專利名稱：一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物藥及其制備方法和應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
“中藥鑒定學(xué)”所述的藤梨根是獼猴桃《中華獼猴桃Actinidia chinensisPlanch.》或獼猴梨《軟棗獼猴桃Actinidia arguta(Sieb.et Zucc)Planch.》的根，藤梨根和獼猴桃或獼猴梨均作藥用，中醫(yī)具有解毒活血、清熱利濕之功效，臨床上常用于抗腫瘤。陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)(VOL28.NO3 2005.5)，衛(wèi)培峰等人的“藤梨根提取物誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究”的報(bào)道采用軟棗獼猴桃的乙醇提取物對(duì)胃癌細(xì)胞有明顯的殺傷作用。陜西中醫(yī)(2005年第26卷第8期)“藤梨根對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠胃癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究”采用軟棗獼猴桃的乙醇提取物，對(duì)大鼠胃癌有顯著的抑制，并有抗胃癌轉(zhuǎn)移的作用。湖南醫(yī)藥(1985年第二卷第5期)，闞克清等“藤梨根抗腫瘤作用及其對(duì)免疫功能的影響”，采用軟棗獼猴桃根的水提液具有抗小鼠U14實(shí)體瘤的作用，并增強(qiáng)細(xì)胞免疫和抑制體液免疫的作用。河北中醫(yī)雜志(2004年4月第26卷第4期)，李昊等人“藤梨根對(duì)胃癌細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究”報(bào)道，采用市售的藤梨根，水提液，乙酸乙酯萃取的水溶液；1.3mg/ml的濃度，24小時(shí)時(shí)，抑制胃癌細(xì)胞達(dá)87.61％。但未對(duì)其抗腫瘤有效部位和成分分離方法作進(jìn)一步的研究。
在CN200410022919、CN02114318、CN03156252、CN02129513、CN01128730、CN1478495A、CN1093594A等中國(guó)專利中都涉及了制備具有抗癌作用的復(fù)方中成藥中使用了藤梨根或獼猴桃根，這些專利大多涉及復(fù)方中成藥的配方組成、制備和應(yīng)用，而不是強(qiáng)調(diào)單方藤梨根提取有效部位和成分分離的新藥制備。
申請(qǐng)?zhí)?005100326666涉及治療或預(yù)防大腸癌、胃癌等含藤梨根及虎杖根、水楊梅根的復(fù)方制劑及制備方法和應(yīng)用，制備片劑、膠囊劑、滴丸劑、及凍干粉針等制劑。但該專利未使用聚酰胺精致，對(duì)大孔樹(shù)脂沒(méi)有定量，藤梨根有效部位沒(méi)有定性檢查確定；缺乏分散片劑、軟膠囊、顆粒劑、脂質(zhì)體等劑型。
申請(qǐng)?zhí)?005100326685公開(kāi)了藤梨根抗腫瘤提取物及其制備方法和用途，該藤梨根抗腫瘤提取物可通過(guò)水或有機(jī)溶劑在70∽100℃溫度下浸提、然后減壓濃縮、調(diào)酸、乙酸乙酯萃取、聚酰胺層析、溶劑洗脫、濃縮干燥制得。但上述專利中未使用大孔樹(shù)脂分離，而用乙酸乙酯萃取，此方法在大工業(yè)生產(chǎn)時(shí)帶來(lái)設(shè)備、勞防、環(huán)保等問(wèn)題，此方法未解決提取物制備新藥的制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷和不足，提供一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)獼猴桃素是一種復(fù)合蒽醌苷類等的總有效部位，用75％乙醇溶解，使成為1-10mg/ml醇液，點(diǎn)樣在高效硅膠G簿層層析板上(110℃活化1小時(shí))，配置氯仿∶甲醇∶水∶甲酸＝3∶2∶0.2∶0.04比例作展開(kāi)劑，展開(kāi)展距17cm，取出晾干，熒光下或硫酸香蘭素液噴霧顯色。具有0.00到0.100、0.167到0.300、0.400到0.533、0.700到0.833或0.900到0.967范圍內(nèi)的Rf值的斑點(diǎn)(

圖1)，與甲醇負(fù)離子掃描顯示獼猴桃素的特征離子峰譜為245、289、357、577、865amu(圖2)。
