專利名稱：家蠶保健品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保健品，具體涉及用5齡家蠶制備具有治療和預(yù)防糖尿病功效的保健品及其制備方法。
背景技術(shù)：
糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一種常見(jiàn)的慢性內(nèi)分泌代謝性疾病，主要特征是高血糖和糖尿，臨床上表現(xiàn)為多飲、多食、多尿和體重減輕的“三多一少”等癥狀，中醫(yī)稱之為消渴。
糖尿病是一種富貴病。近年來(lái)，隨著人民生活水平的提高，糖尿病發(fā)病率逐年升高。國(guó)際上II型糖尿病占整個(gè)糖尿病比例的85％-95％，而中國(guó)的發(fā)病率在90％以上[見(jiàn)郭嘯華等，高糖高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型及其腎病特點(diǎn)，中國(guó)糖尿病雜志，2002，10卷5期，290-294]。糖尿病特別是II型糖尿病的治療和預(yù)防成為醫(yī)學(xué)工作者的一個(gè)重要課題。在中國(guó)、日本、韓國(guó)都有利用家蠶治療糖尿病的民間療法。在《本草綱目》中有“蠶蛹煎汁飲，止消渴”的記載。韓國(guó)針對(duì)家蠶具有治療糖尿病的功效提出了以全蠶粉為降糖健康輔助食品及全蠶粉的制備方法，并在中國(guó)、日本、韓國(guó)同時(shí)申請(qǐng)專利(中國(guó)專利公告號(hào)1127637)。隨后，中國(guó)有多家單位也申請(qǐng)了有關(guān)全蠶粉制備方法的相關(guān)專利。但至今尚未有服用方便，效果好的家蠶保健品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種用家蠶制備服用方便、安全、質(zhì)量可控的家蠶保健品。
本發(fā)明提供了一種具有調(diào)節(jié)血糖功能的家蠶保健品。
本發(fā)明目的是這樣實(shí)現(xiàn)的將5齡3日至7日活體家蠶快速冷凍后，用蛋白酶消化，分離消化產(chǎn)物。
本發(fā)明公布了一種用蛋白酶消化5齡家蠶制備具有預(yù)防高脂高糖高蛋白食物引起的高血糖癥和對(duì)II型糖尿病有治療功效的保健營(yíng)養(yǎng)品的制備方法。
本發(fā)明所用材料如下家蠶871×872和蘇鎮(zhèn)×春光，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供蠶種，用桑葉飼養(yǎng)至5齡。胃蛋白酶(1∶250)、胰蛋白酶(1∶250)蛋白酶、中性蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解酶(復(fù)合酶)、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等均為市場(chǎng)售產(chǎn)品。尿酸測(cè)定試劑盒(氧化酶法)，購(gòu)自上海榮盛生物技術(shù)有限公司。葡萄糖測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海生物制品研究所。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明系小鼠購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。其它所有化學(xué)藥品均為分析純。切向流超濾器Vivaflow 50為vivascience公司產(chǎn)品，截留分子量5000。
本發(fā)明的方法包括下列步驟家蠶的處理(將飼養(yǎng)的5齡3日至7日活體家蠶裝入塑料袋內(nèi)，-20℃快速冷凍保存)→粉碎(組織粉碎機(jī))→蛋白酶消化→煮沸滅酶活→分離水相(去除固相物質(zhì))→超濾(去除大分子物質(zhì))→質(zhì)量檢測(cè)→產(chǎn)品本發(fā)明產(chǎn)品可為口服液、膠囊、片劑或顆粒劑等口服制劑。
