專利名稱：重組人角質(zhì)細胞生長因子-2凍干粉針劑的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制劑生產(chǎn)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種人角質(zhì)細胞生長因子-2 (KGF-2)凍干粉針劑，以及相應(yīng)的生產(chǎn)方法，包括有關(guān)的輔料篩選和凍干 工藝。
背景技術(shù)：
1996年，Yamasaki等/尸力/si^ fesfrw7 te^ "Ker尸力/w'o7 yVoy;iy^(^)從鼠的胚胎中擴增到與角質(zhì)細胞生長因子(Keratinocyte Growth Factor, KGF)具有高度同源的一種嶄新的細胞因子，稱為角質(zhì)細胞生長因子一2(KGF—2)，又叫做成纖維細胞生長因子一IO (Fibroblast Growth Factor-10， FGF-10)。之后，Emoto等(/^"/7 / e力a&7 ，W,/朋-Fe/ ,^0 "..5-9) 克隆到人的KGF—2cDNA，其編碼的蛋白由208個氨基酸組成，N端有39個氨基 酸的疏水信號肽，成熟蛋白169個氨基酸(40 — 208aa)，理論分子量為19. 3kDa， 對肝素具有較強的親和作用。KGF-2能特異性的結(jié)合于靶細胞表面的酪氨酸激酶受體FGFR2IIIb (KGFR)、 FGFR1而觸發(fā)信號傳導(dǎo)，從而發(fā)揮生理作用。體外活性研究表明，在0. 1-5nM(2-100ng/mL)濃度時對角質(zhì)上皮細胞Bal/MK具有顯著的促分裂作用，對成纖 維細胞NIH3T3無作用，而在高于5nM的濃度時對NIH3T3同樣具有顯著的促進分 裂和生長作用。研究表明，KGF—2 mRNA的表達主要是在胚胎的發(fā)育過程之中， 以及在特定的成年組織如肺、前列腺。在胚胎發(fā)育過程中KGF — 2是起始肢芽的 形成及促進其生長的關(guān)鍵的細胞因子。在創(chuàng)口愈合的過程中KGF —加KNA卨水平 表達，動物試驗結(jié)果表明，KGF—2在創(chuàng)口愈合中起著重要作用。Han等(./尸at力o7 /卯9 A7《;^5Y".U/- 利用消炎痛誘導(dǎo)小鼠小腸潰瘍 模型研究表明，KGF-2靜脈注射顯著降低急性和慢性腸損傷。其通過刺激上皮恢 復(fù)和保護性的前列腺素產(chǎn)生來抑制小腸炎癥；燒傷等需要大面積皮膚移植的病 人，面臨嚴重的代謝問題和感染致死的危險，Smith等(/fer/朋co7 777w /.9.9.97"〃厶3^Y":鄰「77)用無胸腺裸鼠的皮膚移植試驗?zāi)Ｐ?，考查KGF-2對皮膚上 皮形成動力學(xué)的影響，表明KGF-2對移植皮膚的愈合具有極為顯著促進作用；Xia 等(/5"/^yfes W卯/^力;<57 C^M-W)利用局部缺血損傷的兔耳真皮潰瘍模 型，考查KGF-2對創(chuàng)口愈合以及對疤痕形成的影響，結(jié)果表明KGF-2顯著促進 表皮細胞生長，提升上皮形成，此外增強肉芽組織的形成(KC;F無此作用)，較 之KGF-1、 TGF-beta等細胞因子，KGF-2最為有效且?guī)缀醪灰鹈黠@的疤痕； Miceli等利用硫酸葡聚糖鈉鹽誘導(dǎo)的鼠潰瘍模型，發(fā)現(xiàn)KGF-2幾乎完全恢復(fù)腸 道表面的正常的細胞構(gòu)造，表明了其對炎性腸病的臨床治療意義。Jimenez等 通過小鼠背部皮膚切割創(chuàng)口模型研究表明，KGF-2對起始和加速外傷性創(chuàng)口愈合 具有重要意義。目前國內(nèi)對KGF-2的開發(fā)利用尚未見諸報道，僅局限于少量的基礎(chǔ)臨床試驗 研究。而國外對其利用則正處于蓬勃發(fā)展之中。美國FDA已批準美國HUMAN GEMN0ME SCIENCES,公司(HGS)對rhKGF-2 (R印ifermin)進行臨床試驗II期研艽。R印iferrain是HUMAN GEMNOME SCIENCES, Inc (HGS)開發(fā)的重組KGF-2的 商品名，1998年2月開始KGF-2用于創(chuàng)口愈合的兩個I期試驗研究， 一個是皮 膚表面的局部用藥，另一個是通過注射的全身用藥。試驗的目的在于評價KGF-2 的安全性、藥物動力學(xué)以及恰當?shù)膭┝?。試驗結(jié)果表明，在選定的劑量下，系統(tǒng) 應(yīng)用KGF-2是安全的，健康志愿者能夠良好耐受，幾乎無副作用。2000年1月起動治療癌癥治療(骨髓移植前高劑量化療)相關(guān)的粘膜炎II 期臨床試驗，早些時候己開始治療靜脈潰瘍的II期臨床試驗。目的在于評價系 統(tǒng)應(yīng)用KGF-2的安全性和效力，2000年9月公布了治療靜脈潰瘍的IIa期臨床 試驗結(jié)果，試驗考察了94名患者，其靜脈潰瘍面積從3 — 30 cm2，持續(xù)了 3 — 36 個月。每周局部用藥治療兩次，直到12周或者創(chuàng)口完全愈合，因為靜脈潰瘍可 能需要許多個月才能完全愈合，試驗中統(tǒng)計了部分愈合的病人數(shù)。IIa試驗結(jié)果表明，KGF-2治療效果顯著，病人能夠良好耐受，基本沒有副 作用，HGS決定更大規(guī)模的lib試驗，將考察600名以上的患者以進一歩評價 KGF-2的使靜脈潰瘍完全愈合的效力。其它的臨床試驗正在進行之中。我們選擇了適合的劑型、輔料、生產(chǎn)工藝，通過控制關(guān)鍵的工藝條件，使制
