專利名稱：內(nèi)皮細胞化動脈瘤支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)療材料領(lǐng)域，涉及一種新型動脈瘤支架，具體涉及一種內(nèi)皮細胞化動脈瘤支架及其制備方法。
背景技術(shù)：
顱內(nèi)動脈瘤是導(dǎo)致急性自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的最主要原因，也是人類猝死的重要原因之一。血管內(nèi)介入治療目前已成為顱內(nèi)動脈瘤治療的重要手段之一。特別是一些難治性動脈瘤，如梭形或?qū)娱g動脈瘤、寬頸動脈瘤、椎基底動脈瘤等，直接外科手術(shù)治療難度大、效果差，且常伴嚴重并發(fā)癥，而血管內(nèi)治療則呈現(xiàn)安全、微創(chuàng)的優(yōu)越性。過去的十年間，應(yīng)用電解可脫性彈簧圈(GDC)治療顱內(nèi)動脈瘤已經(jīng)被本領(lǐng)域普遍接受。然而，由于彈簧圈治療動脈瘤的歷史有限，盡管短期療效得到臨床肯定，長期療效仍有待進一步觀察。Hayakawa等在455個動脈瘤GDC栓塞后復(fù)查發(fā)現(xiàn)178(39％)個動脈瘤未完全填塞，有瘤頸殘留。其中大型(11-25mm)或巨大型(＞25mm)動脈瘤和寬頸(＞4mm)小型(4-10mm)動脈瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)的概率遠高于窄頸小型動脈瘤。Bavinzski(Bavinzski G，et al.JNeurosurg.1999；91(2)284-93)等在顱內(nèi)動脈瘤GDC栓塞后的尸檢中也發(fā)現(xiàn)瘤頸較大的動脈瘤頸口的新生內(nèi)膜覆蓋較少。因而Geremia等將支架置于動脈瘤瘤頸附近載瘤動脈中，通過支架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)干擾正常的血流促使瘤內(nèi)血栓形成，組織纖維化，進而閉塞瘤腔。支架技術(shù)的應(yīng)用為顱內(nèi)難治性動脈瘤的治療開辟了新的局面。然而，支架技術(shù)在動脈瘤中的應(yīng)用還存在缺陷。首先，支架作為金屬異物可以誘發(fā)載瘤動脈的血栓形成；其次，金屬支架的刺激性作用可引起血管內(nèi)膜增生，導(dǎo)致載瘤動脈的狹窄或閉塞(Levy EI，et al.Neurosurgery.2002；51(5)1280-5)。這些問題，已限制了支架在臨床中的廣泛應(yīng)用。本領(lǐng)域研究認為，對于顱內(nèi)巨大型及寬頸動脈瘤，如何在支架建立后加快瘤頸口新生內(nèi)皮的產(chǎn)生和覆蓋，是減少動脈瘤復(fù)發(fā)和避免載瘤動脈狹窄的關(guān)鍵問題。
研究認為，支架內(nèi)皮細胞化的目的在于使動脈瘤瘤頸處被內(nèi)皮細胞封閉，重建血管壁。對于栓塞不全者，可以使瘤腔與循環(huán)血液隔絕；對于完全栓塞的動脈瘤，可以減輕血流對彈簧圈或瘤內(nèi)血栓的沖擊，降低再通的發(fā)生率。支架上的內(nèi)皮細胞，有利于減輕和修復(fù)治療中損傷的血管內(nèi)皮，可以避免金屬支架與血流直接接觸，減少對血流的干擾；同時內(nèi)皮細胞還可以分泌一氧化氮(NO)、前列環(huán)素(PGI2)等活性物質(zhì)，降低血管痙攣和狹窄的發(fā)生率。因此在支架表面實現(xiàn)內(nèi)皮細胞化，可以減少支架的金屬裸露面積從而能夠減輕植入后引起的異物炎癥反應(yīng)，同時內(nèi)皮細胞分泌的活性物質(zhì)，有助于支架形成具有抗凝特性的光滑表面。支架內(nèi)皮細胞化的前景十分誘人，但仍然有許多實際的問題有待解決。如支架內(nèi)皮細胞化的效果取決于種植的內(nèi)皮細胞數(shù)目、粘附細胞的抗血流沖刷能力等，其中首先要解決的是內(nèi)皮細胞來源問題。