本發(fā)明方法具體有下列步驟(1)家蠶的處理5齡3日蠶至7日蠶均可，將飼養(yǎng)的活體家蠶裝入塑料袋內(nèi)，-20℃快速冷凍保存；(2)蛋白酶消化將冷凍保存的家蠶取出，稱重，按重量比為0.5-2的比例加去離子純化水，用組織粉碎機(jī)粉碎，按蠶重的0.1-2％加入蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶、中性蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解酶(復(fù)合酶)、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等均可)消化，煮沸滅酶活，冷卻，在酸性條件下pH2-5用2層紗布過(guò)濾，并擠干，收集水相；(3)超濾將上述過(guò)濾后的上清用NaOH調(diào)pH至6-7，通過(guò)蠕動(dòng)泵用切向流超濾器過(guò)濾，去除未消化的蛋白質(zhì)、脂肪大分子物質(zhì)，濾過(guò)液備用；(4)干燥將上述步驟(3)的濾過(guò)液經(jīng)冷凍干燥制得粉末備用；(5)制劑將上述步驟(3)的濾過(guò)液或步驟(4)的粉末按常規(guī)方法制得家蠶保健品制劑。
質(zhì)量控制1)、對(duì)α-葡萄糖苷酶活力的抑制效果測(cè)定①α-葡萄糖苷酶制備處死小鼠，然后取小腸擠出食麇，腸壁用生理鹽水沖洗干凈，用玻片刮取粘膜，冰浴5Min后粉碎，重懸于磷酸緩沖液中(0.02M PBSPh7.2)，4000RPM 4℃離心10Min以除去大的細(xì)胞碎片，繼續(xù)以10000RPM 4℃離心20Min，取上清作α-葡萄糖苷酶。紫外法測(cè)蛋白濃度后，于-20℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)加入200μL 0.0067mol/L pH6.8的磷酸緩沖液，配成0.1mg/ml酶溶液。
②α-葡萄糖苷酶活力測(cè)定將50μL酶溶液和50μL水混合，37℃預(yù)溫水酶混合物5分鐘，加入100μL底物(0.028M麥芽糖/0.1M馬來(lái)酸pH6.8)，37℃水浴10分鐘，加入40μlNa2CO3(0.1mol/L)中止反應(yīng)。取20μl溶液用葡萄糖測(cè)定試劑盒測(cè)其中的葡萄糖含量。以在pH6.8，溫度為37℃的條件下，每分鐘水解麥芽糖釋放1μmol葡萄糖所需的酶量為α-葡萄糖苷酶活力的單位，按下列公式計(jì)算α-葡萄糖苷酶活力(I/mg)＝葡萄糖濃度(μM)×0.00024÷0.005÷10當(dāng)α-葡萄糖苷酶活力(I/mg)≥10時(shí)，可以用于α-葡萄糖苷酶活力的抑制效果測(cè)定③α-葡萄糖苷酶活力的抑制效果測(cè)定將50μL酶溶液和50μL水(作為對(duì)照)或50μL保健液混合，37℃預(yù)溫水酶混合物5分鐘，加入100μL底物(0.028M麥芽糖/0.1M馬來(lái)酸pH6.8)，37℃水浴30分鐘，加入40μlNa2CO3(0.1mol/L)中止反應(yīng)。取20μl溶液用葡萄糖測(cè)定試劑盒測(cè)其中的葡萄糖含量。按下列公式計(jì)算抑制率抑制率＝(對(duì)照管葡萄糖含量-實(shí)驗(yàn)管葡萄糖含量)÷對(duì)照管葡萄糖含量×100％質(zhì)量控制要求抑制率≥80％2)、氨基酸(多肽)含量測(cè)定將保健液用水稀釋100倍，以水為空白對(duì)照，紫外掃描儀測(cè)定260nm和280nm的光吸收值，按下列公式計(jì)算氨基酸(多肽)含量含量(mg/mL)＝(1.47×280nm吸收值-0.47×260nm吸收值)×100質(zhì)量控制要求含量≥50mg/mL.
