專利名稱：含自體表皮細(xì)胞和異體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)創(chuàng)面修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種用于深度皮膚缺損創(chuàng)面修復(fù)的含自體表皮細(xì)胞和異體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮。
背景技術(shù)：
為解決大面積深度燒傷患者皮源短缺的問(wèn)題，體外構(gòu)建含表皮細(xì)胞的復(fù)合皮用于移植已成為創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。目前常規(guī)的制備復(fù)合皮的方法是患者第一次手術(shù)時(shí)，取小塊皮膚標(biāo)本(2cm2～4cm2)，分離自體表皮細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增，然后接種于真皮替代物(如脫細(xì)胞真皮、海綿狀膠原膜等)表面，繼續(xù)培養(yǎng)，形成含單層或復(fù)層表皮細(xì)胞的復(fù)合皮，將復(fù)合皮移植于經(jīng)手術(shù)處理的深度燒傷創(chuàng)面，即可形成新的皮膚組織，從而修復(fù)創(chuàng)面。但用這種方法構(gòu)建復(fù)合皮，自體表皮細(xì)胞要達(dá)到一定的擴(kuò)增倍數(shù)，才能有效地用于臨床，因此常需體外培養(yǎng)3～4周甚至更長(zhǎng)時(shí)間，不能及時(shí)應(yīng)用于臨床，尤其是對(duì)于創(chuàng)面大皮源極度缺乏的患者，不僅獲取充足的自體表皮細(xì)胞受到限制，而且漫長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)周期嚴(yán)重限制了復(fù)合皮的臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種除了含自體表皮細(xì)胞外還含有異體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮，以節(jié)省自體皮源，并縮短細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間，盡早將復(fù)合皮應(yīng)用于患者，有利于創(chuàng)面愈合。
本發(fā)明對(duì)目前臨床上所用的僅含自體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮進(jìn)行了改進(jìn)，即將自體表皮細(xì)胞和異體表皮細(xì)胞混合后再接種在真皮替代物表面構(gòu)建復(fù)合皮。異體表皮細(xì)胞可采用常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)、擴(kuò)增并凍存于液氮中備用。構(gòu)建復(fù)合皮時(shí)，可臨時(shí)解凍、復(fù)蘇適量異體表皮細(xì)胞，與獲取的自體表皮細(xì)胞混合后接種于臨床上常用的真皮替代物(如脫細(xì)胞真皮、海綿狀膠原膜等)表面，接種的細(xì)胞密度為2.5-5×105個(gè)/cm2，按常規(guī)在細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1-2周，細(xì)胞培養(yǎng)液可選自DMEM、或SFM等表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，即可形成含單層或復(fù)層表皮細(xì)胞膜片的復(fù)合皮。使用時(shí)，將該復(fù)合皮按常規(guī)植入經(jīng)手術(shù)處理好的深度燒傷或慢性皮膚潰瘍等創(chuàng)面。由于移植后的復(fù)合皮中的異體表皮細(xì)胞會(huì)逐漸被機(jī)體排斥并被周邊的自體表皮細(xì)胞爬行替代，因此本復(fù)合皮既使裸露創(chuàng)面得以早日覆蓋治療，又可避免因?qū)氘愺w表皮細(xì)胞而可能引起的潛在危害。
本發(fā)明復(fù)合皮與目前臨床上常用的含單純自體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮比較，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的復(fù)合皮含有異體表皮細(xì)胞，異體表皮細(xì)胞可預(yù)先培養(yǎng)、凍存，需要時(shí)可隨時(shí)解凍、復(fù)蘇與自體表皮細(xì)胞混合培養(yǎng)構(gòu)建復(fù)合皮，這樣可明顯縮短表皮細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間，不僅節(jié)省了自體表皮量，而且可及時(shí)應(yīng)用于臨床。比如將自體表皮細(xì)胞與異體表皮細(xì)胞按1∶1比例混合，與單純的自體表皮細(xì)胞培養(yǎng)移植相比，可節(jié)省50％的自體表皮量，減少50％的培養(yǎng)時(shí)間。