué)物質(zhì)(溶質(zhì))在另外的液體中形成的均質(zhì)混和物及溶解的物質(zhì)分子打散在這些溶劑中。溶液可以含有在制藥學(xué)上能夠被接受的化學(xué)成分，如緩沖液，穩(wěn)定劑或保存溶質(zhì)，通常在溶液中使用的溶劑有生理鹽水，水，乙醇，丙二醇或其他制藥學(xué)可以接受的載體。尤其是透辟增強(qiáng)劑和活性藥物在溶液中按一定比例足夠地增強(qiáng)藥物透皮達(dá)到局部或系統(tǒng)的理想效果。含有透皮增強(qiáng)者與藥物的溶液應(yīng)用在人或動(dòng)物皮膚或其他表示一定區(qū)一段時(shí)間后達(dá)到足夠的理想效果。
本發(fā)明的透皮釋放成分可以用一些制劑的形式制作適合于局部和/或透皮應(yīng)用。本發(fā)明具體化是含有一個(gè)通過(guò)身體表面增強(qiáng)藥物釋放的成分。制劑由下面組成(a)有效的藥物治療量(b)不損傷皮膚的透皮增強(qiáng)劑能夠有效的促進(jìn)藥物通過(guò)皮膚表面。本發(fā)明合適的制劑也包括藥膏，油膏，膠狀體，洗液，貼劑和其他膏劑，是常規(guī)的一種藥理學(xué)制劑。半固定制劑基于石油或其他石油衍生物局部應(yīng)用，特別油膏應(yīng)用是被認(rèn)同的方法，提供了一個(gè)合適藥物釋放并且尤其提供其他想得到的特性。例如，皮膚潤(rùn)滑劑與其他。一般，油膏制劑可能有四組油狀的，乳狀的，乳劑的和水溶的。油狀的油膏包括如植物油，來(lái)源于動(dòng)物的脂肪，來(lái)源于石油半固體碳水化合物。成為乳狀油膏被認(rèn)為是可以吸收的油膏，含有少量的或無(wú)水。包括如硬脂酸鹽，無(wú)水羊毛脂和親水礦脂。乳狀液油膏是水—油乳劑或油—水乳劑，包括如十六(烷)醇，單硬脂酸甘油，羊油脂和硬脂酸。
霜，被認(rèn)為是粘性液體或半固體乳液，或油—水或水—油。霜?jiǎng)┦强梢员凰吹舻?，并且含有油相，乳化劑和水相。油相，也叫?nèi)在相。一般被認(rèn)為含有礦脂和脂肪醇，例如十六(烷)基或硬脂酸醇。通常的水相，雖然有時(shí)不必要，超過(guò)油相在體積方面，一般含有潤(rùn)滑劑。乳化劑在霜制劑中通常是非離子，陰性離子，陽(yáng)性離子或兩性分子。
這些工作在制藥學(xué)上令人欣賞的是，膠是半固定懸浮性系統(tǒng)。單一的膠含有有機(jī)大分子，充分的均以地散布于整個(gè)載體溶液，典型的是水溶液。但也有酒精和隨機(jī)的油。膠凝劑是交聯(lián)的丙烯酸聯(lián)合體，例如碳水化合物多聚體家族。碳水化合物多聚亞烴基可以獲得通過(guò)商業(yè)途徑。也包括親水多聚物，例如聚環(huán)氧乙烷，多聚氧乙醚多聚體，多聚乙烯醇，纖維素聚合體，羥—丙基—纖維素，羥基纖維素，羥甲基纖維素，丙基甲基纖維素，鄰苯二甲酸鹽和甲苯纖維素。樹(shù)脂，例如黃茋膠和黃原樹(shù)酯，藻酸鈉，凝膠是首先膠，目的是準(zhǔn)備一致的膠，分散劑如加入乙醇或甘油，或凝膠劑通過(guò)研碎，機(jī)械攪拌與混合可以擴(kuò)散。
洗液(洗劑)是優(yōu)先應(yīng)用釋放化妝品制劑，制劑沒(méi)有摩擦力應(yīng)用于皮膚表面，使含有固定的典型半固體或液體制劑，以水或酒精為基質(zhì)的含有活性成份。洗液通常懸浮固體狀含有液油乳狀液組成油—水類(lèi)型。洗液(洗劑)對(duì)于治療大面積區(qū)是優(yōu)先選擇制劑，由于他有更多液體成分更容易被應(yīng)用。一般的是有必要的不溶性物質(zhì)在洗液中產(chǎn)生于有用的復(fù)合物一樣更好的擴(kuò)散效果是活性劑藥物更好的在皮膚表面接觸與維持，例如甲基維生素，羥甲基纖維素鹽，或其他。
貼劑是半固體制劑形式在貼劑中活性成分被懸浮在一個(gè)合適的基質(zhì)中。根據(jù)基質(zhì)的自然特性，貼劑在脂肪貼劑或由單一水凝膠相之間分配。脂肪貼劑的基質(zhì)是礦脂或親水性礦脂或其他。由單一水凝膠組成的貼劑通常與羥甲基纖維素結(jié)合或其他相結(jié)合作為其機(jī)制。制劑也可用于脂質(zhì)體，微體，微球束準(zhǔn)備。脂質(zhì)體是精微的束狀結(jié)拼，含有油脂質(zhì)雙分子層組成的脂質(zhì)外殼。在這里可以用來(lái)作為藥物釋放系統(tǒng)，一般，脂質(zhì)體是優(yōu)先作為微溶或不溶藥物載體。脂質(zhì)體制劑可以及時(shí)地用包括陽(yáng)離子(正電荷)，陰離子(負(fù)電荷)，中性成分來(lái)制作。陽(yáng)離子脂質(zhì)體與陰離子，中性脂質(zhì)體一樣容易地可用到的來(lái)自Avantpolarlipids(Birmingham，Ala)或能夠被容易制作使用容易獲得的材料，這些材料包括卵磷脂，膽固醇，磷脂酰乙醇胺，二油酸磷脂酰，二油酸磷脂酰甘油，二油酸磷脂酰乙醇胺。包括其他，這些材料也可以適當(dāng)?shù)谋嚷逝cDOTMA混合，用這些材料來(lái)制作脂質(zhì)體的方法是已經(jīng)知道的。
微囊眾所周知并且由兩性分子以合適的安排組成以便他們極性頭組成一個(gè)球型外殼，而疏水區(qū)，碳鏈區(qū)超兩球的中央組成內(nèi)核。在水溶液中組成形式含有高濃度的表面活性劑以便微球自然產(chǎn)生。有用的表面活性劑形成微球包括但不局限于月桂酸酯鉀，辛烷磺酸鈉，癸烷磺酸鈉，十二烷磺酸鈉，月桂醇硫酸鈉，溴化二環(huán)三甲基色氨酸胺，溴代三環(huán)三甲基色氨酸胺，氯化三環(huán)三甲基溴化胺，多羥8-十二烷基酯，多羥12-十二烷基酯，或作為局部反應(yīng)或皮膚釋放系統(tǒng)貯存池或作用身體表面應(yīng)用制劑。
微滴，同樣地，可以作為一個(gè)制劑和藥物釋放系統(tǒng)，像脂質(zhì)體和微體一樣，微滴在本質(zhì)上是含有藥物的膠本或包含藥物的制劑。它們一般，雖然有時(shí)不必要，由油脂組成，有現(xiàn)代電荷脂質(zhì)如磷脂。油脂微滴制劑是眾所周知的，并且在操作流程方面被相關(guān)教科書(shū)和文獻(xiàn)描述。
本發(fā)明的透皮釋放成分含有可以令人接受材料和/或一個(gè)或多個(gè)佐劑制成的一個(gè)或多個(gè)藥理學(xué)上令人接受的載體。術(shù)語(yǔ)“載體”指的是攜帶一些合適物質(zhì)透皮或局部的藥物應(yīng)用，在這里，提到的有用的載體包括在技術(shù)上一致的沒(méi)有毒性和不與其他成分以毒性方式相互作用的材料。
對(duì)于已成熟的技術(shù)，許多添加劑可能包括在制劑中。例如，容積包括使用相對(duì)少量的酒精可能增加某些藥物的溶解度。其他一些可供選擇的添加劑包括遮光劑，抗氧化劑，香味劑，著色劑，膠凝集，增稠劑，穩(wěn)定劑，表面活性劑和其他。另外在制劑中有可能也包括其他成分，例如抗菌劑，阻止制劑的損壞及抑制酵母和包子等微生物的生長(zhǎng)。合適的抗菌劑可以從羥苯甲酸甲酯和羥苯甲酸丙酯，苯甲酸鈉，山梨酸及其他相互結(jié)合選擇。