得的產(chǎn)品保持了很高的活性和穩(wěn)定性。中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作 簡單，周期短，成本低。適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種人角質(zhì)細胞生長因子-2 (KGF-2)凍干粉針劑。本發(fā)明的另一目的就是提供優(yōu)化的人角質(zhì)細胞生長因子-2的制劑工藝。在本發(fā)明的第一方面，就是提供了一種人角質(zhì)細胞生長因子-2 (KGF-2)凍 干粉針劑，它由人角質(zhì)細胞生長因子-2，蔗糖，甘露醇，NaCl， EDTA與擰檬酸 一檸檬酸鈉緩沖體系凍干而成。在本發(fā)明的第二方面，提供了人角質(zhì)細胞生長因子-2的制劑工藝，該方法 包括步驟a. 將人角質(zhì)細胞生長因子-2與輔料混合；b. 加入合適的緩沖溶液；C.在合適的條件下，凍干； d.按合適的規(guī)格分裝；在另一優(yōu)選例中，所述的輔料是7%蔗糖、7%甘露醇、0.02M NaCl、 lmMEDTA。在另一優(yōu)選例中，所述的緩沖溶液是40mM梓檬酸一檸檬酸鈉，pH6.2。 在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，人角質(zhì)細胞生長因子-2經(jīng)過凍干后得到產(chǎn)品水 分<3%,穩(wěn)定性可達2年，復(fù)溶后澄明度良好。


圖1. KGF-2樣品凍干曲線，此圖記錄了 KGF —2樣品凍干過程設(shè)定的溫度和真 空度值和實際值。
具體實施方式
本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，通過對輔料、緩沖溶液、凍干工藝等因素 的篩選和優(yōu)化，生產(chǎn)人角質(zhì)細胞生長因子-2的凍干粉針品，獲得高的穩(wěn)定性和 活性的凍干粉針劑，實現(xiàn)了人角質(zhì)細胞生長因子-2規(guī)模生產(chǎn)，在此基礎(chǔ)上完成
了本發(fā)明。本發(fā)明根據(jù)相關(guān)資料的査詢整理總結(jié)，通過對輔料、緩沖溶液和凍干工藝 的篩選和摸索，以外觀、溶解度、水分、活性變化、凍千曲線等參數(shù)為指標優(yōu)化 工藝，方法概要如下表。 表1方法概要步驟試驗名稱取點工作基礎(chǔ)要獲得的參數(shù)單次試驗時 間試驗l輔料種類3-5種，濃度 5-15%文獻、溶解 性能外觀、溶解度、水分、活性變化、 凍千曲線笫1周試驗2輔料濃度卜2種，濃度細化試驗1外觀、溶解度、水分、活性變化、 凍干曲線第2周試驗3凍干條件1-2禾中試驗2外觀、溶解度、水分、活性變化、 凍干曲線第3周試驗4初步穩(wěn)定性 試驗數(shù)據(jù)1-2種試驗3外觀、溶解度、水分、活性變化、 凍干曲線第4周開始， 約2個月試驗4中試放人1種試驗3外觀、溶解度、水分、活性變化、 凍干曲線試驗5中試優(yōu)化1種外觀、溶解度、水分、活性變化、 凍干曲線、產(chǎn)業(yè)化價值在本發(fā)明的另一個實例中，進行了緩沖溶液及其pH的篩選。保證了樣品的 活性和穩(wěn)定性。在本發(fā)明的一個實例中，進行了輔料種類及其濃度的篩選，進一步保證了人 角質(zhì)細胞生長因子-2活性和穩(wěn)定性。通過以上方法，得到優(yōu)化的工藝，通過此工藝制得的人角質(zhì)細胞生長因子-2 注射用粉針劑。初步穩(wěn)定性試驗表明，該粉針劑穩(wěn)定。中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，適合產(chǎn)業(yè) 化生產(chǎn)。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1) 選用的輔料和緩沖溶液易得，廉價，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。(2) 優(yōu)化后的凍干工藝穩(wěn)定，操作簡單，效率高，成本低，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 (3)由于采用凍干工藝，通過控制關(guān)鍵的生產(chǎn)工藝條件，水分〈3%，復(fù)溶性好，使穩(wěn)定性可達2年。 