專利名稱：自體脂肪干細胞構(gòu)建的組織工程化軟骨的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學和生物醫(yī)學工程領域，更具體地涉及組織工程化軟骨及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
先天畸形、外傷、感染、腫瘤或骨軟骨炎等疾病均可以導致軟骨的缺損或損傷。由于軟骨組織損傷后自我修復能力很低，因此，軟骨缺損或損傷的治療一直是修復重建外科面臨的巨大挑戰(zhàn)。目前臨床上常用的治療手段包括自體軟骨的游離或帶蒂移植(主要取自體肋軟骨)、異體軟骨的游離移植、自體或異體軟骨細胞注射移植、骨膜或軟骨膜移植及應用人工假體等。但這些方法均存在明顯的缺點，如自體軟骨移植供體來源少、創(chuàng)傷大、移植后易吸收縮小，還可能出現(xiàn)各供區(qū)并發(fā)癥。異體和異種軟骨移植物不但具有免疫原性，而且存在傳播艾滋病、肝炎等病原體的危險。雖然人工合成的軟骨組織代用品具有制作簡單，使用方便等優(yōu)點，但是替代材料只具備充填、支持及維持美觀的作用，缺少軟骨生物學功能，不是真正意義上的結(jié)構(gòu)與功能重建，而且可能發(fā)生移植部位疼痛、人工代用品外露等問題，無法滿足患者的治療要求。
組織工程技術(shù)的興起為軟骨缺損的完美修復帶來了新的希望。其基本原理是將有特定功能的細胞與一定形狀的可降解生物材料結(jié)合，通過體外培養(yǎng)構(gòu)建出有相應功能的活體組織用于組織缺損的修復，或直接將細胞-材料復合物植入體內(nèi)組織缺損部位進行修復。
軟骨是最早應用組織工程技術(shù)構(gòu)建成功的組織，目前應用軟骨細胞為種子細胞在體內(nèi)外已經(jīng)能夠成功地構(gòu)建出精確形狀的成熟軟骨組織。但獲取軟骨細胞同樣會面臨軟骨移植時存在的供區(qū)創(chuàng)傷大、供體來源不足及同種異體免疫排斥反應等問題，而且軟骨細胞體外大量擴增極易發(fā)生老化與去分化，常規(guī)培養(yǎng)傳代3～4次后即喪失軟骨形成能力。
干細胞(stem cells)包括間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)的軟骨分化潛能已被許多研究充分證實，但骨髓穿刺給病人帶來很大的痛苦，胚胎干細胞應用又存在倫理問題。
成體干細胞的應用大大拓展了種子細胞的來源，但目前只有將自體成體干細胞用于小動物的軟骨組織的缺損修復，對于將其用于大型哺乳動物，目前還未獲成功。
因此，本領域迫切需要提供一種將自體成體干細胞作為種子細胞的軟骨移植物，并且是可用于大型哺乳動物的軟骨移植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種可用于大型哺乳動物的軟骨移植物。
本發(fā)明的另一個目的是提供所述軟骨移植物的制法和用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種軟骨移植物，它包括(a)藥學上可接受的生物可降解材料；(b)脂肪干細胞；并且具有與需修復的軟骨缺損部位相匹配的形狀。
在另一優(yōu)選例中，所述的軟骨移植物的形狀與大型哺乳動物軟骨組織缺損部位相匹配。
在另一優(yōu)選例中，所述的軟骨移植物的形狀與關節(jié)部位相匹配。
在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪干細胞為自體脂肪干細胞。
在另一優(yōu)選例中，脂肪干細胞的含量為1×107個細胞/ml移植物-1×109個細胞/ml移植物。
在另一優(yōu)選例中，還含有由脂肪干細胞誘導分化形成的軟骨樣細胞。
在另一優(yōu)選例中，由脂肪干細胞誘導分化形成的軟骨樣細胞的含量為1×107個細胞/ml移植物-9×108個細胞/ml移植物。