若按1∶4比例混合，則可節(jié)省80％的自體表皮量，減少約五分之四的體外培養(yǎng)時(shí)間，對(duì)于皮源極度缺乏的大面積燒傷患者的救治具有重要意義。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明復(fù)合皮的構(gòu)建方法為1.異體表皮細(xì)胞培養(yǎng)取正常人廢棄皮膚組織如包皮，采用常規(guī)的表皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，分離表皮層，制備成單個(gè)表皮細(xì)胞懸液，按2.5-5×105個(gè)/cm2細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中以完全型DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)表皮細(xì)胞達(dá)70％～80％融合時(shí)進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。當(dāng)異體表皮細(xì)胞達(dá)一定數(shù)量時(shí)，凍存于液氮中備用。
2.自體表皮細(xì)胞培養(yǎng)切取患者小塊皮膚標(biāo)本如2cm2～4cm2，采用常規(guī)的表皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，分離表皮層，制備單個(gè)表皮細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、擴(kuò)增(具體同異體表皮細(xì)胞培養(yǎng))，當(dāng)自體表皮細(xì)胞能滿足應(yīng)用需要的數(shù)量時(shí)，置于培養(yǎng)液中待用。
3.構(gòu)建復(fù)合皮解凍、復(fù)蘇適量的異體表皮細(xì)胞，以適當(dāng)比例與自體表皮細(xì)胞混合后按常規(guī)接種于臨床上常用的真皮替代物(如脫細(xì)胞真皮、海綿狀膠原膜等)表面，加入完全型DMEM培養(yǎng)液經(jīng)體外培養(yǎng)1-2周，每2～3天換液一次，形成含單層或復(fù)層表皮細(xì)胞膜片的復(fù)合皮。
本發(fā)明含自體表皮細(xì)胞和異體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮，主要用途有兩種。第一種，作為永久性皮膚替代物用于大面積深度燒傷、增生性疤痕、慢性深度皮膚潰瘍等皮膚缺損創(chuàng)面的修復(fù)。經(jīng)大量動(dòng)物(裸鼠)實(shí)驗(yàn)表明，將自體表皮細(xì)胞與異體表皮細(xì)胞按1∶1、1∶3、1∶5比例混合，接種于脫細(xì)胞真皮替代物表面培養(yǎng)后形成復(fù)合皮，然后以真皮替代物一面朝下，植入全層皮膚缺損創(chuàng)面，完全存活率達(dá)65％。復(fù)合皮移植后，異體表皮細(xì)胞隨移植時(shí)間延長(zhǎng)逐漸被排斥，被自體表皮細(xì)胞爬行替代，創(chuàng)面無(wú)明顯裸露。新生皮膚可見(jiàn)基底層、基底上層和角化層，表皮與真皮連接結(jié)構(gòu)正常，真皮中膠原纖維排列規(guī)則有序。第二種用途，作為暫時(shí)性覆蓋物用于促進(jìn)供皮區(qū)、淺度燒傷創(chuàng)面的修復(fù)。將含自體表皮細(xì)胞和異體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮以細(xì)胞面朝下，貼于創(chuàng)面，可充當(dāng)暫時(shí)性覆蓋物，表皮細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間接觸、釋放多種細(xì)胞因子促進(jìn)殘存上皮再生，加速供皮區(qū)、淺度燒傷創(chuàng)面或慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面的愈合。
實(shí)施例1制備異體表皮細(xì)胞取正常人廢棄皮膚組織4cm2一塊，采用常規(guī)的表皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，分離表皮層，制備成單個(gè)表皮細(xì)胞懸液，按5×105個(gè)/cm2細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中以完全型DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1周，表皮細(xì)胞達(dá)70％～80％融合，進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。當(dāng)異體表皮細(xì)胞達(dá)1×108個(gè)/ml時(shí)，分裝后凍存于液氮中備用。
實(shí)施例2制備復(fù)合皮(1)自體表皮細(xì)胞培養(yǎng)切取患者小塊皮膚標(biāo)本2cm2，采用常規(guī)的表皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，分離表皮層，制備單個(gè)表皮細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、擴(kuò)增(具體同異體表皮細(xì)胞培養(yǎng))，自體表皮細(xì)胞達(dá)1×108個(gè)/ml時(shí)，置于培養(yǎng)液中備用。