下面結(jié)合具體實施例，進一歩闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法， 通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。實施例l.KGF-2凍干粉針初步穩(wěn)定性實驗A.輔料甘露醇和蔗糖輔料濃度為甘露醇濃度5%、 7.5%、 10%;蔗糖濃度5%、 6%、 7.5%。加速穩(wěn)定性實驗結(jié)果澄明度在燈下用肉眼觀察kgf-2在室溫中2天所有樣品均出現(xiàn)白點或絮狀不溶物，3天后則出現(xiàn)大量的白點和絮狀不溶物。在4'C中樣品白點或絮狀不溶物較少。凍干的樣品復(fù)溶后在普通R光燈下肉眼觀察未見白點，但在特定的燈下觀察，1、 2號樣品可見乳光，6、 7號樣品溶解度低，加Tween80的樣品剛?cè)芙鈺r有類似鹽交換現(xiàn)象，液體感覺粘稠但在震蕩后此現(xiàn)象消失。其他樣品之間無特別明顯的差異。因此3、 4號樣品的澄明度最好。水分在水分檢測中，剛出柜時，除7號的樣品結(jié)構(gòu)松溶質(zhì)又低，水分達到8%，其他樣品均在2.2%以下，水分合格。30天后復(fù)檢除了3、 4號樣品的水分在3%以下，其余均大于3%, 60天后3、 4號樣品的水分仍在3%以下?；钚?號活性最好，但其中毒量和有效量很近，3號活性則明顯高于其他幾個樣品o實施例2. KGF-2凍干粉針中試穩(wěn)定性試驗針對水份檢測，5%濃度蔗糖敷料一直合格。外觀檢測蔗糖相比甘露醇，40 。C時樣品無粉末狀，而敷料為甘露醇時的樣品三個溫度外觀均合格；澄清度檢測 隨著甘露醇濃度的不斷增高，溶解度降低，故澄清度不合格。兩種敷料條件下， 甘露醇作為敷料有二聚體，而蔗糖作為敷料，只在第四月37t:有二聚體，其他 條件下沒有出現(xiàn)。
加速穩(wěn)定性實驗表明綜合澄明度、活性、水分、穩(wěn)定性幾個方面，確定 KGF-2添加的輔料為0.02MNaCl、 7%甘露醇和7%蔗糖。三批中試樣品在2年內(nèi) 其穩(wěn)定性各檢測指標均在正常范圍內(nèi)，故我們確定KGF-2的有效期為2年
權(quán)利要求
1.一種人角質(zhì)細胞生長因子-2(KGF-2)凍干粉針劑，其特征在于，它由人角質(zhì)細胞生長因子-2，合適的輔料和合適的緩沖體系凍干而成。
2. 如權(quán)利要求1所述的凍干粉針劑，其特征在于，所述的輔料為5-15%蔗糖、5-15% 甘露醇、0.01-0.05MNaCl、 0.1 — 10mM EDTA。較佳的，7%蔗糖、7%甘露醇、0.02M NaCl、 lmMEDTA。
3. 如權(quán)利要求1所述的凍干粉針劑，其特征在于，所述的緩沖體系是10—100mM擰檬酸 一檸檬酸鈉，pH5—7。較佳的，40mM檸檬酸一檸檬酸鈉，pH6.2。
4. 一種人角質(zhì)細胞生長因子-2的制劑工藝方法，其特征在于，該方法包括歩驟a. 將人角質(zhì)細胞生長因子-2與輔料混合；b. 加入合適的緩沖溶液；C.在合適的條件下，凍干； d.按合適的規(guī)格分裝；
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，歩驟(a)所述的輔料是5-15%蔗糖、5-15% 甘露醇、0.01 -0.05M NaCl 、 0.1 — 10mMEDTA。較佳的，7%庶糖、7%甘露醇、0.02M NaCl、 lmMEDTA。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(b)所述的緩沖溶液是10—100mM狩檬 酸一檸檬酸鈉，pH5 — 7。較佳的，緩沖液為40mM檸檬酸一檸檬酸鈉，pH6.2。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人角質(zhì)細胞生長因子-2(KGF-2)凍干粉針劑，及其生產(chǎn)方法。通過對人角質(zhì)細胞生長因子-2進行了大量的輔料、凍干程序、工藝優(yōu)化的摸索和研究后，得到了一套人角質(zhì)細胞生長因子-2凍干粉針劑的生產(chǎn)方法。用本法，可得到高活性、高穩(wěn)定性的人角質(zhì)細胞生長因子-2凍干粉針品，并能滿足臨床需要。本發(fā)明可高效、簡便、低成本，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61K9/19GK101134020SQ20061003069
公開日2008年3月5日 申請日期2006年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月31日
發(fā)明者軍 任, 孫九如, 翊 張, 駿 蔡, 黃陽濱 申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司;上海新生源生物醫(yī)藥有限公司