專利名稱：化合物(2s)－5，7,2＇，6＇－四羥基－6，8－二異戊烯基－二氫黃酮的提取工藝及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥中具有明顯藥理活性成分的分離純化方法，更具體地說，本發(fā)明涉及的是白花敗醬草中一種具有明顯抗腫瘤活性的化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮的提取工藝及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是嚴重危害人民生命健康的重大疾病，世界上每年有600多萬人死于惡性腫瘤。目前臨床上使用的治療藥物主要是傳統(tǒng)的細胞毒類化學(xué)合成抗腫瘤藥物，雖然部分藥物抗腫瘤作用明顯，但毒副作用大，選擇性較差，容易產(chǎn)生耐藥性。中醫(yī)藥學(xué)是一門積淀中華民族幾千年來防病治病的實踐經(jīng)驗結(jié)晶，具有鮮明的理論體系，又能體現(xiàn)辨證論治和個體化治療時代特征的生命科學(xué)。中醫(yī)能辨西醫(yī)不明之癥，中藥能治西藥難治、不治之癥。因此抗腫瘤中藥的研究越來越收到國內(nèi)外醫(yī)藥界的重視和青睞。
白花敗醬草(Patrinia villosa Juss)又名苦菜、苦齋、鹿腸，系敗醬科多年生草本植物，分布于我國華東、華中、華南及西南各地。因其含有多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等有益成份而被人們廣泛食用，它也是一種常用中藥，始載于《神龍本草經(jīng)》，后又被《中國藥典》(1977版)收載，具有清熱利濕、解毒排膿、活血化瘀、清心安神、促進肝細胞再生、改善肝功能、增強抑菌和抗病毒等作用，臨床上常用于治療闌尾炎、痢疾、肝炎、扁桃體炎、流行性腮腺炎、癰腫等癥。現(xiàn)代研究表明白花敗醬草主要含有三萜類與環(huán)烯醚萜類化合物如白花敗醬醇甙(villosolside)、白花敗醬醇(villosol)、番木別甙(loganin)、莫諾甙(morroniside)、白花敗醬甙(villoside)等，此外還有以敗醬烯與異敗醬烯為主的揮發(fā)油、內(nèi)酯、香豆素等，但很多未見文獻報道，也未見有相關(guān)活性篩選的報道，其中化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮[(2S)-5，7，2′，6′-tetrahydroxy-6，8-di(γ，γ-dimethylallyl)-flavanone]的結(jié)構(gòu)式如下 雖然我們已經(jīng)采用高速逆流色譜技術(shù)從白花敗醬草藥材中對該化合物進行了分離制備，但所得產(chǎn)物量較少，不能滿足大量藥效試驗的需要[J.Y.Peng，G..J.Yang，G.R.Fan，Y.T.Wu，J.Chromatogr.A，1092(2005)235-240]，并且也沒有進行該化合物藥效篩選尤其是抗腫瘤活性方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從白花敗醬草中分離純化具有明顯抗腫瘤活性化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮的提取工藝，并進行了抗腫瘤活性篩選以驗證其抗腫瘤活性。
本發(fā)明提供的從白花敗醬草中分離純化具有明顯抗腫瘤活性的化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮的提取工藝，具體包括粗提物提取、粗提物的極性分段、硅膠柱層析三道工序，其特征在于采用一定濃度的乙醇提取藥材獲取粗提物，采用有機溶劑對粗提物分段萃取并結(jié)合硅膠柱層析得到純品。
其具體提取工藝工序如下1.粗提物提取取白花敗醬藥材適當(dāng)粉碎后，用80％乙醇回流提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮至無醇味。
2.粗提物的極性分段取提取所得浸膏，加適量水混懸后，先用石油醚(60-90℃)萃取，靜止分取石油醚層，再向水層中加入氯仿萃取，靜止后分取氯仿層，減壓濃縮氯仿萃取物，真空干燥。
3.硅膠柱層析取氯仿萃取物進行硅膠柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫，接收氯仿-甲醇(20∶1)洗脫流分，該流分減壓回收溶劑后再次進行硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫，接收氯仿-甲醇(15∶1)洗脫流分，減壓回收后得淺黃色粉末，即為(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮。
亦對化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮進行了體內(nèi)、體外抗腫瘤活性實驗，考察所得化合物的體外細胞毒活性和體內(nèi)對移植性腫瘤生長的抑制作用。
采用MTT法考察了所得化合物體外對7種人腫瘤細胞株(A549、BEL-7402、SGC-7901、MCF-7、HT-29、K562和A498)的生長抑制作用。結(jié)果該化合物對所選7種人腫瘤細胞株的半數(shù)抑制濃度均小于10μg/ml。
同時也進行了該化合物對小鼠體內(nèi)S180移植性肉瘤生長的抑制作用試驗。
建立小鼠體內(nèi)S180移植性肉瘤模型，腹腔注射該化合物，并與陽性對照藥環(huán)磷酰胺對照，計算該化合物的抑瘤率，并觀察該化合物對小鼠的免疫系統(tǒng)和白細胞的影響。結(jié)果表明在腹腔注射給藥40mg/kg時，該化合物的抑瘤率達到了57％以上。