獼猴桃素制備方法和應(yīng)用包括下述步驟1)藤梨根用水煎，煎液取上清液濃縮，加入殼聚糖澄清后過(guò)濾，得清膏液；2)清膏液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂層析，用水洗脫至無(wú)色，再用有機(jī)溶劑層析，流份收集濃縮，得濃縮液；3)將濃縮液用聚酰胺吸附，用水洗脫至無(wú)色，再用有機(jī)溶劑洗脫，洗脫液濃縮，干燥，得獼猴桃素。
4)將獼猴桃素添加適當(dāng)輔料和添加劑后，制成薄膜包衣片、硬膠囊劑、合劑、軟膠囊劑、顆粒劑、注射劑、脂質(zhì)體等藥劑。
步驟1)中的水為去離子水或蒸餾水，加水為藥材重量的6-12倍量，煎煮1-3次，每次1-3小時(shí)；濃縮至藥材量的1∶1或相對(duì)密度1.06-1.10；所用殼聚糖是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，用量為藥材的0.05-5％；過(guò)濾用濾布、濾紙、濾膜。
步驟2)中的大孔吸附樹(shù)脂為D型或HPD型系列；粒度20-60目或0.3mm-1.2mm；孔徑50-300；用量為藥材量的0.5-2倍；流速0.5-10ml/g/分鐘；洗脫水是去離子水或蒸餾水，層析采用有機(jī)溶劑15％-30％乙醇、丙酮或50-85％乙醇、丙酮；收集50-85％乙醇或丙酮的洗脫液，濃縮至相對(duì)密度為1.100-1.350。
步驟3)中吸附的聚酰胺用量為濃縮液的0.5-50倍；粒度100-120目；洗脫用有機(jī)溶劑為50-85％的乙醇或丙酮，優(yōu)選50-75％；濃縮液相對(duì)密度為1.15-1.35；干燥可用真空烘干，真空度-0.06-0.1Mpa，溫度≤80℃；或離心噴霧干燥，離心度α＝20000-50000；進(jìn)風(fēng)溫度120-220℃，藥液流速10-200ml/分；或真空冷凍干燥，真空度-0.06-0.1Mpa，溫度-40℃-25℃，時(shí)間5-30小時(shí)。
步驟3)和步驟4)中的獼猴桃素添加的輔料和添加劑包括纖維素類、硬脂酸脂類、苯甲酸鈉、蔗糖、淀粉、糊精、環(huán)糊精、乳糖、歐巴代薄膜包衣預(yù)制粉、甘乳醇、甘油、亞硫酸氫鈉、PVP、PEG200-5000、二棕櫚酰磷脂酰堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、膽固醇，卵磷脂。制成薄膜包衣片、硬膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、注射劑、脂質(zhì)體等藥劑。
薄膜包衣片獼猴桃素30-80％糊精1-20％乳糖1-20％歐巴代薄膜包衣預(yù)制粉0.5-5％PVP乙醇液 0.5-40％硬膠囊劑獼猴桃素30-90％糊精1-20％乳糖1-20％PVP乙醇液 0.5-40％顆粒劑獼猴桃素30-90％糊精1-20％乳糖1-20％PVP乙醇液 0.5-40％合劑獼猴桃素30-90％蔗糖1-20％PEG400 1-10％防腐劑 0.5-1軟膠囊獼猴桃素30-90％PEG4000 1-20％乳糖1-20％明膠1-20％甘油1-5％注射劑獼猴桃素1-30％亞硫酸氫鈉 0.1-2％丙二醇 0.1-10％注射用水65-98％脂質(zhì)體
獼猴桃素1-30％PEG200-5000 1-20％二棕櫚酰磷脂酰堿1-30％膽固醇 1-5％注射用水0-96％本發(fā)明的獼猴桃素，采用質(zhì)譜分析，確定了離子特征圖譜，為進(jìn)一步分離純化提供了明確的目標(biāo)。獼猴桃素可以用于防治食道癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌、肝癌等消化道腫瘤。
本發(fā)明提供了從藤梨根提取獼猴桃素的方法，用去離子水或蒸餾水使用本煎煮方法，雜質(zhì)少，有效成分轉(zhuǎn)移率高；殼聚糖澄清藥液簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效，有效成分損失少；而且殼聚糖無(wú)毒無(wú)害，對(duì)提取物不會(huì)引起任何不良副反應(yīng)；最大的優(yōu)點(diǎn)在處理藥液時(shí)能吸附除去重金屬等有害雜質(zhì)。