異體內(nèi)皮細胞因涉及免疫排斥反應(yīng)而不宜應(yīng)用于臨床；轉(zhuǎn)基因永生化內(nèi)皮細胞系具有潛在的致瘤危險。目前進行的人血管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)中，以臍靜脈和幼童包皮的血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)方法較為成熟，顯然這兩種方法都不大可能應(yīng)用于支架的內(nèi)皮細胞化。盡管血管細胞生物學(xué)已取得很大的進步，但內(nèi)皮細胞的獲得仍不夠便利。因而，尋找新的內(nèi)皮細胞獲得途徑是建立可供臨床應(yīng)用的內(nèi)皮化支架的關(guān)鍵問題之一。
選擇合適的表面涂層材料，形成適合內(nèi)皮細胞生長的支架表面是建立內(nèi)皮化支架的又一關(guān)鍵問題。內(nèi)皮化支架進入血管內(nèi)后，其附著的內(nèi)皮細胞必須具備抗血流沖刷能力，同時部分裸露的涂層材料不能引起血小板聚集而發(fā)生血栓。以往采用的纖維連接蛋白(Fibronectin)和多聚賴氨酸(poly-L-lysine)粘附力有限，同時存在促進血栓形成的隱患。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是改進已有的金屬材質(zhì)動脈瘤支架的性能，克服已有技術(shù)的缺陷，提供一種內(nèi)皮細胞化動脈瘤支架。本發(fā)明將自體血管內(nèi)皮細胞對支架金屬表面修飾，能在支架建立后加快瘤頸口新生內(nèi)皮的產(chǎn)生和覆蓋，減少動脈瘤復(fù)發(fā)和避免載瘤動脈的狹窄，提高動脈瘤特別是顱內(nèi)動脈瘤的治愈率，減少動脈內(nèi)血栓形成的機會。
本發(fā)明的另一目的是提供所述內(nèi)皮細胞化動脈瘤支架的制備方法。
本發(fā)明首先解決了內(nèi)皮細胞的來源，采用從自體靜脈內(nèi)皮層采集擴增的血管內(nèi)皮細胞，并將該細胞粘附于經(jīng)生物相容性的，生物可降解的，無毒的高分子生物材料涂層處理的不銹鋼動脈瘤支架表面，制成自體內(nèi)皮細胞化動脈瘤支架，用于動脈瘤的血管內(nèi)治療，特別是顱內(nèi)動脈瘤的介入治療。
本發(fā)明所述的高分子生物材料選自肝素鍵合的聚(乳酸-氨基酸)共聚物(專利申請?zhí)?1132179.2；國際申請?zhí)朠CT/CN01/01622)，其生物相容性好，可降解且無毒。
本發(fā)明通過下述方法制備，包括以下步驟1、培養(yǎng)自體血管內(nèi)皮細胞取實驗用犬頸靜脈，血管段，放入1％膠原酶(Sigma)，0.125％胰酶(Sigma)中消化，吸出細胞懸液，離心，倒去上清夜，用80％DMEM20％胎牛血清，20ng/mlVEGF培養(yǎng)液重懸細胞，將1×106細胞密度的細胞懸液種植于涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代。
2、制備涂層材料及不銹鋼支架表面涂層將交酯或內(nèi)酯與含多官能團氨基酸的嗎啉二酮衍生物(derivative ofmorpholine-dione)，其中兩者的投料摩爾比例控制在99∶1～1∶99，以辛酸亞錫為催化劑，進行聚合；所得聚合物用Pd/C為催化劑催化氫化或采用HBr/HAc為催化劑脫去保護基團后，得具有可反應(yīng)性側(cè)基的生物降解型聚酯，再將脫保護后的聚合物與肝素溶解在混和溶劑THF/H2O中，以二環(huán)己基碳二亞氨為催化劑進行反應(yīng)，得到可完全生物降解的藥物高分子材料。
將制備的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，得到濃度從10％wt～0.01％wt的溶液，噴涂到支架表面，劑量從10～1000ug，抽干，消毒后待用。
所述的交酯或內(nèi)酯包括L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己內(nèi)酯等類似的單體。
