專利名稱：一種蜈蚣藻多糖提取物在制備抗腫瘤及其它藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種植物提取物，尤其是涉及一種蜈蚣藻多糖提取物、其制備方法及其在制備抗凝血、抗血栓、抗艾滋病和/或抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病和腫瘤是當(dāng)前威脅人類健康最大的兩類疾病。目前臨床上針對此兩類疾病的藥物很多，但通常都具有一定的毒副作用。如已有多年臨床應(yīng)用的抗凝血藥肝素，是很好的抗凝血類藥物。同時，它作為一種血管生成抑制劑用于腫瘤的治療也有很好的效果。但其最大的缺點是常導(dǎo)致難以控制的出血，從而限制了其更為廣泛的應(yīng)用。目前科學(xué)家正試圖通過兩條途徑來解決一是通過化學(xué)降解或全合成的方式獲得小分子量肝素類似物；一是從其他來源分離純化獲得具有高的血管生成抑制活性而沒有或只有很低的抗凝血活性的多糖。在前一途徑中科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一些活性高于肝素的小分子量的肝素或硫酸化肝素，并全合成了活性遠(yuǎn)高于肝素的一些寡糖(Digabreiele，A.D.et al.Nature，1998，393812-817；Ram，S.et al.Nature ReviewCancer.2002，2521-528.)，但通過該途徑的成本太高。
本發(fā)明人在對紅藻中多糖成分的研究中發(fā)現(xiàn)蜈蚣藻多糖(GFP)不但具有抗凝血作用，而且還具有較強的抗血栓、抗HIV-1病毒和抗腫瘤作用。有關(guān)蜈蚣藻多糖的結(jié)構(gòu)及其抗腫瘤活性、抗HIV-1病毒、抗血栓與抗凝血活性均未見文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究設(shè)計蜈蚣藻多糖的藥物用途。
本發(fā)明提供了一種具有抗凝血、抗HIV-1病毒、抗血栓和抗腫瘤作用的蜈蚣藻多糖提取物。本發(fā)明還提供蜈蚣藻多糖提取物在制備抗凝血、抗血栓、抗艾滋病和/或抗腫瘤藥物中的用途。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種蜈蚣藻多糖提取物，含下列重量配比成份72～82％半乳糖、5～15％3，6-脫水半乳糖、0.5～5％2-甲基半乳糖和1～10％6-甲基半乳糖。該提取物還含有1～10％木糖和1～10％葡萄糖。特別是，本發(fā)明的提取物含有下列重量配比成分75.0％半乳糖、9.6％3，6-脫水半乳糖、0.5％2-甲基半乳糖、3.5％6-甲基半乳糖、2.1％木糖、9.5％葡萄糖和25.7％硫酸基團(tuán)。
本發(fā)明還提供了一種制備蜈蚣藻多糖提取物的方法。
本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物可由如下方法制得將蜈蚣藻粉碎后用10-30倍量熱水提取1～3小時，溫度控制在90～100℃，溶液pH控制在5～7之間，得一提取液；將所述提取液經(jīng)離心后留上清液，攪拌下加入1～3倍量的乙醇，再次離心留沉淀物；和將所述沉淀物溶于水后冷凍干燥得到蜈蚣藻多糖提取物。
優(yōu)選將所述溶液的pH控制在6～7之間。
本發(fā)明制備蜈蚣藻多糖提取物的方法，具體包括下列步驟(1)將蜈蚣藻粉碎后用其重量的10-30倍量熱水用熱水提取1～3小時，溫度控制在90～100℃，溶液pH控制在5～7之間，得提取液；(2)將所述提取液經(jīng)離心后留上清液，攪拌下加入1～3倍量的乙醇，再次離心留沉淀物；和(3)將所述沉淀物溶于水后冷凍干燥得到蜈蚣藻多糖提取物。
優(yōu)選將所述驟(1)溶液的pH控制在6～7之間。
本發(fā)明的另一目的是提供了蜈蚣藻多糖提取物在制備抗凝血、抗血栓和/或抗腫瘤藥物中的用途。特別是在制備抗白血病、肺癌或S-180肉瘤的藥物中的用途。
本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物通過下列試驗證實了具有抑制腫瘤細(xì)胞作用；抗凝血活性；抗血栓作用和抗艾滋病毒(HIV-1)活性。