由于一些藥物穿透皮膚或粘膜組織的能力顯著的低，雖然優(yōu)先在沒(méi)有其他透皮滲透劑幫助下使用透皮增強(qiáng)劑，有可能是值得需要得出在這里揭露透皮增強(qiáng)子外還需要一個(gè)次要的透皮增強(qiáng)劑。任何其他透皮滲透劑應(yīng)和本發(fā)明中提到的透皮釋放增強(qiáng)劑一樣，將對(duì)皮膚的損傷，炎癥和循環(huán)系統(tǒng)毒性極可能降到最少。合適的二級(jí)增強(qiáng)劑(協(xié)同增強(qiáng)劑)包括許多族但不局限于此。例如脂肪酸，包括飽和和不飽和脂肪酸；膽汁酸；脂質(zhì)醇；非離子表面活性劑，包括脂肪酸酯，羥基脂肪酸酯，羥基脂肪質(zhì)醇，二醇，多羥基化合物，二醇和多羥基可以被酯化用脂肪酸和被取代用聚乙二醇，聚乙二醇脂肪酸酯，聚乙醇脂肪醚和丙三基脂肪酸酯；胺；氨基化合物；N-烷基-azacycloalkanones和N-烷基-azacycloalkenones；碳?xì)浠衔锶軇惠?烴)；低烷基酯；環(huán)糊精；含氮雜環(huán)；亞砜和尿素和其他衍生物。其他一些協(xié)同增強(qiáng)劑包括醚和二甘醇3，4-乙基醚(從通過(guò)商業(yè)途徑得到Transcutolg，Gattefosse SA)，表面活性劑如月桂酸酯鈉，十二烷醇硫酸鈉，十六烷基三甲基色氨酸溴化氨鹽，氯化苯甲烷銨，Poloxamer(231，182，184)，土溫(20，40，60，80)和卵磷脂。醇如乙醇，丙醇，辛醇，芐醇，與其他醇等；脂肪酸如月桂酸，油酸和戊酸；脂肪酸酯如乙丙基十四(烷)酸鹽，異丙基棕櫚酸鹽。甲醛丙酸鹽(酯)，和乙烷基油酸鹽；多醇和酯類(lèi)似物如聚乙二醇，單月桂酸酯聚乙二醇；氨基化合物和其他含氮化合物如尿素，而甲基乙酰胺，2-pyrrolidone，吡咯烷酮，1-甲基-2-吡咯烷酮，膽胺，二乙醇胺和三乙醇胺；萜(烴)；alkanones和有機(jī)酸，特別檸檬酸和琥珀酸。AZONR和亞砜類(lèi)如二甲亞砜與乙酸二甲亞砜也有被使用，但不是首選。
制劑中有可能也含有一些減輕炎癥的添加劑將藥物、透皮增強(qiáng)劑和其他成分對(duì)皮膚的炎癥與損傷降到最低。合適的減輕炎癥的添加劑包括α-維生素E，單胺氧化酶抑制劑，特別是苯醛醇如2-苯基-1-乙醇；丙三醇；水楊酸和水楊酸鹽；抗壞血酸維生素C和抗壞血酸鹽；離子型載體如monensin；兩性分子胺；氯化胺；N-乙酰半胱氨酸；cis-urocanic acid；辣椒素和氯喹；減輕炎癥添加劑以合適有效濃度加入制劑中減輕皮膚炎癥與損傷，在制劑中添加劑濃度大多數(shù)不超過(guò)20ut％，更常見(jiàn)的不超過(guò)5ut％。
在制劑中活性藥物濃度依賴(lài)于許多因素，包括疾病或治療的條件，或形劑的自然展性與活度，理性的治療效果，可能存在的副作用，活性劑到達(dá)預(yù)定靶位能力與速度，和在病人與醫(yī)生所具有的知識(shí)中的一些其他因素，透皮增強(qiáng)劑與藥物首選的某些具體比率為1∶1，1.5∶1，2.5∶1，3∶1，3.5∶1，4∶1，4.5∶1，5∶1，5.5∶1，6∶1，6.5∶1，7∶1，7.5∶1，8∶1，8.5∶1，9∶1，9.5∶1，10∶1或更多。
涉及到使用的藥物釋放系統(tǒng)可供選擇和優(yōu)先使用的方法，如局部或透皮“貼片”，含有透皮增強(qiáng)劑與活性藥物混合的片層結(jié)構(gòu)固定在皮膚上面。在這種結(jié)構(gòu)中，藥物含在片層結(jié)構(gòu)或貯存庫(kù)中，在使用過(guò)程中作為一個(gè)外層表面裝置的襯底層。片層結(jié)構(gòu)可能含有一層或多層藥物蓄庫(kù)。
另外，本發(fā)明的另外一個(gè)具體化體現(xiàn)在一個(gè)增強(qiáng)局部或透皮藥物應(yīng)用的系統(tǒng)包含有(a)至少含有一個(gè)藥物與透皮增強(qiáng)劑有效濃度使藥物能夠通透皮膚或身體表面達(dá)到足量但不引起皮膚的損傷的蓄庫(kù)。(b)至少一個(gè)手段/方法含有藥物與透皮增強(qiáng)劑和皮膚或者身體表面相關(guān)性和組成一個(gè)系統(tǒng)-機(jī)體表面相互作用的系統(tǒng)方式。(c)含有一個(gè)襯底層結(jié)構(gòu)作為在使用過(guò)程中的外層裝置。
另外一個(gè)具體實(shí)施例中，藥物蓄池含有一個(gè)在藥理學(xué)上被接受的粘性材料的多聚物基質(zhì)在藥物釋放的過(guò)程中固定系統(tǒng)到皮膚表面；典型地，粘性材料式一個(gè)壓力敏感性粘合劑，適合于皮膚表面長(zhǎng)期接觸，而且在物理和化學(xué)上應(yīng)該是與本發(fā)明中的藥物，透支增強(qiáng)劑和載體，媒質(zhì)和其他添加劑相容。這里包括一些合適的粘性材料但不局限于此，例如聚乙烯，聚硅醚，聚異丁烯，丙烯酸脂(鹽)，聚丙稀酰胺，聚胺酯，可塑性乙烯—乙烯基醋酸鹽二聚體和粘性橡膠如聚乙烯，聚丁二烯，聚苯乙烯-橡膠共聚體，聚苯乙烯—丁二烯共聚體，氯丁(二烯)橡膠(聚氯丁烯)。首選的粘附劑是聚異丁烯。
襯底層作為透皮系統(tǒng)中可行的，適宜的裝置，它的功能是作為透皮系統(tǒng)中的基本結(jié)構(gòu)元件，制作襯底層的材料在本發(fā)明中應(yīng)該是惰性的，對(duì)藥物與透支增強(qiáng)劑和制劑中含有的其它成分無(wú)吸收作用，襯底層應(yīng)優(yōu)先選擇含有柔韌性，彈性材料作為覆蓋劑防止藥物的損失和/或作為載體從貼片上層傳送藥物，并且給予給藥系統(tǒng)一定的封閉性。用來(lái)做襯底層的材料應(yīng)該允許按照皮膚的輪廓及皮膚的一些區(qū)域和關(guān)節(jié)皮膚褶皺而改變，防止出現(xiàn)一些機(jī)械的拉傷和防止由于皮膚與裝置的柔韌性與彈性的差異而從皮膚上脫離，作為襯底層的材料像上面提到一樣不具有咬合性與滲透性，雖然咬合性襯底層提到過(guò)，一般來(lái)源于合成多聚物(例如聚酯，聚乙烯，聚丙稀，聚亞胺酯，聚乙烯氯化物合聚氨醚)，天然聚合物(如纖維材料)或有大孔性紡織或非紡織材料。
在貯芷毓使用前期間，層狀結(jié)構(gòu)適宜于含有一個(gè)可以撕脫的襯底層，在使用前立即將襯底層從裝置上撕脫下來(lái)以便給藥系統(tǒng)能貼附到皮膚上?？梢运好摰囊r底層應(yīng)有藥物與載體不能滲透的材料組成，并且可以隨意的使用一些元件，僅僅在應(yīng)用前保護(hù)裝置，典型的，可以撕脫的襯底層又在本發(fā)明中的藥理活性劑與透皮增強(qiáng)劑不能滲透的材料組成并且在使用前可以很容易得從貼片上撕脫下來(lái)。
另外具體體現(xiàn)在，含有藥物的蓄池和與皮膚接觸的粘合劑作為獨(dú)立的，明確的分層出現(xiàn)。粘合劑在需要苦的下方。按照這樣，蓄藥庫(kù)可能是上面提到的多聚物基質(zhì)。另外，蓄藥庫(kù)有可能是由含有封閉的室或袋的液體或半固體制劑組成，或有可能是水凝膠池及其他形式。在工藝上這些技術(shù)是被認(rèn)同的。水凝膠是吸水膨脹但不溶于水的大分子網(wǎng)絡(luò)，也就是，水凝膠含有親水功能基團(tuán)提供了水的吸收，但水凝膠是由膠聯(lián)的多聚物組成附于水凝膠的水不溶性。一般的，水凝膠由膠聯(lián)的含親水基團(tuán)的多聚物組成，如聚亞胺酯，聚乙烯醇，聚丙烯酸，聚氧乙烯，聚乙烯吡咯烷酮，聚(羥甲基丙烯酸鹽)(poly(HEMA))或其他類(lèi)似的多聚物，特別是已提到的親水多聚物是HEMA和聚乙烯吡咯烷酮。
另外一層，如中間過(guò)渡構(gòu)造層(織物層)和/或控制釋放率的膜可能出現(xiàn)在任何藥物釋放系統(tǒng)中?？椢飳涌梢杂脕?lái)使裝置更容易制作，控制釋放膜可以用來(lái)控制外層裝置層中的成分釋放。這些成分在本發(fā)明中可以是藥物、透皮增強(qiáng)劑、其它的增強(qiáng)劑，或者藥物釋放系統(tǒng)中含有的其它成分。
控制釋放膜應(yīng)在一個(gè)或多個(gè)蓄藥池的皮膚側(cè)，用來(lái)制造控制釋放膜材料的選擇，目的是限制藥物制劑中一個(gè)或多個(gè)成分的流量?？刂漆尫拍び杏玫拇硇圆牧习ň巯N如聚乙烯和聚丙烯、聚酰胺、聚酯、乙烯-丙烯酸鹽多聚物、乙烯基-乙烯醋酸鹽多聚物、乙烯基-乙烯甲基醋酸鹽多聚物、乙烯基-乙烯乙烷基醋酸鹽多聚物、乙烯基-乙烯丙基醋酸鹽多聚物、聚異戊二烯、聚丙烯腈，乙烯-丙烯多聚物及其他。