(3)內(nèi)皮化不銹鋼支架集成采用1×107-5×107的高滴度細胞懸液滴在血管支架上，使均勻貼附在支架上后浸入培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時備用。
本發(fā)明提供了決定支架內(nèi)皮細胞化效果的種植的內(nèi)皮細胞數(shù)目，保證了粘附細胞的抗血流沖刷能力。
本發(fā)明自體內(nèi)皮化不銹鋼支架制備的每個步驟中均進行了相應(yīng)的理化性能和生物學(xué)特征的檢測，結(jié)果表明符合設(shè)計要求。表1是涂層材料的理化及生物特征。表2是內(nèi)皮化支架的生物學(xué)特征。
表1

表2

將上述集成的內(nèi)皮化不銹鋼支架置于體外血流沖刷儀中，采用70dyne/cm2切應(yīng)力沖刷24小時，觀察結(jié)果顯示支架表面內(nèi)皮細胞形態(tài)無明顯變化，并計每1mm長度支架表面的粘附細胞數(shù)量無明顯減少，0、12、24小時細胞數(shù)分別為305.3±22.54；294.7±20.45；288.6±30.97。
本發(fā)明所用實驗試劑，儀器及實驗動物均為市購。
本發(fā)明采用自體血管內(nèi)皮細胞修飾不銹鋼動脈瘤支架表面，克服了不銹鋼裸支架的諸多缺陷，具有以下主要優(yōu)點。
1、抗載瘤動脈血栓形成。
內(nèi)皮化的支架表面避免了金屬與血液直接接觸，減少炎癥反應(yīng)后產(chǎn)生血栓形成作用，降低載瘤動脈狹窄的發(fā)生率；涂層材料中鍵合的肝素在支架到達治療位置后緩慢釋放，阻止了治療早期載瘤動脈內(nèi)的血栓形成。
2、促進治療后動脈瘤瘤頸部位內(nèi)皮細胞層的形成。
通過支架帶入的自體內(nèi)皮細胞在瘤頸部位沿支架的網(wǎng)格排列，這種排列結(jié)構(gòu)大大減少了內(nèi)皮細胞所要爬行的距離，可在瘤頸部位疏松的血栓表面形成內(nèi)皮細胞層，從而真正達到治愈動脈瘤的目的。
3、自體內(nèi)皮細胞容易采集、無免疫源性、不存在倫理問題。
人類自體內(nèi)皮細胞可以在大隱靜脈的內(nèi)皮層中采集擴增而得。自體內(nèi)皮細胞的使用避免了諸如臍靜脈內(nèi)皮細胞、永生化內(nèi)皮細胞系等需要考慮的排斥反應(yīng)以及倫理問題等。
4、本發(fā)明所涉及的技術(shù)方法成熟可行，成本在可接受范圍內(nèi)。


圖1犬血管內(nèi)皮細胞形態(tài)(放大倍數(shù)200)。
圖2A，B均為內(nèi)皮細胞化支架在掃描電鏡下的形態(tài)。
具體實施例方式
實施例1(1)培養(yǎng)自體血管內(nèi)皮細胞取實驗用犬一側(cè)頸靜脈，無菌下剝離靜脈周圍的芥蒂組織，用D-hank’s液反復(fù)沖洗血管，將血管內(nèi)的血液沖洗干凈，用外科縫線把血管一頭扎住，血管內(nèi)壁外翻，外科縫線扎住血管另一頭將血管段放入1％膠原酶(Sigma)，0.125％胰酶(Sigma)中37℃消化20分鐘，用血清終止消化吸出細胞懸液，離心1500轉(zhuǎn)/分5分鐘，倒去上清夜，用80％DMEM20％胎牛血清，20ng/mlVEGF培養(yǎng)液重懸細胞，將1×106細胞密度的細胞懸液種植于涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞鋪滿皿底后進行細胞傳代。
(2)涂層材料的制備及不銹鋼支架的表面涂層將交酯或內(nèi)酯與含多官能團氨基酸的嗎啉二酮衍生物以辛酸亞錫為催化劑，進行聚合；其中兩者的投料摩爾比例控制為99∶1；反應(yīng)溫度為50-200℃，反應(yīng)時間為0.5-46小時；所得聚合物用Pd/C為催化劑催化氫化24～180小時，得到具有可反應(yīng)性側(cè)基的生物降解型聚酯，反應(yīng)溫度為10-35℃，反應(yīng)時間為8-80h；再將上述脫保護后的聚合物與肝素溶解在混和溶劑THF/H2O中，以二環(huán)己基碳二亞氨為催化劑進行反應(yīng)，即得可完全生物降解的藥物高分子。