(1)蜈蚣藻多糖提取物A(GFP)體外/體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長實驗(實施例5)(2)蜈蚣藻多糖提取物體外對凝血酶原時間(PT)的影響(實施例6)(3)蜈蚣藻多糖提取物體外對活化部分凝血酶時間(APTT)的影響(實施例7)(4)體內(nèi)法測定蜈蚣藻多糖提取物靜脈注射對小鼠凝血時間、流血時間、PT、APTT的影響(實施例8)(5)體內(nèi)法蜈蚣藻多糖提取物口服對小鼠凝血時間、流血時間、PT、APTT的影響(實施例9)(6)靜脈注射GFP對下腔靜脈血栓形成的影響(實施例10)(7)口服GFP對下腔靜脈血栓形成的影響(實施例11)(8)蜈蚣藻多糖對HIV-1病毒抑制作用(實施例12)本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物中可加入可藥用載體以促進(jìn)其給藥。較佳的，本發(fā)明的藥物組合物含有0.1-99.9％重量比的提取物?！翱伤幱幂d體”不會破壞蜈蚣藻多糖提取物的藥學(xué)活性，同時其有效用量，即能夠起到藥物載體作用時的用量對人體無毒。
“可藥用載體”包括但不限于離子交換材料、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)(SEDDS)如d-α-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐溫(Tweens)或其他類似聚合介質(zhì)等藥物制劑用的表面活化劑、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸部分甘油酯混合物、水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二納、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、硅酸鎂等。聚乙烯吡咯酮、纖維素物質(zhì)、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙稀酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛酯、環(huán)糊精如α-、β-及γ-環(huán)糊精或其經(jīng)化學(xué)修飾的衍生物如2-和3-羥丙基-β-環(huán)糊精等羥烷基環(huán)糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促進(jìn)本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物的藥物傳遞。
其他可藥用輔料如填充劑(如無水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合劑(如微晶纖維素)、崩解劑(如交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素和交聯(lián)PVP)、潤滑劑(如硬酯酸鎂)、吸收促進(jìn)劑、香味劑、甜味劑、稀釋劑、賦形劑、潤濕劑、溶劑、增溶劑和著色劑等也可加入本發(fā)明的藥物組合物中。
上述蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物可通過腸道或者非腸道途徑給藥。腸道給藥制劑包括丸劑、顆粒劑、膠囊劑、懸浮液或溶液。非腸道給藥制劑包括注射劑、霜劑、膏劑、貼劑或噴霧劑。非腸道給藥途徑包括皮下、皮內(nèi)、動脈、靜脈、肌肉、關(guān)節(jié)、滑液、胸骨、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)、顱內(nèi)注射或滴注。其它給藥途徑可包括局部、直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、陰道、舌下、粘膜、氣管或尿道。蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物還可以通過氣霧吸入或植入蓄積或針刺等方式給藥。
蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物的口服制劑包括但不限于膠囊、片劑、乳劑、水懸浮劑、膠體液、溶液、微膠囊、丸劑、錠劑、顆粒劑、粉劑。常用于片劑的可藥用載體包括乳糖和玉米淀粉。通常還會加入硬脂酸鎂等潤滑劑。常用于膠囊劑的可藥用載體包括乳糖和干玉米淀粉。當(dāng)制成口服水懸浮劑和/或乳劑時，蜈蚣藻多糖提取物可懸浮或溶解于油相里并與乳化劑或懸浮劑相結(jié)合。如果需要，也可以加入一些甜味劑和/或香味劑和/或增色劑。
