專利名稱：一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白及其載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種結(jié)構(gòu)融合分子，特別是一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白及含有此融合蛋白編碼基因的載體。
背景技術(shù)：
乙肝是危害人類健康的一大疾病，在我國尤其嚴(yán)重。由于傳統(tǒng)的血源性疫苗安全性差，產(chǎn)量較低，因此已被基因工程疫苗所取代。由于大部分乙肝患者為幼兒時(shí)期感染病毒，處于對HBSAg的免疫耐受狀態(tài)，現(xiàn)存的基因工程疫苗雖然可以在大部分人中誘導(dǎo)出抗體，但對于已經(jīng)感染乙肝病毒的患者作用不大。因?yàn)閷τ诓《竞桶麅?nèi)菌而言，中和性抗體可以阻斷它們進(jìn)入胞內(nèi)，但不能清除已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒或者細(xì)菌。對于此類患者，需要能誘導(dǎo)出較強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的治療性疫苗。
乙肝表面抗原是乙肝病毒的包膜蛋白，由3種蛋白組成主蛋白(S)、中蛋白(M)和大蛋白(L)，目前市場上的乙肝疫苗主要為S蛋白疫苗，而M和L蛋白N端的preS1和preS2區(qū)含有許多重要的T、B抗原決定簇，它們在增強(qiáng)S蛋白的反應(yīng)、克服對S蛋白的無反應(yīng)中起著重要作用。
因此，研究一種包含有preS1或preS2區(qū)的疫苗，并且達(dá)到提高細(xì)胞免疫應(yīng)答、低毒、易于制備的效果是目前現(xiàn)有技術(shù)中急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白，它具有第一部分和第二部分，所述的第一部分為乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S，所述的第二部分為鼠IgG1 Fc段。
進(jìn)一步的，所述的融合蛋白的第一部分具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的第二部分具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
進(jìn)一步的，所述的融合蛋白的第一部分具SEQ ID NO3有所示的基因序列，所述的融合蛋白的所述的第二部分具有SEQ ID NO4所示的基因序列。
進(jìn)一步的，所述的融合蛋白的所述的第一部分和第二部分通過設(shè)計(jì)限制性酶切位點(diǎn)來進(jìn)行連接。
本發(fā)明的目的還在于提供所述的融合蛋白在制備乙肝疫苗的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的還在于提供一種載體，含有上述所述的融合蛋白的編碼基因。
進(jìn)一步的，所述的載體含有SEQ ID NO9所示的基因序列。
進(jìn)一步的，所述的載體含有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的目的還在于提供所述的載體在制備乙肝疫苗的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的還在于提供制備所述的融合蛋白的方法，包含以下步驟1)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因；3)將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段編碼基因克隆入質(zhì)粒，獲得含有目的基因的載體，通過原核或者真核細(xì)胞表達(dá)獲得表達(dá)蛋白。
本發(fā)明的目的還在于提供制備所述的載體的方法，包含以下步驟1)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因；3)將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段編碼基因克隆入質(zhì)粒，獲得含有目的基因的載體。
更具體的，制備上述所述的載體的方法，包含以下步驟1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因的合適酶切位點(diǎn)的引物，2)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，3)設(shè)計(jì)擴(kuò)增鼠IgG1 Fc段編碼基因的合適酶切位點(diǎn)的引物，4)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因，5)將獲得的preS2-S克隆入含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的PcDNA3質(zhì)粒，獲得PCS2S載體，再將IgG1 Fc克隆入含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒PCS2S，獲得PCMFS載體。
本發(fā)明的目的還在于提供一種抗體化的乙肝疫苗，含有上述所述的融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的目的還在于提供一種抗體化的乙肝疫苗，含有有效量的上述所述的載體，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明人通過長期而廣泛的研究發(fā)現(xiàn)，將乙肝表面抗原與IgG的Fc段融合，可通過抗原攝取方式和遞呈方式的改變，從而可從根本上打破乙肝免疫耐受，顯著提高治療性疫苗的效果。
乙肝表面抗原是乙肝病毒的包膜蛋白，由3種蛋白組成主蛋白(S)、中蛋白(M)和大蛋白(L)，目前的乙肝疫苗主要為S蛋白疫苗，而M和L蛋白N端的preS1和preS2區(qū)含有許多重要的T、B抗原決定簇，它們在增強(qiáng)S蛋白的反應(yīng)、克服對S蛋白的無反應(yīng)中起著重要作用。另外preS2通過人多聚白蛋白介導(dǎo)結(jié)合于肝細(xì)胞的表面，所以含pres2的疫苗可與HBV競爭從而阻斷HBV的感染途徑。故我們設(shè)計(jì)的乙肝疫苗包含了preS2和S基因。
IgG Fc能與Fc受體結(jié)合，preS2和S基因與鼠IgG1 Fc段的融合一方面能促進(jìn)融合蛋白被DC細(xì)胞的攝取，另一方面融合蛋白在胞內(nèi)與Fc受體結(jié)合，促進(jìn)了PreS2-S蛋白以內(nèi)源性抗原的方式進(jìn)行遞呈，從而有利于活化CD8+T細(xì)胞，促進(jìn)了特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。鑒于APC細(xì)胞表達(dá)的Fc受體以FcγR為主，而IgG1與FcγR親和力較強(qiáng)，因此我們選擇了來自IgG1亞型的Fc段。并且，F(xiàn)c段與Fc受體結(jié)合的位點(diǎn)位于鉸鏈區(qū)和CH2段，且抗體的鉸鏈區(qū)富含脯氨酸而易于伸展彎曲，能夠使融合蛋白的兩個(gè)部分之間的位障減到最小程度，所以我們選擇的Fc段包括鉸鏈區(qū)Hinge和CH2+CH3。