圖1為白花敗醬草中具有明顯抗腫瘤活性化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮的提取工藝流程圖。
圖2為化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮體內(nèi)抗S180肉瘤試驗各給藥組肉瘤的病理切片具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明進行說明實施例1.
化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮的提取1.稱取白花敗醬草藥材粗粉8.0kg，用8倍量80％乙醇回流提取2.0h，過濾，再向濾渣中加入6倍量80％乙醇回流提取1.5h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至浸膏約2000ml(濃縮溫度為50度)。
2.取濃縮后的浸膏，加1000ml水混懸后，置于5000ml分液漏斗中，加石油醚1000ml充分振搖后靜止分層，分取石油醚層，如此萃取二次，合并石油醚萃取液。再向水層中加入1000ml氯仿，充分振搖后靜止分層，分取氯仿層，如此萃取三次，合并氯仿萃取液。減壓濃縮萃取液(濃縮溫度60度)后減壓干燥得氯仿萃取物94g。
3.取氯仿萃取物進行硅膠柱層析(8.0×120cm，硅膠量2500g，200-300目)，依次用氯仿、氯仿∶甲醇(100∶1-1∶10)梯度洗脫，接收氯仿∶甲醇(20∶1)洗脫液，減壓濃縮后，真空干燥(60℃)，得淺黃色粉末3.5g。取次粉末在此進行硅膠柱層析(8.0×120cm，硅膠量350g，200-300目)，依次用氯仿-甲醇(50∶1-1∶1)梯度洗脫，接收氯仿∶甲醇(15∶1)洗脫液，減壓濃縮后，真空干燥(60℃)，得淺黃色粉末400mg，即為化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮。
實施例2.
化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮體內(nèi)、體外抗腫瘤實驗選擇7種人腫瘤細胞株，A549、BEL-7402、SGC-7901、MCF-7、HT-29、K562和A498在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液、37℃、5％CO2培養(yǎng)箱生長至細胞旺盛，經(jīng)0.25％胰酶加0.02％EDTA消化，制成細胞懸液，將細胞懸液接種于96孔微量培養(yǎng)板中(細胞濃度為5×105個/ml)，給藥組分別加入不同濃度的化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮，對照組加入相應(yīng)的溶劑，給藥后培養(yǎng)72小時，按MTT法用酶標(biāo)儀在550nm波長處測定吸光度(A)值，計算化合物的抑制率，由抑制率和樣品濃度繪制相應(yīng)的抑制曲線，再計算出半數(shù)抑制濃度(IC50)。該化合物對各腫瘤細胞株的IC50值見下表1。
表1化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮對7種人腫瘤細胞株的IC50值