本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物可被制成無菌注射劑，如無菌水相或油相懸浮液。該懸浮液可按本領(lǐng)域的常規(guī)方法即使用適宜的分散劑或濕潤劑(如Tween 80)及懸浮劑等制得。其還可以是在可腸道外給藥的無毒稀釋劑或溶劑中的水溶液或懸浮液，如在1，3-丁二醇中的溶液。相關(guān)的可用載體或溶劑包括甘露醇、水、林格氏液、等滲氯化鈉等。另外，無菌的固定油常被作為溶劑或懸浮劑的媒介，因而包括合成甘油單酯或甘油二酯在內(nèi)的多種柔和的固定油(bland fixed oil)均適用。脂肪酸，如十八烯酸及其甘油酯衍生物(如橄欖油或蓖麻油，特別是其聚氧乙烯基衍生物)等可用于制備所述注射劑。所述油溶液或懸浮液還可包含一種長鏈的乙醇稀釋劑或分散劑或羧甲基纖維素或類似的其他分散劑，此類物質(zhì)常用于制備可藥用乳劑和/或懸浮劑。其它一些制劑常用的表面活性劑如Tweens或Spans和/或其他類似的乳化劑或生物利用度促進(jìn)劑等也同樣可用于制備本制劑。
本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物可制成栓劑通過直腸給藥，方法是將蜈蚣藻多糖提取物與適宜的非刺激性賦形劑混合，后者在室溫下為固體而在直腸溫度下為液體，因而該栓劑可融解于直腸中并釋放出活性成份。此類賦形劑包括但不限于；可可油、蜂蠟和聚乙烯。本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物的局部給藥制劑(如油膏)可直接用于患處。此類局部制劑含有活性成份及可藥用載體，后者包括但不限于礦物油、液體石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯或聚氧丙稀化合物、乳化臘或水。另外，本發(fā)明的藥物組合物還可制成洗劑或油劑。適用的載體包括但不限于礦物油、三梨醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鯨臘酯、十六烷醇、2-十八烷醇、苯甲基乙醇或水。本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物還可制成灌腸劑等用于直腸局部給藥。局部透皮貼劑亦在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物亦可經(jīng)鼻噴霧或者吸入給藥，即按本領(lǐng)域的常規(guī)方法，使用苯甲基乙醇或其他防腐劑、吸收促進(jìn)劑、碳氟化合物和/或其他增溶劑或分散劑制得鹽溶液。
本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物還可通過植入給藥。采用植入給藥方式可達(dá)到在給藥對象體內(nèi)持續(xù)，定時釋放本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物的效果。另外，植入給藥還能在局部組織和器官定位給藥(Negrin et al.，Biomaterials 22(6)563，2001)定時釋放技術(shù)亦可用于本發(fā)明蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物的給藥中，如基于聚合體技術(shù)的定時釋藥膠囊、緩釋技術(shù)和制劑包裹技術(shù)(如聚合體和脂質(zhì)體)等。
貼劑同樣包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。其包括基層(如聚合體、布、紗和繃帶)和本發(fā)明的藥物組合物?；鶎拥囊贿吙稍O(shè)有一保護(hù)層以防止活性成份的流出。所述貼劑還可含有一用于固定的粘合劑，后者可以是一種自然的或者合成的物質(zhì)，當(dāng)其與給藥對象的皮膚接觸時可暫時粘附于皮膚上。粘合劑可以是防水的。