因?yàn)榇罂孜綐?shù)脂分離效果好，成本低，易生產(chǎn)，本發(fā)明制備獼猴桃素的方法中主要根據(jù)D、DA系列、HPD系列樹(shù)脂吸附量的計(jì)算，確定大孔吸附樹(shù)脂用量為藥材量的0.5-2倍的最佳用量，充分確保吸附有效成分，減少樹(shù)脂的浪費(fèi)；聚酰胺精制方法是將市售的聚酰胺碾磨成100-120目的細(xì)顆粒，更合理地使用聚酰胺用量，提高原料獼猴桃素的純度，使生產(chǎn)操作簡(jiǎn)便，工藝穩(wěn)定。
說(shuō)明書附1獼猴桃素獼猴桃素薄層層析2、圖3、圖4、圖5獼猴桃素質(zhì)譜分析圖譜。
具體實(shí)施方法本發(fā)明的具體制備方法，由下例實(shí)施實(shí)例舉例說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍，不局限于此。
實(shí)施例1取藤梨根100kg，加1200L去離子水，浸泡30分鐘，加熱煮沸，保持沸騰3小時(shí)，濾取藥液；第二次煎煮加1000L去離子水，煎煮2小時(shí)；第三次煎煮加800L去離子水，煎煮1小時(shí)；合并三次煎液，靜置過(guò)夜，濾取上清夜，真空濃縮至相對(duì)密度1.08，；澄清劑殼聚糖200g(用1％醋酸溶液20L溶解)，加入水提濃縮液中，攪拌靜置12小時(shí)，濾取上清夜，通過(guò)D101-I型大孔吸附樹(shù)脂200kg的柱子，流速1L/分鐘，用去離子水洗脫至無(wú)色，再用15％乙醇200L洗脫，及用75％乙醇500L洗脫，收取75％乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.25(70℃)，拌入25kg聚酰胺，裝入聚酰胺柱，用水及15％乙醇洗脫后，用75％乙醇50L洗脫，收集75％的洗脫液，回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度1.35，在真空度-0.06--0.1Mpa，溫度60℃下真空烘干，粉碎，得到3.1kg的獼猴桃素。
實(shí)施例2取藤梨根100kg，加1000L去離子水，浸泡45分鐘，加熱煮沸，保持沸騰3小時(shí)，濾取藥液；第二次煎煮加800L去離子水，煎煮2小時(shí)；第三次煎煮加800L去離子水，煎煮1小時(shí)；合并三次煎液，靜置過(guò)夜，濾取上清夜，真空濃縮至相對(duì)密度1.06，；澄清劑殼聚糖500g(用1％醋酸溶液50L溶解)，加入水提濃縮液中，攪拌靜置12小時(shí)，濾取上清夜，通過(guò)HPD300-型大孔吸附樹(shù)脂200kg的柱子，流速1.2L/分鐘，用去離子水洗脫至無(wú)色，再用15％丙酮200L洗脫，及用75％丙酮500L洗脫，收取75％丙酮洗脫液，回收丙酮，濃縮至相對(duì)密度1.30(70℃)，拌入30kg聚酰胺，裝入聚酰胺柱，用水及15％丙酮洗脫后，用75％丙酮50L洗脫，收集75％的洗脫液，回收丙酮，濃縮至相對(duì)密度1.15，離心噴霧干燥，離心度α＝20000-50000；進(jìn)風(fēng)溫度120-220℃，藥液流速10-200ml/分；得到2.8kg的獼猴桃素。
實(shí)施例3取藤梨根100kg，加1000L去離子水，浸泡45分鐘，加熱煮沸，保持沸騰3小時(shí)，濾取藥液；第二次煎煮加800L去離子水，煎煮2小時(shí)；第三次煎煮加800L去離子水，煎煮1小時(shí)；合并三次煎液，靜置過(guò)夜，濾取上清夜，真空濃縮至相對(duì)密度1.06，；澄清劑殼聚糖750g(用1％醋酸溶液75L溶解)，加入水提濃縮液中，攪拌靜置24小時(shí)，濾取上清夜，通過(guò)DA201-型大孔吸附樹(shù)脂200kg的柱子，流速1.0L/分鐘，用去離子水洗脫至無(wú)色，再用15％丙酮200L洗脫，及用75％丙酮500L洗脫，收取75％丙酮洗脫液，回收丙酮，濃縮至相對(duì)密度1.30(70℃)，拌入25kg聚酰胺，裝入聚酰胺柱，用水及15％丙酮洗脫后，用75％丙酮50L洗脫，收集75％的洗脫液，回收丙酮，濃縮至相對(duì)密度1.15，真空冷凍干燥，真空度-0.1Mpa，溫度-40℃升至25℃，時(shí)間25小時(shí)。得到3.8kg的獼猴桃素。
實(shí)施例4獼猴桃素，用70％乙醇溶解，使成為1-10mg/ml醇液，點(diǎn)樣在高效硅膠G簿層層析板上(110℃活化1小時(shí))，配置氯仿∶甲醇∶水∶甲酸＝3∶2∶0.2∶0.04比例作展開(kāi)劑，展開(kāi)展距17cm，取出晾干，熒光下或硫酸香蘭素液噴霧顯色。具有0.00到0.100、0.167到0.300、0.400到0.533、0.700到0.833或0.900到0.967范圍內(nèi)的Rf值的斑點(diǎn)。