因此，在本發(fā)明中，所述的融合蛋白將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S作為融合蛋白的N端，可作為疫苗抗原部分；鼠IgG1 Fc段作為融合蛋白的C端，可使疫苗具有抗體化特征。
本發(fā)明將獲得的乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及獲得的鼠IgG1 Fc段編碼基因克隆入質(zhì)粒，獲得含有目的基因的載體成為基因疫苗，通過原核或者真核細(xì)胞表達(dá)獲得表達(dá)蛋白成為蛋白疫苗，所述的基因疫苗的5’端為抗原表位部分，由表面抗原前S蛋白preS2和主蛋白S組成的preS2-S基因；它的3’端為抗體的Fc段基因。所述的蛋白疫苗的N端為抗原表位部分，由表面抗原前S蛋白preS2和主蛋白S組成，它的C端為抗體的Fc段。
本發(fā)明的融合蛋白可以通過多種方式制備獲得，包括但不限于a)化學(xué)合成；b)將目的基因克隆入適當(dāng)?shù)妮d體，表達(dá)出目的融合蛋白。所述融合蛋白的第一部分和第二部分之間可以是帶有連接序列(linker)的或直接相連接的；優(yōu)選的，第一部分和第二部分之間可直接相連，直接利用抗體分子的絞鏈區(qū)富含脯氨酸而易于伸展彎曲的特性，將兩部分連接起來，在保證了各自功能基團(tuán)的獨(dú)立性的同時(shí)也有助于形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明中，用于克隆入目的基因的載體包括任何哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化用載體，或病毒載體，尤其是各種市售的載體或病毒載體。包括但不限于PcDNA、pEGFP、pSEc、pMG18、pGL3等。
在本發(fā)明中，可用于轉(zhuǎn)化所述融合基因的載體的細(xì)胞為原核或者真核生物細(xì)胞，比如、CHO細(xì)胞等。
將特定DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)化方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)所需的蛋白。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
在本發(fā)明中，所述的藥物組合物中有效成分的存在形式包括但不限于以下幾類a)乙肝表面抗原前S抗原和主蛋白S以及鼠IgG1 Fc段的融合蛋白；b)含有乙肝表面抗原前S抗原和主蛋白S以及鼠IgG1 Fc段基因的載體；c)含有b)所述的載體并且可表達(dá)所述融合蛋白的細(xì)胞。在給藥時(shí)，可直接給予a)、b)、c)任一所述的有效成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。
在本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的載體”是用于將具有活性的成分傳送給動物或人的藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。所述的載體可以是液體或固體。
本發(fā)明的藥物組合物，它含有上述的有效成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。
本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的有效成分以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
本發(fā)明所構(gòu)建的抗體化乙肝疫苗，經(jīng)過肌肉基因免疫小鼠的方法，證實(shí)其可以誘導(dǎo)很強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有比傳統(tǒng)疫苗更好的效果。


圖1顯示了抗體化乙肝疫苗融合分子的質(zhì)粒模式圖。
圖2顯示了構(gòu)建融合分子的PCR結(jié)果。其中第1、5泳道為DNA marker；第2泳道為preS2S+Fc融合分子；第3泳道為preS2S；第四泳道為mouse IgG1Fc。
圖3顯示了PCMFS的酶切鑒定結(jié)果。其中第1泳道為PCMFS經(jīng)Hind III和NotI雙酶切結(jié)果；第2泳道為PCMFS經(jīng)Hind III單酶切結(jié)果。
圖4顯示了PCMFS的測序鑒定結(jié)果。其中A、B為以T7為測序引物的正向測序，A為測序部分序列，其中，第十八至第二十個(gè)堿基所示的序列為起始密碼子atg，B為相應(yīng)的峰圖；C、D為以SP6為測序引物的反向測序，C為測序部分序列，第三十六至第三十八個(gè)堿基開始的序列為終止密碼子tga的反向互補(bǔ)序列tca，D為相應(yīng)的峰圖。
圖5顯示了以PCMFS轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，收集不同時(shí)間的轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染上清，抽濾至硝酸纖維素膜上，以小鼠抗人HBsAg單克隆抗體、生物素化的馬抗小鼠二抗和ABC、DAB檢測，其中，1.未轉(zhuǎn)染上清24-72小時(shí)；2.PcDNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上清24-72小時(shí)3.PCMFS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上清24-72小時(shí)。
圖6顯示了PCMFS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞后72小時(shí)細(xì)胞內(nèi)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平的檢測。1.PCMFS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；2.PcDNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3.陽性對照。
圖7顯示了C2C12細(xì)胞中HBsAg的轉(zhuǎn)錄水平及上清和細(xì)胞裂解物中HBsAg的表達(dá)情況。
圖8顯示了顯示了抗體化乙肝疫苗在體外的表達(dá)情況，a為pcDNA3肌注局部HBsAg蛋白的檢測；b為PCMFS肌注局部HBsAg的檢測。
圖9顯示了PCMFS免疫組同PCS2S組一樣，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。
圖10顯示了不同質(zhì)粒免疫小鼠脾臟細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示在用特異性抗原HBsAg刺激時(shí)PCMFS免疫組小鼠的增殖能力比PCS2S免疫組強(qiáng)。ConA為非特異性的淋巴細(xì)胞激活劑，可以刺激不同組的淋巴細(xì)胞增殖，1640組為陰性對照。
