專利名稱：一種抗肝壞死與纖維化的SiRNA表達模板的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因片段，具體涉及一種抗肝壞死與纖維化的siRNA表達模板。
背景技術：
病毒性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝、日本血吸蟲病等導致的慢性肝病是我國最常見的疾病、多發(fā)病。慢性肝病(主要是慢性病毒性肝炎)的重要病理基礎是肝纖維化。肝纖維化的發(fā)生是機體對炎癥的修復反應，如同瘢痕形成一樣。肝穿標本分析表明輕型慢性肝炎發(fā)生纖維化者有62.6％，中、重度者為100％；日本血吸蟲病性肝纖維化是日本血吸蟲病的嚴重后果。其慢性肝病通過纖維化的發(fā)展走向肝硬化，乃至發(fā)生門脈高壓，肝性腦病甚至肝癌等嚴重并發(fā)癥。如能阻斷、減輕肝纖維化，就能在很大程度上改善肝病的預后，因而成為肝病治療的一個方向。
轉化生長因子β(TGFβ)是肝纖維化形成過程中最重要的細胞因子之一，它通過自分泌和旁分泌方式，對細胞的分裂增殖具有促進或抑制雙重作用，是目前與肝纖維化相關的肝臟貯脂細胞(又稱肝星狀細胞)重要的細胞調節(jié)因子。TGFβ的信號轉導首先是通過靶細胞膜上的特異性受體而介導的。其功能性受體主要為I型受體(TβR I)和II型受體(TβR II)，TβR I為介導TGFβ促細胞外基質合成的信號通道，TβR II則與細胞增殖、分化密切相關。因此，利用基因治療抗肝纖維化的關鍵在于阻斷TGFβ特異性受體介導TGFβ的信號轉導途徑。
隨著基因治療技術的迅速發(fā)展，RNA干擾技術已顯示出廣闊前景，用RNAi干擾技術制備治療抗肝纖維化的基因藥物是值得探索的重要課題。
發(fā)明內容
本發(fā)明旨在采用siRNA技術阻斷TGFβ I型受體介導TGFβ的信號轉導途徑，使肝臟貯脂細胞和枯否細胞的激活受到抑制，從而十分有效地阻斷肝纖維化進程，改善肝臟功能，實現(xiàn)抗肝纖維化的治療。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案為設計一段阻斷TBR介導轉化生長因子β的信號轉導途徑的SiRNA表達模板，該模板的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
下面結合附圖進一步詳述本發(fā)明
圖1SiRNA表達模板設計與作用示意圖；①.SiRNA表達模板設計示意圖(以TBR I-3為例)②.對照用six2模板設計示意圖③.SiRNA表達模板作用示意圖(以TBR I-3為例)圖2pRNAT-U6.1/Neo質粒和靶序列模板酶切圖譜；①.退火后模板DNA ②.酶切后質粒 ③.酶切前質粒圖3陽性克隆測序結果；圖4正常組病理切片(放大倍數10×10×)圖5病理組切片(放大倍數10×10×)圖6治療組病理切片(放大倍數10×10×)。
本發(fā)明分別設計了三段TGFβ I靶基因SiRNA表達模板以及一段與TGFβ I序列無關的對照模板six2(見圖1)，將SiRNA表達模板與對照模板分別插入到siRNA表達載體pRNAT-U6.1/Neo(GenScript公司產品)中，得到重組表達質粒pRNA-TBR I-1、pRNA-TBR I-2、pRNA-TBR I-3以及空白對照pRNA-six2。通過轉染成纖維細胞(3T3細胞)與MTT法篩選，篩選了效果最明顯的一對模板，然后進行動物實驗驗證。
一、siRNA模板序列的設計GeneScript公司提供了在線siRNA模板序列設計的軟件，利用該軟件可設計siRNA模板序列，本研究設計了3對siRNA模板及一個空白對照(分別命名為TBR I-1、TBR I-2、TBR I-3、six2；)供實驗篩選，模板序列如下TBR1-15′GATCCCGTTGATGCCTTCCTGTTGACTGTTCAAGAGACAGTCAACAGGAAGGCATCAATTTTTTCCAAA3′3′ GGCAACTACGGAAGGACAACTGACAAGTTCTCTGTCAGTTGTCCTTCCGTAGTTAAAAAAGGTTTTCGA 5′TBR1-25′GATCCCACAAACGGCCTATCTCGAGGATTCAAGAGATCCTCGAGATAGGCCGTTTGTTTTTTTCCAAA 3′3′GGTGTTTGCCGGATAGAGCTCCTAAGTTCTCTAGGAGCTCTATCCGGCAAACAAAAAAAGGTTTTCGA 5′TBR1-35′GATCCCGTAAATCTCTGCCTCACGGAACTTCAAGAGAGTTCCGTGAGGCAGAGATTTATTTTTTCCAAA3′3′GGCATTTAGAGACGGAGTGCCTTGAAGTTCTCTCAAGGCACTCCGTCTCTAAATAAAAAAGGTTTTCGA5′Six25′GATCCGGGTCTTACATAAGAGGACTTTAGTACTAGTCCTCTTATGTAAGACCTTTTTA3′3′GCCCAGAATGTATTCTCCTGAAATCATGATCAGGAGAATACATTCTGGAAAAATTCGA5′
二、將合成的模板與酶切好的質粒連接，并轉染DH5α感受態(tài)細菌1.將siRNA表達質粒pRNAT-U6.1/Neo用EcoR I(Promega公司)、BamH I(Promega公司)進行雙酶切(37℃水浴箱切4小時，酶切體系見表1)，酶切產物進行厚瓊脂糖凝膠電泳(結果見圖2)，用膠純化試劑盒(Promega公司產品)純化回收酶切后的線性質粒條帶(操作按說明書進行)，-20度冰箱保存?zhèn)溆谩?br>