實(shí)施例5獼猴桃素400g糊精40g乳糖60g歐巴代薄膜包衣預(yù)制粉10gPVP乙醇液 0.5-40％制成1000片實(shí)施例6獼猴桃素400g糊精40g乳糖60gPVP乙醇液 0.5-40％制成1000粒膠囊實(shí)施例7獼猴桃素800g糊精1000g乳糖1200gPVP乙醇液 0.5-40％制成3g/1000包實(shí)施例8獼猴桃素100g蔗糖200gPEG400 20g防腐劑 0.5-1％蒸餾水 加至全量制成1000ml
實(shí)施例9獼猴桃素400gPEG4000 200g乳糖100g明膠100g甘油50g制成1000粒實(shí)施例10獼猴桃素10g亞硫酸氫鈉 2g丙二醇 100ml注射用水加至全量制成1000ml實(shí)施例11獼猴桃素50gPEG200-5000 50g二棕櫚酰磷脂酰堿100g膽固醇 5g制成前體脂質(zhì)體實(shí)施例12將前體脂質(zhì)體，加注射用水，過(guò)0.22μ微孔濾膜滅菌，充N2，灌封，得脂質(zhì)體注射液。
實(shí)施例13將前體脂質(zhì)體，加注射用水及10％的甘露醇，過(guò)0.22μ微孔濾膜滅菌，分裝，冷凍干燥，得粉針劑。
實(shí)施例14小鼠口服獼猴桃素浸膏后活動(dòng)正常，末見(jiàn)動(dòng)物有明顯毒性反應(yīng)及死亡情況，生長(zhǎng)發(fā)育正常(見(jiàn)后體重增長(zhǎng)表)。試驗(yàn)結(jié)束解剖巨檢，主要臟器末見(jiàn)明顯病理變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論當(dāng)小鼠一次性口服獼猴桃素相當(dāng)于藤梨根750g生藥/kg時(shí)，未見(jiàn)該藥有任何毒性反應(yīng)，根據(jù)人一天臨床用量折算獼猴桃素370倍以上劑量?jī)?nèi)服食是安全的。
實(shí)施例15獼猴桃素的體外抗腫瘤作用1、受試藥物獼猴桃素樣品配制用DMSO溶解后，加入PBS配成100μg/ml的溶液或均勻的混懸液，然后用PBS稀釋。
2、細(xì)胞株人乳腺癌(Bcap-37)、人慢性髓原白血病(K562)、人乳腺癌(MCF-7)、人結(jié)腸癌(HT-29)、小鼠黑色素瘤(K111)、成人肺纖維母細(xì)胞(WI38)、中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞(CHL)、小鼠成纖維細(xì)胞(3T3)、人肝癌(SMMC7721)、人白血病細(xì)胞(W256)、人黑色素瘤(SKMEL28)上述細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室凍存和傳代。
3、培養(yǎng)基(1)RPMI(1640)細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO)含10％滅活新生小牛血清(上海賽達(dá)生物藥業(yè)有限公司)；L-谷氨酰氨(進(jìn)口分裝，SANGON)；丙酮酸鈉；1×105U.L-1青霉素，100mg.L-1鏈霉素；無(wú)菌過(guò)濾，4℃保存。
(2)0.25％胰蛋白酶溶液(Trypsin)購(gòu)自Invitrogen公司，-20℃保存。
(3)磷酸緩沖液(PBS)NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，溶于1L雙蒸水，121℃高壓消毒20min，4℃保存。
(4)MTT(AMRESCO)溶液用PBS配成5mg/ml溶液。
(5)溶解液每100ml去離子雙蒸水含SDS10g，異丁醇5ml，濃硫酸0.12ml。
4、實(shí)驗(yàn)方法對(duì)上述腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性通過(guò)MTT法測(cè)得。具體步驟如下(1)樣品制備將樣品用PBS作梯度稀釋，得到濃度分別為100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml的稀釋樣品。
(2)將稀釋好的樣品加入平底96孔板中，每孔10μl，每點(diǎn)作兩個(gè)平行測(cè)試。將DMSO相應(yīng)作梯度稀釋后加入板中，作為對(duì)照。
(3)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，經(jīng)胎盤藍(lán)染色排除法計(jì)活細(xì)胞數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液密度至2×105細(xì)胞/ml。