一般的，在透皮裝置的下層，如皮膚接觸區(qū)面積，選擇面積范圍約5-200cm2，更適宜選擇5-100cm2，最好的是選擇20-60cm2，當(dāng)然，接觸面積是可以改變的，根據(jù)釋放藥物量及透過(guò)身體表面所需量，大的貼片適應(yīng)于大量藥物供給，而小的貼劑適應(yīng)于小量藥物供給，展示一個(gè)相對(duì)高的滲透率。
這樣的藥物釋放系統(tǒng)可以使用工藝上已知的傳統(tǒng)常用的衣料和層壓術(shù)來(lái)制造。例如，粘合基質(zhì)系統(tǒng)可以通過(guò)鑄造流動(dòng)性的粘合劑混合物、藥物和載體黏附于襯底層上，隨后形成片層結(jié)構(gòu)。同樣的，粘合劑復(fù)合物可以鑄造到撕脫的襯底層上，跟隨片層結(jié)構(gòu)襯底層，另外，蓄藥池可以在沒(méi)有藥物或賦形劑的前提下事先準(zhǔn)備，然后浸泡在含藥物/載體的混合物中，具體到在本發(fā)明中，透皮系統(tǒng)是通過(guò)溶劑蒸發(fā)，薄膜鑄塑，熔體擠出，薄膜迭層，沖切或其他方法制作，透皮增強(qiáng)劑一般地在制作貼劑的過(guò)程中加入裝置勝過(guò)準(zhǔn)備好裝置后在加。
在首選的藥物釋放系統(tǒng)中，粘合覆蓋層可以作為襯底層保護(hù)藥物釋放裝置與皮膚觸面。這種覆蓋層大小估計(jì)超過(guò)蓄藥池以便整個(gè)區(qū)域接觸到身體表面，覆蓋層是有用的。由于粘合劑/蓄藥池襯底層可能損失其黏附性，在應(yīng)用數(shù)小時(shí)后由于水和作用，通過(guò)結(jié)合一個(gè)黏附覆蓋層，藥物釋放系統(tǒng)可維持*在適當(dāng)?shù)奈恢脻M(mǎn)足長(zhǎng)時(shí)間的需要。
其他類(lèi)型或構(gòu)型的透皮釋放系統(tǒng)可以結(jié)合使用本發(fā)明中提到的在透皮藥物釋放工藝這些技術(shù)被認(rèn)同的方法。
本發(fā)明中局部應(yīng)用的制劑，皮層結(jié)構(gòu)蓄藥池中含有藥物及透皮增強(qiáng)劑，也可以含有許多另外的成分。在某些事例上，缺乏另外的液體，藥物及透皮增強(qiáng)劑可以靈巧的釋放；在另外一些事例上，藥物及透皮增強(qiáng)劑可以溶解、擴(kuò)散或懸浮在合適的在藥學(xué)上被接受的載體中，典型的是生理鹽水、溶劑或膠另外的成分包括防腐劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、助溶劑、其他的增強(qiáng)劑和其他成分等可能出現(xiàn)。
本發(fā)明提供了一個(gè)非侵入性方法增強(qiáng)了任何藥理學(xué)活性劑和/或藥物透皮，具體地說(shuō)，應(yīng)用理想的藥理學(xué)活性劑和/或藥物到選擇好的皮膚區(qū)達(dá)到治療疾病的有效藥理劑量，至少通過(guò)噬菌體體內(nèi)展示技術(shù)得到一個(gè)透皮增強(qiáng)劑能夠促進(jìn)藥理學(xué)活性劑/或藥物有足夠的量透過(guò)皮膚進(jìn)入血循環(huán)。在這里提到“治療”這個(gè)術(shù)語(yǔ)，指的是降低了疾病癥狀發(fā)生的次數(shù)及程度，消除了癥狀和/或潛在病因，阻止癥狀/或它們的潛在病因的發(fā)生，改善或糾正了疾病的損傷。“治療”術(shù)語(yǔ)也包括了阻止易感人群代謝失調(diào)和治療出現(xiàn)臨床癥狀代謝失調(diào)個(gè)體。
而釋放藥學(xué)活性劑的方法是可變的，這些方法典型地涉及到應(yīng)用的溶液、制劑或含有本發(fā)明中的透皮增強(qiáng)劑的藥物釋放系統(tǒng)和預(yù)先應(yīng)用到皮膚或身體其他表面足夠的時(shí)間提供理想的局部或系統(tǒng)治療效果的藥理學(xué)活性劑和/或藥。方法可以涉及到作為溶液、藥膏、膠、霜膏及其他的成分，以提供涉及到藥物釋放裝置。
應(yīng)用活性劑的量將依賴(lài)許多因素，從一個(gè)個(gè)體到另一個(gè)個(gè)體和依賴(lài)于應(yīng)用的藥物、治療特別狀態(tài)與條件、癥狀的程度、個(gè)體的年齡、重量和一般條件和處方醫(yī)生的判斷而改變。其他一些因素，特別是對(duì)于透皮藥物釋放包括藥物溶解度與載體滲透能力和在藥物釋放裝置中的粘合劑層，如果在使用中，還包括系統(tǒng)黏附到皮膚或其他表面的時(shí)間。藥物的最小量是由填充在裝置中藥物足夠的量或其他成分在應(yīng)用的一段時(shí)間后達(dá)到理想的釋放率決定。最大安全量是由不引起機(jī)體毒性反應(yīng)的不超過(guò)一定水平的<最大？>藥物釋放率決定。藥物最大濃度是由載體容納藥物數(shù)量不能產(chǎn)生組織學(xué)副作用如炎癥、身體無(wú)法接受脈沖式釋放、或釋放裝置副作用如黏度散失或其他性質(zhì)變質(zhì)等決定因此，本發(fā)明提供新穎的、高效的方法增加了藥理學(xué)活性劑和/或藥物通過(guò)人或動(dòng)物的身體表面(如皮膚、粘膜組織)。在這里揭露的透皮增強(qiáng)劑，在制劑或蓄藥池中具有一定的量是許多藥物和藥物原型滲透性增強(qiáng)，包括自由酸、自由堿基、acid addition salts ofbasic drugs、basic addition salts of acidic drugs、非離子藥物、肽和蛋白質(zhì)。下面提到了許多例子，特別是一些屬于治療藥物與本發(fā)明中提到的透皮增強(qiáng)劑合用時(shí)能夠透皮釋放，令人驚訝的是增加滲透性不伴隨一些顯著的組織損傷、炎癥或致敏。本發(fā)明在藥物釋放領(lǐng)域提供了一個(gè)重要方向。
在整個(gè)申請(qǐng)中，許多出版物被引用，提到的所有出版物和其中應(yīng)用的文獻(xiàn)，因此，應(yīng)用這些相關(guān)文獻(xiàn)更能理解這份申請(qǐng)。
本發(fā)明前文詳細(xì)的呈現(xiàn)應(yīng)該被理解并且在沒(méi)有變動(dòng)發(fā)明的前提下有許多改變。本發(fā)明更能被下文的例子所闡明。有些沒(méi)有說(shuō)明的地方，相反地，很容易理解的是，它可能求助于多種具體的條件、修飾物和它的相似物。
實(shí)施例1、體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)篩選具有透皮增強(qiáng)功能的肽用來(lái)篩選具有透皮增強(qiáng)功能的肽的文庫(kù)，是由New England Biolabs(Mass，MA)提供的，三個(gè)隨機(jī)肽文庫(kù)中含有二硫鍵的七肽的文庫(kù)(Ph.D.-C7C)。這個(gè)文庫(kù)中的隨機(jī)片段的兩側(cè)是半胱氨酸殘基，它們可以在噬菌體組裝過(guò)程中被氧化形成二硫鍵的連接，這樣就形成一個(gè)環(huán)肽和靶對(duì)象相互作用。(Ph.D.TM-C7C噬菌體肽展示試劑盒[online]，[在2005-09-01購(gòu)買(mǎi)].是在網(wǎng)絡(luò)上獲知信息的<URL:http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp>)。這個(gè)文庫(kù)含有超過(guò)二十億個(gè)克隆數(shù)。文庫(kù)中隨機(jī)肽在小外殼蛋白pIII的氨基端，所以每個(gè)噬菌體顆粒都表達(dá)五個(gè)拷貝。Ph.D.-C7C文庫(kù)中噬菌體表達(dá)隨機(jī)序列的位置之前是丙氨酸-半胱氨酸。在隨機(jī)肽和pIII蛋白間含有短的連接序列(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)。(Ph.D.TM-C7C噬菌體肽展示試劑盒[online]，[在2005-09-01購(gòu)買(mǎi)].是在網(wǎng)絡(luò)上獲知信息的<URL:http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp>)。
