專利名稱：：分裂缺陷蛋白3的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及已知蛋白的新功能，尤其涉及分裂缺陷蛋白3的DNA修復(fù)功能及可能的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：DNA存儲著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，因此維護DNA分子的完整性對細胞至關(guān)重要。外界環(huán)境和生物體內(nèi)部的因素都經(jīng)常會導(dǎo)致DNA分子的損傷或改變。DNA修復(fù)(DNAr印airing)是細胞對DNA受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新能執(zhí)行它原來的功能；但有時并非能完全消除DNA的損傷，只是使細胞能夠耐受這種DNA的損傷而能繼續(xù)生存。DNA損傷如在復(fù)制前得不到有效修復(fù)，將引起突變。也許這未能完全修復(fù)而存留下來的損傷會在適合的條件下顯示出來(如細胞的癌變等)。目前認為，細胞癌變是各種基因突變不斷累積的結(jié)果。因人類細胞有多種DNA修復(fù)機制，可防止基因突變，因此，DNA修復(fù)能力與腫瘤發(fā)生之間有著密切的聯(lián)系(HoeijmakersJH,etal.Enoffllemaintenancemechanismforpreventingcancer.Nature,2001,411:366-374)。DNA修復(fù)缺陷和基因組不穩(wěn)定性也是多種人類遺傳性疾病的特征，這些遺傳性疾病中大多數(shù)使受累個體易感惡性腫瘤,如色素性干皮病、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌等。DNA修復(fù)功能的異常使腫瘤細胞對抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性。利用DNA修復(fù)的特點降低腫瘤細胞的多藥耐藥性將為腫瘤耐藥的逆轉(zhuǎn)提供新的思路。DNA雙鏈斷裂和修復(fù)也是腫瘤放射治療和多種化學(xué)治療的主要機制，其中最為重要的是DNA非同源末端重組(NonhomologousDNAdoublestandbreakend—joining，NHEJ)，它與DNA雙鏈斷裂(DSBs)后細胞死亡與否直接相關(guān)。已經(jīng)證實一些基因與這種修復(fù)或重組缺陷有關(guān)，如編碼DNA依賴性蛋白激酶(DNA—PK)復(fù)合物的基因，其表達產(chǎn)物DNA—PK為整個過程的關(guān)鍵酶，是由DNA激活的核內(nèi)蛋白激酶，包含一個大的具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的催化亞單位(DNA—PKcs)和兩個由DNA結(jié)合蛋白Ku70和Ku80的調(diào)節(jié)亞單位組成，通過磷酸化多種蛋白質(zhì)底物，廣泛參與轉(zhuǎn)錄及細胞凋亡等過程。許多癌癥病例都與基因DNA—PK的損傷有關(guān).重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠(SCID)由于其DNA—PK發(fā)生突變而缺乏DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力，是研究DSBs修復(fù)和腫瘤的關(guān)系的最常用的動物模型。(0chiaiM,etal.HighsusceptibilityofScMmicetocoloncarcinogenesisinducedbyazoxymethaneindicalesapossiblecaretakerroleforDNA—dependentproteinkinase.Carcinogenesis,2001,22:1551—1555)用氧化偶氮甲烷(A0M)處理SCID鼠6周后觀察結(jié)腸癌的發(fā)生率(87%)較對照組(50%)顯著增高。DNA—PKcs基因剔除小鼠發(fā)育過程中不僅表現(xiàn)免疫缺陷和極度的輻射敏感，也出現(xiàn)腸黏膜的異常增生(KurimasaA,etaLCatalyticsubunitofDNAdependentproteinkinase:impactonlymphocytedevelopmentandt,rigenesis.ProcNailAcadsciUSA.1999,96:1403—1408)。人為地使Ku70基因失活，造成小鼠成纖維細胞姐妹染色體互換率增高及淋巴瘤的發(fā)生(LiGC,etal.Ku70:acandidatetumorsuppressorgeneformurineTcelllymphoma.MolCell,1998,2:1-8)。新近報道的臨床研究結(jié)果也提示，DNA—PK活性的降低和肺癌危險度有關(guān)(AucldeyDH，etaLReducedDNAd印endentproteinkinaseactivityisassociatedwithlungancer.Carcinogenesis,2001,22:723-27)。體內(nèi)外研究結(jié)果顯示，DNA—PK在腫瘤抑制方面起到了非常重要的作用。而該基因在正常情況下專門修復(fù)人體中被損壞的基因，癌細胞同樣會利用DNA—PK的修復(fù)能力使得細胞對抗癌治療產(chǎn)生抵抗作用。由于DNA—PK在輻射誘導(dǎo)的DSBs修復(fù)中的核心作用，其功能的喪失必然導(dǎo)致細胞損傷修復(fù)能力的降低，對電離輻射的敏感性增高，DNA損傷在細胞內(nèi)累積造成基因組的不穩(wěn)定及突變率的增加。這一推斷已經(jīng)得到了一系列體內(nèi)外實驗的證實。分析對輻射高度敏感的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(M059J)基因序列發(fā)現(xiàn)，其DNA-PKcs活性喪失。同一起源的另一野生型細胞系(M059K)則顯示正常的DNA-PK活性和放射敏感性(AndersonCW,etFrameshiftmutationinP細C，thegeneforDNA—PKcs，intheDNArepair—defectivehumanglioma-derivedcelllineM059J".RadiatRes，2001，156:2-9)。對輻射敏感且具腫瘤傾向的BALB/c小鼠的成纖維細胞DNA-PKcs蛋白水平和DNA-PK活性較對照組顯著降低(0kayasuR,etaLAdeficiencyinDNArelpairandDNA-PKcsexpressionintheradiosensitiveBALB/cmouse.CancerRes,2000,60:4342-4345)。臨床試驗也發(fā)現(xiàn)低表達DNA—PKcs的腫瘤對放療的反應(yīng)敏感(SakataK,etaLClinnicalstudiesofstainingofDNA—dependentproteinkinaseinoropharyngealandhypopharyngealcarcinomas.RadiatMed,2001,19:93-97)。以上資料顯示，DNA-PK的活性水平?jīng)Q定了個體內(nèi)在的放射敏感性。了解DNA-PK在人群中的多態(tài)性對于易感人群的篩査及腫瘤患者的術(shù)后放療均有重要意義。目前很多抗腫瘤藥物都是通過損傷腫瘤細胞DNA而發(fā)揮作用的。而腫瘤組織中DNA—PK的過度表達可導(dǎo)致對放療化療的抵抗性。阿霉素獲得性耐藥細胞株(HL60)的DNA-PKcs表達較敏感細胞增高可達15倍，總的DNA-PK活性增加3倍。反義核酸轉(zhuǎn)染使其表達降低50%后可部分逆轉(zhuǎn)細胞的抗藥性(ShenH,etal.IncreasedexpressionofDNA—dependentproteinkinaseconfer9resistancetoadriamycirL.BiochimBi叩hysActa,1998,1381:131-138)。另有研究結(jié)果表明，DNA-PK和GST—起參與了腫瘤細胞多藥耐藥性(MDR)的形成，聯(lián)合應(yīng)用DNA-PK的抑制劑渥曼青霉素(wortmannin)使細胞對抗腫瘤藥物的敏感性增強(KilnSH,etal.PotentiationofchemosensitivityinmultidrugresistanthumanleukemiaCEMcellsbyinhibitionofDNA—dependentproteinkinaseusingwortmanni.LeukRes,2000,24:1917-925)。DNA-PK作為感受并傳遞損傷信號的信使，在持續(xù)的損傷壓力下可被誘導(dǎo)表達，這是細胞內(nèi)在的損傷應(yīng)答反應(yīng)，可保護正常細胞免受損傷。另一方面，抑制腫瘤細胞DNA-PK的過度表達可增強細胞對基因毒性藥物的敏感性，達到增強療效的目的。Ku蛋白與DNA-PKcs組成DNA-PK全酶通過參與DNA雙鏈修復(fù)的非同源性末端連接(NHEJ)過程從而進行DSBs修復(fù)。Ku蛋白由70kDa和80kDa兩條多肽鏈組成，分別被稱之為Ku70和Ku80。根據(jù)Ku這一作用，研究者們在肺癌等多種腫瘤細胞中導(dǎo)人反義Ku70基因片段，以封閉其正義Ku70基因表達，致使經(jīng)放療后造成的DSBs不能修復(fù)，從而顯著增加了腫瘤細胞的放射敏感性(MoriS，etal.S叩pressionofaDNAdoublestrandbreakrepairgene,Ku70，increasesradio-andehemosensitivityinahumanlungcarcinomacellline.DNAR印air(Amst)，2002,1(4):299—310.張捷等.Ku70基因?qū)巳朔伟┘毎蟮谋磉_及意義.腫瘤免疫學(xué)，2000，16(4):203-207.張捷等.反義Ku70在人肺癌細胞的表達及對放射線的敏感研究.中國免疫學(xué)雜志，2001，17(2):82-84.UGC,etal.Adenovirus-mediatedheabactivatedan—tisenseKu70expressionradiosensitizcstumoreelsinvitroandinvivo.CancerRes,2003,63(12):3268—3274)。研究者進行動物實驗也獲得了同樣的結(jié)果。Kim等測定了博萊霉素、阿糖胞苷和長春新堿對1(1170-/-和Ku80-/-細胞的殺傷作用，與原形細胞比較呈高度敏感；而過度表達人Ku70和Ku80蛋白的R7080-6細胞株可抵抗博萊霉素引起的凋亡，提示Ku蛋白影響著抗癌藥物對腫瘤細胞的敏感性(KimSH，etal.Kuautoantigenaffectsthesuscep—tibihtytoanticancerdruge.CancerRes,1999,59(16):4012—4017)。Ku80異常表達蛋白Ku86v的細胞對放射、絲裂霉素、博萊霉素的敏感性較含正常Ku80的多發(fā)性骨髓瘤或正常骨髓細胞高，Tai明確指出Ku可能成為一個新的腫瘤治療靶點(TaiYT,etal.Ku86variantexpressionandfunctioninmultiplemydomacellsisassociatedwithincreasedsensitivitytoDNAdamage.JImmunol,2000,165(11):6347—6355)。這為腫瘤的放射和基因治療相結(jié)合提供了廣闊前景。進化上極其保守的分裂缺陷蛋白3/分裂缺陷蛋白6/非典型蛋白激酶C(Par3/Par6/aPKC)復(fù)合物被認為是一個調(diào)節(jié)細胞極性、非對稱性細胞分化、脊椎動物上皮細胞間緊密連接的形成和維持的重要的調(diào)節(jié)因子(圖1A)。以往的研究也證實了Par3上的PDZ結(jié)構(gòu)域(PSD95/Dlg/Z0-1三個蛋白所共同有的結(jié)構(gòu)域)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用(ShengM,etal.PDZdomainsandtheorganizationofsupramolecularcomplexes.AnnuRevNeurosci,2001,24:1-29)。然而，迄今為止，未曾有發(fā)現(xiàn)Par3參與及調(diào)節(jié)DNA損傷后的修復(fù)的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供Par3調(diào)節(jié)DNA損傷后的DNA修復(fù)的功能，以及與該功能相關(guān)的應(yīng)用。