在另一優(yōu)選例中，所述的軟骨移植物中還含有轉(zhuǎn)移生長因子-β3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(BMP-4)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)、軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白(CDMP)、血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)-1和2、堿性脂肪干細胞生長因子(bFGF)、角質(zhì)細胞生長因子(KGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)和肝細胞生長因子(HGF)和表皮生長因子(EGF)中的一種或多種。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥學上可接受的生物可降解材料選自下組可降解性合成高分子材料、天然可降解材料、可注射性材料，及其混合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥學上可接受的生物可降解材料選自下組聚α-羥基酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚對二氧六環(huán)酮，及其混合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥學上可接受的生物可降解材料選自聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB，及其混合物。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種軟骨移植物的制備方法，它包括步驟(1)將脂肪干細胞接種于三維的藥學上可接受的生物可降解材料上，形成脂防干細胞-支架復合物，所述的復合物具有與需修復的軟骨缺損部位相匹配的形狀；(2)將脂肪干細胞-支架復合物在誘導液中培養(yǎng)2-4周，使得脂肪干細胞誘導分化形成軟骨樣細胞，從而形成含軟骨細胞的移植物。
在另一優(yōu)選例中，所述的誘導液含有轉(zhuǎn)移生長因子-β110±5ng/ml，胰島素樣生長因子100±50ng/ml，地塞米松40±20ng/ml。
在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中脂肪干細胞的接種密度為1×107個細胞/ml移植物-1×109個細胞/ml移植物。
在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中將脂肪干細胞誘導分化形成的軟骨樣細胞含量為1×107個細胞/ml移植物-9×108個細胞/ml移植物。
在另一優(yōu)選例中，步驟(2)的培養(yǎng)溫度為37±2℃。
在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪干細胞為自體脂肪干細胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪干細胞為原代-第十五代脂肪干細胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪干細胞為第二代脂肪干細胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥學上可接受的生物可降解材料選自下組可降解性合成高分子材料、天然可降解材料、可注射性材料，及其混合物。
在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中所述的藥學上可接受的生物可降解材料選自下組聚α-羥基酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚對二氧六環(huán)酮，及其混合物。更佳地，是聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB，及其混合物。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種上述的軟骨移植物的用途，所述的軟骨移植物可用于制備修復軟骨組織缺損的試劑盒或用于制備人工軟骨關節(jié)。
由此，本發(fā)明提供了一種將自體成體干細胞作為種子細胞的軟骨移植物，并且可用于大型哺乳動物的軟骨缺損修復。


圖1顯示了新生軟骨的大體觀察情況，其中A為實驗組，即術(shù)后3個月新生軟骨(ADSCs復合PLGA)的大體觀；B為實驗組，即術(shù)后3個月新生軟骨(ADSCs復合PLGA)的剖面觀；C為對照組，是單純的支架(PLGA)。