Balb/c裸小鼠(斯萊克斯，上海，中國(guó))在無(wú)菌的動(dòng)物房中飼養(yǎng)。裸鼠用烏拉坦麻醉，用槍頭側(cè)面將100微升共含有1012個(gè)噬菌體(New England Biolabs，Mass.，MA)涂布在其腹部大約3.0厘米×3.0厘米的區(qū)域。從血液循環(huán)中回收噬菌體顆粒，擴(kuò)增，用于再次篩選。噬菌體處理一個(gè)小時(shí)后，從心臟中抽取1毫升血，和0.5毫升快速生長(zhǎng)的大腸桿菌ER 2738。孵育半個(gè)小時(shí)后，倒入20毫升的培養(yǎng)基中擴(kuò)增6個(gè)小時(shí)。擴(kuò)增的噬菌體在磷酸緩沖液中重懸，并用來(lái)做第二輪的篩選。第一輪大約回收了150個(gè)噬菌體，第一輪后擴(kuò)增的噬菌體透皮效率比圖書(shū)館噬菌體要高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。
將第二輪從血液中回收的噬菌體鋪在含有x-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)和IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)的LB平板上。從板上隨機(jī)挑取12個(gè)藍(lán)色的噬菌斑，用DNA自動(dòng)測(cè)序儀(ABI3730)進(jìn)行DNA測(cè)序。它們其中的8個(gè)都含有同樣的插入序列，編碼的肽序列是CSSSPSKHC(PH-1，序列號(hào)1)。
實(shí)施例2、透皮增強(qiáng)劑及其類(lèi)似物的化學(xué)合成本專(zhuān)利中的多肽都由上海吉爾生化公司利用標(biāo)準(zhǔn)的FMOC固相合成法在多肽自動(dòng)合成儀(CS536-1381，CS Bio Co.，Menlo Park，CA)中合成，并用HPLC純化使其純度大于95％，利用質(zhì)譜儀(BIFLEXTMIII，Bruker，Germany)鑒定分子量。
序列ACSSSPSKHCG(TD-1，SEQ ID NO2)的肽合成步驟如下。末端氨基酸丙氨酸和甘氨酸來(lái)源于M13表面蛋白。TD-1的使用標(biāo)準(zhǔn)的FMOC固相合成法，一般的手動(dòng)合成步驟如下大約0.2mmol Fmoc-Gly-Wang resin加到手動(dòng)反應(yīng)試管(Peptides International)，加入DMF使其膨脹2小時(shí)。然后加入20％哌啶/DMF反應(yīng)2min以除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，重復(fù)一次去保護(hù)基的步驟并反應(yīng)20min。陽(yáng)性的Kaiser檢測(cè)結(jié)果表明樹(shù)脂上有自由氨基。氨基酸殘疾按照如下的循環(huán)方法加到樹(shù)脂上按照TD-1的序列將三倍過(guò)量的Fmoc保護(hù)氨基酸、三倍過(guò)量的HOBT和三倍過(guò)量的DIPEA/DMF加到反應(yīng)試管中。在N2流中偶聯(lián)反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)試管用真空泵抽干。N端保護(hù)的肽用DMF(5×1min)洗滌以除去過(guò)量的反應(yīng)物，然后如前方法用20％的哌啶/DMF去Fmoc保護(hù)基。反應(yīng)試管用DMF洗滌以除去哌啶，重復(fù)的步驟偶聯(lián)下序列中的一個(gè)氨基酸。合成好有側(cè)鏈保護(hù)的Na-Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-His(Trt)-Cys(Trt)-Gly-resin結(jié)合物后，肽樹(shù)脂結(jié)合物用DMF(4×1min)洗滌，并用真空抽干。氨基末端Fmoc保護(hù)基用20％哌啶/DMF除去。側(cè)鏈的去保護(hù)以及肽樹(shù)脂鍵的斷裂用10ml的裂解液(95％三氟乙酸、2.5％水和2.5％三異丙基硅烷)在500rpm振蕩下反應(yīng)3小時(shí)。將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到預(yù)稱(chēng)重的錐形瓶重，用冰的無(wú)水乙醚沉淀。粗產(chǎn)物真空干燥48小時(shí)。70-100mg的粗產(chǎn)物用反相高效液相色譜(RPHPLC)純化并凍干成粉末。肽的純度用分析型RP-HPLC鑒定，其分子量用質(zhì)譜儀鑒定。
使用相同的方法合成對(duì)照肽ACNATLPHQCG(AP-1，SEQ ID NO6)和HPGARPVFPWPG(SC-1，SEQ ID NO7)。AP-1是一個(gè)有相同末端氨基酸而包含不相干的內(nèi)部序列的11肽。FITC通過(guò)Acp偶聯(lián)到TD-1和SC-1的氨基端。
實(shí)施例3、TD-1抑制PH-1的透皮活性雄性的Wistar大鼠(180克到220克)飼養(yǎng)在動(dòng)物房中，有恒溫(22℃)，恒定的相對(duì)濕度(60％)，并且有固定的12小時(shí)光照/黑暗的循環(huán)，它們可以自由取食和飲水。用烏來(lái)糖(5毫克/千克，濃度為20％)麻醉老鼠，然后用剪刀地將老鼠腹部面積約3厘米×厘米的毛發(fā)剪干凈，要很小心不損傷皮膚(有任何可見(jiàn)傷痕的老鼠均丟棄不用)。展示TD-2肽(SEQ ID NO1)1012PH-1噬菌體或?qū)φ帐删w，對(duì)照噬菌體是隨機(jī)從文庫(kù)中挑取的，并且編碼序列AP-1(序列號(hào)6)，被置于剪毛區(qū)域中，并用槍頭側(cè)面將其涂布于整個(gè)區(qū)域。一個(gè)小時(shí)后，從尾靜脈取血，并按照廠商的使用手冊(cè)做滴度。
在Wistar大鼠中檢驗(yàn)，表明表達(dá)TD-1肽的噬菌體能穿過(guò)皮膚并到達(dá)血液中，局部處理后一小時(shí)，滴度可達(dá)到每毫升4556個(gè)噬菌體(圖1A)。與此相比，展示肽AP-1的對(duì)照噬菌體所具有的透皮能力還不到PH-1的0.2％，在血液中沒(méi)有回收到有活性的噬菌體(圖1A)。
當(dāng)TD-1和PH-1共同處理老鼠，TD-1會(huì)隨著劑量的增加對(duì)PH-1的透皮有抑制作用。在總量超過(guò)5微克時(shí)，TD-1就完全抑制了PH-1透皮的能力(圖1B)，說(shuō)明PH-1的透皮能力是由于它展示的肽和皮膚的一些成分特異的相互作用。
TD-1對(duì)PH-1有競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，TD-1能增強(qiáng)對(duì)照噬菌體AP-2噬菌體的透皮，但活性相對(duì)較低并且不一致(陳等，未發(fā)表)。