將制備的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，得到濃度從10％wt～0.01％wt的溶液，所得溶液采用計算機控制的噴涂工藝噴涂到支架表面，劑量為10ug，然后抽干，消毒后待用。
所述交酯或內(nèi)酯可選用L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己內(nèi)酯等類似的單體。
(3)內(nèi)皮化不銹鋼支架的集成用1×107的高滴度細胞懸液緩慢地滴在血管支架上并旋轉(zhuǎn)支架，在倒置顯微鏡下可見血管內(nèi)皮細胞均勻的貼附在支架上后浸入培養(yǎng)液中放入37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后準(zhǔn)備進行體內(nèi)植入支架。
本發(fā)明自體內(nèi)皮化不銹鋼支架制備的各步驟中均進行了相應(yīng)的理化性能和生物學(xué)特征的檢測，結(jié)果表明符合設(shè)計要求。表1是涂層材料的理化及生物特征。
表2是內(nèi)皮化支架的生物學(xué)特征。
表1

表2

實施例21、培養(yǎng)自體血管內(nèi)皮細胞同實施例1。
2、制備涂層材料及不銹鋼支架表面涂層將交酯或內(nèi)酯與含多官能團氨基酸的嗎啉二酮衍生物，其中兩者的投料摩爾比例為1∶99，以辛酸亞錫為催化劑，進行聚合；反應(yīng)溫度為50～200℃，反應(yīng)時間為0.5～46小時，得到聚合物的交酯或內(nèi)酯與含多官能團氨基酸的嗎啉二酮衍生物的摩爾比例為1∶99；所得聚合物用HBr/HAc為催化劑脫去保護基團后，得具有可反應(yīng)性側(cè)基的生物降解型聚酯，反應(yīng)溫度為10-35℃，反應(yīng)時間為8-80h；再將脫保護后的聚合物與肝素溶解在混和溶劑THF/H2O中，以二環(huán)己基碳二亞氨為催化劑進行反應(yīng)，即得可完全生物降解的藥物高分子材料。
將制備的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，得到濃度從10％wt～0.01％wt的溶液，用計算機程序控制的噴涂工藝噴涂到支架表面，劑量為1000ug。抽干，消毒后待用。
所述的交酯或內(nèi)酯可選用L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己內(nèi)酯等類似的單體。
(3)內(nèi)皮化不銹鋼支架集成采用5×107的高滴度細胞懸液慢滴在血管支架上，并旋轉(zhuǎn)支架，使均勻貼附在支架上后浸入培養(yǎng)液中放入37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后準(zhǔn)備用。進行體內(nèi)植入支架。
本發(fā)明支架進行了相應(yīng)的理化性能和生物學(xué)特征的檢測，結(jié)果表明符合設(shè)計要求。
實施例3內(nèi)皮化支架介入治療動脈瘤的實驗將上述自體內(nèi)皮細胞化動脈瘤支架均勻壓縮于微導(dǎo)管球囊表面?zhèn)溆谩?br> 選用上述的同一實驗用犬(15-20Kg)，頸外靜脈采集后建立頸總動脈動脈瘤模型(瘤頸8mm；瘤體6×8×10mm3)。模型建立后三周，將頸總動脈動脈瘤犬經(jīng)靜脈全身麻醉后固定于數(shù)字減影血管造影(DSA)床，經(jīng)右側(cè)股動脈插入6F動脈鞘。常規(guī)血管造影顯示動脈瘤位置及形態(tài)后，將6F導(dǎo)引導(dǎo)管置于載瘤頸總動脈的近端。自體內(nèi)皮細胞化動脈瘤通過微導(dǎo)管輸送到動脈瘤瘤頸位置，球囊擴張到位后釋放支架。即刻復(fù)查DSA顯示支架位置滿意，動脈瘤內(nèi)渦流產(chǎn)生，部分血栓形成，瘤體縮小。三月后復(fù)查DSA顯示動脈瘤不顯影。將動脈瘤解剖離體，經(jīng)免疫組化染色顯示瘤頸部位有內(nèi)皮細胞層形成。對照組采用裸不銹鋼支架經(jīng)相同途徑治療后，三月后DSA顯示動脈瘤閉塞不全，免疫組化染色顯示瘤頸部位內(nèi)皮細胞層形成不全。