(4)在平底96孔板中，每孔加入90微升細(xì)胞，于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
(5)將加入細(xì)胞的平底96孔板在37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中保溫48小時(shí)。
(6)每孔中加入20μl 5mg/mlMTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫3～4小時(shí)。
(7)每孔加入100μl DMSO，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫過(guò)夜，次日，以A570波長(zhǎng)測(cè)各孔的光密度(可采用DG3022酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀)。各檔試液孔均值與陰性對(duì)照值比較得各檔濃度的百分抑制率(同時(shí)設(shè)一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥作為陽(yáng)性對(duì)照)。計(jì)算公式為IC％＝(C-T)/C×100％T為試液組OD值C為陰性對(duì)照組OD值然后根據(jù)各個(gè)檢測(cè)液各檔濃度的IC％，以回歸曲線求得IC50值。
5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)下表1，獼猴桃素對(duì)人慢性髓原白血病(K562)、人結(jié)腸癌(HT-29)、人肝癌(SMMC7721)、人黑色素瘤(SKMEL28)、小鼠黑色素瘤(K111)、人乳腺癌(MCF-7)、小鼠黑色素瘤(K111)、人結(jié)腸癌(HT-29)細(xì)胞株具有較好的抗腫瘤作用。
表.1樣品水提、醇提物對(duì)各細(xì)胞株的體外增殖抑制作用

實(shí)施例16獼猴桃素抑制腫瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表2方法1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠、♀性、19-21g，由上海斯萊克動(dòng)物責(zé)任有限公司。
合格證號(hào)SCXK(滬)2003-0032、瘤源來(lái)源S180瘤源有本實(shí)驗(yàn)室傳代保種3、實(shí)驗(yàn)方法將生長(zhǎng)旺盛的小鼠S180腹水細(xì)胞用生理鹽水按1∶5稀釋，在小鼠一側(cè)腋下接種0.2ml稀釋液，隨機(jī)分組，每組10只小鼠。不同提取物用藥組、空白對(duì)照組，接種第2天給藥，連續(xù)7天，第9天處死小鼠，取下瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2

注(1)水提物10g生藥/ml；(2)乙醇提取物10g生藥/g；(3)大孔樹(shù)脂洗脫物15g生藥/g；(4)獼猴桃素。
實(shí)施例171.試驗(yàn)?zāi)康臏y(cè)試獼猴桃素對(duì)小鼠肝癌(HAC)實(shí)體瘤的初步療效(表3)2.受試藥物獼猴桃素；配制方法用生理鹽水稀釋(0.1g/ml)，現(xiàn)配現(xiàn)用。
3.動(dòng)物來(lái)源和種屬昆明種小鼠，由本院動(dòng)物房提供合格證號(hào)滬動(dòng)合證字第107號(hào)體重19-21克性別雌性各組動(dòng)物數(shù)10只4.移植性腫瘤小鼠肝癌(HAC細(xì)胞)，系上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理室傳代維持5.試驗(yàn)的主要步驟和方法取生長(zhǎng)良好的小鼠肝癌(HAC細(xì)胞)，用生理鹽水1∶4稀釋后，每只小鼠腋皮下接種0.2ml，隨機(jī)分組，設(shè)生理鹽水對(duì)照組和環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組(100mg/kg，ip×3(1，3，5，))，批號(hào)980401，樣品組(6.25、12.5、25ml/kg)。次日起給予不同藥物，0.5ml/鼠，連續(xù)灌胃7天。接種后10日脫頸處死動(dòng)物，解剖取瘤塊，比較各劑量組瘤重之大小。結(jié)果判定根據(jù)以下公式