圖11顯示了不同質(zhì)粒免疫小鼠脾臟細(xì)胞的特異性殺傷情況?？梢娪锰禺愋钥乖璈BsAg刺激后，PCMFS免疫組小鼠脾臟細(xì)胞對表達(dá)表面抗原的SP2/0-preS2S細(xì)胞有更強(qiáng)的殺傷能力。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述的實(shí)施例是用于描述本發(fā)明的使用和用途，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例中采用的質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動物及試劑如下質(zhì)粒、菌種、細(xì)胞、動物、質(zhì)粒pcDNA3、PEHH、宿主細(xì)菌DH5α、細(xì)胞SP2/0為本實(shí)驗(yàn)室保存。將編碼preS2S的質(zhì)粒PCS2S轉(zhuǎn)入SP2/0細(xì)胞得到表達(dá)表面抗原的細(xì)胞SP2/0-preS2S。基因合成委托上海博亞公司。4-6周齡雌性BALB/c(H-2Kd)小鼠購自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。
分子生物學(xué)試劑限制性核酸內(nèi)切酶HindIII、EcoRV、Not I(TaKaRa公司)、T4DNA連接酶(MBI公司)；Taq DNA聚合酶(Promega公司)；RNaseA(Ameresco公司)；dNTP(Promega和華美生物公司)；LB培養(yǎng)基(英國OXOID公司)，瓊脂粉、瓊脂糖、SDS、EB、重蒸酚(上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站)，Tris(USB公司)，瓊脂糖膠回收試劑盒(上海華舜生物制品公司)，小鼠抗人HBsAg單克隆抗體(上?？迫A公司)，HBsAg蛋白純品(北京肝炎所)ABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，CFSE、7-AAD(Sigma公司)。
細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化試劑細(xì)胞培養(yǎng)試劑(Gibco BRL公司)。Lipofectamin2000真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)。
實(shí)施例1抗體化乙肝疫苗的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和鑒定1.PreS2-S和鼠IgG1 Fc編碼基因的擴(kuò)增本發(fā)明所設(shè)計(jì)的抗體化乙肝疫苗由乙肝表面抗原和鼠IgG1 Fc段構(gòu)成，中間不加linker，為了保證兩個(gè)部分各自功能基團(tuán)的獨(dú)立性以及形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，我們將表面抗原設(shè)計(jì)在融合分子的N端，F(xiàn)c段則在融合分子的C端，類似于完整的抗體分子。
乙肝表面抗原PreS2-S編碼基因以質(zhì)粒PEHH為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用的引物見表1(SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)，在設(shè)計(jì)引物的同時(shí)引入酶切位點(diǎn)Hind III和EcoR V。
鼠IgG1 Fc段編碼基因從小鼠來源的雜交瘤細(xì)胞520C9中擴(kuò)增，細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI1640(含10％小牛血清，1000u/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素)中，用Trizol抽提細(xì)胞總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第一鏈為模板，PCR方法擴(kuò)增Fc編碼基因，采用的引物見表1(SEQ ID NO7和SEQ ID NO8)，在設(shè)計(jì)引物的同時(shí)引入酶切位點(diǎn)EcoR V和Not I。
酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。
表1引物設(shè)計(jì) 2.抗體化乙肝疫苗的構(gòu)建如圖1所示，將PreS2-S以限制性酶切的方式克隆至載體PcDNA3的相應(yīng)位點(diǎn)上，構(gòu)成質(zhì)粒PCS2S，再將鼠IgG1 Fc以限制性酶切的方式克隆至質(zhì)粒PCS2S的相應(yīng)位點(diǎn)上，構(gòu)成質(zhì)粒PCMFS。
具體地，將上述擴(kuò)增得到的基因產(chǎn)物以膠回收試劑盒回收純化，并用Hind III和EcoR V雙酶切，同時(shí)將載體PcDNA3雙酶切，酶切后經(jīng)電泳回收純化，以T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨卞青霉素抗性平板，陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測序鑒定。
經(jīng)鑒定構(gòu)建成功的質(zhì)粒PCS2S和Fc PCR產(chǎn)物用EcoR V和Not I雙酶切，酶切后經(jīng)電泳回收純化，以T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨卞青霉素抗性平板，陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定，鑒定構(gòu)建成功的質(zhì)粒包含編碼抗體化乙肝疫苗的融合基因(SEQ ID NO9)，稱之為PCMFS，其相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列見SEQ ID NO10。PCMFS的酶切鑒定結(jié)果見圖3，其中第1泳道為PCMFS經(jīng)Hind III和NotI雙酶切結(jié)果；第2泳道為PCMFS經(jīng)Hind III單酶切結(jié)果。
PCMFS的測序鑒定結(jié)果見圖4，左側(cè)為以T7為測序引物的正向測序，右側(cè)為以SP6為測序引物的反向測序。
實(shí)施例2PCMFS的體外轉(zhuǎn)染依照Lipofectamine2000真核轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行C2C12細(xì)胞培養(yǎng)于完全1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染前一天以5×105C2C12細(xì)胞加入35mm六孔板，待細(xì)胞密度為80％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取10μl Lipofectamine2000加至90μl不完全1640培養(yǎng)基中，即為溶液A；取2μl(約3-5μg)經(jīng)QIAGEN試劑盒純化的質(zhì)粒，即為溶液B；將溶液A加入溶液B中，輕輕混勻，室溫作用20-25分鐘促進(jìn)復(fù)合物的形成。室溫孵育時(shí)，吸去培養(yǎng)上清，并以PBS洗滌細(xì)胞一次，逐滴將A、B復(fù)合物加入六孔板中，再加入800μl不完全1640培養(yǎng)基，輕輕混勻。37℃ 5％CO2培養(yǎng)5小時(shí)后，加入含有20％NBS的完全1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至收集上清，置-20℃保存；在六孔板中每孔加入1mlTrizol消化細(xì)胞抽提RNA進(jìn)行檢測。