當(dāng)本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物和制劑可與一種或多種附加的治療藥物或預(yù)防藥物混合。附加藥劑可作為獨立的劑型與本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物、及其藥物組合物分別給藥。附加藥劑也可和本發(fā)明的蜈蚣藻多糖提取物及其藥物組合物一起以單一劑型給藥。
為了便于理解本發(fā)明，特列舉以下實施例。其作用應(yīng)被理解為是對本發(fā)明的詮釋而絕非對本發(fā)明的任何形式的限制。
實施例1 制備蜈蚣藻多糖提取物A蜈蚣藻300g粉碎，然后加入90℃水6升提取1小時，期間加入冰醋酸控制提取液的pH值為6.2。離心得上清液5升，攪拌下加入95％乙醇15升，離心，棄去上清液。沉淀物溶于水3升，冷凍干燥得蜈蚣藻多糖10g(A提取物)。
實施例2 制備蜈蚣藻多糖提取物B蜈蚣藻1.5kg粉碎，然后加入沸水50升提取2小時，期間加入冰醋酸控制提取液的pH值為6.8。離心得上清液濃縮至30升，攪拌下加入95％乙醇60升，離心，棄去上清液。沉淀物溶于水10升，冷凍干燥的蜈蚣藻多糖60g(B提取物)。
實施例3 制備蜈蚣藻多糖提取物C蜈蚣藻1.0kg粉碎，然后加入70℃水30升提取3小時，期間加入冰醋酸控制提取液的pH值為5.5。離心得上清液濃縮至15升，攪拌下加入95％乙醇15升，離心，棄去上清液。沉淀物溶于水10升，冷凍干燥的蜈蚣藻多糖31g(C提取物)。
實施例4 蜈蚣藻多糖提取物結(jié)構(gòu)特征的確證蜈蚣藻多糖提取物1mg經(jīng)2mol/L三氟乙酸水解，硼氫化鈉還原，醋酐乙?；筮M(jìn)行GC分析，表明蜈蚣藻多糖提取物含有75.0％半乳糖、9.6％3，6-脫水半乳糖、0.5％2-甲基半乳糖、3.5％6-甲基半乳糖、2.1％木糖和9.5％葡萄糖.
經(jīng)比色法測定蜈蚣藻多糖提取物中含有25.7％硫酸基團(tuán)。
實施例5 蜈蚣藻多糖提取物A(GFP)體外/體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長實驗經(jīng)實驗證實GFP對小鼠白血病腫瘤細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用，在1mg/ml時抑制率為100％。GFP對人肺腺癌腫瘤細(xì)胞的生長同樣具有明顯的抑制作用，在1mg/ml時抑制率為94.％。
實驗小鼠移植S-180肉瘤后第二天按80mg/kg、40mg/kg靜脈給藥，連續(xù)7天，測定實驗組與對照組平均瘤重，結(jié)果表明80mg/kg時GFP對小鼠移植性S-180肉瘤具有明顯的抑制作用(P＜0.01)(表1)。
表1GFP對小鼠S-180肉瘤的抑制作用

實施例6 蜈蚣藻多糖提取物體外對凝血酶原時間(PT)的影響(表2)表2蜈蚣藻多糖提取物體外對PT的影響

結(jié)果顯示GFP大劑量和小劑量均能明顯延長凝血酶原時間，與正常組比均有顯著性差異，表明GFP具有抗凝血活性。
實施例7 蜈蚣藻多糖提取物體外對活化部分凝血酶時間(APTT)的影響(表3)表3蜈蚣藻多糖提取物體外對APTT的影響

結(jié)果顯示GFP能明顯延長活化部分凝血活酶時間，與正常組比較有顯著性差異，表明GFP具有抗凝血活性。
實施例8 體內(nèi)法測定蜈蚣藻多糖提取物靜脈注射對小鼠凝血時間、流血時間、PT、APTT的影響(表4)表4蜈蚣藻多糖提取物靜脈注射對小鼠凝血時間、流血時間、PT、APTT的影響

**P＜0.01，***P＜0.001結(jié)果顯示GFP靜脈注射對小鼠凝血時間、流血事件、PT、APTT均有明顯的延長作用，與正常組有顯著性差異，表明GFP靜脈注射具有良好的抗凝血作用。
實施例9 體內(nèi)法蜈蚣藻多糖提取物口服對小鼠凝血時間、流血時間、PT、APTT的影響(表5)表5蜈蚣藻多糖提取物口服對小鼠凝血時間、流血時間、PT、APTT的影響

*P＜0.05，**P＜0.01，P＜0.001結(jié)果顯示GFP口服對小鼠凝血時間、流血時間、PT、APTT均有明顯延長作用，與正常組比有顯著性差異，表明GFP口服亦有抗凝血作用。
實施例10 靜脈注射GFP對下腔靜脈血栓形成的影響(表6)表6靜脈注射GFP對下腔靜脈血栓形成的影響


*表示與正常組相比有顯著性差異(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)結(jié)果顯示靜脈注射GFP各劑量組均能顯著的減少小鼠血栓干濕重，表明蜈蚣藻多糖具有良好的抗血栓作用.