圖2顯示了新生軟骨的組織學、免疫組化及特殊染色檢測情況，其中，A為實驗組，即術(shù)后3個月新生軟骨(ADSCs復合PLGA)的HE染色；B為實驗組，即術(shù)后3個月新生軟骨(ADSCs復合PLGA)的II型膠原染色；C為實驗組，即術(shù)后3個月新生軟骨(ADSCs復合PLGA)的藏紅花染色。
圖3顯示了生物支架復合聚乳酸/聚羥基乙酸。
具體實施例方式
發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)將自體脂肪干細胞作為種子細胞接種于支架材料上，經(jīng)過特定的軟骨誘導液培養(yǎng)數(shù)周后，可構(gòu)建成用于修復大型哺乳動物的軟骨移植物。這樣，就可以使用來源豐富的脂肪干細胞作為種子細胞制備用于修復缺損的軟骨組織的軟骨移植物。
本文所用的術(shù)語“ADSCs(Adipose-derived stem cells，脂肪干細胞)”是指從脂肪組織中得到的具有增殖分化能力的干細胞。
本文所用術(shù)語“BMSCs(Bone Marrow Stem Cells，骨髓基質(zhì)干細胞)”是從骨髓中得到的具有增殖分化能力的干細胞。
本文所用術(shù)語“成軟骨誘導”是指體外培養(yǎng)的ADSCs在成軟骨誘導條件下，表達成軟骨細胞表型。
本發(fā)明所用術(shù)語“成軟骨細胞”和“軟骨細胞”可互換使用。
本發(fā)明所稱的軟骨移植物的形狀與需修復的軟骨缺損部位相匹配，是指移植物的形狀與需修復的軟骨缺損部位的形狀一致或基本一致，尤其是指移植物的形狀與需修復的哺乳動物軟骨缺損部位的形狀一致或基本一致，所述移植物的體積是哺乳動物軟骨體積的1-120％。
種子細胞可用于本發(fā)明軟骨移植物的種子細胞選自脂肪干細胞、軟骨細胞或骨髓基質(zhì)細胞，其中優(yōu)選脂肪干細胞。
本發(fā)明用于軟骨移植物的是脂肪干細胞，或脂肪干細胞與其他細胞(如軟骨細胞和/或骨髓基質(zhì)細胞等)的混合物。在脂肪干細胞與其他的混合物中，脂肪干細胞與軟骨細胞和/或骨髓基質(zhì)細胞的數(shù)量之比為100-10000∶1，較佳地為50-10000∶1，更佳地為10-10000∶1。
本發(fā)明的脂肪干細胞的來源沒有特別限制，可以是任何來源的脂肪干細胞，通常，本發(fā)明的脂肪干細胞是自體的(如真皮、皮下組織以及其他組織中的脂肪干細胞)、或同種異體的脂肪干細胞(如人胎兒來源的脂肪干細胞)。脂肪干細胞還可以是衍生自骨髓基質(zhì)干細胞、或其他干細胞的脂肪干細胞。優(yōu)選自體脂肪干細胞。
可用于本發(fā)明的脂肪干細胞可以來自任何脊椎動物，較佳地是哺乳動物。
盡管自體的脂肪干細胞是優(yōu)選的，但異體的脂肪干細胞的來源也可使用。
分離和獲得脂肪干細胞的方法是本領域中已知的。常用的分離方案包括(a)膠原酶消化、分離法。無菌條件下獲取脂肪組織，充分剪碎后移入離心管，加入等體積的0.075％的I型膠原酶消化，37℃、40min，加入含血清培養(yǎng)液終上消化，離心1390r/min，10min，棄去上清，用150目細胞濾器過濾，再離心1390r/min，5min，棄去上清，加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液混勻細胞，以5×104/cm2接種于100mm2培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。24小時后，可見梭型細胞貼壁，待細胞生長達培養(yǎng)皿底部近80％-90％融合時，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。
(b)組織塊培養(yǎng)法。在全麻無菌條件下取皮下脂肪組織或關節(jié)脂肪墊組織，切成1×1×1mm3大小組織塊，磷酸緩沖液(PBS，含青、鏈霉素各100U/ml)沖洗2遍。將組織塊在培養(yǎng)皿表面均勻擺置，將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中放置2-4小時，輕輕加入培養(yǎng)液，讓液體緩慢覆蓋組織小塊，等待細胞游出。
