專利名稱：一種治療h的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于一種治療H22肝癌藥物。具體地說是以中草藥為原料制備的中成藥，本發(fā)明還關(guān)于該藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
中藥斑蝥早在十三世紀(jì)的《仁齋直指方》中就有記載，可用治于乳癌及腹部癌。古人還常用“斑蝥煮雞蛋，棄斑蝥食蛋”的偏方治療肝癌及其它消化系統(tǒng)癌癥，至今仍在民間沿用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為斑蝥性寒味辛，有大毒。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，斑蝥可以治療癰疽、潰瘍、癬瘡等病癥，具有攻毒蝕疽、破血散結(jié)的作用。臨床發(fā)現(xiàn)其還有多種新用途，治療一些疑難雜癥具有獨特的療效，如治療風(fēng)濕痛、神經(jīng)痛、梅核氣、斑禿、乳腺增生、鼻炎、傳染疣、肝炎、癌腫等，尤其對原發(fā)性肝癌有肯定的治療效果。
原發(fā)性肝癌(PHC，以下簡稱肝癌)為常見的消化道惡性腫瘤，東亞地區(qū)是世界肝癌高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第三位，男性肝癌發(fā)病率約是女性的3倍，新病例中73％是男性。肝癌病死率高(死亡率/發(fā)病率＝0.95)，2000年死亡病例39.6萬，在惡性腫瘤死因中排列第二。如何有效地防治本病是醫(yī)藥界面臨的一個重要課題。目前，特別對H22肝癌治療還沒有特效的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療H22肝癌，且安全有效，適于長期服用的藥物。
本發(fā)明的另一目的在于提供治療H22肝癌藥物的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實現(xiàn)的本發(fā)明發(fā)明了由斑蝥為主要成分的藥物，然后選擇移植性肝癌H22小鼠為模型，觀察該藥物的抑瘤作用，檢測T淋巴細(xì)胞增殖功能、NK細(xì)胞殺傷功能、T淋巴細(xì)胞表型變化及IL-12、IL-4含量。
本發(fā)明藥物是由下列組分制成的(用量為重量份)斑蝥10-20份。
本發(fā)明藥物也可是由下列組分制成的(用量為重量份)斑蝥10-20份、陳皮5-10份、谷芽5-10份。
本發(fā)明藥物的配方優(yōu)選重量(份)配比范圍是斑蝥12-18份、陳皮6-8份、谷芽6-8份。
本發(fā)明藥物的最佳重量(份)配比是斑蝥15份、陳皮7份、谷芽7份。
本發(fā)明藥物的制備方法(一)(1)取斑蝥，加水，浸泡、煮沸，過濾(2)藥渣加水繼續(xù)煮沸，過濾；(3)合并兩次濾液，濃縮，藥液冷卻裝入滅菌藥瓶。
本發(fā)明藥物的制備方法(二)(1)斑蝥、陳皮、谷芽，加水，浸泡、煮沸，過濾(2)藥渣加水繼續(xù)煮沸，過濾；(3)合并兩次濾液，濃縮，藥液冷卻裝入滅菌藥瓶。
藥效學(xué)研究1材料和方法1.1實驗材料1.1.1治療H22肝癌藥物的制備取中藥斑蝥置煎煮容器內(nèi)，加相當(dāng)于藥材量5-7倍的冷水浸泡1-2h，煮沸30min，過濾。藥渣加3-5倍量水繼續(xù)煎煮，煮沸20min，過濾。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材0.01g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱備用。
1.1.2動物C57BL/6小鼠，雄性，10周齡，購自上海中科院動物中心。
1.1.3瘤株肝癌H22瘤株，由上海市免疫學(xué)研究所提供。
1.1.4試劑ConA(Sigma公司)，CD3、CD4、CD8單抗(eBioScience公司)，NK細(xì)胞殺傷試劑(上海市免疫研究所自配)，3H-TdR(上海原子能研究所)，IFN-γ和IL-4檢測試劑盒(晶美公司)。
1.2實驗方法1.2.1造模方法無菌條件下取生長7-9d傳代接種的H22細(xì)胞株，將細(xì)胞5×106接種于每只小鼠右側(cè)腋窩皮下。
1.2.3動物分組及給藥方法小鼠30只，10只作為正常組，其余均按上法造模。小鼠接種腫瘤5天后，隨機(jī)分成生理鹽水組和實驗組，每組10只，生理鹽水組予以生理鹽水處理，實驗組給予治療H22肝癌藥物水煎液0.01g/ml，均灌胃0.2ml/只，連續(xù)給藥15天。
1.2.4標(biāo)本采集停藥次日，斷頸處死小鼠，剝離腫瘤組織并無菌取脾。
1.3檢測指標(biāo)1.3.1小鼠體重、瘤重及抑瘤率胃飼15天后，稱取兩組小鼠體重；處死小鼠后完整剝離腫瘤，用電子天平稱取瘤重，計算抑瘤率。
1.3.2T淋巴細(xì)胞增殖功能采用3H-TdR摻入法。在96孔平底培養(yǎng)板中，每孔加入小鼠脾細(xì)胞懸液100μl，濃度為5×106/ml，三復(fù)孔培養(yǎng)。同時，分別加入ConA 10μl。于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72h。終止培養(yǎng)前16h，每孔加入3H-TdR 1μCi。用細(xì)胞收集儀將細(xì)胞收集于玻璃纖維濾紙上，β-液閃儀測定cpm值，并計算刺激指數(shù)。
1.3.3NK殺傷功能用1640培養(yǎng)液分別調(diào)整小鼠脾細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)和體外培養(yǎng)的K562細(xì)胞(靶細(xì)胞)濃度為5×106/ml和1×105/ml。按效∶靶＝50∶1比例，各取100μl加入96孔平底培養(yǎng)板，37℃、5％CO2條件下共同培養(yǎng)4h。并設(shè)自然釋放和最大釋放組作為實驗陰陽性對照。然后1000rpm，離心5min。吸取上清100μl，加入底物液100μl，靜置3min顯色。再加入1N HCL終止反應(yīng)，490nm波長讀取OD值。計算NK細(xì)胞的殺傷百分率。