本發(fā)明的一方面，提供了分裂缺陷蛋白3用于促進DNA損傷的修復(fù)，所述的蛋白具有SEQIDN0:1的氨基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白。本發(fā)明的另一方面，提供了分裂缺陷蛋白3在制備促進DNA修復(fù)制劑中的應(yīng)用，所述的蛋白具有SEQIDNO:l的氨基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白。本發(fā)明的第三方面，提供了分裂缺陷蛋白3在制備增強抗癌藥物敏感度的藥物中的應(yīng)用，所述的蛋白具有SEQIDNO:l的氨基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白。本發(fā)明的研究表明，Par3可促進DNA損傷的修復(fù)，發(fā)明人通過下面一系列試驗證實Par3可與Ku70/80相互作用，結(jié)合合位點為Par3的PDZ2-3結(jié)構(gòu)域，Par3是通過結(jié)合Ku70/Ku80及DNA-PKcs從而調(diào)節(jié)DNA—PK的活性來促進DNA損傷的修復(fù)。1.鑒定了Ku70/80為Par3的結(jié)合蛋白。構(gòu)建包含Par3PDZ2-3(426695aa)的GST融合蛋白，于不同細胞系中進行體外結(jié)合實驗。細胞裂解產(chǎn)物與此融合蛋白反應(yīng)，用GlutathioneS印harose4B獲得此融合蛋白及其結(jié)合蛋白。SDS-PAGE檢測與此融合蛋白結(jié)合的蛋白，發(fā)現(xiàn)分子量位于70kDa和80kDa的兩個蛋白，用LC/Ms/Ms分析得知這兩個蛋白分別為Ku70與Ku80。2.Ku70和Ku80在體外及體內(nèi)與Par3發(fā)生特異性的相互作用。將A431細胞和Hela細胞裂解產(chǎn)物分別與結(jié)合在谷胱甘肽磁珠上的Par3PDZ2-3的GST融合蛋白反應(yīng)，用Ku70和Ku80抗體通過免疫印記檢測到了與Par3PDZ2-3結(jié)合的內(nèi)源性Ku70和Ku80。將編碼Ku70和Ku80的VSV(VesicularStomatitisVirus)標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞或兩質(zhì)粒共轉(zhuǎn)，檢測Par3PDZ2-3的GST融合蛋白分別與外源性表達的Ku70、Ku80和Ku70/Ku80的相互作用。結(jié)果為Par3PDZ2-3的GST融合蛋白只能與表達的Ku70和Ku70/Ku80結(jié)合，卻不能與單獨表達的Ku80結(jié)合，此結(jié)果暗示Ku70調(diào)節(jié)Ku復(fù)合物與Par3間的相互作用。為檢測此PDZ結(jié)構(gòu)域與Ku復(fù)合物的相互作用特異性，發(fā)明人將Par3PDZ結(jié)構(gòu)域與緊密連接蛋白和PTPAS中不同的PDZ結(jié)構(gòu)域進行了比較?？寺×艘恍┡cPar3PDZ結(jié)構(gòu)域具有高度同源性的PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白例如PDZ1(251385aa)、PDZ2-3(426695aa)、ZO-1(zonaoccludens-1)PDZ1(1lilaa)、PTPBAS(PROTEIN-TYROSINEPHOSPHATASE)PDZ2-3(13271612aa)，并制備相關(guān)的GST融合蛋白，A431細胞裂解產(chǎn)物與這些重組的融合蛋白反應(yīng)，內(nèi)源性Ku70和KuSO僅和Par3的PDZ2-3發(fā)生了特異性地結(jié)合沉淀反應(yīng).這些結(jié)果表明Ku70和Ku80特異性地與Par3的PDZ2-3結(jié)合。為了進一步證明Par3和Ku蛋白復(fù)合物能實質(zhì)性地在細胞內(nèi)相互作用，發(fā)明人用編碼VSV標(biāo)記的Par3180K的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，并檢測Par3蛋白與內(nèi)源性Ku70和Ku80相互作用的能力，Ku70C和Ku80C多克隆抗體都能通過IP反應(yīng)沉淀Ku70和Ku80進而獲得與之結(jié)合的Par3180K，表示Par3的過表達能形成Par3/Ku70/Ku80三元復(fù)合物。為進一步確認內(nèi)源性相互作用，用抗Par3PDZ2-3多克隆抗體于293T、Hela和A431細胞中免疫沉淀Par3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ku70/80復(fù)合物與Par3共沉淀，反之用抗Ku70C多克隆抗體于Hela細胞中免疫沉淀Par3，也發(fā)現(xiàn)Ku70/80復(fù)合物與Par3共沉淀，結(jié)果表明在體內(nèi)Ku70/80也與Par3結(jié)合。3.Par3PDZ2和TOZ3之間區(qū)域的片斷與Ku70N端結(jié)合。為進一步獲得Par3上的Ku70和Par3相互作用位點，將表達Par3APDZ2-3(Par3缺失PDZ2-3結(jié)構(gòu)域的蛋白)和Par3的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞，用抗Ku70C多克隆抗體分別與外源性表達的Par3APDZ2-3和Par3免疫沉淀反應(yīng)，正如預(yù)期那樣，雖然Par3與Ku70結(jié)合，但缺失PDZ2-3結(jié)構(gòu)域的Par3不能與Ku70結(jié)合，暗示Par3上與Ku70作用位點位于PDZ2-3結(jié)構(gòu)域內(nèi)。為進一步了解在這種相互作用中Par3各區(qū)域所發(fā)揮的作用，發(fā)明人制備了跨越Par3PDZ2-3結(jié)構(gòu)域的各種重組GST融合蛋白，于A431細胞中做體外結(jié)合試驗，發(fā)現(xiàn)Par3PDZ2和PDZ3之間區(qū)域的片斷與Ku70和Ku80特異性結(jié)合，但僅Par3PDZ2或者Par3PDZ3結(jié)構(gòu)域片斷沒有與Ku70結(jié)合，結(jié)果暗示連接TOZ2和PDZ3之間區(qū)域的片斷調(diào)節(jié)Par3與Ku70的結(jié)合，PDZ2結(jié)構(gòu)域的存在似乎能促進這種結(jié)合，然而PDZ3結(jié)構(gòu)域的存在似乎能阻止這種結(jié)合。為獲得Ku70上介導(dǎo)Ku70和Par3相互作用的位點，證明這種相互作用是直接的，發(fā)明人純化了表達Par3PDZ2-3結(jié)構(gòu)域His融合蛋白，使其與各種Ku70的GST融合蛋白反應(yīng)，并用GST磁珠沉淀，獲得了包含1-273氨基酸的N-端片斷的Ku70融合蛋白，但沒有獲得GST和2種C-端的Ku70融合蛋白(400609氨基酸)(1116氨基酸)，結(jié)果證明示Par3PDZ2-3結(jié)構(gòu)域直接且選擇性的結(jié)合于Ku70N端VWA結(jié)構(gòu)域。4.Gamma射線損傷或DNA損傷因子(et叩oside)促進Ku蛋白和Par3的結(jié)合。Ku蛋白促進雙鏈DNA損傷修復(fù)。為研究DSB修復(fù)對Ku70和Par3結(jié)合的影響，發(fā)明人用10Gy的劑量照射A431細胞，并監(jiān)測照射停止后一定時間點Ku70和Par3的相互作用。由于Gamma射線照射，細胞中與Par3—起沉淀下來的Ku70的量增加了，反之，在Hela細胞中與Ku70—起沉淀下來的Par3的量增加了，發(fā)明人還在擁有正常緊密連接的Caco2細胞中檢測了他們結(jié)合情況隨Gamraa射線照射的變化，發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果。同時，擬輻射劑etoposide，加強了Ku蛋白和Par3的相互作用。所有數(shù)據(jù)提示DNA損傷過程促進了Ku蛋白和Par3的相互作用。IR對細胞副作用之一就是產(chǎn)生了活性氧物質(zhì)。當(dāng)用細胞經(jīng)IR處理并產(chǎn)生H202或更強的氧化劑時，許多受體(如EGFR,B細胞受體，和胰島素受體激酶)以非酉己體依賴方式開女臺f言號轉(zhuǎn)導(dǎo)(RethM,etal.Hydrogenperoxideassecondmessengerinlymphocyteactivation.NatImmunol,2002，3:1129-1134)。為了解是否受體酪氨酸磷酸化途徑誘導(dǎo)了Ku蛋白和Par3的結(jié)合，發(fā)明人用EGF配體或Pervanadate(釩酸鈉，一種酪氨酸磷酸化酶抑制劑)刺激A431細胞，細胞裂解物與抗Par3抗體免疫沉淀反應(yīng)，沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)合的Ku70的增加，結(jié)果排除了酪氨酸激酶調(diào)節(jié)Ku蛋白和Par3的相互作用的可能性。5.Par3在hela細胞中定位于細胞膜和細胞核內(nèi)。Hela細胞中Par3有兩個異構(gòu)體180K和150K。發(fā)明人獲得特異性Par3C端Par3-LCT(Par3150K無此部分氨基酸)多克隆抗體(抗Par3或抗LCT)，并用抗原競爭抑制試驗證實其用于熒光染色反應(yīng)的有效性后，發(fā)明人研究了Par3在Hela細胞中的分布模式。用抗LCT(抗Par3)抗體免疫熒光染色Hela細胞，發(fā)現(xiàn)于膜上和核內(nèi)Par3清晰的熒光信號,信號能被針對抗LCT(抗Par3)的抗原(GST-LCT)阻斷，因此，發(fā)明人相信Par3存在于核內(nèi)。正如預(yù)期的，用PS0RT軟件發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Par3中的4個核定位信號(NLS),Par3180K有4個NLS，而Par3150K只有2個NLS。免疫熒光染色分別表達Par3180K、Par3150K和Par3-LCT的MDCK細胞，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Par3180K大部分定位于胞漿，小部分定位于核內(nèi)，然而Par3150K幾乎完全定位于胞漿內(nèi)，所以導(dǎo)致Par3核定位的信號可能位于Par3180KC端NLS，為確認此功能，免疫熒光染色Par3-LCT的MDCK細胞，發(fā)現(xiàn)45kDaPar3-LCT完全定位于核內(nèi)。發(fā)明人用anti-LCT或anti-VSV抗體免疫熒光染色分別表達Par3180K、Par3150K和Par3-LCT的Hela細胞，發(fā)現(xiàn)同樣的現(xiàn)象。因此，發(fā)明人相信Par3進入核內(nèi)了。6.DNADSBs損傷導(dǎo)致Par3和Ku70共定位增加。為獲得Par3和Ku70細胞內(nèi)分布模式，用抗Par3抗體和抗Ku70抗體免疫熒光染色Hela細胞，經(jīng)ETO或粒子射線照射后細胞中，Par3和Ku70核中共定位較對照細胞(未經(jīng)過以上處理)明顯增加，未經(jīng)過處理細胞中僅有極少量共定位，結(jié)果暗示DNADSBs損傷調(diào)節(jié)了Par3核內(nèi)定位。丫H2AX是一個在DNADSBs損傷時會被磷酸化的位點，是用于檢測DNADSBs損傷的指標(biāo)為闡明IR后Par3是否與DSBs相關(guān)，發(fā)明人檢測了它與yH2AX在中共定位。Hela細胞經(jīng)過IR恢復(fù)2小時后，或ETO處理細胞8小時恢復(fù)后，分別用抗體Par3抗體和YH2AX抗體免疫熒光染色同一固定后細胞，共聚焦觀察，發(fā)現(xiàn)DSBs誘導(dǎo)集落的形成，并存在Par3和丫H2AX部分共定位，而在對照細胞中共定位極少。7.DNA-PKcs也被招募到Par3/Ku70/Ku80復(fù)合物上。Ku蛋白是由Ku70andKu80兩個亞單位組成的異聚體。DNA-PKcs是Ku異聚體的催化亞單位。Ku異聚體結(jié)合到DSBs并招募DNA-PKcs從而獲得活性。為了研究DNA-PKcs是否也與Par3/Ku70/Ku80復(fù)合物結(jié)合，Hela細胞經(jīng)10Gy射線照射后，使其恢復(fù)一段時間。細胞裂解后，與Par3免疫沉淀反應(yīng)，用DNA-PKcs單克隆抗體于此復(fù)合物中通過免疫印記檢測DNA-PKcs.結(jié)果暗示由于IR導(dǎo)致Par3，Ku70,Ku80和DNA-PKcs在體內(nèi)形成了一個復(fù)合體。