3)、尿酸鹽含量測(cè)定用上海榮盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的尿酸測(cè)定試劑盒(氧化酶法)測(cè)定尿酸鹽含量，參照說(shuō)明書(shū)并約加改動(dòng)(即將反應(yīng)體系由1mL改為2mL)進(jìn)行即按下表加入相關(guān)試劑后，混勻，37℃水浴5min，于波長(zhǎng)520nm，以空白調(diào)零，測(cè)定吸光值。尿酸含量＝(樣本吸光值/校準(zhǔn)管吸光值)×6mg/L。，


質(zhì)量控制要求尿酸含量≤50mg/L產(chǎn)品產(chǎn)品兩種，一為經(jīng)質(zhì)量測(cè)定后調(diào)整濃度的保健液，二為保健液的凍干粉末。
保健液樣品經(jīng)質(zhì)量測(cè)定后調(diào)整濃度，用0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾后，分裝，室溫保存。
凍干粉末經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)后的樣品用冷凍干燥機(jī)凍干，分裝，室溫或4℃保存。
將本發(fā)明方法制備的凍干保健品送中國(guó)科學(xué)院上海生化與細(xì)胞生物學(xué)研究所用酸裂解后以氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸含量，結(jié)果該保健品中氨基酸含量為36.64％，各種氨基酸的組成見(jiàn)下表

本發(fā)明方法制得的家蠶保健營(yíng)養(yǎng)器經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果如下用本發(fā)明方法制備的保健品的降血糖動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、對(duì)二型糖尿病動(dòng)物模型鼠的降血糖效果材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性昆明小鼠(20g±2g)，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院。葡萄糖測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海生物制品研究所；四氧嘧啶(Alloxan)購(gòu)自Fluka公司，使用時(shí)稱取0.210g，用10ml生理鹽水溶解。糖尿病治療藥物拜糖蘋(píng)購(gòu)自第一醫(yī)藥商店。高糖高脂高蛋白飼料由本實(shí)驗(yàn)室提供配方，海軍醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物飼料廠制成小鼠飼料(餅干)。該飼料的配方如下常規(guī)飼料112.5kg，食糖30kg，蛋黃粉4.5kg，豬油3kg。保健液參照本發(fā)明方法說(shuō)明書(shū)制備，其氨基酸(多肽)含量為60mg/mL，對(duì)糖苷酶酶活力的抑制率為85.61％，尿酸含量為29mg/L。
方法由正常小鼠尾靜脈注射100μl制備四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，在注射48h后測(cè)空腹血糖，選取血糖值在200mg/dL以上者進(jìn)行分組，分組時(shí)各組動(dòng)物平均血糖值之差不大于10mg/dL，每組9只。共分3組，即保健液實(shí)驗(yàn)組分組，藥物(拜糖蘋(píng))對(duì)照組，生理鹽水對(duì)照組。分組后以高糖高脂高蛋白飼料飼養(yǎng)。保健液和藥物均用飲水方法喂飼，即先觀察各組動(dòng)物每天的飲水量(約200mL)，再將所用劑量的保健液、藥物、生理鹽水分別用水稀釋至200mL，放入飲水瓶?jī)?nèi)，供小鼠飲用，每天對(duì)所用飲水瓶進(jìn)行煮沸消毒，換液一次。保健液的劑量為0.5mL/鼠/天，拜糖蘋(píng)的劑量為0.5mg/鼠/天。喂飼28天后，禁食過(guò)夜，斷尾采集空腹鼠尾靜脈血，然后喂食，在喂食后2小時(shí)，摘眼球取血。待血液凝固后離心分離血清，用葡萄糖測(cè)定試劑盒測(cè)定血糖濃度。
結(jié)果本發(fā)明方法制備的保健液在二型糖尿病動(dòng)物模型鼠中具有良好的降血糖效果(見(jiàn)下表)。

二、對(duì)輕度二型糖尿病動(dòng)物模型鼠的降血糖效果材料與方法所用試劑、實(shí)驗(yàn)方法同對(duì)二型糖尿病動(dòng)物模型鼠的降血糖效果實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為對(duì)二型糖尿病動(dòng)物模型鼠的降血糖效果實(shí)驗(yàn)時(shí)注射四氧嘧啶后血糖濃度未達(dá)到要求的昆明系小鼠，以常規(guī)小鼠飼料喂養(yǎng)。將動(dòng)物分為2組，即保健液實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水對(duì)照組，兩組在喂飼實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前的血糖值分別為168.98±29.23和163.51±31.36。按上述對(duì)二型糖尿病動(dòng)物模型鼠的降血糖效果實(shí)驗(yàn)方法喂飼保健液和生理鹽水，共喂飼40天。