1.3.4T淋巴細(xì)胞表型采用直接免疫熒光及流式細(xì)胞儀分析。取小鼠脾細(xì)胞1×106，加入適量PE-Cy5-CD3、FITC-CD4和PE-CD8混合單抗，室溫避光孵育20min。1000rpm，離心5min，洗滌2次后，加入300μl固定液，上機(jī)檢測。
1.3.5細(xì)胞因子采用ELISA法。收集小鼠脾細(xì)胞經(jīng)ConA刺激24h后的培養(yǎng)上清，按照細(xì)胞因子檢測試劑盒操作說明分別測定IFN-γ和IL-4的含量。
1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用Statpal團(tuán)體T檢驗統(tǒng)計分析各組別數(shù)據(jù)的差異顯著性。
2結(jié)果2.1治療H22肝癌藥物對荷瘤小鼠體重、瘤重及抑瘤率的影響結(jié)果如圖1所示。與正常組比較，兩組發(fā)生腫瘤的小鼠體重均減輕，而實驗組小鼠體重下降明顯(P＝0.001)，但實驗組小鼠腫瘤重量顯著小于生理鹽水組小鼠瘤重(P＝0.0015)，抑瘤率達(dá)65.76％。表明治療H22肝癌藥物能有效抑制小鼠肝癌細(xì)胞的生長。
2.2治療H22肝癌藥物對荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響兩組T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能均較正常小鼠有顯著降低。實驗組小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化刺激指數(shù)增加顯著(SI＝4.34＞3，P＝0.00129)，具有較強(qiáng)的增殖能力，結(jié)果見圖2。說明治療H22肝癌藥物能顯著上調(diào)小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖功能。
2.3治療H22肝癌藥物對荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷功能的影響與正常組比較，單純胃飼生理鹽水組NK細(xì)胞殺傷活性無顯著性差異，說明罹患肝癌后，并不能有效地刺激小鼠NK細(xì)胞產(chǎn)生針對腫瘤的免疫應(yīng)答。實驗組小鼠NK細(xì)胞殺傷活性顯著增高，為生理鹽水組的5倍(P＜0.005)，結(jié)果見圖3。說明治療H22肝癌藥物能增強(qiáng)患瘤小鼠NK細(xì)胞的殺傷功能。
2.4治療H22肝癌藥物對荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群變化的影響如圖4所示，與正常組比較，兩腫瘤小鼠組T細(xì)胞數(shù)量均有明顯下降(P＜0.05)，說明其免疫功能低下。同時，兩組小鼠外周T細(xì)胞亞群比例發(fā)生明顯變化CD4+/CD8+比例倒置，這可能是因為發(fā)生腫瘤后，小鼠體內(nèi)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞克隆增殖的結(jié)果。而生理鹽水組與實驗組相比，后者更能改變T淋巴細(xì)胞亞群比例。
2.5治療H22肝癌藥物對荷瘤小鼠分泌細(xì)胞因子能力的影響IFN-γ測定顯示見圖5，實驗組小鼠T細(xì)胞分泌IFN-γ能力有顯著升高(P＜0.05)，說明治療H22肝癌藥物能顯著上調(diào)CD4+Th1細(xì)胞的分泌能力，并進(jìn)而上調(diào)小鼠細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的抗腫瘤作用。IL-4檢測結(jié)果顯示見圖6，實驗組小鼠T細(xì)胞分泌IL-4的能力有顯著升高(P＜0.001)，說明治療H22肝癌藥物能顯著上調(diào)CD4+Th2細(xì)胞的分泌能力，并進(jìn)而上調(diào)小鼠體液免疫功能。綜合以上兩種情況，實驗組既能上調(diào)小鼠細(xì)胞免疫功能，又能有效刺激小鼠的體液免疫功能，因此能有效抑制小鼠腫瘤的生長。
本發(fā)明所公開一種治療H22肝癌藥物及其制備方法，其優(yōu)點表現(xiàn)在該藥物屬于中藥復(fù)方制劑，其配伍符合中藥“君臣佐使”原則，具有中藥復(fù)方藥學(xué)最大化，毒性最小化，作用部位多靶點的優(yōu)點。經(jīng)實驗初步驗證，本藥具有抑制腫瘤生長和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的雙重效應(yīng)，為臨床治療腫瘤提供了依據(jù)。同時，本藥毒副作用較小，適于長期服用，是一種安全有效的藥物。


圖1顯示治療H22肝癌藥物對荷瘤小鼠體重及瘤重的影響。
圖2顯示治療H22肝癌藥物對荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響注1.正常組T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化刺激指數(shù)為42.01；注2.與生理鹽水組比較，*P＜0.01。
圖3顯示治療H22肝癌藥物對荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷功能的影響注與生理鹽水組比較，*P＜0.01。
圖4顯示治療H22肝癌藥物對荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群變化的影響。