實施例11 口服GFP對下腔靜脈血栓形成的影響(表7)表7口服GFP對下腔靜脈血栓形成的影響

*表示與正常組相比有顯著性差異(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)結(jié)果顯示口服GFP各劑量組均能顯著減少小鼠血栓干濕重，表明GFP口服亦具有良好的抗血栓作用.
實施例12 蜈蚣藻多糖對HIV-1病毒抑制作用(表8)表8蜈蚣藻多糖對HIV-1病毒的抑制作用

結(jié)果表明蜈蚣藻多糖對未感染HIV-1病毒細(xì)胞的半致死劑量大于10μM，50％有效抑制劑量為0.005μM，90％有效抑制劑量為0.57μM，治療指數(shù)大于2000.同批實驗陽性藥(硫酸化右旋糖苷)的半致死劑量為1μM，50％有效抑制劑量為0.002μM，90％有效抑制劑量為0.23μM，治療指數(shù)為500.表明蜈蚣藻多糖具有良好的抗HIV-1病毒活性。
權(quán)利要求
1.一種蜈蚣藻多糖提取物，其特征在于該提取物含有下列重量配比的成份72～82％半乳糖、5～15％3，6-脫水半乳糖、0.5～5％2-甲基半乳糖和1～10％6-甲基半乳糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蜈蚣藻多糖提取物，其特征在于該提取物還含有1～10％木糖和1～10％葡萄糖。
3.一種蜈蚣藻多糖提取物，其特征在于該提取物含有下列重量配比的成份75.0％半乳糖、9.6％3，6-脫水半乳糖、0.5％2-甲基半乳糖、3.5％6-甲基半乳糖、2.1％木糖、9.5％葡萄糖和25.7％硫酸基團(tuán)。
4.一種如權(quán)利要求1所述的蜈蚣藻多糖提取物的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)將蜈蚣藻粉碎后用其重量的10-30倍量熱水提取1～3小時，溫度控制在90～100℃，溶液pH控制在5～7之間，得提取液；(2)將所述提取液經(jīng)離心后留上清液，攪拌下加入1～3倍量的乙醇，再次離心留沉淀物；和(3)將所述沉淀物溶于水后冷凍干燥得到蜈蚣藻多糖提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種蜈蚣藻多糖提取物，其特征在于其中所述步驟(1)的提取溶液pH為6～7。
6.一種權(quán)利要求1所述的蜈蚣藻多糖提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
7.一種權(quán)利要求1所述的蜈蚣藻多糖提取物在制備抗凝血藥物中的應(yīng)用。
8.一種權(quán)利要求1所述的蜈蚣藻多糖提取物在制備抗血栓藥物中的應(yīng)用。
9.一種權(quán)利要求1所述的蜈蚣藻多糖提取物在制備抗艾滋病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蜈蚣藻多糖提取物在制備抗凝血、抗血栓、抗艾滋病和/或抗腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明提供了制備方法。
文檔編號A61P7/02GK101077356SQ200610026830
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日
發(fā)明者王順春, 施松善, 周吉燕, 王崢濤, 胡之璧 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)