實(shí)施例4、TD-1增強(qiáng)胰島素的透皮釋放125I標(biāo)記的胰島素(170微居/微克)是由北京原子高科(北京，中國(guó))用Bolton-Hunter過(guò)程生產(chǎn)的，并經(jīng)過(guò)快速液相色譜純化。五百萬(wàn)cpm的125I標(biāo)記的胰島素溶解在100微升的生理鹽水中，和三種不同劑量的TD-1以及16ugAP-1共同處理Wistar大鼠剪過(guò)毛的腹部。在不同的時(shí)間點(diǎn)從老鼠的尾靜脈取血，并用γ計(jì)數(shù)儀(GC-911，中科創(chuàng)新有限公司，合肥，中國(guó))測(cè)量放射量。
特殊的是，對(duì)雄性的Wistar大鼠腹腔注射鏈脲酶素(60毫克/千克；Sigma-Aldrich，St.Louis，MI)使這些老鼠患糖尿病。注射后7到10天，用One-Touch血糖儀(LifeScan，Milpitas，CA)測(cè)量血糖。選擇血糖高于20mmol/l(正常的老鼠在4-6mmol/l之間)的老鼠，隨機(jī)分組進(jìn)行不同的處理，每組6只。為了估算TD-1幫助胰島素透皮的能力，125I標(biāo)記的胰島素與三種不同劑量的TD-1混合，共同處理剪過(guò)毛的老鼠裸露的腹部，再測(cè)量血液中的放射量。為了測(cè)試TD-1是否能幫助胰島素透皮達(dá)到治療的濃度，將70微克藥物級(jí)的豬胰島素(＞98％，30IU/mg)(徐州萬(wàn)邦制藥廠，徐州，中國(guó))和500微克TD-1混合在100微升的生理鹽水中(胰島素TD-1為7∶50(約1∶7.5))局部處理老鼠裸露的皮膚。作為對(duì)照，化學(xué)增強(qiáng)劑組中，在100微升1∶1 PBS∶乙醇溶液中，溶有70微克胰島素，0.35％(質(zhì)量/體積)sodium laureth sulfate(SLA；Sigma)和0.15％(質(zhì)量/體積)phenyl piperazine(PP；Sigma)用此溶液100微升處理老鼠裸露的皮膚。SLA/PP化學(xué)增強(qiáng)劑的配方來(lái)自高通量篩選(Karande et al.，1994，Nature Biotech.22192)。此外，在其它透皮處理組，用100微升生理鹽水處理老鼠。皮下注射組，每只老鼠注射14微克胰島素。
在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行劑量研究，處理前及局部處理后2，5，8，11小時(shí)，皮下注射組是測(cè)量處理前及處理后1，2，3，5小時(shí)時(shí)間點(diǎn)。在這些時(shí)間點(diǎn)，從老鼠尾靜脈取血，測(cè)量血糖濃度和用放射免疫試劑盒(Immunotech，Czech)測(cè)胰島素含量。對(duì)于胰島素和TD-1量的研究，按照如上所述的方法，只測(cè)處理前和處理后5小時(shí)的血糖和血清的胰島素含量。
當(dāng)沒(méi)有TD-1，例如TD-1為0克(圖2A中圖標(biāo)□)，125I標(biāo)記的胰島素就不能透皮進(jìn)血液中。然而，當(dāng)和不同劑量4微克，8微克，或16微克的TD-1混合，共同處理老鼠剪過(guò)毛的區(qū)域，兩小時(shí)后就能檢測(cè)的全血中的碘的放射量，在持續(xù)的全過(guò)程中，放射量不斷增加(圖2A中的圖標(biāo)■，○和)，說(shuō)明TD-1能幫助胰島素透皮釋放。這些研究表明這三個(gè)劑量都是有效的。
另外，以500微克/70微克的比率將TD-1和胰島素混合溶解在生理鹽水中，然后處理鏈霉菌素誘發(fā)的糖尿病鼠，表明能達(dá)到治療水平。在這些研究中，兩個(gè)小時(shí)后，就能檢測(cè)到胰島素濃度增加，5小時(shí)達(dá)到峰值，在11小時(shí)回到初始水平(圖2B中圖標(biāo)■)。相對(duì)的，處理兩小時(shí)后，血糖水平下降了，在8小時(shí)達(dá)到最低水平(＜初始水平的25％)血糖降低至少持續(xù)11小時(shí)(圖2C中圖標(biāo)■)。相對(duì)的，對(duì)照噬菌體表達(dá)的肽，AP-1沒(méi)有提高血清中胰島素濃度和降低血糖的作用。(圖2B和2C中的圖標(biāo)□)?；瘜W(xué)增強(qiáng)劑的混合物sodium laureth sulfate and phenyl piperazine(SLA/PP)，對(duì)于提高血清中胰島素濃度和降低血糖，也沒(méi)有作用(圖2B和2C中的▲)。
然而，研究顯示，在沒(méi)有胰島素的情況下，TD-1不能提高血清中的胰島素濃度，也不能降低血糖，說(shuō)明TD-1和胰島素的共同處理導(dǎo)致的血糖降低是由于透進(jìn)了外源胰島素，而不是由于TD-1引起的一些不明原因的生理作用(圖2B和2C中的圖標(biāo)●)。作為對(duì)照，皮下注射胰島素，引起快速而短暫的胰島素濃度提高和血糖降低，其峰值作用大約在處理后2到3小時(shí)之間，持續(xù)時(shí)間不超過(guò)5個(gè)小時(shí)(圖2B和2C中圖標(biāo)○)。
此外，研究表明，TD-1可以促進(jìn)胰島素透皮是有量的要求的。研究顯示少于20微克的TD-1和70微克的胰島素混合，不能顯著提升血清中的胰島素含量和降低血糖。而大于500微克的TD-1和70微克胰島素混合，局部處理老鼠，此時(shí)，TD-1的促透能力達(dá)到最大(圖2D和2E)。還有研究表明，胰島素也有劑量要求。和TD-1的量為500微克，與之混合的胰島素量為35微克時(shí)就足夠升高胰島素濃度和降低血糖了，但要達(dá)到最好效果，就需要胰島素70微克或更多(圖2F和2E)。
胰島素的透皮釋放中，除了皮下注射組，都是在不同的時(shí)間點(diǎn)和只有TD-1處理組相比較，應(yīng)用的是獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。而皮下注射組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都是和其處理前0點(diǎn)相比，應(yīng)用配對(duì)T檢驗(yàn)。
實(shí)施例5、TD-1增強(qiáng)生長(zhǎng)激素的透皮釋放為了測(cè)試TD-1能否幫助其他蛋白藥物透皮釋放，將500微克的重組生長(zhǎng)激素和兩個(gè)不同劑量的TD-1混合，共同涂抹在連續(xù)兩天用地塞米松(12.5毫克/公斤，Sigama)封閉垂體的Wistar大鼠的裸露皮膚。特別是，雄性的Wistar大鼠每天皮下注射地塞米松(12.5毫克/公斤，Sigama)。兩天后，將它們隨機(jī)分組，每組3到4只，進(jìn)行不同的處理。其中的一組，每只老鼠給500微克重組生長(zhǎng)激素，生長(zhǎng)激素是在大腸桿菌中表達(dá)的全長(zhǎng)為21.5kd的蛋白，純度＞95％，其生物效價(jià)為2.5微克/毫克(瑞生技術(shù)公司，上海，中國(guó))。另外，將生長(zhǎng)激素和100微克或500微克的TD-1混合(相對(duì)的生長(zhǎng)激素和TD-1的比例為5∶1和1∶1)，總體積100微升，共同涂抹在老鼠裸露的皮膚上。處理后，分別在0，2，5，8時(shí)間點(diǎn)，從老鼠的尾靜脈取血，血清中的生長(zhǎng)激素總量用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)知(DiagnosticSystems Laboratories，Webster，TX)。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各組都和生理鹽水和生長(zhǎng)激素混合組比較，應(yīng)用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。