表1pRNAT-U6.1/Neo質粒酶切體系Buffer H(Promega公司)2ulEcoR I 1ulBamH I 1ul質粒pRNAT-U6.1/Neo 5ul蒸餾水 11ul總量 20ul2.將合成的siRNA模板DNA于95℃水浴5分鐘變性，然后自然冷卻退火。
3.將步驟2處理后的DNA分別與酶切回收的質粒用T4連接酶(Promega公司產品)16℃連接過夜，連接體系見表2。將連接后產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)態(tài)細菌(晶美公司產品)，鋪Amp+LB細菌培養(yǎng)板(氨芐青霉素含量100μg/ml，下同)，37℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。
表2連接反應體系T4Buffer(Promega公司) 1.5ul質粒pRNAT-U6.1/Neo(己酶切并3ul純化)siRNA模板DNA 9ulT4連接酶 1.5ul總量 15ul三、挑陽性克隆進行測序鑒定，以確定siRNA模板是否已正確插入質粒挑取Amp+LB細菌培養(yǎng)板上陽性菌落接種10mlAmp+LB液體細菌培養(yǎng)基，37℃搖床、230(轉/分鐘)擴增過夜，質粒提取試劑盒(QIAGEN公司產品)抽提質粒，送大連寶生物公司測序。測序結果見圖3。
四、體外細胞篩選實驗每對模板選擇一個經測序證實已經正確插入載體的克隆，分別大量擴增選擇的克隆并用質粒提取試劑盒抽提質粒，再用乙醇進行無菌處理(加入95％乙醇于-80℃固定3小時；16000rpm離心30分鐘，去上清，再用70％乙醇重懸后于-80℃冷凍2小時去鹽；16000rpm離心30分鐘，適量無菌去離子水溶解沉淀)后，采用LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)脂質體介導轉染3T3細胞，經G418(Geneticin，氨基糖苷類抗生素，Promega公司產品)篩選起初200μg/ml，兩天后換液加至400μg/ml，再過兩天換液加到800μg/ml，維持800μg/ml至空白對照組細胞全部死亡后改為300μg/ml。篩選后建立的穩(wěn)定細胞株，分別命名為TBR I-1-3T3細胞、TBR I-2-3T3細胞、TBR I-3-3T3細胞、six2-3T3細胞。分別消化收集穩(wěn)定細胞株細胞，以1×105個/ml的密度種96孔平底細胞培養(yǎng)板，48小時后加MTT(四唑鹽，5mg/ml)20μl，繼續(xù)5％CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時，去孔內培養(yǎng)液，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)充分溶解孔內形成的甲瓚顆粒，酶標儀570nm波長檢測各孔OD值，統(tǒng)計軟件SPSS 10.0分析結果(見表3)。
表3pRNA-TBR I穩(wěn)定細胞株生長對比實驗結果
**該組P＜0.05，效果顯著，進行動物試驗進一步驗證。
五、動物實驗取體重150～200g雌性SD大鼠15只(購自中南大學湘雅附二院動物實驗中心)，標準飼料，自由飲水，隨機分成3組正常組、病理組、RNAi治療組各5只。用60％CCl4的橄欖油溶液0.3ml/(100g大鼠體重)皮下注射SD大鼠(正常組用等體積生理鹽水代替，每周2次、共6周)制備肝纖維化模型。治療組在造模6周后按5ug/(20g大鼠體重)的劑量皮下注射RNAi載體，病理組及正常給予等體積生理鹽水，各組實驗動物在最后一次給藥后2天處死，取肝組織作組織學及病理檢查(結果見表4、圖4～圖6)。
表4pRNA-TBR I-3動物試驗病理切片結果
由表4病理切片結果結合圖4～圖6說明經pRNA-TBR I-3治療后，大鼠肝細胞脂肪變明顯減少；壞死、變性肝細胞消失；沒有進一步向肝纖維化發(fā)展(無肝細胞橋狀壞死)。說明pRNA-TBR I-3能明顯改善肝細胞壞死，阻止肝纖維化發(fā)生。
<110>蘇先獅<120>一種抗肝壞死與纖維化的SiRNA表達模板<160>1<210>1<211>69<212>DNA<213>SiRNA表達模板<220>
<400>1gatcccgtaa atctctgcct cacggaactt caagagagtt ccgtgaggca gagatttatt60ttttccaaa69
權利要求
1.一種抗肝壞死與纖維化SiRNA表達模板，其特征在于該表達模板的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗肝壞死與纖維化的siRNA表達模板。發(fā)明設計了一段阻斷TBR介導轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)的信號轉導途徑的SiRNA表達模板，將模板插入到siRNA表達載體pRNAT－U6.1/Neo中，得到重組表達質粒pRNA－TBR I。通過轉染3T3成纖維細胞，MTT法篩選，及動物實驗驗證，重組表達質粒pRNA－TBR I能十分有效地阻斷肝纖維化進程、改善肝臟功能，為開發(fā)治療慢性肝炎和血吸蟲肝硬化疾病的基因藥物開辟了一條新途徑。
文檔編號A61P1/16GK1974591SQ20061003257
公開日2007年6月6日 申請日期2006年11月14日 優(yōu)先權日2006年11月14日
發(fā)明者蘇先獅 申請人:蘇先獅