圖5顯示治療H22肝癌藥物對荷瘤小鼠分泌IFN-γ能力的影響注與生理鹽水組比較，*P＜0.01。
圖6顯示治療H22肝癌藥物對荷瘤小鼠分泌IL-4能力的影響注與生理鹽水組比較，*P＜0.01。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實施例1治療H22肝癌藥物的制備(一)取中藥斑蝥150g置煎煮容器內(nèi)，加入750g的冷水浸泡1h，煮沸30min，過濾。藥渣加入450g水繼續(xù)煎煮，煮沸20min，過濾。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材0.01g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱備用。
治療H22肝癌藥物的制備(二)取中藥斑蝥200g置煎煮容器內(nèi)，加入1400g的冷水浸泡2h，煮沸30min，過濾。藥渣加入800g量水繼續(xù)煎煮，煮沸20min，過濾。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材0.01g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱備用。
治療H22肝癌藥物的制備(三)取中藥斑蝥100g置煎煮容器內(nèi)，加入600g的冷水浸泡1.5h，煮沸30min，過濾。藥渣加入400g水繼續(xù)煎煮，煮沸20min，過濾。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材0.01g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱備用。
治療H22肝癌藥物的制備(四)取中藥斑蝥50g、陳皮25g、谷芽25g置煎煮容器內(nèi)，加入600g的冷水浸泡1.5h，煮沸30min，過濾。藥渣加入400g水繼續(xù)煎煮，煮沸20min，過濾。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材0.01g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱備用。
治療H22肝癌藥物的制備(五)取中藥斑蝥100g、陳皮50g、谷芽50g置煎煮容器內(nèi)，加入1400g的冷水浸泡2h，煮沸30min，過濾。藥渣加入800g量水繼續(xù)煎煮，煮沸20min，過濾。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材0.01g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱備用。
治療H22肝癌藥物的制備(六)取中藥斑蝥60g、陳皮40g、谷芽35g置煎煮容器內(nèi)，加入750g的冷水浸泡1h，煮沸30min，過濾。藥渣加入450g水繼續(xù)煎煮，煮沸20min，過濾。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成相當(dāng)于原生藥材0.01g/ml的藥液，冷卻裝入滅菌藥瓶，置4℃冰箱備用。
權(quán)利要求
1.一種治療H22肝癌藥物，其特征在于它主要是由斑蝥制成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于它還包括陳皮、谷芽，它們的重量份比為斑蝥10-20份、陳皮5-10份、谷芽5-10份。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物，其特征在于它是由下列重量份的原料藥制成斑蝥12-18份、陳皮6-8份、谷芽6-8份。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于它是由下列重量份的原料藥制成斑蝥15份、陳皮7份、谷芽7份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物制備方法，其特征在于它包括以下步驟(1)取斑蝥，加水，浸泡、煮沸，過濾(2)藥渣加水繼續(xù)煮沸，過濾；(3)合并兩次濾液，濃縮，藥液冷卻裝入滅菌藥瓶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物制備方法，其特征在于步驟(1)中加水量為藥材量5-7倍，浸泡時間為1-2h，煮沸30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物制備方法，其特征在于步驟(2)中加水量為藥材量3-5倍，煮沸20min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物制備方法，其特征在于步驟(3)中藥液濃縮為相當(dāng)于原生藥材0.01g/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制備方法，其特征在于它包括以下步驟(1)取斑蝥、陳皮、谷芽，加水，浸泡、煮沸，過濾；(2)藥渣加水繼續(xù)煮沸，過濾；(3)合并兩次濾液，濃縮，藥液冷卻裝入滅菌藥瓶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物制備方法，其特征在于步驟(1)中加水量為藥材量5-7倍，浸泡時間為1-2h，煮沸30min。
全文摘要
本發(fā)明公開一種治療H
文檔編號A61K35/56GK1879818SQ200610026278
公開日2006年12月20日 申請日期2006年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月29日
發(fā)明者周阿高, 張勇, 孔德云, 葛海良, 任秋華 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院