6.結(jié)果表3獼猴桃素對(duì)小鼠肝癌(HAC)的抑瘤作用

與空白對(duì)照組比較**P＜0.01。
從上表3可見(jiàn)，獼猴桃素在25ml/kg劑量時(shí)對(duì)小鼠肝癌(HAC)有一定的抑制作用，抑瘤率為52.83％，與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01＝。
附測(cè)試報(bào)告一.試驗(yàn)儀器ABI 3200Q Trap串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)二.試驗(yàn)步驟1.樣品配置稱取樣品1.0mg，溶于1mL甲醇，配成1mg/mL溶液；用甲醇稀釋成濃度為5ug/mL溶液。
2.取甲醇分別做正、負(fù)離子掃描，掃描范圍100～1000amu；3.取上述5ug/mL樣品溶液分別做正、負(fù)離子掃描，掃描范圍100～1000amu。
三.試驗(yàn)結(jié)果與分析1.試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖2-5。
2.結(jié)果分析與甲醇正離子掃描圖比較，樣品正離子掃描未見(jiàn)有強(qiáng)特征離子峰。
與甲醇負(fù)離子掃描圖比較，在樣品負(fù)離子掃描出現(xiàn)中出現(xiàn)289、577amu強(qiáng)離子峰，具有特征性。同時(shí)，由于289＝(577+1)/2，因此推測(cè)289與577結(jié)構(gòu)可能有一定的相關(guān)性。另外在245、357、865amu也有特征離子峰獼猴桃素的特征離子峰譜為245、289、357、577、865amu。
為進(jìn)一步對(duì)獼猴桃素分離純化提供了明確的目標(biāo)。
3.填補(bǔ)藤梨根的有效部位的藥物制劑的缺乏，開(kāi)發(fā)出單味藥的新劑型，達(dá)到申報(bào)新藥劑型的目的。
權(quán)利要求
1.一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”，其特征在于獼猴桃素是一種復(fù)合蒽醌苷類，用75％乙醇溶解，使成為1-10mg/ml醇液，高效硅膠G簿層層析板上，具有0.00到0.100、0.167到0.300、0.400到0.533、0.700到0.833或0.900到0.967范圍內(nèi)的Rf值的斑點(diǎn)(圖1)，特征離子峰譜為245、289、357、577、865amu(圖2-5)。
2.一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其制備方法，其特征在于獼猴桃素制備方法包括下述步驟1)藤梨根用水煎，煎液取上清液濃縮，加入殼聚糖澄清后過(guò)濾，得清膏液；2)清膏液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂層析，用水洗脫至無(wú)色，再用有機(jī)溶劑層析，流份收集濃縮，得濃縮液；3)將濃縮液用聚酰胺吸附，用水洗脫至無(wú)色，再用有機(jī)溶劑洗脫，洗脫液濃縮，干燥，得獼猴桃素。
3.如權(quán)利要求1所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其制備方法，其特征在于所述的水為去離子水或蒸餾水，加水為藥材重量的6-12倍量，煎煮1-3次，每次1-3小時(shí)；濃縮至藥材量的1∶1或相對(duì)密度1.06-1.10；所用殼聚糖是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，用量為藥材的0.05-5％；過(guò)濾用濾布、紙、膜。
4.如權(quán)利要求1所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其制備方法，其特征在于所述的大孔吸附樹(shù)脂是D型或HPD型系列；粒度20-60目或0.3mm-1.2mm；孔徑50-300；流速0.5-10ml/g/分鐘。
5.如權(quán)利要求4所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其制備方法，其特征在于所述的層析采用有機(jī)溶劑是15％-30％乙醇、丙酮或50-85％乙醇、丙酮。
6.如權(quán)利要求4所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其制備方法，其特征在于所述的大孔吸附樹(shù)脂用量是藥材量的0.5-2倍，層析采用有機(jī)溶劑是75％乙醇或75％丙酮。