以PCMFS轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，收集不同時(shí)間的轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染上清，抽濾至硝酸纖維素膜上，以小鼠抗人HBsAg單克隆抗體、生物素化的馬抗小鼠二抗和ABC、DAB檢測，結(jié)果見圖5，其中1.未轉(zhuǎn)染上清24-72小時(shí)；2.PcDNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上清24-72小時(shí)；3.PCMFS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上清24-72小時(shí)。
PCMFS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞后72小時(shí)細(xì)胞內(nèi)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平的檢測見圖6，其中1.PCMFS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；2.PcDNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；3.陽性對照。
C2C12細(xì)胞中HBsAg的轉(zhuǎn)錄水平及上清和細(xì)胞裂解物中HBsAg的表達(dá)見圖7，可見PCS2S和PCMFS轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞都能檢測到HBsAg的表達(dá)，但在PCS2S轉(zhuǎn)染上清中HBsAg的表達(dá)量相對較高，而PCMFS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物中HBsAg的表達(dá)量相對較高。PCMFS的表達(dá)的融合蛋白具有在細(xì)胞內(nèi)積聚的特性，有利于PreS2-S蛋白以內(nèi)源性抗原的方式進(jìn)行遞呈，從而有活化CD8+T細(xì)胞，促進(jìn)了特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
實(shí)施例3抗體化乙肝疫苗經(jīng)肌肉基因注射本實(shí)施例中，注射的是PCMFS質(zhì)粒。
以0.75％戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠(約120-150ul/只)，取腹位，調(diào)整腿姿暴露脛骨前肌。消毒后，用帶有塑料套管的1ml注射器在肌肉的中部垂直進(jìn)針，針尖插入深度由套管決定，約為2-3mm，緩慢推進(jìn)，一次注射量為100ul(含100ug PCMFS質(zhì)粒)，可見注射肌肉膨脹，完畢后將針頭旋轉(zhuǎn)90°，停留5秒，緩緩拔出。
實(shí)施例4基因注射后肌肉局部HBsAg蛋白的檢測取小鼠免疫部位肌肉組織做冰凍切片，37℃烤片45分鐘，置預(yù)冷的丙酮固定10分鐘，蒸餾水沖洗；在各切片上滴加0.3％H2O2-甲醇溶液，37℃濕盒中孵育30分鐘，蒸餾水沖洗，再以0.01M PBS(pH＝7.4)洗3次，每次5分鐘；在各切片上滴加正常羊血清(0.01M PBS，pH＝7.4，1∶100)，37℃濕盒中孵育20分鐘；傾去稀釋的正常血清，滴加小鼠抗人HBsAg單克隆一抗(0.01M PBS，pH＝7.4，1∶10)，37℃濕盒中孵育1小時(shí)，以0.01MPBS洗3次，每次5分鐘；在各切片上滴加生物素化的馬抗小鼠二抗(0.01MPBS，pH＝7.4，1∶1000)，37℃濕盒中孵育1小時(shí)，0.01M PBS洗3次，每次5分鐘；滴加提前半小時(shí)配好的ABC，37℃濕盒中孵育30分鐘，0.01M PBS洗3次，每次5分鐘；滴加DAB底物液，顯微鏡下控制染色時(shí)間，蒸餾水終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，室溫下風(fēng)干，以中性樹膠封片。
結(jié)果見圖8，a為pcDNA3肌注局部HBsAg蛋白的檢測，b為PCMFS肌注局部HBsAg的檢測。可見PCMFS肌肉免疫可以在局部檢測到HBsAg的表達(dá)。
實(shí)施例5抗體化乙肝疫苗可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答小鼠共免疫三次，間隔2周，自眼眶內(nèi)靜脈按期采集各組小鼠全血，分離血清，采用常規(guī)ELISA檢測免疫小鼠血清特異性抗體，以純化蛋白(HBsAg5μg/ml，100μl/孔)包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，置濕盒中，37℃放置1小時(shí)，4℃過夜。測血清標(biāo)本之前以0.01M PBST(PH＝7.4，0.05％Tween-20)洗滌三次，每次3分鐘；以含5％山羊血清和10％小牛血清的PBST封閉，37℃作用1小時(shí)，以0.01M PBST洗滌三次，每次3分鐘；小鼠血清以0.01MPBST稀釋后加入孔中，37℃作用1小時(shí)，以0.01M PBST洗滌三次，每次3分鐘；加入以0.01M PBST稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，37℃作用1小時(shí)，0.01M PBST洗滌三次，每次3分鐘；OPD顯色，1M H2SO4終止反應(yīng)，測OD490值。圖9顯示PCMFS免疫組同PCS2S組一樣，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生很強(qiáng)的抗HBsAg的特異性抗體。
實(shí)施例6抗體化乙肝疫苗促進(jìn)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答免疫小鼠第8周時(shí)處死取脾細(xì)胞，以5×105細(xì)胞/孔加入96孔板，同時(shí)加入非特異性抗原con A(5ug/ml)或特異性抗原HBsAg(50ug/ml)，37℃，5％CO2培養(yǎng)72小時(shí)，在收獲細(xì)胞前18小時(shí)每孔加入0.5uCi3H-TdR，最后以多頭細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上，液體閃爍計(jì)數(shù)器測量cpm值。
同樣取自8周免疫小鼠的脾細(xì)胞，以4×106細(xì)胞/孔加入6孔板中，以50ug/ml的HBsAg刺激，第二天加入50u/ml的IL-2，培養(yǎng)5天后作為效應(yīng)細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染了PCS2S基因的SP2/0細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用CFSE標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞后，以10∶1、20∶1和40∶1的效靶比混合加入96孔板，37℃作用6小時(shí)后收集細(xì)胞，加入7-AAD 4℃染色30分鐘，流式細(xì)胞儀檢測靶細(xì)胞調(diào)亡情況。
不同質(zhì)粒免疫小鼠脾臟細(xì)胞的增殖情況見圖10。
不同質(zhì)粒免疫小鼠脾臟細(xì)胞的特異性殺傷情況見圖11，可以見到與PCS2S免疫組相比，PCMFS組脾細(xì)胞增殖能力增加，特異性殺傷能力明顯增強(qiáng)，提示此抗體化乙肝疫苗能夠誘導(dǎo)較好的細(xì)胞免疫應(yīng)答，有利于打破因病毒感染而引起的免疫耐受。