取本室自己傳代呈對數(shù)生長期的S180小鼠腹水，用生理鹽水稀釋成2×107/ml，取0.2ml接種于小鼠右腋皮下。小鼠接種后第二天灌胃給藥，空白組給予生理鹽水0.2ml，陽性對照組給腹腔注射CTX 0.2ml(20mg/kg)，各治療組分別給予化合物化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg注射用油溶解后腹腔注射)，連續(xù)10天，于次日處死。小鼠處死前眼眶取血，并作白細胞(WBC)計數(shù)，之后行脫臼處死小鼠。
剝?nèi)∪饬鼋M織同時取小鼠脾臟和胸腺，稱重后按照下式計算抑瘤率，并計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。小鼠服用CTX后，被毛疏松，精神較差，飲水飲食減少，與對照組相比體重增加緩慢，但對腫瘤的抑瘤作用十分突出，抑瘤率高達57.7％。腹腔注射化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮后的小鼠飲食良好，行動自如，體重與模型組相比無顯著性差異，腫瘤生成時間延后，瘤塊生長緩慢。所得結(jié)果表明本工藝制備得到的化合物具有很強的抑制小鼠體內(nèi)S180肉瘤生長的作用，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，同時該化合物能明顯見降低小鼠的脾指數(shù)和升高小鼠的胸腺指數(shù)，高劑量時的作用尤為顯著(P＜0.01)。白細胞計數(shù)表明該制備物能明顯升高由CTX所造成的小鼠白細胞降低(P＜0.01)。
同時，我們也對小鼠S180肉瘤進行了常規(guī)石蠟切片和顯微分析，如圖2所示。由圖可知模型組腫瘤細胞生長旺盛，各給藥組腫瘤細胞都有不同程度的死亡，尤其是CTX和給藥高劑量組，腫瘤細胞死亡比例較大，病理切片表明CTX和化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮都能殺死一定量的腫瘤細胞，從而抑制肉瘤的生長，與上述實驗所得數(shù)據(jù)一致。
具體見表2、3和4。
表2化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮對S180移植肉瘤的抑制作用(mean±S)

注與模型組相比ΔP＜0.05；與模型組相比ΔΔP＜0.01；與CTX組相比#P＜0.05表3化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮對荷瘤小鼠免疫器官的影響(mean±S)

注與模型組相比ΔP＜0.05；與CTX組相比#P＜0.05；與CTX組相比##P＜0.01表4化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮對荷瘤小鼠WBC數(shù)的影響(mean±S)

注與模型組相比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與CTX組相比###P＜0.00權(quán)利要求
1.一種從白花敗醬草中分離純化化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮的提取工藝，包括粗提物提取、粗提物的極性分段、硅膠柱層析三道工序，其特征在于工序(1)采用乙醇提取藥材獲取提取物，工序(2)采用有機溶劑對提取物分段萃取得到粗提物，工序(3)采用硅膠層析對粗提物進行分離純化，即得化合物純品。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種從白花敗醬草中分離純化化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮的提取工藝，其特征在于工序(1)中乙醇為80％的藥用乙醇，藥材粗粉用80％乙醇提取兩次，每次2.0小時，過濾，合并提取液，減壓濃縮至浸膏。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種從白花敗醬草中分離純化化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮的提取工藝，其特征在于工序(2)中提取液萃取所用的有機溶劑為石油醚(60-90℃)和氯仿，先用石油醚萃取，再用氯仿萃取，得到氯仿萃取物。
4.按照權(quán)利1或3所述的一種從白花敗醬草中分離純化化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮的提取工藝，其特征在于工序(3)中氯仿萃取物進行硅膠柱層析，用氯仿—甲醇梯度洗脫，接收氯仿∶甲醇＝20∶1的洗脫流分，以此為進一步分離純化樣品。
5.按照權(quán)利要求4所述的一種從白花敗醬草中分離純化化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮的提取工藝，其特征在于采用硅膠柱層析對氯仿∶甲醇＝20∶1的洗脫流分再次進行分離純化，氯仿—甲醇梯度洗脫，接收氯仿∶甲醇＝15∶1的洗脫流分，即得化合物純品。
6.化合物(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基-二氫黃酮在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種白花敗醬草中具有明顯抗腫瘤活性化合物(2S)－5，7，2′，6′－四羥基－6，8－二異戊烯基－二氫黃酮[(2S)－5，7，2′，6′－tetrahydroxy－6，8－di(γ，γ－dime－thylallyl)－flavanone]的提取工藝，具體包括粗提物提取、粗提物的極性分段、硅膠柱層析三個步驟，其特征在于采用乙醇提取藥材獲取粗提物，采用有機溶劑對粗提物分段萃取并結(jié)合硅膠柱層析得到純品。本法具有制備量大、所得產(chǎn)品純度高的特點(純度高于99％)。并對該化合物進行了抗腫瘤活性篩選以驗證其抗腫瘤活性。該化合物在制備抗腫瘤藥物方面可得到應(yīng)用。
文檔編號A61K31/352GK1850816SQ20061002682
公開日2006年10月25日 申請日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日
發(fā)明者范國榮, 彭金詠, 柴逸峰, 吳玉田 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)