8.Par3促進了DNA損傷的修復(fù)。將Hela細胞分別轉(zhuǎn)入Par3180kDa(Par3野生型)和缺乏PDZ2和PDZ3之間結(jié)構(gòu)域的Par3180K(簡稱Par3AB23)，經(jīng)10Gy射線照射并恢復(fù)兩小時后，細胞提取物被準(zhǔn)備用來進行激酶活力檢測。由于己知DNA-PK的活力與DNA損傷的修復(fù)直接相關(guān)，我們以檢測DNA-PK的活力為指標(biāo)來反應(yīng)Par3促進DNA損傷的修復(fù)功能。試驗結(jié)果表明，經(jīng)照射后，與未轉(zhuǎn)入表達Par3的細胞相比，表達Par3WT的細胞中DNA-PK活性顯著提高了，而表達變異Par3(Par3AB23)的細胞中活性顯著降低了。DNA-PKcs在Thr2609位的磷酸化是通過NHEJ機制修復(fù)DSBs所必須的，因此我們又以Thr2609位的磷酸化為指標(biāo)來衡量DNA損傷的修復(fù)。分別外源性表達pcDNA3，Par3野生型和Par3AB23，經(jīng)10Gy射線照射并恢復(fù)兩小時后，用pT2609抗體分析細胞內(nèi)情況，與對照細胞株相比，經(jīng)射線照射后，在表達Par3野生型的細胞中，Thr2609磷酸化程度明顯增強了，然而在表達Par3突變體的細胞中，Thr2609磷酸化程度只是輕微增強。所以，結(jié)果顯示Par3可能通過影響DNA-PK活性從而參與IR后的DNA修復(fù)。以上兩個試驗都證實了Par3促進了DNA損傷的修復(fù)。本發(fā)明的有益效果在于通過本發(fā)明對Par3蛋白促進DNA損傷的修復(fù)功能的修復(fù)功能的揭露，為Par3蛋白的應(yīng)用開辟了全新的領(lǐng)域。圖1.體外結(jié)合實驗篩選與Par3結(jié)合的蛋白質(zhì)。A.Par3結(jié)構(gòu)域構(gòu)成、GST融合蛋白表達的Par3區(qū)域和相應(yīng)的氨基酸區(qū)域。B、C.LC/Ms/Ms結(jié)果。m/z(amu):電荷/質(zhì)量圖2.Ku70和Ku80特異性地結(jié)合于Par3PDZ2-3結(jié)構(gòu)域。A.內(nèi)源性Ku70和Ku80結(jié)合于Par3PDZ2-3結(jié)構(gòu)域。GST:對應(yīng)的泳道為Hela細胞及A431細胞裂解產(chǎn)物分別用結(jié)合在谷光甘肽磁珠上的GST蛋白進行體外結(jié)合反應(yīng)后，經(jīng)SDS—PAGE后通過免疫印記檢測的條帶情況，Mock為負對照。PDZ2-3:對應(yīng)的泳道為Hela細胞及A431細胞裂解產(chǎn)物分別用結(jié)合在谷光甘肽磁珠上的Par3PDZ2-3GST融合蛋白進行體外結(jié)合反應(yīng)后，經(jīng)SDS—PAGE后通過免疫印記檢測的條帶情況，Mock為負對照。上下顯色條帶分別表示含有Ku80y與Par3PDZ2-3GST融合蛋白結(jié)合的復(fù)合物，及含有Ku80與Par3TOZ2-3GST融合蛋白結(jié)合的復(fù)合物。Lysate:對應(yīng)的泳道為用作對照的等量Hela細胞及A431細胞的細胞裂解液，經(jīng)SDS—PAGE后通過免疫印記檢測的條帶情況。上下顯色條帶分別表示細胞內(nèi)有Ku80及Ku70。IB:anti-Ku70/Ku80:免疫印記中用了抗Ku70和抗Ku80的單克隆抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，對應(yīng)的97、66均為分子量。B.外源性Ku70和Ku80結(jié)合于Par3PDZ2-3結(jié)構(gòu)域。Pulldown:對應(yīng)的泳道表示，瞬時轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒pcDNA3、Ku70表達質(zhì)粒、Ku80表達質(zhì)粒，以及同時轉(zhuǎn)染了Ku70和Ku80表達質(zhì)粒的293T細胞裂解液，分別和結(jié)合到谷光甘肽磁珠上的Par3PDZ2-3GST融合蛋白進行體外結(jié)合反應(yīng)。結(jié)合的蛋白用抗Ku70和抗Ku80的單克隆抗體免疫印記檢測的條帶情況。97對應(yīng)的顯色條帶表示含有Ku80與Par3PDZ2-3GST融合蛋白結(jié)合的復(fù)合物，66對應(yīng)的顯色條帶表示含有Ku80與Par3PDZ2-3GST融合蛋白結(jié)合的復(fù)合物。Lysate:對應(yīng)的泳道為瞬時轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒(pcDNA3)、Ku70表達質(zhì)粒、Ku80表達質(zhì)粒，以及同時轉(zhuǎn)染了Ku70和Ku80表達質(zhì)粒的293T細胞的細胞裂解液用抗VSV抗體免疫印記檢測的條帶情況。97對應(yīng)的顯色條帶表示含有Ku80，66對應(yīng)的顯色條帶表示含有Ku70。IB:anti-Ku70/Ku80:免疫印記中用了抗Ku70和抗Ku80的單克隆抗體。IB:anti-VSV:免疫印記中用了抗VSV抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，對應(yīng)的97、66均為分子量。C.各種PDZ結(jié)構(gòu)域氨基酸序列群比對。D.內(nèi)源性Ku70和Ku80特異性地結(jié)合于胞外Par3PDZ2-3結(jié)構(gòu)域。A431celllysate:對應(yīng)的泳道表示，將A431細胞裂解液分別與GST、Par3GST-PDZ1、Par3GST-PDZ2-3、Z0-1GST-PDZ1和PTPBASGST-PDZ2-3蛋白進行體外結(jié)合反應(yīng)，然后用抗Ku70或抗Ku80的抗體來進行免疫印記檢測的條帶情況。標(biāo)記Par3-PDZ1、Par3-PDZ2-3、Z0-1-PDZ1和PTPBAS-PDZ2-3分別表示Par3GST-PDZ1、Par3GST-PDZ2-3、Z0-1GST-PDZ1和PTPBASGST-PDZ2-3蛋白。顯色條帶表示內(nèi)源性的Ku70或Ku80和相應(yīng)泳道的蛋白發(fā)生了結(jié)合。Mock:對應(yīng)的泳道為負對照，即未加細胞裂解液反應(yīng)，而直接用抗Ku70或抗Ku80的抗體來進行免疫印記檢測的條帶情況。Lysate:對應(yīng)的泳道為用作對照的等量A431細胞的細胞裂解液，經(jīng)SDS—PAGE后通過免疫印記檢測的條帶情況。上下顯色條帶分別表示細胞內(nèi)有Ku80與Ku70。IB:anti-Ku70/Ku80:免疫印記中用了抗Ku70和抗Ku80的單克隆抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，對應(yīng)的97、66均為分子量。圖3.細胞內(nèi)Par3與Ku70相互作用。A.外源性表達Par3180K與內(nèi)源性Ku70和Ku80相互作用。IP:免疫沉淀NS:對應(yīng)的泳道表示，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3及Par3180K表達質(zhì)粒的293T細胞裂解液用免疫前血清(未免疫抗原的健康雄兔的血清)來免疫沉淀，然后分別經(jīng)抗Par3抗體、抗Ku80抗體、抗Ku70抗體免疫印記檢測的條帶情況，為陰性對照。Anti-Ku70C:對應(yīng)的泳道表示，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3及Par3180K表達質(zhì)粒的293T細胞裂解液用抗Ku70C抗體免疫沉淀，然后分別經(jīng)抗Par3抗體、抗Ku80抗體、抗Ku70抗體免疫印記檢測的條帶情況。上面的膠顯色條帶表示有Par3，中間的膠顯色條帶表示有Ku80，下面的膠顯色條帶表示有Ku70，三塊膠帶均顯色表示有Par3/Ku70/Ku80三元復(fù)合物。Anti-Ku80C:對應(yīng)的泳道表示，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3及Par3180K表達質(zhì)粒的293T細胞裂解液用抗Ku80C抗體免疫沉淀，然后分別經(jīng)抗Par3抗體、抗Ku80抗體、抗Ku70抗體免疫印記檢測的條帶情況。上面的膠顯色條帶表示有Par3，中間的膠顯色條帶表示有Ku80,下面的膠顯色條帶表示有Ku70，三塊膠帶均顯色表示有Par3/Ku70/Ku80三元復(fù)合物。Lysate:對應(yīng)的泳道表示，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3及Par3180K表達質(zhì)粒的293T細胞裂解液用抗Par3抗體免疫印記檢測的條帶情況，顯色條帶表示有Par3。Mr(K):分子量(千道爾頓)，對應(yīng)的200、97、66均為分子量。B.Par3與Ku70內(nèi)源性地結(jié)合。IP:免疫沉淀293Tcells:對應(yīng)的泳道表示，將293T細胞裂解液用免疫前血清NS或抗Par3的抗體(anti-Par3)免疫沉淀。然后用分別用抗Par-3，Ku70orKu80的抗體免疫印記檢測的條帶情況，顯色條帶從上至下分別表示含有Ku80、含有Ku70及含有Par3，三條條帶均顯色表示有Par3/Ku70/Ku80三元復(fù)合物。Helacells:對應(yīng)的泳道表示，將Hela細胞裂解液用免疫前血清NS或抗Par3的抗體(anti-Par3)免疫沉淀。然后用分別用抗Par-3,Ku70orKu80的抗體免疫印記檢測的條帶情況，顯色條帶從上至下分別表示含有Ku80、含有Ku70及含有Par3，三條條帶均顯色表示有Par3/Ku70/Ku80三元復(fù)合物。A431cells:對應(yīng)的泳道表示，將A431細胞裂解液用免疫前血清NS或抗Par3的抗體anti-Par3免疫沉淀。然后用分別用抗Par-3,Ku70orKu80的抗體免疫印記檢測的條帶情況，顯色條帶從上至下分別表示含有Ku80、含有Ku70及含有Par3，三條條帶均顯色表示有Par3/Ku70/Ku80三元復(fù)合物。IB:anti-Ku70/Ku80:免疫印記中用了抗Ku70和抗Ku80的單克隆抗體。IB:anti-Par3:免疫印記中用了抗Par3的單克隆抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，對應(yīng)的97、66、200均為分子量。C.Par3與Ku70內(nèi)源性地結(jié)合。將HeLa細胞裂解液用抗Ku70C端的抗體anti-Ku70C或免疫前血清NS免疫沉淀。然后用分別用抗Par-3，Ku70orKu80的抗體檢測的條帶情況。顯色條帶從上至下分別表示含有Par3、含有Ku80及含有Ku70，三條條帶均顯色表示有Par3/Ku70/Ku80三元復(fù)合物。IP:免疫沉淀IB:anti-Ku70/Ku80:免疫印記中用了抗Ku70和抗Ku80的單克隆抗體。IB:anti-Par3:免疫印記中用了抗Par3的單克隆抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，對應(yīng)的200、97、66均為分子量。圖4Ku70通過其N末端直接與Par3PDZ2和PDZ2—3之間的結(jié)構(gòu)域相互作用。A.Par3與Ku70作用位點位于PDZ2-3結(jié)構(gòu)域內(nèi)。293T細胞轉(zhuǎn)染了所示的Par3和Par3APDZ2-3表達質(zhì)粒。細胞裂解液用抗Ku70C的多抗進行免疫沉淀，再用抗Par3，Ku70或Ku80的抗體進行免疫印記分析。IP:anti-Ku70C:對應(yīng)的泳道表示，分別轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒PcDNA3、Par3表達質(zhì)粒及Par3APDZ2-3表達質(zhì)粒的293T細胞裂解液，用Ku70C的多抗進行免疫沉淀，再用抗Par3，Ku70或Ku80的抗體進行免疫印記檢測的條帶情況。上面膠塊顯色條帶表示含有Par3，下面膠塊顯色條帶表示含有Ku70或Ku80。兩塊膠塊均顯色表示含有Par3與Ku70或Ku80結(jié)合的復(fù)合物，只有一塊膠塊顯色表示沒有Par3與Ku70或Ku80結(jié)合的復(fù)合物。Lysate:對應(yīng)的泳道表示，分別轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒PcDNA3、Par3表達質(zhì)粒及Par3APDZ2-3表達質(zhì)粒的293T細胞裂解液，用抗Par3,Ku70或Ku80的抗體進行免疫印記檢測的條帶情況。