脂肪干細胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液是本領域中熟知的。一種優(yōu)選的方法是將脂肪干細胞在飽和濕度、5％CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限于)1)低糖DMEM培養(yǎng)基(購自Gibco公司)+10％胎牛血清；2)低糖DMEM培養(yǎng)基+20％小牛血清；3)低糖DMEM培養(yǎng)基+10-20％自體(異體)動物血清。此外，上述培養(yǎng)液中添加各種生長因子(例如促進脂肪干細胞生長的細胞因子等)、各種轉(zhuǎn)基因成分、各種細胞成分。
適用于本發(fā)明的脂肪干細胞應能在體內(nèi)或體外增殖。一種優(yōu)選的脂肪干細胞是體外培養(yǎng)的原代至第十五代細胞，且免疫組織化學染色證明I型膠原表達，原位雜交檢測證明I型膠原mRNA表達脂肪干細胞。
此外，本發(fā)明的軟骨移植物還可添加或含有一些其他細胞，如軟骨細胞、和/或骨髓基質(zhì)細胞。
分離和獲得軟骨細胞的方法是本領域中已知的。一種優(yōu)選的方法是在全麻無菌條件，手術(shù)顯微鏡下，解剖分離軟骨層組織，放入4℃的PBS中清洗。(1)將軟骨層組織剪成1mm3大小組織塊，置離心管中，加入0.2％II型膠原酶(體積/容積比為1∶5)，37℃恒溫振蕩器內(nèi)消化4h以上，直至軟骨組織塊基本消失、溶液變渾濁為止；或采用分階段消化法，即每消化1h就過濾，離心1次，將分離后的軟骨細胞立即放入培養(yǎng)液中保存起來，這樣反復進行，直至所有軟骨組織塊消化完全。然后收集細胞懸液，以1500r/min速度離心10min，棄去上清液；PBS反復沖洗3次，離心，棄去上清液；加入含10％FBS的F-12培養(yǎng)液10ml，軟骨細胞接種于培養(yǎng)皿后，放入5％CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)，隔日換液，開始原代細胞培養(yǎng)。
軟骨細胞的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液也是本領域中熟知的。一種優(yōu)選的方法是將軟骨細胞在飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限于)1)F12培養(yǎng)基+10％胎牛血清；2)F12培養(yǎng)基+20％小牛血清；3)F12培養(yǎng)基+10-20％自體(異體)動物血清。此外，上述培養(yǎng)液中添加各種生長因子(例如促進軟骨細胞生長的細胞因子等)、各種轉(zhuǎn)基因成分、各種細胞成分。所述的軟骨細胞也可以是脂肪干細胞誘導產(chǎn)生的。
可用于本發(fā)明的骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)的來源沒有特別限制，一種優(yōu)選的來源是來自自體的骨髓。分離獲得骨髓基質(zhì)干細胞的方法是本領域中已知的。一種優(yōu)選的方法是全麻下骨髓穿刺抽取自體骨髓，以密度梯度離心法分離出其中的有核細胞，加入適合的培養(yǎng)液(如含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，維生素C50ug/ml，青、鏈霉素各100U/ml，地塞米松5nM(Sigma)的DMEM(Gibco，GlandIsland，NY，USA)條件培養(yǎng)液)，制成細胞懸液，以約1×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，于37℃、5％CO2、100％飽和濕度的條件下培養(yǎng)。48小時后首次換液，加入條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)隔日換液。待細胞生長近融合后，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1×104/cm2的密度接種進行細胞傳代。
生物可降解材料可用于本發(fā)明的組織工程化軟骨的材料是醫(yī)學上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羥基酸(如聚乳酸PLA、聚羥基乙酸PGA、聚羥基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對二氧六環(huán)酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽、藻酸鈣凝膠等；各種脫細胞基質(zhì)；(c)上述材料的混合物或復合材料，尤其是高分子材料與天然材料的復合材料。