如前所述，由于高劑量的地塞米松可有效地將內(nèi)源的生長(zhǎng)激素濃度降低到不能檢測(cè)的水平(Kolonin et al.，2004，Nature Med.10625，and Karande et al.，2004，Nature Biotech.22192)，所以在這些用地塞米松處理的老鼠體內(nèi)，就能很容易的檢測(cè)到透皮釋放的外源生長(zhǎng)激素。研究表明，100微克(△)和500微克(○)的TD-1都能幫助生長(zhǎng)激素進(jìn)入血液循環(huán)，共處理兩小時(shí)后濃度到達(dá)最大(圖3)。并且100微克TD-1比500微克TD-1更有效，說(shuō)明TD-1和生長(zhǎng)激素的比例對(duì)生長(zhǎng)激素的透皮釋放很重要。相對(duì)的，當(dāng)將生長(zhǎng)激素和對(duì)照噬菌體表達(dá)的肽AP-1混合，處理老鼠后，沒(méi)在血清中檢測(cè)到生長(zhǎng)激素增加，說(shuō)明AP-1不能幫助生長(zhǎng)激素透皮。
實(shí)施例6、TD-1對(duì)APO透皮釋放的增強(qiáng)作用國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)顯示，阿樸嗎啡(APO)能夠用于治療帕金森病和性功能障礙(Hagell et al，2001，J.Neutosci.Nur.3337；Francesco Montorsi，2002，European Urology Supplements1(3)4)。它是一種多巴胺受體激動(dòng)劑，在下丘腦和脊髓部位通過(guò)促進(jìn)多巴胺的釋放起作用(Anden et al，1967，J.Pharm.Pharmacol.19(9)627)。研究證明APO能引起快感和勃起反應(yīng)。APO的分子式為C17H17NO2.HCl.1/2H2O，分子量為321.8KD。
在本實(shí)驗(yàn)中，選用200-250g的SD雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，光照12h，黑暗12h，給予充足的食物和水。所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)都在上午9:00到下午4:00中進(jìn)行，環(huán)境溫度恒溫在24±1℃。大鼠用烏拉坦麻醉后，用剪刀小心的剪去肩胛間區(qū)的毛，面積大約為3.0cm×3.0cm，小心剪破大鼠的皮層(皮膚有可見(jiàn)的破損的大鼠將不被使用)。大鼠在經(jīng)過(guò)至少24h的恢復(fù)蘇醒后才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。包含指定量APO的100ul乳膏涂在去毛的皮膚上，并用移液槍頭的一段將其均勻的分布開(kāi)。乳膏的成分包含單硬脂酸甘油酯(7.5％重量比)、羥丙基甲基纖維素(0.5％重量比)、異丙基(肉)豆蔻酸酯(10％重量比)、尼泊金甲酯(0.5％重量比)、尼泊金丙酯(0.5％重量比)、聚二甲苯-40-硬脂酸酯(11％重量比)、生理鹽水(70％重量比)以及隨同給藥的各種劑量的APO和TD-1。
涂藥之后立即將大鼠放進(jìn)各自的聚苯乙烯籠子里(長(zhǎng)32cm，寬30cm，高30cm)以便觀察，由兩位觀察者記錄大鼠在2h內(nèi)陰莖勃起(PE)的次數(shù)。按照Berendsen and Broekkamp(1987，Eur.J.Pharmacol.135(3)279-87)的描述，勃起的標(biāo)準(zhǔn)為骨盆前推并且跟隨直立姿態(tài)露出陰莖頭，包皮后退，陰莖膨大，大鼠舔其陰莖而站立不穩(wěn)。
圖4顯示2.0mg/Kg TD-1和0.8mg/kg APO的劑量給藥可增加APO的透皮效果，而AP-1在相同劑量(2.0mg/kg)下對(duì)APO的透皮釋放沒(méi)有增強(qiáng)作用。對(duì)作用時(shí)間段的效果分析顯示，在透皮給藥APO(0.8mg/kg)和TD-1(2.0mg/kg)后，大部分勃起現(xiàn)象在后一個(gè)小時(shí)內(nèi)觀察到(如圖5)。
另外，此次實(shí)驗(yàn)研究顯示TD-1對(duì)APO的透皮作用是劑量依賴(lài)性的。在APO的劑量固定為0.8mg/kg的情況下，當(dāng)TD-1的劑量為0.4mg/kg時(shí)，大鼠陰莖勃起的次數(shù)沒(méi)有顯著的增加，而當(dāng)TD-1的劑量為0.8mg/kg、2.0mg/kg或3.2mg/kg時(shí)，其透皮增強(qiáng)效果達(dá)到最大(如圖6)。同樣，我們也觀察到APO的劑量依賴(lài)性效應(yīng)。在TD-1的劑量固定為0.8mg/kg的情況下，APO至少要達(dá)到0.8mg/kg的劑量才能觀察到顯著的效果，而劑量為0.4mg/kg或更少時(shí)大鼠的陰莖勃起次數(shù)沒(méi)有顯著性的增加(如圖7)。
實(shí)施例7、TD-1對(duì)PT-141透皮釋放的增強(qiáng)作用Palatin技術(shù)公司(Cranbury，NJ)研發(fā)的PT-141是由七個(gè)氨基酸組成的多肽Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-OH。作為α-MSH的類(lèi)似物，PT-141結(jié)合并激活中樞黑皮質(zhì)素受體，選擇性的刺激雌鼠的引誘行為(Pfaus et al.，2004，Proc.Nat.Acad.Sci.101(27)10201-204)。早期的臨床研究顯示PT-141在治療勃起功能障礙和女性性功能障礙的病人方面是個(gè)非常有效的藥物(Diamond et al.，2005，Urology 65(4)755-59；或http://www.palatin.com/pdfs/pt141.pdf)。
在研究TD-1對(duì)PT-141透皮釋放的增強(qiáng)作用實(shí)驗(yàn)中，也是選用200-250g的SD雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，光照12h，黑暗12h，給予充足的食物和水。所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)都在上午9:00到下午4:00中進(jìn)行，環(huán)境溫度恒溫在24±1℃。大鼠用烏拉坦麻醉后，用剪刀小心的剪去肩胛間區(qū)的毛，面積大約為3.0cm×3.0cm，小心剪破大鼠的皮層(皮膚有可見(jiàn)的破損的大鼠將不被使用)。大鼠在經(jīng)過(guò)至少24h的恢復(fù)蘇醒后才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。包含指定量PT-141的100μl乳膏涂在去毛的皮膚上，并用移液槍頭的一段將其均勻的分布開(kāi)。乳膏的成分包含單硬脂酸甘油酯(7.5％重量比)、羥丙基甲基纖維素(0.5％重量比)、異丙基(肉)豆蔻酸酯(10％重量比)、尼泊金甲酯(0.5％重量比)、尼泊金丙酯(0.5％重量比)、聚二甲苯-40-硬脂酸酯(11％重量比)、生理鹽水(70％重量比)以及隨同給藥的各種劑量的PT-141和TD-1。