序列表<110>復(fù)旦大學(xué)<120>一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白及其載體<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>281<212>PRT<213>PreS2-S蛋白<400>1Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg1 5 10 15Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val20 25 30Asn Pro Val Leu Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg35 40 45Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu50 55 60Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile65 70 75 80Leu Thr Ile Pro Gln Cys Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe85 90 95Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr100 105 110Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg115 120 125Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu130 135 140
Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro145 150 155 160Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys165 170 175Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys180 185 190Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro195 200 205Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg210 215 220Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly225 230 235 240Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp245 250 255Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro260 265 270Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile275 280<210>2<211>227<212>PRT<213>鼠IgG1 Fc<400>2Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu1 5 10 15Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr20 25 30Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys35 40 45
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val50 55 60His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe65 70 75 80Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly85 90 95Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile100 105 110Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val115 120 125Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser130 135 140Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu145 150 155 160Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro165 170 175Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val180 185 190Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu195 200 205His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser210 215 220Pro Gly Lys225<210>3<211>843<212>DNA<213>preS2-S<400>3
atgcagtgga attccacaac cttccaccaa actctgcaag atcccagagt gagaggcctg60tatttccctg ctggtggctc cagttcagga acagtaaacc ctgttctgac tactgcctct120cccttatcgt caatcttctc gaggattggg gaccctgcgc tgaacatgga gaacatcaca180tcaggattcc taggacccct tctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc240ctcacaatac cgcagtgtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggaact300accgtgtgtc ttggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt360cctccaactt gtcctggtta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat cttcctcttc420atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actatcaagg tatgttgccc480gtttgtcctc taattccagg atcctcaaca accagcacgg gaccatgccg gacctgcatg540actactgctc aaggaacctc tatgtatccc tcctgttgct gtaccaaacc ttcggacgga600aattgcacct gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg gaaaattcct atgggagtgg660gcctcagccc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg720ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg780tacagcatct