一種優(yōu)選的材料為聚乳酸PLA和聚羥基乙酸PLGA的復合材料(PLA/PGA，PLGA)。
組織工程化軟骨體外培養(yǎng)擴增的脂肪干細胞接種到生物相容性良好并可被機體吸收的可降解生物材料上形成種子細胞—生物材料復合物，將這一“種子細胞—生物材料”復合物植入到缺損部位，隨著生物材料的逐漸降解吸收，種子細胞繼續(xù)增殖并分泌基質(zhì)，最終替代生物材料而形成相應的軟骨組織。
本發(fā)明的組織工程化軟骨的制備方法簡便，將一定數(shù)量的種子細胞與藥學上可接受的生物可降解材料混合。
本發(fā)明的組織工程化軟骨移植物的形狀沒有特別限制。通常，移植物的形狀與哺乳動物軟骨缺損的形狀相同或基本相同。以類似于關節(jié)軟骨形狀的移植物為例，其體積為0.02-6cm3。
當本發(fā)明的生物可降解材料為可注射性材料時，以該液體材料調(diào)整軟骨細胞濃度；當本發(fā)明的生物可降解材料為固體性材料時，以培養(yǎng)液調(diào)整種子細胞懸液濃度，然后與可降解材料混合，混合時，培養(yǎng)液與可降解材料的比例沒有特別限制，但是以該材料能夠吸附的細胞懸液最大量為宜，接種密度是按ml細胞懸液。本發(fā)明組織工程化軟骨中的種子細胞濃度通常約為1×107至5×109/ml或更高，較佳地為1×107至1×108/ml，更佳地為1×107至1×108/ml。
本發(fā)明的組織工程化軟骨的制備方法簡便，將一定數(shù)量的種子細胞與藥學上可接受的生物可降解材料混合即可。一種優(yōu)選的方法是將脂肪干細胞接種于藥學上可接受的生物可降解材料上，37℃培養(yǎng)4h后加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，共同培養(yǎng)3天；第四天更換成軟骨誘導液，體外培養(yǎng)2周-4周。
軟骨的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)液是本領域中熟知的。合適的培養(yǎng)液包括(但并不限于)轉(zhuǎn)移生長因子-β110±5ng/ml，胰島素樣生長因子100±50ng/ml，地塞米松40±20ng/ml。
此外，在本發(fā)明的組織工程化軟骨移植物中，還可添加或復合其他各種細胞、生長因子、各種轉(zhuǎn)基因成分，從而促進脂肪干細胞分化為軟骨細胞，以及保持軟骨細胞的表型和/或促進軟骨細胞生長。代表性的物質(zhì)包括(但并不限于)轉(zhuǎn)移生長因子-β3、BMP-2、BMP-4、BMP-7、CDMP、血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)-1和2、堿性脂肪干細胞生長因子(bFGF)、角質(zhì)細胞生長因子(KGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)和肝細胞生長因子(HGF)和表皮生長因子(EGF)。
用本發(fā)明方法形成的組織工程化軟骨，分為兩類，一類是軟骨細胞與可注射性生物材料構(gòu)成的復合物，該復合物可直接注射到皮下、軟骨缺損處等體內(nèi)各部位。另一類是軟骨細胞與非可注射性復合物，該復合物可直接植入體內(nèi)皮下、軟骨缺損處等體內(nèi)各部位。
用途本發(fā)明提供的軟骨移植物，可用于制備修復軟骨組織的缺損的試劑盒。試劑盒包括(但不限于)脂肪干細胞，藥學上接受的生物可降解材料，軟骨誘導液，說明書等。所述的誘導液含有(但并不限于)轉(zhuǎn)移生長因子-β110±5ng/ml，胰島素樣生長因子100±50ng/ml，地塞米松40±20ng/ml。
本發(fā)明提供的軟骨移植物，還可用于制備人工軟骨關節(jié)。可以使用本領域熟知的方法將人工軟骨關節(jié)植入體內(nèi)。一種優(yōu)選的方法是使用關節(jié)鏡。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1、利用來源充足的脂肪干細胞作為種子細胞；2、首次制備了可用于大型哺乳動物的軟骨移植物。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計。