顯色條帶表示含有Par3。IB:anti-Ku70/Ku80:免疫印記中用了抗Ku70和抗Ku80的單克隆抗體。IB:anti-Par3:免疫印記中用了抗Par3的單克隆抗體。B.Par3結(jié)構(gòu)域圖解，及GST融合蛋白中表達的區(qū)域。PDZ1:為Par3PDZ1結(jié)構(gòu)域。PDZ2:為Par3PDZ2結(jié)構(gòu)域。PDZ3:為Par3PDZ3結(jié)構(gòu)域。16:對應(yīng)的片段表示用GST融合蛋白表達的區(qū)域，右邊的數(shù)字表示片段在Par3中的氨基酸位置。C.Par3通過PDZ2結(jié)構(gòu)域及PDZ2-3連接處區(qū)域與Ku70相互作用。結(jié)合到谷光甘肽s印harose4B磁珠上的各種GST融合蛋白和A431細胞裂解液在4t:一起孵育。用抗Ku70或抗Ku80抗體進行免疫印記分析。16:同圖4BGST:表示沒有融合的GST蛋白。Lysate:表示沒有轉(zhuǎn)染的A431細胞裂解液。IB:anti-Ku70/Ku80:免疫印記中用了抗Ku70和抗Ku80的單克隆抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，對應(yīng)的97、66均為分子量。97橫向?qū)?yīng)的顯色條帶表示含有相應(yīng)泳道的融合蛋白與Ku80結(jié)合的復(fù)合物。66橫向?qū)?yīng)的顯色條帶表示含有相應(yīng)泳道的融合蛋白與Ku70結(jié)合的復(fù)合物。D.Ku70圖解，及GST融合蛋白中表達的區(qū)域VWA:為Ku70VWA結(jié)構(gòu)域。Ku80hetero-dimerizationregion:與Ku70形成二聚體的區(qū)域SAP:DNA結(jié)合區(qū)域Ku70N、KuCl、KuC2:對應(yīng)的片段表示用GST融合蛋白表達的區(qū)域，右邊的數(shù)字表示片段在Ku70中的氨基酸位置。(+):表示結(jié)合(-)表示不結(jié)合E.Par3PDZ2-3結(jié)構(gòu)域直接與Ku70N末端相互作用。純化的大約10ng組氨酸Par3PDZ2-3融合蛋白和結(jié)合于谷光甘肽磁珠上的不同結(jié)構(gòu)域的Ku70GST融合蛋白一起孵育。結(jié)合的組氨酸Par3PDZ2-3融合蛋白用抗組氨酸的抗體檢測，等量的純化的組氨酸Par3PDZ2-3融合蛋白用作陽性對照。His-PDZ2-3:對應(yīng)的泳道表示，將組氨酸Par3PDZ2-3融合蛋白分別和結(jié)合于谷光甘肽磁珠上的GST蛋白、及Ku70N、KuCl、KuC2的GST融合蛋白免疫沉淀。而后用抗組氨酸的抗體免疫印記檢測的條帶情況。顯色條帶表示含有Par3和相應(yīng)泳道的GST融合蛋白結(jié)合的復(fù)合物。I叩ut:為陽性對照，用等量的純化的組氨酸Par3PDZ2-3融合蛋白用抗組氨酸的抗體免疫印記檢測情況。IB:anti-His:免疫印記中用了抗組氨酸抗體。圖5Gamma射線或etoposide(ETO)上調(diào)Ku70和Par3結(jié)合A.Gamma射線增加Ku70和Par3的結(jié)合用Gamma射線照射A431細胞后恢復(fù)一定的時間，細胞裂解液用抗Par3抗體免疫沉淀后，用抗Ku70或抗Par3的抗體免疫印記檢測。IP:anti-Par3:表示經(jīng)射線照射后恢復(fù)一定時間的用抗Par3抗體免疫沉淀。Timepost-IR:(hour):射線照射后恢復(fù)時間(小時)，橫向?qū)?yīng)的數(shù)字表示恢復(fù)的時間。上面膠塊顯色條帶表示含有Ku70。下面膠塊顯色條帶表示含有Par3。同一泳道上下膠塊均顯色:表示含有Par3與Ku70結(jié)合的復(fù)合物，條帶的濃淡表示含量的多少。IB:anti-Ku70:免疫印記中用了抗Ku70的單克隆抗體。IB:anti-Par3:免疫印記中用了抗Par3抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，縱向?qū)?yīng)的66、200均為分子量。B.Ga咖a射線增加Ku70和Par3的結(jié)合用Gamma射線照射Hela細胞后恢復(fù)一定的時間，細胞裂解液用抗Par3抗體免疫沉淀后，用抗Ku70或抗Par3的抗體免疫印記檢測。IP:anti-Par3:表示經(jīng)射線照射后恢復(fù)一定時間的用抗Par3抗體免疫沉淀。Timepost-IR:(hour):射線照射后恢復(fù)時間(小時)，橫向?qū)?yīng)的數(shù)字表示恢復(fù)的時間。上面膠塊顯色條帶表示含有Par3。下面膠塊顯色條帶表示含有Ku70。同一泳道上下膠塊均顯色:表示含有Par3與Ku70結(jié)合的復(fù)合物，條帶的濃淡表示含量的多少。IB:anti-Ku70:免疫印記中用了抗Ku70的單克隆抗體。IB:anti-Par3:免疫印記中用了抗Par3抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，縱向?qū)?yīng)的66、200均為分子量。C.Gamma射線增加Ku70和Par3的結(jié)合。用Gamma射線照射CaCo2細胞后恢復(fù)一定的時間，細胞裂解液用抗Par3抗體免疫沉淀后，用抗Ku70或抗Par3的抗體免疫印記檢測。上面膠塊顯色條帶表示含有Ku70。下面膠塊顯色條帶表示含有Par3。同一泳道上下膠塊均顯色:表示含有Par3與Ku70結(jié)合的復(fù)合物，條帶的濃淡表示含量的多少。IP:anti-Par3:表示經(jīng)射線照射后恢復(fù)一定時間的用抗Par3抗體免疫沉淀。Timepost-IR:(hour):射線照射后恢復(fù)時間(小時)，橫向?qū)?yīng)的數(shù)字表示恢復(fù)的時間。IB:anti-Ku70:免疫印記中用了抗Ku70的單克隆抗體。IB:anti-Par3:免疫印記中用了抗Par3抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，縱向?qū)?yīng)的66、200均為分子量。D.ETO增加Ku70和Par3的結(jié)合。Caco2細胞被給以10ETO處理1小時然后用抗Par-3的抗體免疫沉淀然后用Ku70或Par-3的抗體進行免疫印記分析。IP:anti-Par3:表示經(jīng)射線照射后恢復(fù)一定時間的用抗Par3抗體免疫沉淀。ETO:用etoposide處理DMSO:二甲基亞砜，具有非常強的溶解能力和非凡的滲透能力一陰性對照，表示未經(jīng)任何處理。上面膠塊顯色條帶表示含有Ku70。下面膠塊顯色條帶表示含有Par3。同一泳道上下膠塊均顯色:表示含有Par3與Ku70結(jié)合的復(fù)合物，條帶的濃淡表示含量的多少。IB:anti-Ku70:免疫印記中用了抗Ku70的單克隆抗體。IB:anti-Par3:免疫印記中用了抗Par3抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，縱向?qū)?yīng)的66、200均為分子量。E.酪氨酸激酶沒有使Ku蛋白和Par3的相互作用。EGFR高表達的A431細胞被用EGF配體或POV刺激10分鐘被裂解并用抗Par-3的抗體進行免疫沉淀然后用抗Ku70或抗Par-3的抗體進行免疫印記分析。POV:PervanadateEGF:表皮生長因子配體NS:為免疫前血清IP:免疫沉淀Stimuli:剌激物IB:anti-Ku70:免疫印記中用了抗Ku70的單克隆抗體。IB:anti-Par3:免疫印記中用了抗Par3抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，縱向?qū)?yīng)的66、200均為分子量。上面膠塊顯色條帶表示含有Ku70。下面膠塊顯色條帶表示含有Par3。同一泳道上下膠塊均顯色:表示含有Par3與Ku70結(jié)合的復(fù)合物，條帶的濃淡表示含量的多少。圖6Par3定位于細胞膜和細胞核內(nèi)。A.Par3180KC端(Par3-LCT)多克隆抗體(anti-par3或anti-LCT)的特異性。MDCK細胞處理后，用純化的抗Par3的多抗進行免疫染色，圖像通過激光共聚焦顯微鏡拍攝的。DAPI:6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚，是一種常用的熒光染料，當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時，最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nra，其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。NS-(nonimmuneserum，免疫前血清)anti-Par3:抗Par3的多抗anti-Par3+GST-LCT:抗Par3的多抗+GST-LCT抗原a:Par3蛋白在MDCK細胞中的定位b:Par3蛋白在HeLa細胞中的定位c:Par3蛋白中潛在的4段核定位信號。B.Hela細胞中于Par3定位于膜上和核內(nèi)。DAPI:6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚NS-(nonimmuneser跳免疫前血清)anti-Par3:抗Par3的多抗anti-Par3+GST-LCT:抗Par3的多抗+GST-LCT抗原d:過表達帶GFP標(biāo)記的野生型Par3180K，Par3150K和Par3C端在MDCK細胞中的定位。e:過表達帶GFP標(biāo)記的野生型Par3180K，Par3150K和Par3C端在HeLa細胞中的定位。f:過表達帶VSV標(biāo)記的野生型Par3180K，Par3150K和Par3C端在MDCK細胞中的定位。C.人源和鼠源Par3的4個核定位信號(NLS)比對。通過PS0RT程序鑒別出來潛在Par-3的4個核定位信號。在紅色和黃色框中所示的2個核定位信號是有兩個堿性氨基酸，10個氨基酸間隔，另外一段是5個氨基酸中有三個堿性氨基酸構(gòu)成；例如爪蟾(Xenopus)的蛋白Nucleoplasmin。而陰影處所示的是4個氨基酸中有3個堿性氨基酸(精氨酸或賴氨酸)和脯氨酸或組氨酸；例如SV40的T抗原。D.外源性Par3腿、Par3150K和Par3HXT的MDCK細胞中的定位。anti-Par3:抗Par3的多抗DAPI:6-聯(lián)脒-2-苯基B引哚Par3150K:轉(zhuǎn)染了表達Par3150K的細胞Par3LCT:轉(zhuǎn)染了表達Par3LCT的細胞anti-lXT:抗IXT抗體sPar3-pEGFPCl:Par3150K的蛋白，裝在pEGFPCl質(zhì)粒上。E.F外源性Par3180K、Par3150K和Par3-LCT的Hela細胞中的定位。HeLa細胞被轉(zhuǎn)染了表達質(zhì)粒并在激光共聚焦顯微鏡下觀察它們的定位。Par3180K:轉(zhuǎn)染了表達Par3180K的細胞Par3150K:轉(zhuǎn)染了表達Par3150K的細胞Par3LCT:轉(zhuǎn)染了表達Par3LCT的細胞anti-VSV:抗VSV抗體anti-LCT:抗Par3C端的抗體圖7DNADSBs損傷導(dǎo)致Par3和Ku70共定位增加。A.B.C經(jīng)ETO或粒子射線照射后細胞中Par3和Ku70共定位。HeLa細胞在經(jīng)過10Gy劑量的伽馬射線照射或未經(jīng)處理后，用抗Par-3(綠色)或抗Ku70(紅色)的抗體進行免疫染色，DAPI染色用來觀察細胞。D.E.F.G經(jīng)ETO或粒子射線照射后細胞中Par3和YH2AX部分共定位。HeLa細胞在經(jīng)過10Gy劑量的伽馬射線照射或未經(jīng)處理后，用抗Par-3(綠色)或抗廣H2AX(紅色)的抗體進行免疫染色，DAPI染色用來觀察細胞。Scarebar(標(biāo)尺)10pm。Par3:縱向?qū)?yīng)的照片為用抗Par3抗體免疫染色的照片Ku70:縱向?qū)?yīng)的照片為用抗Ku70抗體免疫染色的照片廣H2AX:縱向?qū)?yīng)的照片為用抗廣H2AX抗體免疫染色的照片Merge:縱向?qū)?yīng)的照片為前兩張照片拼合的照片DAPI:6-聯(lián)脒-2-苯基B引哚Control:橫向?qū)?yīng)的照片為對照ETO:橫向?qū)?yīng)的照片為經(jīng)ETO處理的細胞照片IR:橫向?qū)?yīng)的照片為經(jīng)射線照射處理的細胞照片圖8體內(nèi)Par3,Ku70,Ku80和DNA-PKcs形成復(fù)合物A.IR導(dǎo)致Par3,Ku70，Ku80和DNA-PKcs在體內(nèi)形成了一個復(fù)合體。