tgagtccctt tttaccgctg ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac840att 843<210>4<211>684<212>DNA<213>鼠IgG1 Fc<400>4gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc60ttcatcttcc ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg120tgtgttgtgg tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat180gatgtggagg tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc240cgctcagtca gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa300tgcagggtca acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa360ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag420gataaagtca gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag480tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca540
gatggctctt acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga600aatactttca cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc660ctctcccact ctcctggtaa atga 684<210>5<211>24<212>DNA<213>引物<400>5cgaagcttat gcagtggaac tcca 24<210>6<211>25<212>DNA<213>引物<400>6cggatatcaa tgtataccca aagac 25<210>7<211>26<212>DNA<213>引物<400>7cggatatcgt gcccagggat tgtggt 26<210>8<211>35<212>DNA<213>引物<400>8
ataagaatgc ggccgctcat ttaccaggag agtgg 35<210>9<211>1533<212>DNA<213>融合基因<400>9atgcagtgga attccacaac cttccaccaa actctgcaag atcccagagt gagaggcctg60tatttccctg ctggtggctc cagttcagga acagtaaacc ctgttctgac tactgcctct120cccttatcgt caatcttctc gaggattggg gaccctgcgc tgaacatgga gaacatcaca180tcaggattcc taggacccct tctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc240ctcacaatac cgcagtgtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggaact300accgtgtgtc ttggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt360cctccaactt gtcctggtta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat cttcctcttc420atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actatcaagg tatgttgccc480gtttgtcctc taattccagg atcctcaaca accagcacgg gaccatgccg gacctgcatg540actactgctc aaggaacctc tatgtatccc tcctgttgct gtaccaaacc ttcggacgga600aattgcacct gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg gaaaattcct atgggagtgg660gcctcagccc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg720ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg780tacagcatct tgagtccctt tttaccgctg ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac840attgatatcg tgcccaggga ttgtggttgt aagccttgca tatgtacagt cccagaagta900tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct960aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg1020tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac1080agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc atcatgcacc aggactggct caatggcaag1140gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc1200aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag1260atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc atgataacag acttcttccc tgaagacatt1320actgtggagt ggcagtggaa tgggcagcca gcggagaact acaagaacac tcagcccatc1380