(2)制備復(fù)合皮將凍存的異體表皮細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，與自體表皮細(xì)胞以1∶1比例混合，按常規(guī)接種于脫細(xì)胞真皮支架表面，細(xì)胞密度為5×105個(gè)/cm2，在完全型DMEM培養(yǎng)液中37℃下培養(yǎng)1周，每2天換液1次，即形成復(fù)合皮。
實(shí)施例3制備復(fù)合皮時(shí)，異體表皮細(xì)胞和自體表皮細(xì)胞的比例為1∶5，按4×105個(gè)/cm2細(xì)胞密度接種于脫細(xì)胞真皮支架表面，培養(yǎng)液為DMEM，其余條件同實(shí)施例2，培養(yǎng)10天即形成復(fù)合皮。
實(shí)施例4制備復(fù)合皮時(shí)，異體表皮細(xì)胞和自體表皮細(xì)胞的比例為1∶1，按5×105個(gè)/cm2細(xì)胞密度接種于海綿狀膠原膜表面，其余同實(shí)施例2，培養(yǎng)1周即形成復(fù)合皮。
實(shí)施例5制備復(fù)合皮時(shí)，異體表皮細(xì)胞和自體表皮細(xì)胞的比例為1∶3，按2.5×105個(gè)/cm2細(xì)胞密度接種于海綿狀膠原膜表面，其余同實(shí)施例2，培養(yǎng)2周即形成復(fù)合皮。
權(quán)利要求
1.一種含自體表皮細(xì)胞和異體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮，由真皮替代物和覆蓋于其表面的單層或復(fù)層表皮細(xì)胞膜片組成，其特征在于表皮細(xì)胞膜片中含自體表皮細(xì)胞和異體表皮細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1所述復(fù)合皮的制備方法，其特征在于將制備的自體表皮細(xì)胞和異體表皮細(xì)胞混合后接種于臨床上常用的真皮替代物表面，接種的細(xì)胞密度為2.5×105～5×105個(gè)/cm2，按常規(guī)在細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1～2周，即成復(fù)合皮。
3.按權(quán)利要求2所述的復(fù)合皮制備方法，其特征在于自體表皮細(xì)胞與異體表皮細(xì)胞的混合比例為1∶1～1∶5。
4.按權(quán)利要求2或3所述的復(fù)合皮制備方法，其特征在于所說(shuō)的真皮替代物為脫細(xì)胞真皮替代物或海綿狀膠原膜。
5.按權(quán)利要求2或3所述的復(fù)合皮制備方法，其特征在于所說(shuō)的細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液。
6.按權(quán)利要求4所述的復(fù)合皮制備方法，其特征在于所說(shuō)的細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)創(chuàng)面修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于深度創(chuàng)面修復(fù)的含自體表皮細(xì)胞和異體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮。按常規(guī)采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將自體表皮細(xì)胞和異體表皮細(xì)胞混合，然后接種于真皮替代物表面，經(jīng)體外培養(yǎng)后形成含單層或復(fù)層表皮細(xì)胞膜片的復(fù)合皮?？勺鳛橛谰眯云つw替代物用于大面積深度燒傷、慢性深度皮膚潰瘍等創(chuàng)面的修復(fù)，也可作為暫時(shí)性覆蓋物用于促進(jìn)供皮區(qū)、淺度燒傷創(chuàng)面的修復(fù)。由于異體表皮細(xì)胞可事先培養(yǎng)、凍存，需要時(shí)可以應(yīng)急隨時(shí)解凍復(fù)蘇，且移植后可被自體表皮細(xì)胞逐漸替代，因此本發(fā)明復(fù)合皮與目前常用的不含異體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮相比，既節(jié)省了自體表皮量，又縮短了表皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)時(shí)間，有利于根據(jù)患者全身情況及創(chuàng)面局部情況及時(shí)應(yīng)用于臨床。
文檔編號(hào)A61L27/38GK1850303SQ20061002704
公開(kāi)日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月30日
發(fā)明者夏照帆, 肖仕初, 田建廣, 王光毅, 王廣慶, 朱世輝 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)