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)皮細胞化動脈瘤支架，其特征是由涂層生物可降解的高分子生物材料的不銹鋼動脈瘤支架和自體血管內(nèi)皮細胞組成，所述的不銹鋼動脈瘤支架表面涂層上貼附自體血管內(nèi)皮細胞。
2.按權(quán)利要求1所述的內(nèi)皮細胞化動脈瘤支架，其特征是所述的自體血管內(nèi)皮細胞選自自體靜脈內(nèi)皮層。
3.按權(quán)利要求1所述的內(nèi)皮細胞化動脈瘤支架，其特征是所述的支架表面涂層的高分子生物材料為肝素鍵合的聚乳酸-氨基酸共聚物。
4.按權(quán)利要求1的內(nèi)皮細胞化動脈瘤支架的制備方法，其特征是包括以下步驟，(1)培養(yǎng)自體血管內(nèi)皮細胞取實驗用犬頸靜脈血管段，放入1％膠原酶，0.125％胰酶中消化，吸出細胞懸液，離心，倒去上清夜，用80％DMEM20％胎牛血清，20ng/mlVEGF培養(yǎng)液重懸細胞，將1×106細胞密度的細胞懸液種植于涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代；(2)制備涂層材料及不銹鋼支架表面涂層將交酯或內(nèi)酯與含多官能團氨基酸的嗎啉二酮衍生物，以辛酸亞錫為催化劑，進行聚合，所得聚合物用Pd/C為催化劑催化氫化或采用HBr/HAc為催化劑脫去保護基團后，得具有可反應(yīng)性側(cè)基的生物降解型聚酯，再將脫保護后的聚合物與肝素溶解在混和溶劑THF/H2O中，以二環(huán)己基碳二亞氨為催化劑進行反應(yīng)，得到可完全生物降解的藥物高分子材料；將制備的生物可降解高分子材料溶解在氯仿中，所得溶液噴涂到支架表面抽干，消毒后待用；(3)內(nèi)皮化不銹鋼支架集成采用1×107-5×107的滴度細胞懸液滴在血管支架上，使均勻貼附在支架上后浸入培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時備用。
5.按權(quán)利要求4的制備方法，其特征是步驟2所述的交酯或內(nèi)酯選自L-丙交酯，DL-丙交酯，乙交酯或己內(nèi)酯等類似的單體。
6.按權(quán)利要求4的制備方法，其特征是步驟2的交酯或內(nèi)酯與含多官能團氨基酸的嗎啉二酮衍生物的投料摩爾比例為99∶1～1∶99。
7.按權(quán)利要求4的制備方法，其特征是步驟2的溶解在氯仿中的所得溶液濃度為10％wt～0.01％wt，噴涂到支架表面的劑量為10～1000ug。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)療材料領(lǐng)域，涉及一種內(nèi)皮細胞化動脈瘤支架及其制備方法。本發(fā)明將自體靜脈內(nèi)皮層采集擴增的血管內(nèi)皮細胞粘附于經(jīng)生物相容性的，生物可降解的，無毒的高分子生物材料涂層的金屬動脈瘤支架表面制成動脈瘤支架，能在支架建立后加快瘤頸口新生內(nèi)皮的產(chǎn)生和覆蓋，減少動脈瘤復(fù)發(fā)和避免載瘤動脈的狹窄，提高動脈瘤特別是顱內(nèi)動脈瘤的治愈率，減少動脈內(nèi)血栓形成。本發(fā)明克服了不銹鋼裸支架的諸多缺陷，無免疫源性和倫理問題，制備成本不高、技術(shù)成熟。有利于提高我國在新型血管內(nèi)治療材料和推動顱內(nèi)動脈瘤介入治療的學(xué)術(shù)水平。
文檔編號A61L27/40GK101073677SQ20061002665
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月17日
發(fā)明者朱巍, 周良輔, 程樹軍, 汪洋, 毛穎, 宋冬雷, 田彥龍, 朱云夢 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院