HeLa細胞在被照射lOGy或未被照射后恢復(fù)一定的時間，裂解然后用抗Par-3的抗體免疫共沉淀，而后免疫印記檢測。IP:anti-Par3:用抗Par3抗體免疫沉淀Timepost-IR:(hour):射線照射后恢復(fù)時間(小時)，橫向?qū)?yīng)的數(shù)字表示恢復(fù)的時間。IB:anti-Ku70:免疫印記中用了抗Ku70的單克隆抗體。IB:anti-Par3:免疫印記中用了抗Par3抗體。IB:anti-DNA-PKcs:免疫印記中用了抗DNA-PKcs抗體。Mr(K):分子量(千道爾頓)，對應(yīng)的200、66均為分子量。上面膠塊顯色條帶表示含有DNA-PKcs。中間膠塊顯色條帶表示含有Ku70。下面膠塊顯色條帶表示含有Par3。同一泳道三塊膠塊均顯色:表示含有Par3/Ku70/DNA-PKcs復(fù)合物，條帶的濃淡表示含量的多少。B.分別表達Par3野生型、Par3AB23和Ku70的Hela細胞經(jīng)射線照射后，細胞中DNA-PK活性。HeLa細胞在被照射10Gy或未被照射后培養(yǎng)2小時，制備全細胞抽提物分然后用用圖示的抗體進行免疫印記分析?？v座標(biāo)表示DNA-PK活性相對值。C.分別表達Par3野生型、Par3AB23和Ku70的Hela細胞經(jīng)射線照射后，細胞中，DNA-PKcs活性。HeLa細胞在被照射10Gy或未被照射后培養(yǎng)2小時，制備全細胞抽提物然后進行免疫印記分析。一對應(yīng)的泳道為陰性對照，為未經(jīng)射線照射。IB:anti-pT2609:免疫印記中用了抗pT2609抗體。IB:anti-DNA-PKcs:免疫印記中用了抗DNA-PKcs抗體。PcDNA3:表示轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒PcDNA3的細胞。上面膠塊顯色條帶表示含有磷酸化的T2609。下面膠塊顯色條帶表示含有DNA-PKcs。具體實施例方式在本發(fā)明中，術(shù)語"分裂缺陷蛋白3"、"Par3"可互換使用，均指具有Par3活性的SEQIDNO:l序列的蛋白。該術(shù)語還包括具有與Par3蛋白相同功能的、SEQIDNO:l序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為150個，較佳的1~30個，更佳的120個，最佳的1~10個)氨基酸的缺失、插入和、或取代，以及在C末端和、或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為IO個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似地氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能，這些保守性變異蛋白最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。又比如，在C末端和、或N末端添加一個和數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括Par3的活性片段和活性衍生物。)換個角度說該蛋白的變異形式還可以包括(但不限于)同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然變異體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與Par3的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗Par3蛋白的抗血清獲得的蛋白。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表l本發(fā)明的Par3可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生，根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的蛋白還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還提供了其他蛋白，如包含Par3或其片段的融合蛋白。較佳的是與信號肽序列或在成熟蛋白N端有特異性斷裂位點的其它蛋白融合表達。通常，該信號肽編碼序列可以是載體的一個組件，或者它可以是插入載體的蛋白DNA的一部分。該信號肽的功能是引導(dǎo)表達產(chǎn)物以活性的形式轉(zhuǎn)移(分泌)到基質(zhì)中，以便以后的純化并避免復(fù)性過程。本發(fā)明還提供了Par3的修飾形式，這些修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括(但不限于)體內(nèi)或體外的蛋白的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的蛋白。這種修飾可以通過將蛋白暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白。本發(fā)明的Par3還可用于制備促進DNA損傷的修復(fù)的制劑，可將Par3配置于常規(guī)無毒的，惰性的載體或賦形劑中，這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。本發(fā)明蛋白在用于制備增強抗癌藥物敏感度的藥物時，可將安全有效量的Par3配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑中，這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。例如每天約1微克/千克體重一約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的蛋白還可與其他治療劑一起使用。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如S柳brook等人，分子克隆試驗手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置，未注明來源的產(chǎn)品均可通過市場途徑獲得。Par3的表達方法己由文獻(Lin,D.,Edwards,A.S.,Fawcett,J.P.，Mbamalu,G.,Scott,J.D.，andPawson，T.(2000).AmammalianPAR-3-PAR-6compleximplicatedinCdc42/RaclandaPKCsignallingandcellpolarity.NatCellBiol么540-547.)完全公開，在此不再詳述。實施例1鑒定Ku70/80為Par3的結(jié)合蛋白(1)構(gòu)建表達包含Par3TOZ2-3的GST融合蛋白人Par3PDZ2-3基因開放讀碼框從人肝癌細胞CDNA文庫中擴增獲得，表達Par3氨基酸為426695位氨基酸，用于擴增的引物序列為5'CGGGATCCCACCCCTCGGGAAAACCA3'(SEQIDN0:2)和5，CGGAATTCGCTCCCAGGTGACTTCAG3'(SEQIDN0:3)(上海生工)。產(chǎn)物經(jīng)BaraHl和EcoRI雙酶(NEB公司)切后克隆至表達載體PGEX—5T—l(AmershamPharmaciaBiotech),經(jīng)測序(博亞公司)確認。將重組質(zhì)粒熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(Invitrogen公司)，涂板，選擇陽性克隆的大腸桿菌BL21接種于LB培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素50ug/ml),37'C振蕩過夜，1:100稀釋到LB培養(yǎng)基，在37。C培養(yǎng)至0D600約0.6-0.8，經(jīng)lmM異丙基硫代一e—D—半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)(分子克隆實驗指南,第三版)。細胞釆用超聲裂解，-20。C保存。采用谷光甘肽S印harose4B(PharmaciaBiotech)純化蛋白(按說明書操作)，經(jīng)測序(博亞公司)證實表達正確。(2)蛋白結(jié)合試驗用lml細胞裂解液(50mMHEPESpH7.5,1%TritonX-100,150mMNaC1,lmMNaF，100umo1PMSF(苯甲基磺酰氟，不可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑，可抑制羧肽酶Y，糜蛋白酶,FactorXa,木瓜蛋白酶，纖溶酶，蛋白酶K，枯草桿菌蛋白酶)和cocktailfromSigma(—種蛋白酶抑制劑混合液))裂解密度95%的10咖dish(Corning公司)的不同細胞系(A431細胞、293T細胞和Hela細胞)，細胞裂解產(chǎn)物與結(jié)合于Glutathione4Bbeads的3ugPar3PDZ2-3GST融合蛋白進行體外結(jié)合反應(yīng)，用HNTG(20mMHEPESpH7.5,150mMNaCl,0.l%Trition-X-100,10%Glycerol)洗磁珠三次后，SDS樣品緩沖液(0.0625%Tris-ClpH6.8,2%SDS，10%Glycerol,0.003%Bromphenolblue，5%p-mercaptoethanol)洗提磁珠上蛋白，SDS-PAGE(分子克隆實驗指南，第三版)后考馬斯(Coomassie)藍染色分析，發(fā)現(xiàn)分子量位于70kDa和80kDa的兩個蛋白，切下目標(biāo)蛋白帶，用LC_MS/MS(液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀)分析6個肽段與Ku70—致，7個肽段與Ku80一致。(圖IB和C)。實施例2Ku70和Ku80在體外及體內(nèi)與Par3發(fā)生特異性的相互作用于含10%胎牛血清(Gibico)DMEM(Gibico)中培養(yǎng)的A431細胞(ATCC)和于含10X胎牛血清MEM(Gibico)中培養(yǎng)的Hela細胞(ATCC)的裂解產(chǎn)物分別與結(jié)合在谷胱甘肽磁珠上的Par3PDZ2-3的GST融合蛋白進行體外結(jié)合反應(yīng)(方法同實施例1)，SDS-PAGE后，用抗Ku70和Ku80單克隆抗體(SantaCruz公司)通過免疫印記(方法同分子克隆實驗指南，第三版，Schleicher&SchuellBioscience硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜購自德國Dassel公司，羊抗鼠二抗Bio-Rad公司，ECL化學(xué)發(fā)光劑購自Pierce公司)檢測蛋白，A431細胞和Hela細胞部分裂解產(chǎn)物被用作對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ku70和Ku80體外結(jié)合于Par3PDZ2-3結(jié)構(gòu)域，如圖2A。構(gòu)建表達空載體、Ku70和Ku80的真核表達質(zhì)粒人Ku70和Ku80基因開放讀碼框分別從人肝癌CDNA文庫中擴增獲得，用于擴增的2對引物序列分別為5，-CGGATCCAGCCAACATGTCAGGGTGGGAG-3'(SEQIDN0:4)和5,-CGGGGCCCGTCCTGGAAGTGCTTGGTGAGGG-3，(SEQIDNO:5),5'-CGGAATTCATGGTGCGGTCGGGGAATMGG-3'(SEQIDNO:6)和5，-GCTCTAGATATCATGTCCAATAAATCGTCCACATC-3'(SEQINN0:7)(上海生工公司)，產(chǎn)物分別經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶(NEB公司)切后分別克隆至真核表達載體pcDNA3-VSV(Invitrogen公司)，經(jīng)測序(博亞公司)確認。293T細胞在含10%馬血清(Gibico公司)MEM中培養(yǎng)，使用磷酸鈣法用以上構(gòu)建載體分別以及共同瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，細胞裂解產(chǎn)物分別與結(jié)合在谷胱甘肽磁珠上的Par3PDZ2-3的GST融合蛋白體外結(jié)合反應(yīng)(方法同實施例1)，用抗VSV抗體(SantaCruz公司)，通過免疫印記檢測表達蛋白。轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞部分裂解產(chǎn)物被用作對照(圖2B)。