結(jié)果兩組動(dòng)物在喂飼40天后空腹6小時(shí)(即禁食6小時(shí))和空腹16小時(shí)(即禁食16小時(shí))的血糖濃度見(jiàn)下表。該結(jié)果表明本發(fā)明方法制備的保健液能顯著降低輕度二型糖尿病動(dòng)物模型鼠的血糖濃度(空腹6小時(shí))，防止長(zhǎng)時(shí)間饑餓(16小時(shí))造成的血糖濃度降低，顯示該保健液具有調(diào)節(jié)血糖功效。

三、對(duì)高糖高蛋白高脂肪食物所至高血糖的預(yù)防效果材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，雄性昆明小鼠(20g±2g)，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院。保健液，按本發(fā)明方法說(shuō)明書(shū)制備，其氨基酸(多肽)含量為60mg/mL，對(duì)糖苷酶酶活力的抑制率為85.61％，尿酸含量為29mg/L。高糖高蛋白高脂肪飼料同同對(duì)二型糖尿病動(dòng)物模型鼠的降血糖效果實(shí)驗(yàn)。
方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用高糖高蛋白高脂肪飼料飼養(yǎng)。將動(dòng)物分為兩組，按上述對(duì)二型糖尿病動(dòng)物模型鼠的降血糖效果實(shí)驗(yàn)方法喂飼保健液和生理鹽水，共喂飼40天。
結(jié)果兩組動(dòng)物在喂飼40天后空腹6小時(shí)(即禁食6小時(shí))和空腹16小時(shí)(即禁食16小時(shí))的血糖濃度見(jiàn)下表。該結(jié)果表明本發(fā)明方法制備的保健液對(duì)高糖高蛋白高脂肪食物所至血糖生高有良好預(yù)防效果。

本發(fā)明方法制得的保健品具有下列特點(diǎn)1，有效性，用該方法制備的保健品既保留了家蠶的豐富營(yíng)養(yǎng)成分，又含有有效降血糖成分，具有降糖、提供營(yíng)養(yǎng)、防止長(zhǎng)時(shí)間空腹時(shí)的低血糖等功效；2安全性，有效去除了可能引起過(guò)敏反應(yīng)的大分子物質(zhì)及家蠶中的大部分(80％)尿酸鹽(尿酸鹽是引起痛風(fēng)的主要原因)，使其服用更為安全；3，方便性，去除了家蠶中的非有效物質(zhì)，服用更為方便；4，質(zhì)量可控，通過(guò)對(duì)氨基酸(多肽)含量測(cè)定、對(duì)糖苷酶活力抑制效果測(cè)定和尿酸含量測(cè)定來(lái)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一1、制備例152克冷凍保存蠶，加入150mL水，用組織粉碎機(jī)粉碎，煮沸5分鐘，冷卻后用NaOH調(diào)pH至8.0，按加入胰蛋白酶，混勻，消化3小時(shí)，煮沸2分鐘滅酶活。冷卻后用10NHCl調(diào)pH至4.0-5.0，加入胃蛋白酶，消化3小時(shí)，煮沸2分鐘滅酶活。用2層紗布過(guò)濾，并擠干，收集水相，再用定性濾紙過(guò)濾，去除所有顆粒。調(diào)pH至7.0，超濾。得150mL產(chǎn)品，其氨基酸(多肽)含量為57mg/mL，對(duì)糖苷酶酶活力的抑制率為84.81％，尿酸含量為27mg/L。
在相關(guān)步驟中取50μL樣品，用水稀釋1倍，進(jìn)行糖苷酶的抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該方法充分保留了家蠶中能抑制糖苷酶的有效成分(見(jiàn)下表)。

取50mL保健液凍干，干物質(zhì)重量為2.4g，既50g蠶可獲得7.2g凍干保健品。
將本發(fā)明方法制備的凍干保健品送中國(guó)科學(xué)院上海生化與細(xì)胞生物學(xué)研究所用酸裂解后以氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸含量，結(jié)果該保健品中氨基酸含量為36.64％，各種氨基酸的組成見(jiàn)下表

2、制備例2156克冷凍保存蠶，加入150mL水，按上述方法消化，超濾后加水稀釋至330mL，其，其氨基酸(多肽)含量為54mg/mL，對(duì)糖苷酶酶活力的抑制率為85.61％，尿酸含量為29mg/L。