實施例1脂肪干細胞的分離培養(yǎng)無菌條件下獲取豬頸背部脂肪組織，充分剪碎后移入離心管，加入等體積的0.075％的I型膠原酶消化，37℃、40min，加入含血清培養(yǎng)液終止消化，離心1390r/min，10min，棄去上清，用150目細胞濾器過濾，再離心1390r/min，5min，棄去上清，加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液混勻細胞，以5×104/cm2接種于100mm2培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。24小時后，可見梭型細胞貼壁，待細胞生長達培養(yǎng)皿底部近80％-90％融合時，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，收集第二代細胞用于接種材料。
實施例2生物支架復合聚乳酸/聚羥基乙酸(polylacticacid/polyglicolicacid，PLA/PGA，PLGA)的制備方法取無紡PGA纖維約40mg均勻地嵌入預制的圓柱狀(直徑9mm，高5mm)硅膠模具內(nèi)，加入1％的PLA二氯乙烷溶液約0.3ml，待其自然干燥后取出真空保存?zhèn)溆谩Ｒ妶D3。
實施例3脂肪干細胞-PLGA復合物制備收集第二代脂肪干細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為50×106/ml，接種于圓柱形PLGA(直徑9mm，高5mm)上，37℃培養(yǎng)4h后加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，共同培養(yǎng)3天；第四天更換成軟骨誘導液，體外培養(yǎng)2周。
軟骨誘導液的組成高糖DMEM培養(yǎng)基，L-谷氨酰胺0.3g/L、抗壞血酸0.05g/L、碳酸氫鈉3.7g/L、青霉素10萬單位/L、硫酸鏈霉素0.1g/L加入1％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)為基礎培養(yǎng)液。另加TGF-β110ng/ml，IGF-1 100ng/ml，地塞米松(Dexamethasone)40ng/ml制備條件培養(yǎng)液。
實施例4軟骨移植物回植實驗豬麻醉前禁食12小時，禁水4小時。氯胺酮10mg/kg肌注，進行誘導麻醉，速眠新0.1ml/kg肌注麻醉，整個過程中動物保持側(cè)臥位。常規(guī)消毒鋪巾，膝關節(jié)側(cè)面縱向切口，制造人工的髕骨脫位，暴露膝關節(jié)面，使用8mm直徑角膜環(huán)鉆制造一個8mm的圓柱形全層軟骨缺損，徹底止血。一側(cè)植入實施例3制備的自體脂肪干細胞-PLGA材料復合物為實驗組，另一側(cè)植入單純PLGA材料為對照組。
結(jié)果術(shù)后新生軟骨評價術(shù)后3個月取材，觀察膝關節(jié)愈合情況。實驗組標本中部及邊緣分別取材，脫鈣后石蠟包埋，組織學切片行HE染色、免疫組織化學染色、特殊染色觀察。
1.大體觀察見圖1。
結(jié)果表明實驗組，術(shù)后3個月時有明顯的新生軟骨組織形成，色澤與周圍軟骨組織相近，質(zhì)實、表面光滑程度欠佳、有一定的彈性，缺損區(qū)基本被修復。新生軟骨區(qū)軟骨厚度略大于周圍關節(jié)軟骨厚度，新生組織深層大部分已骨化，與周圍松質(zhì)骨間界限無法區(qū)分。
對照組未被修復，而且，缺損出現(xiàn)擴大現(xiàn)象。
2.組織學檢測見圖2。
結(jié)果表明HE染色顯示在3個月時修復組織與正常軟骨組織形態(tài)相近，有成熟的軟骨陷窩形成，但細胞密度較正常軟骨組織高，核大位于陷窩中央。正常組織與新生組織交界處連接良好，但組織學上極易區(qū)分。圖2A。
實驗組術(shù)后3個月，II型膠原免疫組化染色顯示修復區(qū)細胞外基質(zhì)有II型膠原表達，但染色比正常軟骨組織稍淡，圖2B。
實驗組術(shù)后3個月，藏紅花染色顯示修復區(qū)軟骨組織有集合蛋白聚糖的表達，同樣，部分區(qū)域染色稍淡。圖2C。
討論關節(jié)軟骨缺損的修復目前有軟骨下骨鉆孔術(shù)、自體軟骨移植、骨軟骨膜移植等，但是，這些方法都因各自的缺點而未能廣泛使用。