表達不同PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白的各類GST融合蛋白制備Par3GST-PDZ1(Par3PDZ1結(jié)構(gòu)域GST融合表達的區(qū)域)(表達Par3的251385位氨基酸)，Z0-1GST-PDZ1(Z0-1PDZ1結(jié)構(gòu)域GST融合表達區(qū)域)(表達Par3的1111位氨基酸)，PTPBASGST-PDZ2-3(PTPBASPDZ2-3結(jié)構(gòu)域GST融合表達區(qū)域)(表達Par3的13271612位氨基酸)構(gòu)建。以上基因分別從人肝癌CDNA文庫中擴增獲得，對應(yīng)的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>分別克隆于pGEX2T(AmershamPharmaciaBiotech公司)、pGEX-5X-l和pGEX2T(Amersh柳PharmaciaBiotech公司)表達載體，測序確認，表達純化同實施例1，經(jīng)測序確認表達正確。A431細胞裂解物與3ug各類GST融合蛋白體外結(jié)合反應(yīng)，用抗Ku70和抗Ku80單克隆抗體，通過免疫印記檢測通過與融合蛋白結(jié)合而獲得的Ku70和Ku80(方法同實施例1)。內(nèi)源性Ku70和Ku80僅和PDZ2-3ofPar3發(fā)生了特異性地結(jié)合沉淀反應(yīng)(圖2D)。這些結(jié)果暗示Ku70和Ku80特異性地與Par3PDZ2-3結(jié)合。人Par3180K基因從人肝癌cDNA文庫中擴增獲得，用于擴增引物序列為5'端引物5'-CCCAAGCTTCGGCGGCATGAAAGTGAC-3'(SEQIDN0:14)和Par-3180K(3，端引物):5'-GGAATAGAAGGGCCTCCCTTTCTC-3，(SEQIDNO:15),產(chǎn)物分別經(jīng)EcoRI和BamHI(NEB公司)切后克隆至真核表達載體pcDNA3VSV，經(jīng)測序(博亞公司)確認。用以上質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞(培養(yǎng)方法同上，轉(zhuǎn)染方法同前所述)。用lml細胞裂解液(50mMHEPESpH7.5，1%TritonX-100,150mMNaCl，0.5%deoxycholaticsodium,ImMNaFandCocktail(Sigma))裂解密度95%的lOmmdish的293T轉(zhuǎn)染細胞，細胞裂解產(chǎn)物與同A蛋白磁珠(ProteinAbeads)(PharmaciaBiotech)結(jié)合的抗Ku70(SantaCruz)或Ku80多克隆抗體(SantaCruz)進行于4。C過夜IP反應(yīng)沉淀Ku70和Ku80，用HNTG(同前)洗磁珠三次后，SDS—PAGE后，用抗Par3多克隆抗體(Upstate)、抗Ku70/Ku80單克隆抗體，免疫印記檢測通過與Ku70和Ku80蛋白結(jié)合而獲得的Par3180K(方法同實施例1)。發(fā)現(xiàn)外源性表達的Par3180K均能通過Ku70/80復(fù)合物被免疫沉淀反應(yīng)獲得(圖3A)，暗示Par3的過表達能形成Par3/Ku70/Ku80三元復(fù)合物。用抗Par3TOZ2-3多克隆抗體于293T、Hela和A431細胞裂解物中免疫沉淀(IP)Par3(方法同實施例l)，用抗Par3多克隆抗體、抗Ku70/Ku80單克隆抗體，免疫印記檢測通過與Par3蛋白結(jié)合而獲得的Ku70和Ku80(方法同實施例l)(圖3B)，反之用抗Ku70C多克隆抗體于Hela細胞中免疫沉淀Par3，用抗Par3多克隆抗體、抗Ku70/Ku80單克隆抗體，免疫印記檢測通過與Ku70蛋白結(jié)合而獲得的Par3和Ku80(圖3C)。實施例3Par3PDZ2和PDZ3之間區(qū)域的片斷與Ku70N端結(jié)合構(gòu)建表達Par3APDZ2-3的真核表達質(zhì)?；蜷_放讀碼框從人肝癌CDNA文庫中擴增獲得，用于擴增的引物序列為5'端引物5，-CCCAAGCTTCGGCGGCATGAAAGTGAC-3，(SEQIDNO:16)，Par-3(5，端引物)5，-CGGGATCCCACCCCTCGGGAAAACCA-3'(SEQIDNO:17)，Par-3(3，端引物)5'-GCGAATTCGTCAGGGCTAAAACGGCT-3'(SEQIDNO:18)，Par_3180K(3,端引物)5，-GGAATAGAAGGGCCTCCCTTTCTC-3，(SEQIDNO:19)，產(chǎn)物分別經(jīng)HindIII，EcoRI和Xbal雙酶(NEB公司)切后克隆至真核表達載體pcDNA3VSV，經(jīng)測序(博亞公司)確認。轉(zhuǎn)染293T細胞方法同實施例2。分別轉(zhuǎn)染pcDNA3VSV一Par3APDZ2-3和pcDNA3VSV—Par3K180(實施例2制備)的293T細胞裂解產(chǎn)物分別與抗Ku70C多克隆抗體進行IP反應(yīng)沉淀Ku70和Ku80，用抗Par3多克隆抗體、抗Ku70/Ku80單克隆抗體，免疫印記檢測Ku70和Ku80蛋白和表達產(chǎn)物結(jié)合情況(方法同實施例1)(圖4A)，沒有PDZ2-3結(jié)構(gòu)域的Par3不能與Ku70結(jié)合，暗示Par3上與Ku70作用位點位于PDZ2-3結(jié)構(gòu)域內(nèi)。表達含不同結(jié)構(gòu)域的Par3蛋白的GST融合蛋白制備編號16，1為表達Par3的425-549位氨基酸的GST融合蛋白，2為表達Par3的577~694位氨基酸的GST融合蛋白，3為表達Par3的425-595位氨基酸的GST融合蛋白，4為表達Par3的531-595位氨基酸的GST融合蛋白，5為表達Par3的531~694位氨基酸的GST融合蛋白，6為表達Par3的425694位氨基酸的GST融合蛋白(圖4B)，以上基因分別從人肝癌CDNA文庫中擴增獲得，引物關(guān)系如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>產(chǎn)物分別經(jīng)EcoRI和BamHI(NEB公司)切后克隆于pGEX2T，表達純化同實施例1。A431細胞裂解產(chǎn)物分別與結(jié)合于S印haroseAbeads表達不同Par3結(jié)構(gòu)域的3ug純化的GST融合蛋白混合反應(yīng)，SDS-PAGE，用抗Ku70和Ku80單克隆抗體通過免疫印記檢測與之結(jié)合的Par3結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖4C所示，包含PDZ2片斷和連接PDZ2和PDZ3之間區(qū)域的片斷的融合蛋白能特異性的與Ku70和Ku80結(jié)合，連接PDZ2和PDZ3之間區(qū)域的片斷本身也能與Ku70和Ku80發(fā)生一定程度的結(jié)合，但僅Par3PDZ2或者Par3PDZ3結(jié)構(gòu)域片斷沒有與Ku70結(jié)合，暗示連接PDZ2和TOZ3之間區(qū)域的片斷調(diào)節(jié)Par3與Ku70的結(jié)合，PDZ2結(jié)構(gòu)域的存在似乎能促進這種結(jié)合，然而PDZ3結(jié)構(gòu)域的存在似乎能阻止這種結(jié)合。表達含不同結(jié)構(gòu)域的Ku70蛋白的GST融合蛋白制備Ku70N(表達Ku70的1-273位氨基酸的GST融合蛋白)、Ku70Cl(表達Ku70的260~609位氨基酸的GST融合蛋白)和Ku70C2(表達Ku70的400~609位氨基酸的GST融合蛋白)，Ku80N(Ku80的N端)，Ku80C(Ku80的C端)(圖4D),以上基因分別從人肝癌CDNA文庫中擴增獲得，對應(yīng)的引物如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHI和EcoRI酶切后克隆于pGEX_5X-l表達載體，表達純化同實施例l。表達純化組氨酸Par3PDZ2-3融合蛋白基因從人肝癌CDNA文庫中擴增獲得，引物同PDZ2-3酶切位點均為EcoRI，克隆于pET-犯-His(Novagen公司)表達載體，表達同實施伊J1，用TALONMetalAffinityResin(Clontech公司)純化(分子克隆實驗指南,第三版)。純化的組氨酸Par3PDZ2-3融合蛋白、SepharoseAbeads分別和三種GSTKu70融合蛋白體外結(jié)合反應(yīng)(同實施例1)，產(chǎn)物SDS-PAGE后，用抗組氨酸抗體(SantaCruz公司)通過免疫印記檢測被結(jié)合的His-PDZ2-3融合蛋白的量，并與作為陽性對照的同樣量的His-PDZ2-3融合蛋白作比較。結(jié)果如圖4e所示，獲得了包含1273氨基酸的N-端片斷的Ku70N融合蛋白，但沒有獲得GST、C-端Ku70融合蛋白(l116氨基酸)和(400609氨基酸)，證明了Par3PDZ2-3結(jié)構(gòu)域直接且選擇性的結(jié)合于Ku70N端VWA結(jié)構(gòu)域(VonWillebrandFactorA結(jié)構(gòu)域)。實施例4Gamma射線損傷或DNA損傷因子etoposide促進Ku蛋白和Par3的結(jié)合95%細胞密度的A431細胞(如圖5A)或CaCo2細胞(如圖5C)經(jīng)10GyGamma射線(包含一個137Cs的Ga隱acell-40發(fā)射器(Nurdion)作為離子放射源(ChanDW,etal.AutophosphorylationoftheDNA-dependentproteinkinasecatalyticsubunitisrequiredforrejoiningofDNAdouble-strandbreaks.GenesDev,2002,16:2333-2338)照射，于37"C濕盒內(nèi)分別恢復(fù)0.5小時、2小時、4小時后收集細胞，用抗Par3的抗體免疫沉淀(IP)細胞裂解產(chǎn)物(方法同實施例1)，用anti-Ku70單克隆抗體或抗Par3多克隆抗體通過免疫印記分析，發(fā)現(xiàn)由于Gamma射線照射，細胞中與Par3—起沉淀下來的Ku70的量增加了(圖5A和C)。反之，Hela細胞經(jīng)10GyGamma射線照射，恢復(fù)一定時間后收集細胞，用抗Ku70C(SantaCruz)的抗體免疫沉淀(IP)細胞裂解產(chǎn)物(方法同實施例1)，用anti-Ku70單克隆抗體或anti-Par3多克隆抗體通過免疫印記分析,得到同樣的發(fā)現(xiàn)(圖5b)。于DMEM中加入Etoposide至終濃度為100pg/ml處理滿盤CaCo2細胞1小時，另一盤加入DMS0處理細胞作為陰性對照，PBS洗細胞2次后，DMEM培養(yǎng)細胞8小時，用抗Par3抗體免疫沉淀細胞裂解產(chǎn)物，用抗Ku70和抗Par3抗體通過免疫印記分析，擬輻射劑etoposide，加強了Ku蛋白和Par3的相互作用(圖5D)。所有數(shù)據(jù)提示DNA損傷過程促進了Ku蛋白和Par3的相互作用。發(fā)明人用EGF配體或Pervanadate(—種酪氨酸磷酸化酶抑制劑)刺激A431細胞10分鐘，細胞裂解物與抗Par3抗體免疫沉淀反應(yīng)，沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)合的Ku70的增加(圖5E)，結(jié)果排除了酪氨酸激酶調(diào)節(jié)Ku蛋白和Par3的相互作用的可能性。實施例5Par3在hela細胞中定位于細胞膜和細胞核內(nèi)于載玻片(FisherBand)上培養(yǎng)MDCK細胞(于含10%胎牛血清MEM中培養(yǎng))或Hela細胞，用冰PBS洗玻片，用-20°C甲醇固定細胞3分鐘。室溫下用含1%BSA的TBST封閉細胞1小時，用抗Par3多抗(叩state)(—抗)于含1%BSA的TBST中37。C孵育1小時，用冰PBS洗玻片后，用FITC/Cy2—羊抗兔(二抗)(JaksonI謹unoResearchLaboratories)于含1%BSA的TBST中37。C孵育1小時，用PE腿FUJ0Raqueousmountingmedium(Immunotech公司)封片，共聚焦顯微鏡(Leica)或熒光顯微鏡(Nikon)觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MDCK細胞中Par3的熒光信號，當(dāng)用GTS-Par3-LCT抗原阻斷抗Par3-LCT多抗后，此熒光信號消失，證明抗Par3-LCT多抗可用于免疫熒光染色中(圖6Aac)。