實(shí)施例二保健品中尿酸減少量觀察由于家蠶無(wú)排尿器官，家蠶中尿酸含量較高，而尿酸鹽是引起痛風(fēng)的主要原因，因而我們對(duì)本發(fā)明方法制備樣品的尿酸的減少量進(jìn)行了測(cè)定取2條家蠶(6.3g)，加入15mL 0.05M NaOH，均質(zhì)器裂解，80℃水浴保溫1小時(shí)，10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清，用0.05M NaOH稀釋至相當(dāng)于6.3g蠶制備的保健液體積(20mL)，用尿酸測(cè)定試劑盒(購(gòu)自上海榮盛生物技術(shù)有限公司)測(cè)定該樣品及保健液中的尿酸含量，結(jié)果該樣品中尿酸含量為139.42mg/L，本發(fā)明方法制備保健液中的尿酸含量為27.20mg/L，說(shuō)明用本發(fā)明方法制備保健液可以降低80.5％的尿酸，使該保健液的服用更為安全。
權(quán)利要求
1.一種具有調(diào)節(jié)血糖功能的家蠶保健品，其特征在于該家蠶保健品是通過(guò)下列方法制得的(1)家蠶的處理5齡3日蠶至7日蠶，將飼養(yǎng)的活體家蠶裝入塑料袋內(nèi)，-20℃快速冷凍保存；(2)蛋白酶消化將冷凍保存的家蠶取出，稱重，按重量比為0.5-2的比例加去離子純化水，用組織粉碎機(jī)粉碎，按蠶重的0.1-2％加入蛋白酶消化，煮沸滅酶活，冷卻，在酸性條件下pH2-5用2層紗布過(guò)濾，并擠干，收集水相；(3)超濾將上述過(guò)濾后的上清用NaOH調(diào)pH至6-7，通過(guò)蠕動(dòng)泵用切向流超濾器過(guò)濾，去除未消化的蛋白質(zhì)、脂肪大分子物質(zhì)，濾過(guò)液備用；(4)干燥將上述步驟(3)濾過(guò)液經(jīng)冷凍干燥制得粉末備用；(5)制劑將步驟(3)濾過(guò)液或步驟(4)的粉末按常規(guī)方法制得家蠶保健品制劑。
2.一種如權(quán)利要求1所述的具有調(diào)節(jié)血糖功能的家蠶保健品制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)家蠶的處理
5齡3日蠶至7日蠶，將飼養(yǎng)的活體家蠶裝入塑料袋內(nèi)，-20℃快速冷凍保存；(2)蛋白酶消化將冷凍保存的家蠶取出，稱重，按重量比為0.5-2的比例加去離子純化水，用組織粉碎機(jī)粉碎，按蠶重的0.1-2％加入蛋白酶消化，煮沸滅酶活，冷卻，在酸性條件下pH2-5用2層紗布過(guò)濾，并擠干，收集水相；(3)超濾將上述過(guò)濾后的上清用NaOH調(diào)pH至6-7，通過(guò)蠕動(dòng)泵用切向流超濾器過(guò)濾，去除未消化的蛋白質(zhì)、脂肪大分子物質(zhì)，濾過(guò)液備用；(4)干燥將上述步驟(3)的濾過(guò)液經(jīng)冷凍干燥制得粉末備用；(4)干燥將上述步驟(3)的濾過(guò)液經(jīng)冷凍干燥制得粉末備用；(5)制劑將上述步驟(3)的濾過(guò)液或步驟(4)的粉末按常規(guī)方法制得家蠶保健品制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有調(diào)節(jié)血糖功能的家蠶保健品制備方法，其特征在于其中所述的步驟(2)中的蛋白酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶、中性蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解復(fù)合酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有調(diào)節(jié)血糖功能的家蠶保健品制備方法，其特征在于其中所述步驟(5)制得的家蠶保健品制劑為口服液、膠囊、片劑或顆粒劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用5齡家蠶制備具有治療和預(yù)防糖尿病功效的保健品。具體涉及將5齡家蠶用蛋白酶消化等制備方法以及按該方法制備的相關(guān)制劑。該制劑富含豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，含人體所必須的氨基酸和有效的降血糖成分，對(duì)高血糖的預(yù)防效果和高血糖產(chǎn)生后(II型糖尿病)的治療效果良好，是理想的血糖調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明方法具有生產(chǎn)成本低，效果好，安全，服用方便，質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K9/08GK101036671SQ20061002470
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日
發(fā)明者劉金明, 傅志強(qiáng), 怨純秀, 蔡幼民, 林矯矯 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲(chóng)病研究所