7.如權(quán)利要求1所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其制備方法，其特征在于所述的聚酰胺用量為濃縮液的0.5-50倍，層析用有機(jī)溶劑是50-75％的乙醇或50-75％丙酮，真空冷凍干燥，真空度-0.06-0.1Mpa，溫度-40℃-25℃，時(shí)間5-30小時(shí)。
8.如權(quán)利要求7所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其制備方法，其特征在于所述的聚酰胺粒度100-120目，層析用有機(jī)溶劑是75％乙醇或75％丙酮。
9.如權(quán)利要求1所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其應(yīng)用，其特征在于所述的藥物制劑是薄膜包衣片，包括獼猴桃素30-80％糊精1-20％乳糖1-20％歐巴代薄膜包衣預(yù)制粉0.5-5％PVP乙醇液 0.5-40％
10.如權(quán)利要求1所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其應(yīng)用，其特征在于所述的藥物制劑是硬膠囊劑，包括獼猴桃素30-90％糊精1-20％乳糖1-20％PVP乙醇液 0.5-40％
11.如權(quán)利要求1所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其應(yīng)用，其特征在于所述的藥物制劑是顆粒劑，包括獼猴桃素30-90％糊精1-20％乳糖1-20％PVP乙醇液 0.5-40％
12.如權(quán)利要求1所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其應(yīng)用，其特征在于所述的藥物制劑是脂質(zhì)體，包括獼猴桃素1-30％PEG200-5000 1-20％二棕櫚酰磷脂酰堿1-30％膽固醇 1-5％注射用水0-96％
13.如權(quán)利要求1所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其應(yīng)用，其特征在于所述的藥物制劑是注射劑，包括獼猴桃素1-30％亞硫酸氫鈉 0.1-2％丙二醇 0.1-10％注射用水65-98％
14.如權(quán)利要求1所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其應(yīng)用，其特征在于所述的藥物制劑是合劑獼猴桃素30-90％蔗糖 1-20％PEG4001-10％防腐劑0.5-1％
15.如權(quán)利要求1所述的一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其應(yīng)用，其特征在于所述的藥物制劑是軟膠囊，包括獼猴桃素 30-90％PEG4000 1-20％乳糖 1-20％明膠 1-20％甘油 1-5％
全文摘要
本發(fā)明涉及植物藥及其制備方法和應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種具有抗腫瘤作用的“獼猴桃素”及其制備方法和應(yīng)用。獼猴桃素是一種復(fù)合蒽醌苷類等的總有效部位，硅膠G薄層層析板上具有0.00到0.100、0.167到0.300、0.400到0.533、0.700到0.833或0.900到0.967范圍內(nèi)的Rf值的斑點(diǎn)，特征離子峰譜為245、289、357、577、865amu。其制備方法包括1)藤梨根用水煎，濃縮，過(guò)濾；2)經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂層析，洗脫有機(jī)溶劑層析，濃縮；3)聚酰胺吸附，洗脫濃縮，干燥；4)將獼猴桃素添加適當(dāng)輔料和添加劑后，制成薄膜包衣片、硬膠囊劑、合劑、軟膠囊劑、顆粒劑、注射劑、脂質(zhì)體等藥劑。
文檔編號(hào)A61K31/7034GK1895302SQ20061002732
公開(kāi)日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2006年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日
發(fā)明者趙正福 申請(qǐng)人:趙正福