實(shí)驗(yàn)大鼠被分成兩組，每組6只。第一組大鼠所涂乳膏僅加生理鹽水；第二組大鼠所涂乳膏僅加160μg/kg的PT-141；第三組大鼠所涂乳膏加入240ug/kg的對(duì)照肽AP-1(SEQID NO6)和160μg/kg的PT-141(AP-1與PT-141的質(zhì)量比為3∶2)，第四組大鼠所涂乳膏中加入240μg/kg的TD-1和160μg/kg的PT-141(TD-1與PT-141的質(zhì)量比為3∶2)。
涂藥之后立即將大鼠放進(jìn)各自的聚苯乙烯籠子里(長(zhǎng)32cm，寬30cm，高30cm)以便觀察，由兩位觀察者記錄大鼠在2h內(nèi)陰莖勃起(PE)的次數(shù)。按照Berendsen and Broekkamp(1987，Eur.J.Pharmacol.135(3)279-87)的描述，勃起的標(biāo)準(zhǔn)為骨盆前推并且跟隨直立姿態(tài)露出陰莖頭，包皮后退，陰莖膨大，大鼠舔其陰莖而站立不穩(wěn)。另外，參考文獻(xiàn)(Nybyet al，1992，Horm.Behav.2624 or Randy et al，1995，Nature 378(23)383)，追逐描述為雄鼠緊跟雌鼠并用嘴舔雌鼠的生殖器部位；騎跨描述為雄鼠的兩條前腳離開(kāi)地面，并將其跨到雌鼠的臀部而沒(méi)有射精。
圖8顯示了透皮增強(qiáng)劑TD-1促進(jìn)PT-141的透皮釋放效果。PT-141單獨(dú)給藥以及和對(duì)照肽AP-1隨同給藥，都未增加陰莖勃起、追逐和騎跨的次數(shù)，這表明PT-141本身以及和AP-1隨同給藥都不能透過(guò)皮膚組織。而當(dāng)PT-141和TD-1共同給藥時(shí)，陰莖勃起、追逐和騎跨的次數(shù)都有顯著的增加，這表明TD-1能促進(jìn)PT-141穿透皮膚組織，達(dá)到生理學(xué)效果。
實(shí)施例8、TD-1類(lèi)似肽的合成以及它們幫助胰島素透皮釋放的效果為了估測(cè)TD-1的序列特異性，化學(xué)合成了幾種TD-1肽的類(lèi)似物，包括TD-4，TD-10和TD-11，并用和前面同樣的方法測(cè)試它們幫助胰島素透皮的效果。這三個(gè)合成肽中的TD-10(ACSSSSSKHCG，SEQ ID NO4)，只將TD-1種一個(gè)位點(diǎn)改變了(P→S)，仍具有TD-1幫助胰島素透皮釋放效率的80％。然而，TD-4(ACSSSPSDHCG，SEQ ID NO3)和TD-1相比只有一個(gè)氨基酸改變了，在用TD-4和胰島素混合處理老鼠后，血清中胰島素含量和血糖水平都沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明其幫助胰島素透皮效率就顯著降低了(圖9A和9B)。相似的，TD-11，只含有TD-1中間的七個(gè)氨基酸SSSPSKH(SEQ ID NO5)，在用TD-11和胰島素混合處理老鼠后，血清中胰島素含量和血糖水平都沒(méi)有變化，說(shuō)明它沒(méi)有幫助胰島素透皮的活性。TD-11沒(méi)有幫助胰島素透皮的活性說(shuō)明二硫鍵對(duì)TD-1透皮活性很重要。
實(shí)施例9、TD-1的延時(shí)對(duì)胰島素透皮釋放的作用為了尋求TD-1的作用機(jī)理，進(jìn)行了時(shí)間延遲實(shí)驗(yàn)，就是在糖尿病鼠皮膚上用TD-1處理5分鐘。然后洗凈TD-1，等待一段時(shí)間，再在同樣的位置涂抹胰島素。由血清中胰島素水平(圖10A)可知，當(dāng)不等待時(shí)(洗凈的過(guò)程需要2分鐘)，胰島素的透皮效率與TD-1和胰島素共處理時(shí)幾乎一樣。當(dāng)?shù)却?分鐘后，仍能顯著的幫助胰島素透皮進(jìn)入血液循環(huán)。但是，當(dāng)?shù)却?5分鐘或更久時(shí)，胰島素的透皮效率就顯著降低了。在測(cè)量血糖時(shí)有同樣的趨勢(shì)(圖10B)。這些結(jié)果表明，TD-1可能在皮膚屏障上形成一個(gè)穿透通道，使得胰島素可以通過(guò)并且到達(dá)血液循環(huán)。
實(shí)施例10、TD-1促進(jìn)FITC標(biāo)記的胰島素從毛孔透皮為了研究TD-1幫助肽類(lèi)藥物透皮的途徑，在用TD-1和FITC標(biāo)記的胰島素混合共同處理皮膚后，制作皮膚切片，可用熒光顯微鏡觀察。需說(shuō)明，F(xiàn)ITC標(biāo)記的胰島素(西安華辰，西安，中國(guó))是溶解在很少量的DMF中，隨后用生理鹽水稀釋?zhuān)倬植刻幚砝鲜?終溶液中DMF濃度＜0.2％)。FITC標(biāo)記的胰島素(10微克)和TD-1(100微克)混合涂抹在老鼠裸露的皮膚上，終體積為100微升，對(duì)照不加TD-1。另外，還有SLA/PP處理組為對(duì)照，PBS∶乙醇為1∶1的100微升混合溶液中，含有10微克FITC標(biāo)記的胰島素，0.35％SLA和0.15％PP，將這100微升溶液涂抹在老鼠裸露的皮膚上。兩個(gè)小時(shí)后，用70％的異丙醇仔細(xì)的擦干凈，再剪下來(lái)。分離的皮膚用含4％多聚甲醛的0.1M磷酸緩沖溶液(PH7.4)固定過(guò)夜。用磷酸緩沖液(PH7.4)清洗幾遍后，將皮膚樣品浸沒(méi)在含4.5％蔗糖的PBS中24小時(shí)，然后將皮膚再放入放入含30％蔗糖的10毫升的PBS中脫水，直至其沉淀。用冷凍切片機(jī)(CM1900 LEICA，Heidelberger，Nussloch，Germany)，以20微米厚度做橫切和縱切。將冷凍切片黏附在多聚賴(lài)氨酸包被的載玻片上，放在室溫下干燥并用10微升VECTASHIELD Mounting Medium(Vector Laboratories，Burlingame，CA)封片。用OLYMPUS IX-70顯微鏡(OLYMPUS，Tokyo，Japan)觀察切片，激發(fā)波長(zhǎng)為490-495納米，發(fā)射波長(zhǎng)為520-530納米，并且拍攝熒光顯微照片。觀察TD-1-FITC和SC-1-FITC的透皮效果也用同樣的方法。
縱切(切面垂直于皮膚表面)表明FITC標(biāo)記的胰島素進(jìn)入了毛囊深處。(圖11A)。毛囊外面幾乎沒(méi)有熒光。當(dāng)沒(méi)有TD-1的作用時(shí)，就沒(méi)有FITC標(biāo)記的胰島素進(jìn)入毛囊深處的現(xiàn)象(圖4)。作為比較的是，SLA/PP幫助FITC標(biāo)記的胰島素透皮既通過(guò)毛囊也通過(guò)皮膚組織，但是總量和深度都沒(méi)有用TD-1和FITC標(biāo)記的胰島素共同作用的效果好(圖11D)。這些結(jié)果都通過(guò)在600微米深處的橫切(切面和皮膚表面平行)驗(yàn)證了(圖11E，G和H)。時(shí)間曲線(xiàn)研究表明處理后30分鐘FITC標(biāo)記的胰島素在TD-1的幫助下就已經(jīng)進(jìn)入毛囊了，兩個(gè)小時(shí)就到達(dá)最深處了，并持續(xù)24小時(shí)(圖12A到F)。胰島素進(jìn)入毛囊深處和胰島素進(jìn)入血液循環(huán)有一定的關(guān)系。和對(duì)照肽AP-1混合共同作用，不能幫助胰島素透皮，也不能使得FITC標(biāo)記的胰島素進(jìn)入毛囊(圖11，B和F)。時(shí)間延遲研究更加支持了這一觀點(diǎn)。等待的時(shí)間和滲透進(jìn)毛囊的FITC標(biāo)記的胰島素以及進(jìn)入血液循環(huán)的胰島素成反比(圖11，I到L)。
為了檢測(cè)TD-1能否進(jìn)入毛囊，F(xiàn)ITC標(biāo)記的TD-1局部處理老鼠后，取皮做熒光顯微切片。觀察切片，F(xiàn)ITC標(biāo)記的TD-1在毛囊中的滲透和TD-1與FITC標(biāo)記的胰島素共同作用時(shí)的情形相似，但對(duì)照肽(SC-1-FITC)就不能進(jìn)入毛囊(圖13，A到D)。