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165 170 175Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys180 185 190Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro195 200 205Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg210 215 220Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly225 230 235 240Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp245 250 255Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro260 265 270Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Val Pro Arg Asp Cys275 280 285Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe290 295 300Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro305 310 315 320Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val325 330 335Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr340 345 350Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu355 360 365Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys370 375 380Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser385 390 395 400Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
405 410 415Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile420 425 430Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly435 440 445Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp450 455 460Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp465 470 475 480Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His485 490 495Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys500 505 510
權(quán)利要求
1.一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白，其特征在于，它具有第一部分和第二部分，所述的第一部分為乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S，所述的第二部分為鼠IgG1 Fc段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一部分具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的第二部分具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一部分具SEQID NO3有所示的基因序列，所述的第二部分具有SEQ ID NO4所示的基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一部分和第二部分通過設(shè)計(jì)限制性酶切位點(diǎn)來進(jìn)行連接。
5.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備乙肝疫苗的藥物中的應(yīng)用。
6.一種載體，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的融合蛋白的編碼基因。
7.如權(quán)利要求6所述的一種載體，其特征在于，含有SEQ ID NO9所示的基因序列。
8.如權(quán)利要求6所述的一種載體，其特征在于，含有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求6所述的載體在制備乙肝疫苗的藥物中的應(yīng)用。
10.制備權(quán)利要求1或2或3所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包含以下步驟1)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因；3)將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段編碼基因克隆入質(zhì)粒，獲得含有目的基因的載體，通過原核或者真核細(xì)胞表達(dá)獲得表達(dá)蛋白。
11.制備權(quán)利要求6或7或8所述的載體的方法，其特征在于，包含以下步驟1)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因；3)將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段編碼基因克隆入質(zhì)粒，獲得含有目的基因的載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備所述的載體的方法，其特征在于，包含以下步驟1)獲得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，2)設(shè)計(jì)擴(kuò)增乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因的合適酶切位點(diǎn)的引物，3)獲得鼠IgG1 Fc段編碼基因，4)設(shè)計(jì)擴(kuò)增鼠IgG1 Fc段編碼基因的合適酶切位點(diǎn)的引物，5)將乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S克隆入含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的PcDNA3質(zhì)粒，獲得PCS2S載體，再將IgG1 Fc克隆入含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒PCS2S，獲得PCMFS載體。
13.一種抗體化的乙肝疫苗，其特征在于，含有有效量的權(quán)利要求1所述的融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
14.一種抗體化的乙肝疫苗，其特征在于，含有有效量的權(quán)利要求6所述的載體，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，公開了一種用于制備抗體化乙肝疫苗的融合蛋白，它具有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，由N端的乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S，及C端的鼠IgG1 Fc段組成。本發(fā)明還公開了含有編碼所述融合蛋白基因的載體。本發(fā)明還公開了一種抗體化的乙肝疫苗。本發(fā)明所構(gòu)建的抗體化乙肝疫苗，可以誘導(dǎo)很強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有比傳統(tǒng)疫苗更好的效果。
文檔編號A61K38/16GK101037476SQ20061002471
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日
發(fā)明者熊思東, 王纓, 蔣正剛, 儲以微 申請人:復(fù)旦大學(xué)