用anti-LCT(anti-par3)免疫熒光染色Hela細胞(方法同前)，發(fā)現(xiàn)于膜上和核內(nèi)Par3清晰的熒光信號(圖6Bd和e),信號能被針對anti-LCT(anti-par3)的抗原(GST-LCT)阻斷(圖6Bf)，因此，相信Par3存在于核內(nèi)。正如預(yù)期的，用PS0RT軟件發(fā)現(xiàn)Par3中的4個核定位信號(NLS),Par3180K有4個NLS,而Par3150K只有2個NLS(圖6C)。將Par3一150K(5，端引物CCCAAGCTTCGGCGGCATGAAAGTGAC(SEQIDN0:42)，'端引物GCTCTAGATCTCTTCTCGGGCTTCAG(SEQIDNO:43)，從人肝癌cDNA文庫中克隆出，酶切位點是HindIII和Xbal)擴增獲得后構(gòu)建于pEGFPCl上形成真核表達質(zhì)粒sPar3-pEGFPCl。將Par3-LCT(從Par3180K質(zhì)粒上擴增，5'端引物GGGAAGCTTGGATGAATGGAAACCAAG(SEQIDN0:44)，3'端引物CCGGAATTCTCAGGAATAGAAGGGCCTC(SEQIDN0:45)擴增獲得后構(gòu)建于pcDNA3VSV上形成真核表達質(zhì)粒pcDNA3VSV—Par3-LCT。將sPar3-pEGFPCl、pcDNA3VSV一Par3-LCT和pcDNA3VSV—Par3180K(實施例2制備)分別轉(zhuǎn)染MDCK細胞(圖6E)或Hela細胞(圖6F)。用試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)按說明書轉(zhuǎn)染細胞。除表達sPar3-pEGFPCl的細胞外，其余細胞分別用anti-par3(或anti-LCT)或抗VSV抗體為一抗，免疫熒光染色固定細胞，后觀察。表達sPar3-pEGFPCl的細胞直接于共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡觀察綠色熒光。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)Par3180K大部分定位于胞漿，小部分定位于核內(nèi)(圖6D-g;39%，n-56個細胞)，然而Par3150K幾乎完全定位于胞漿內(nèi)(圖6-h;94%,n=35個細胞)，45kDaPar3-LCT完全定位于核內(nèi)(圖6D-i)。用anti-LCT(圖6E)或anti-VSV抗體(圖6F)免疫熒光染色分別表達Par3180K、Par3150K和Par3-LCT的Hela細胞，發(fā)現(xiàn)同樣的現(xiàn)象。因此，相信Par3進入核內(nèi)了。實施例6DNADSBs損傷導(dǎo)致Par3和Ku70共定位增加Hela細胞經(jīng)ETO或粒子射線照射處理(方法同實施例4)，細胞恢復(fù)2小時候，固定細胞，用抗Par3抗體和抗Ku70抗體免疫熒光染色(方法同實施例5)，共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)處理過的細胞中Par3和Ku70核中共定位較對照細胞(未經(jīng)過以上處理)明顯增加，未經(jīng)過處理細胞中僅有極少量共定位(圖7A、B、C)，結(jié)果暗示DNADSBs損傷調(diào)節(jié)了Par3核內(nèi)定位。Hela細胞經(jīng)ETO或粒子射線照射(IR)處理，細胞恢復(fù)2小時候，固定細胞，用抗Par3抗體和抗yH2AX抗體(upstate,抗S139有磷酸化修飾的組蛋白X)免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)處理過細胞中DSBs誘導(dǎo)集落的形成，并存在Par3和yH2AX部分共定位，而在對照細胞中共定位極少(圖7E、F、G)。實施例7DNA-PKcs也被招募到Par3/Ku70/Ku80復(fù)合物上A431細胞經(jīng)10Gy射線照射后，使其恢復(fù)0.5、2、4、8小時后，與抗Par3多克隆抗體免疫沉淀(IP)細胞裂解產(chǎn)物，用DNA-PKcs單克隆抗體(SantaCruz,USA)和抗Ku70抗體于此沉淀復(fù)合物中通過免疫印記檢測DNA-PKcs和Ku70(圖8A)，結(jié)果暗示Par3,Ku70,和DNA-PKcs在體內(nèi)形成了一個復(fù)合體。實施例8Par3促進了DNA損傷的修復(fù)。構(gòu)建缺乏PDZ2和PDZ3之間結(jié)構(gòu)域的Par3180K(簡稱Par3AB23)于真核表達質(zhì)粒pCDNA3VSV(實施例3制備)，轉(zhuǎn)染Hela細胞。分別轉(zhuǎn)染Par3AB23、Par3180K和Ku70的Hela細胞，經(jīng)10Gy射線照射后，使其恢復(fù)2小時后(如圖8C)，細胞裂解產(chǎn)物同抗PT2609抗體(這是針對DNA-PKcsThr2609位發(fā)生磷酸化的抗體，抗體來自Rockland)和DNA-PKcs單克隆抗體免疫印記反應(yīng)，與對照細胞株相比，經(jīng)射線照射后，在表達Par3野生型的細胞中，Thr2609磷酸化程度明顯增強了，然而在表達Par3突變體的細胞中，Thr2609磷酸化程度只是輕微增強(圖8C)。所以，結(jié)果顯示Par3可能通過影響DNA-PK活性從而參與IR后的DNA修復(fù)。以上細胞轉(zhuǎn)染24小時后細胞提取物被準(zhǔn)備用來進行激酶活力檢測，使用SignaTECTDNA-D印endentProteinKinaseAssaySystem(Promega,USA)按說明書操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)照射后，與未轉(zhuǎn)入表達Par3質(zhì)粒的細胞相比，表達Par3WT的細胞中DNA-PK活性顯著提高了，而表達變異Par3(Par3AB23)的細胞中活性顯著降低了(圖8B)。序列表<110〉中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院〈120〉分裂缺陷蛋白3的用途〈130>PCNSM060396<160>45〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211〉1353<212>PRT〈213>Homosapiens〈400〉1MetLysValThrValCysPheGlyArgThrArgValValValProCys151015GlyAspGlyHisMetLysValPheSerLeulieGinGinAlaValThr202530ArgTyrArgLysAlalieAlaLysAspProAsnTyrTrplieGinVal354045HisArgLeuGluHisGlyAspGlyGlylieLeuAspLeuAspAsplie505560LeuCysAspValAlaAspAspLysAspArgLeuValAlaValPheAsp65707580GluGinAspProHisHisGlyGlyAspGlyThrSerAlaSerSerThr859095GlyThrGinSerProGluliePheGlySerGluLeuGlyThrAsnAsn100105110ValSerAlaPheGinProTyrGinAlaThrSerGlulieGluValThr115120125ProSerValLeuArgAlaAsnMetProLeuHisValArgArgSerSer130135140Asp145SerAlaArgTrpSer225AspAspLysValArg305AsnPhelieLeuAsp385ThrSerProSerGlyLysSer210HisGlyThrLeuAlaLeulieGlyLeuSerThrSerValSer150155GluProSerArgLysAsnProThrAspGluTrpSer370SerValHisGluPheLys195AsnProThrGlyVal275PheLeu180AspGinMetGluLeu260GluCysGinPhe355GinGinGinSerLyslieAla340HisSerTyrArgArg420Pro165LysGluPheValPro290LeuGluLysGlyAla405LeuGinAsnGinArgAsnTyrArg215LysLysThrArg200AspGlu245GluHislieProValProAsnProSerAlaArgGly310ArgGly295LyslieAsp280GlyAlaAsnVal325GinHisMetPheValValProGlulieLysAsp390ProProAsn375AsnArgHisAla360AsnArgLeuSerAsnAla185SerAsnLeuGlyLysTrp230AspAsnSerArgAsn265GlyArgGluAspArg345AlaTyrSerAsnAla425Pro170GlyLeuAlaGluVal250PheGlyThrHisGly330GinAsnTyrValHis410HisSerProArgLys235GluProLeuGlu315AspAlaLysSerAsn395ProProArgProArgSer220GinAspTrpLysAsp205SerGluValSerLeuAspLeuGly300AsnLeuMetGluSer380SerProSerSerSerThr190ThrLeuGinProValGlyAsp270lieGly285LeuLeuArgArgGin365ArgAlaGluGlyLeuPheAsnThr350TyrPheGlyGinLys430AsnThr175CysSerSerAspHis255MetHisValArgArg335ProGluSerLeulie415ProPhe160ThrAspAsnAlaGlu240AlaValValLysGlu320ArglieGinProHis400AspProSerSerLys465ThrGlyGluSerPhe545SerValLeuArglie625GinAlaProAlaGly450LysAlaValLeu530ArgGinLeuAsnSer610AsnLeuPro435TyrGlyGlyAlaAsn515LeuThr705Leu690AlaMetThrAsp595LysGlylieAspAlaMetArgGluGlyMet675LysAsnThrlieGlyGlylie500GlySerThrGluSer485GinValSerArgGinGluAspGinLeuPro580SerGluGlyAlaGlu660lieSerAsplie565AspGlyAsnAlaVal645ThrGinProAspAlaLysGly470AlaAspAspThrAla550ProGlySerHisAla630AsnLeuLeuGlyArg710ProLys455LeuProGlyLeuLys535PheLysThrAlaAla615SerGlyArglieSer695GluGin440lieGlylieArgVal520MetHisGluArgGly600AspLysGluArgVal680ProArgAsnGlyPheTyrLeu505GlyGluProThrGlu585LeuLeuAspSerSer665AlaProArgValPheSerLysSerArgVal490LysLysGlyArgLys570PheGlyGlyGlyLeu650MetArgGlylielie475LysAlaSerThrGlu555AlaLeu460ThrAsnGlyGinVal540LeuVallieArg635LeuSerArgProSer715Thr445AsnSerlieAspGlu525SerAsnAspLeuThrPheGluSerPhe620LeuGlyThrlieGlu700HisVal605ValArgLysGluSer685LeuThrlieArgLeuValGinAspPro495LeuLeuAlaGluGlu590LysLysValThrGly670LysCyslieSerLeuTyrProSerLeuVal480ArglieArg510GluValValLeuGluAsp575ValGlySerAsnAsn655AsnValPro560lieProAsnlieAsp640GinLysAsnGluSer720GlylieGluGlyArglieMetAspAspHisVal785AlaArgPheSerAsp865LeuVallieSerLeu945SerGlyGlyLeu770ThrAspGluSerMet850GinLysThrArgTyr930GluThrAsnLysThr755SerGly740ValLeu725LysAlaCysGlyAsp835AspLysLysLeuGly915AspGluAlaGinGlu995lielieGluAspAspSerPhe820AlaLeuAlaSerAsn900ArgLysAspSerGlu980LysGinAlaLeu805GlySerGinLeuGlyGlySer885GlyGlyProThrAsp965LysLysAspTyrlieSerGly790SerArgGinlieSer870SerAspCysAlaGlu950GinGlyLysGluSerProSerArgAsnAlaAla730GinLeuSerProThrValAsnSer775ThrProGinAla855ProLeulieAsnVal935GluProAspAspLeuAsp760SerTrpAspSerAsp840AspSerGluProGlu920AspSerSerLysSer745AspSerAlaValMet825PheGluArgSerPhe905SerAspSerHisThr985ArgAsp1000ArgSerLysAsp810SerValThrAspLeu890HisPheAspArgSer970AspLysLeuHisAla795ProGluLysLysVal875GinArgArgAspSer955LeuArgGluProAsp780AlaValLysThrLeu860GlyThrProAlaGlu940GlyGluLysLysVal765AsplieLeuArgArg845AsnProAlaArgAla925GlyArgArgLysMet750LeuValSerAlaThr830LysLeu735ProProGlyAspPhe815LysSerGinProPheSer800GinGinLysThrValAspSerSerValPro910lieMetGluGinLeuAla895ArgAspGluSerMet975LysGly880GlulieLysThrVal960AsnThrAsp990AspLysMetLys1005AlaGlyLysLysGluHisSerProLysThrGinTyrSerArgSerGinSerAsnLys1010Lys1025lie1040Gin1055Arg1070Arg1085Ser1100Arg1115Pro1130Pro1145Gin1160Ser1175Gly1190Gin1205Ser1220Asp1235Ala1250Gly1265LysHisGinGluGinThrTyrGluArgSerAlaPheArgGluLeuSerLysTyrGlyArgGluGinAlaPheGluGlyAsnAsnLysGluHisGluProTrpGluLeuMetLysSerGluArgGlyGlyHisSerHisGinGinSerArgArgGluAsnGlyLeuAspPheArgGluCysSerMetLysAspAspProValGluGinGinProGlyLys1015Asp1030Thr1045lie1060Arg1075Asp1090Met1105Met1120Pro1135Arg1150Glu1165Trp1180Ser1195Ser1210Ser1225Asn1240Arg1255His1270GlyLysSerGinAspAspAlaAspSerlieAspProValSerArgTyrTyrGlyLeulieGluAlaTyrGluLeuAlaProGinValAsnGluGinLysSerSerPheGlyGluGluLysAlaLeuAsnLeuValArgGluAlaValGinAsnProSerAsnAspLysGluThrGluMetAlaTyrAspLeuAspArgGinAlaAlaGlyTyrAlaMet1020Thr1035Arg1050Arg1065lie1080Tyr1095Arg1110Ala1125Ser1140Arg1155Arg1170Pro1185Met1200Gin1215Ser1230Glu1245Gin1260Arg1275PheGlylieGluGinGlyProGinAsnGinAlaGinArgSerGlyGlyValArgPheLyslieArgMetPheArgAspPheGlyValGinSerValLysArgSerGluPheArgThrThrGinArgGinGinTyrValSerPheGinSerArgMetLeuGluThrGinGluLeuLeuArgGinGluGinArgArgLysGluGin128012851290GinMetLysLysGinProProSerGluGlyProSerAsnTyrAsp129513001305SerTyrLysLysValGinAspProSerTyrAlaProProLysGly131013151320ProPheArgGinAspValProProSerProSerGinValAlaArg132513301335LeuAsnArgLeuGinThrProGluLysGlyArgProPheTyrSer134013451350〈210>2〈211〉26〈212〉DNA<213〉合成的引物〈400>2cgggatcccacccctcgggaaaacca〈210〉3〈211>26〈212〉DNA<213〉合成的引物<400>3cggaattcgctcccaggtgacttcag〈210〉4〈211〉29<212〉■〈213〉合成的引物<400>4cggatccagccaacatgtcagggtgggag262629<210>5<211>31〈212〉DNA〈213>合成的引物<400〉5cggggcccgtcctggaagtgcttggtgaggg31〈210〉6〈211〉30〈212〉DNA〈213〉合成的引物<德6cgg組tcatggtgcggtcggggaataagg30<210>7〈211〉35〈212〉DNA〈213〉合成的引物<400>7gctctagatatcatgtccaataaatcgtccacatc35<210>8〈211〉26〈212〉腿〈213>合成的引物〈400〉8gcggatcccctgttggacatgctgac26<210>9<211〉26〈212>DNA<213〉合成的引物〈400>9gcgaattcgtcagggctaaaacggct26〈210>10〈211〉31<212>DNA〈213〉合成的引物〈400〉10cggaattcatggaggaaacagctatatggga31<210>11<211>32〈212〉DNA〈213〉合成的引物<400>11ccgctcgagggttcaggatcaggacgacttac32<210>12〈211>30<212>畫<213>合成的引物<400>12cgggatccactccagcagtcaggatcatca30〈210>13<211>29<212〉DNA〈213〉合成的引物<400>13cgggatcctgctgg卿ctgaagtggggt<210>14〈211〉27〈212〉腿<213>合成的引物<400〉14cccaagcttcggcggcatgaaagtgac<210〉15〈211〉24〈212>畫〈213〉合成的引物<400〉15ggaatagaagggcctccctttctc<210〉16〈211〉27〈212〉腿<213〉合成的引物<16cccaagcttcggcggcatgaaagtgac〈210〉17〈211〉26<212〉腿〈213〉合成的引物〈400〉17cgggatcccacccctcgggaaaacca26〈210〉18〈211>26〈212〉DNA〈213>合成的引物〈400>18gcgaattcgtcagggctaaaacggct26〈210〉19〈211>24〈212>DNA〈213〉合成的引物〈德19ggaatagaagggcctccctttctc24〈210〉20〈211〉26〈212〉DNA〈213〉合成的引物〈400〉20cgggatcccacccctcgggaaaacca26<210>21〈211〉28〈212〉DNA<213>合成的引物〈400>21cggaattcccttccatcttggtgcttct28〈210〉22<211〉26〈212>DNA〈213〉合成的引物〈400〉22cgggatccacacctgatggcaccagg26〈210>23〈211>26〈212>腿〈213〉合成的引物<400〉23cggaattcgctcccaggtgacttcag26<210>24〈211〉26〈212〉DNA〈213>合成的引物<400〉24cgggatcccacccctcgggaaaacca26<210>25〈211〉29〈212〉DNA〈213〉合成的引物〈400〉25cggaattctcctgaatcattaagtgggac〈210〉26<211〉28<212>DNA〈213〉合成的引物<400>26cgggatccagaagcaccaagatggaagg〈210〉27〈211〉29〈212〉DNA〈213>合成的引物〈400〉27cggaattctcctgaatcattaagtgggac〈210〉28<211>28〈212〉DNA<213〉合成的引物<400>28cgggatccagaagcaccaagatggaagg<210>29〈211〉26〈212〉畫〈213〉合成的引物29282928〈400>29cggaattcgctcccaggtgacttcag26〈210〉30<211>26〈212>腿<213>合成的引物〈400〉30cgggatcccacccctcgggaaaacca26〈210〉31<211>26<212>DNA〈213〉合成的引物〈400>31cggaattcgctcccaggtgacttcag26<210>32〈211〉26〈212〉腿〈213〉合成的引物〈400〉32cgggatccacatgtcagggtgggagt26〈210〉33〈211〉29〈212〉廳〈213〉合成的引物<400〉33ccgctcgagatgcccacagagatcactat29<210>34<211〉26〈212〉DNA〈213>合成的引物〈400〉34cgggatccacacaccccgcaggaaca26〈210〉35〈211〉27〈212〉廳〈213〉合成的引物<400>35cggctcgaggtcctggaagtgcttggt27<210>36<211〉30〈212〉DNA〈213〉合成的引物〈400〉36cgggatccctgaagctcaacaaagatatag30〈210〉37〈211〉31<212>隨<213>合成的引物〈400〉37cggaattcgtcctggaagtgcttggtgaggg31〈210〉38〈211>30〈212〉DNA<213>合成的引物〈400〉38cggaattcatggtgcggtcggggaataagg30〈210〉39〈211>29〈212〉■〈213>合成的引物〈400>39cggctcgagatccagctgacttttgctga29〈210>40〈211〉27〈212〉■〈213〉合成的引物〈德40cgggatccgatcaagtgactgctcagg27〈210>41〈211〉29〈212〉DNA〈213〉合成的引物〈，41cggaattctatcatgtccaataaatcgtc29<210>42〈211〉27〈212〉■<213>合成的引物〈400〉42cccaagcttcggcggcatgaaagtgac27〈210〉43〈211〉26〈212〉■<213>合成的引物<400〉43gctctagatctcttctcgggcttcag26<210〉44〈211〉27〈212〉腿〈213>合成的引物〈400〉44gggaagcttggatgaatggaaaccaag27〈210〉45〈211〉28<212〉DNA<213>合成的引物〈400〉45ccggaattctcaggaatagaagggcctc28權(quán)利要求1.分裂缺陷蛋白3用于促進DNA損傷的修復(fù)，所述的蛋白具有SEQIDNO:l的氨基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白。2.分裂缺陷蛋白3在制備促進DNA修復(fù)制劑中的應(yīng)用，所述的蛋白具有SEQIDN0:1的氨基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白。3.分裂缺陷蛋白3在制備增強抗癌藥物敏感度的藥物中的應(yīng)用，所述的蛋白具有SEQIDN0:1的氨基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及分裂缺陷蛋白3的新功能。本發(fā)明提供了分裂缺陷蛋白3可促進DNA損傷的修復(fù)的功能，利用該功能，可將分裂缺陷蛋白3用來制備促進DNA修復(fù)的制劑以及制備增強抗癌藥物敏感度的藥物。文檔編號A61P35/00GK101121019SQ20061003004公開日2008年2月13日申請日期2006年8月11日優(yōu)先權(quán)日2006年8月11日發(fā)明者房龍后,陳正軍申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院