研究表明，TD-1能有效釋放進(jìn)體循環(huán)，但它不需要和所促透藥物連接，促?gòu)亩龠M(jìn)其透皮。研究更證明了，噬菌體展示技術(shù)對(duì)于篩選促進(jìn)透皮肽是有效的，是有力的分子生物技術(shù)，TD-1和類(lèi)似物在透皮和局部藥物特別是親水性大分子藥物的釋放中有廣泛的應(yīng)用。
序列表<110>上海諾美醫(yī)藥技術(shù)有限公司<120>透皮給藥增強(qiáng)劑及其使用方法<130>061024C<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>9<212>PRT<213>phage<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(9)<400>1Cys Ser Ser Ser Pro Ser Lys His Cys1 5<210>2<211>11<212>PRT<213>phage<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(11)<400>2Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ser Lys His Cys Gly1 5 10<210>3
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<221>PEPTIDE<222>(1)..(11)<400>3Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ser Asp His Cys Gly1 5 10<210>4<211>11<212>PRT<213>phage<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(11)<400>4Ala Cys Ser Ser Ser Ser Ser Lys His Cys Gly1 5 10<210>5<211>7<212>PRT<213>phage<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(7)<400>5Ser Ser Ser Pro Ser Lys His1 權(quán)利要求
1.一種識(shí)別并篩選具有增強(qiáng)透皮給藥能力的多肽的方法，包括體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)，其特征在于該方法包括(a)在動(dòng)物體或人體皮膚的適當(dāng)區(qū)域涂以噬菌體展示多肽庫(kù)；(b)從所述動(dòng)物或人的循環(huán)系統(tǒng)、器官、組織以及細(xì)胞中回收噬菌體顆粒；(c)擴(kuò)增回收的噬菌體用于下一輪體內(nèi)篩選；(d)重復(fù)上述(a)到(c)的步驟至少一次；(e)對(duì)回收的噬菌體挑取單克隆，驗(yàn)證其透皮能力后測(cè)序，獲得所編碼的展示多肽。
2.一種透皮給藥增強(qiáng)劑，其特征在于，含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4所示的多肽序列或其類(lèi)似物。
3.一種核苷酸序列，其特征在于，該核苷酸序列含有編碼一種含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4所示的多肽序列或其類(lèi)似物的核苷酸序列。
4.一種透皮給藥組合物，其特征在于，包括至少一種治療某疾病的有效劑量的藥物活性試劑或藥物，和至少一種透皮給藥增強(qiáng)劑，所述透皮給藥增強(qiáng)劑含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4所示的多肽序列或其類(lèi)似物。
5.一種增強(qiáng)藥物透皮給藥的方法，其特征在于包括將至少一種透皮給藥增強(qiáng)劑與至少一種藥物活性制劑或藥物聯(lián)合給藥，所述透皮給藥增強(qiáng)劑含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4所示的多肽序列或其類(lèi)似物，相比未將所述活性試劑或藥物與所述透皮給藥增強(qiáng)劑結(jié)合的給藥，所述活性試劑或藥物通過(guò)動(dòng)物或人的皮膚或者身體表面的給藥得到增強(qiáng)或促進(jìn)。
6.一種增強(qiáng)藥物局部或者透皮給藥的藥物給藥系統(tǒng)，其特征在于包括(a)至少一個(gè)含有一種藥物和一種透皮給藥增強(qiáng)劑的藥庫(kù)，該透皮給藥增強(qiáng)劑的量能夠有效增強(qiáng)一定數(shù)量的所述藥物穿透皮膚或身體表面，以達(dá)到治療效果而不會(huì)造成傷害；(b)一個(gè)工具，用于維持所述系統(tǒng)中藥物和透皮給藥增強(qiáng)劑向皮膚或機(jī)體表面的輸送關(guān)系，并且形成機(jī)體表面-系統(tǒng)接觸面；和(c)一個(gè)襯底層，用于在所述工具的使用過(guò)程中作為外表面。
7.一種美容制劑，其特征在于包括至少一種透皮給藥增強(qiáng)劑，和零至多種皮膚護(hù)養(yǎng)、皮膚機(jī)能改善或皮膚色澤調(diào)節(jié)的有效成份，所述透皮給藥增強(qiáng)劑含有SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO4所示的多肽序列或其類(lèi)似物。
8.一種美發(fā)制劑，其特征在于包括至少一種透皮給藥增強(qiáng)劑，與至少一種美發(fā)活性制劑或藥物聯(lián)合給藥；所述美發(fā)活性制劑或藥物包括任何具有促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、防止毛發(fā)脫落、改變毛發(fā)結(jié)構(gòu)、成份或色澤功效的化合物，天然提取物或生物制劑；所述透皮給藥增強(qiáng)劑含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4所示的多肽序列或其類(lèi)似物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于識(shí)別具有增強(qiáng)透皮給藥能力的多肽的體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)。本發(fā)明還提供了能夠透皮給藥增強(qiáng)肽，該多肽能夠促進(jìn)和/或增強(qiáng)任何藥物活性制劑或藥物的透皮給藥。本發(fā)明還公開(kāi)了包含有本發(fā)明的透皮給藥增強(qiáng)肽的組合物，以及使用透皮給藥增強(qiáng)劑以提高藥物或者其他藥物活性制劑的透皮給藥的方法。
文檔編號(hào)A61K8/64GK1879888SQ20061002388
公開(kāi)日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2006年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月15日
發(fā)明者溫龍平, 陳勇平, 沈媛媛, 郭欣 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué), 上海諾美醫(yī)藥技術(shù)有限公司