聚羥基乙酸(Polyglycolic acid，PGA)是一種人工合成的高分子材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，可以被制作成優(yōu)良的三維細胞支架。本發(fā)明人先后成功的應用軟骨細胞、骨髓基質(zhì)干細胞復合PLGA材料形成細胞材料復合物，成功地修復了豬關節(jié)軟骨缺損。這表明了PLGA作為軟骨缺損修復的支架材料是可行的，但并沒有成功轉(zhuǎn)化的實例。
本發(fā)明應用自體脂肪干細胞復合PLGA材料修復豬關節(jié)軟骨缺損。組織學、免疫組織化學及特殊染色均表明了自體脂肪干細胞修復了豬關節(jié)軟骨的缺損，而對照組則未被修復，缺損還出現(xiàn)進一步擴大的現(xiàn)象。本發(fā)明顯示，自體脂肪干細胞在關節(jié)軟骨缺損的修復中發(fā)揮作用。術(shù)后3個月組織學上未發(fā)現(xiàn)材料殘留，表明材料的降解速度與組織形成相匹配，是組織工程軟骨構(gòu)建的良好材料。
當然，可以理解的是上述內(nèi)容僅是舉例說明本發(fā)明的應用原則。本領域的普通技術(shù)人員可做出很多改變和修飾，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍，后面的權(quán)利要求即包括了這些改變和修飾。因此，盡管本發(fā)明參照本發(fā)明之優(yōu)選實施例方案進行描述，但本領域的普通技術(shù)人員可以顯而易見地做出很多改變，包括但不限于面積大小、材料、形狀、操作方法、使用等，但都不偏離本發(fā)明的原則和范圍。
權(quán)利要求
1.一種軟骨移植物，其特征在于，它包括(a)藥學上可接受的生物可降解材料；(b)脂肪干細胞；并且具有與需修復的軟骨缺損部位相匹配的形狀。
2.如權(quán)利要求1所述的軟骨移植物，其特征在于，所述的脂肪干細胞為自體脂肪干細胞。
3.如權(quán)利要求1所述的軟骨移植物，其特征在于，脂肪干細胞的含量為1×107個細胞/ml移植物-1×109個細胞/ml移植物。
4.如權(quán)利要求1所述的軟骨移植物，其特征在于，還含有由脂肪干細胞誘導分化形成的軟骨樣細胞。
5.如權(quán)利要求1所述的軟骨移植物，其特征在于，所述的藥學上可接受的生物可降解材料選自下組可降解性合成高分子材料、天然可降解材料、可注射性材料，及其混合物。
6.一種軟骨移植物的制備方法，其特征在于，它包括步驟(1)將脂肪干細胞接種于三維的藥學上可接受的生物可降解材料上，形成脂肪干細胞-支架復合物，所述的復合物具有與需修復的軟骨缺損部位相匹配的形狀；(2)將脂肪干細胞-支架復合物在誘導液中培養(yǎng)2-4周，使得脂肪干細胞誘導分化形成軟骨樣細胞，從而形成含軟骨細胞的移植物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的誘導液含有轉(zhuǎn)移生長因子-β110±5ng/ml，胰島素樣生長因子100±50ng/ml，地塞米松40±20ng/ml。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)中脂肪干細胞的接種密度為1×107個細胞/ml移植物-1×109個細胞/ml移植物。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的脂肪干細胞為自體脂肪干細胞。
10.一種如權(quán)利要求1所述的軟骨移植物的用途，其特征在于，所述的軟骨移植物可用于制備修復軟骨組織缺損的試劑盒或用于制備人工軟骨關節(jié)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種軟骨移植物，所述的移植物包括(a)藥學上可接受的生物可降解材料；(b)脂肪干細胞；并且具有與需修復的軟骨缺損部位相匹配的形狀。本發(fā)明的自體脂肪干細胞構(gòu)建的組織工程化軟骨可有效地治療軟骨病損。本發(fā)明還提供了該組織工程化軟骨的制備方法和用途。
文檔編號A61L27/50GK101077426SQ20061002686
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月25日
發(fā)明者崔磊, 曹誼林, 尹爍 申請人:上海國睿生命科技有限公司