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      與RnaseP核酶聯(lián)用的外部引導(dǎo)基因C6及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:1113442閱讀:297來源:國知局
      專利名稱:與Rnase P核酶聯(lián)用的外部引導(dǎo)基因C6及其應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,具體涉及與RNase P核酶聯(lián)用的外部引導(dǎo)序列及其在制備抗HCMV藥物中的應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      20世紀80年代,Sidney Altman等發(fā)現(xiàn)埃希氏桿菌核糖核酸酶P(RNase P)的RNA組分M1 RNA能獨立對前體tRNA(ptRNA)進行剪切加工。人們把具有催化切割活性的RNA稱為“核酶”(ribozyme)。核酶的發(fā)現(xiàn)拓寬了基因治療的視野。核酶的互補切割特性和循環(huán)特性在哺乳動物細胞基因治療中具有顯而易見的優(yōu)越性。近年來的實驗結(jié)果表明,核酶作為基因治療的一種工具有著廣闊的應(yīng)用前景和極大的臨床實用價值。
      RNase P是一種核蛋白復(fù)合物,廣泛存在于細菌、酵母和動植物中,是細胞自身具備的天然核酶,無顯著細胞毒性。它是目前發(fā)現(xiàn)的活性最高的核酶之一,催化所有tRNA 5’末端的成熟。RNase P的特點是其識別底物的二級結(jié)構(gòu)而不是核苷酸序列,因此它可以在體內(nèi)和體外水解各種堿基序列完全不同的底物。大腸桿菌來源RNase P包括一個RNA催化活性單位M1 RNA和一個堿性蛋白C5,二者均為RNase P體內(nèi)活性所必需。在缺乏C5蛋白的體外環(huán)境下,M1 RNA可在高鹽溶液中對底物RNA進行催化切割。研究發(fā)現(xiàn),底物的二級結(jié)構(gòu)在M1 RNA對底物的識別中起決定作用。
      由于RNase P或M1 RNA具有識別底物二級結(jié)構(gòu)而非識別底物核苷酸序列這一特點,只要兩個RNA分子形成類似于ptRNA分子結(jié)構(gòu)的復(fù)合物,即可被RNase P或M1 RNA識別并切割。能夠指導(dǎo)RNase P或M1 RNA識別靶mRNA上的切割位點的RNA分子被稱為外部引導(dǎo)序列(External Guide Sequences,EGSs)。理論上說,只要靶mRNA上存在RNase P潛在的切割位點,那么使用適合的EGS與靶mRNA上潛在的切割位點互補,即可指導(dǎo)RNase P對復(fù)合物中靶mRNA進行特異性切割。實際上,由于細胞內(nèi)許多的mRNA均是與蛋白質(zhì)結(jié)合并以一種高度組織化、高度折疊化的空間結(jié)構(gòu)存在,在目前尚無法進行精確的底物RNA二級結(jié)構(gòu)區(qū)域分析的實驗室條件下,在底物RNA上選擇一個易與EGS結(jié)合的靶位極為困難。即使選擇在M1GS實驗結(jié)果中切割活性較高的靶位,在其他因素的影響下,也可能在EGS實驗中不能實現(xiàn)高效引導(dǎo)切割。
      以RNA為基礎(chǔ)的EGS(RNA-based EGS)已經(jīng)通過轉(zhuǎn)基因方法在細菌和哺乳類細胞中得到內(nèi)源性表達,并且在抑制皰疹病毒和流感病毒表達及阻斷流感病毒在人類細胞中復(fù)制的應(yīng)用中被證明是非常有效的。在引導(dǎo)RNase P切割靶mRNA時,以DNA為基礎(chǔ)的EGS(DNA-based EGS)與RNA-based EGS同樣有效。DNA-based EGS無論從成本還是穩(wěn)定性方面都比RNA-based EGS具有更大優(yōu)勢。
      人類巨細胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是一種在全世界不同種族人群中廣泛傳播且感染率很高的病原體。目前研究發(fā)現(xiàn),HCMV感染造成的主要危害是引發(fā)移植感染、宮內(nèi)感染,導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、骨髓發(fā)育不良、畸形、智力低下等,因此是圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和優(yōu)生學(xué)以及骨髓移植研究中的重大課題。
      編碼HCMV DNA復(fù)制相關(guān)蛋白的ORF中,UL54基因的功能是編碼140kD的DNA多聚酶,為病毒DNA復(fù)制所必需,是研究病毒感染機制的重要基因,同時也是作為抗病毒治療中的良好藥靶。
      針對HCMV這種嚴重危害人類健康的感染性疾病的病原體,研制一種有效的抗病毒藥物對于控制HCMV感染以及預(yù)防HCMV相關(guān)并發(fā)癥是至關(guān)重要的。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的在于提供與RNase P聯(lián)用的外部引導(dǎo)基因(EGS),是用于引導(dǎo)RNase P切割HCMV聚合酶mRNA片段的EGS,包括以RNA為基礎(chǔ)的EGS與以DNA為基礎(chǔ)的EGS。
      本發(fā)明的另一目的在于提供包含所述EGS的重組表達載體,以及用所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞所得的轉(zhuǎn)化體。表達載體可采用pUC19等含Ecoli復(fù)制位點的載體。宿主細胞可采用JM109或DH5α等基因工程菌。JM109、DH-5α、pUC19均為商業(yè)化產(chǎn)品,JM109、DH-5α可購自華美公司,pUC19可購自TaKaRa公司(大連寶生公司)。
      本發(fā)明的進一目的在于提供上述EGS在制備抗HCMV病毒藥物中的應(yīng)用。
      本發(fā)明所述的與RNase P聯(lián)用的外部引導(dǎo)序列,是以RNA為基礎(chǔ)的外部引導(dǎo)序列,具有SEQ ID NO1所列的序列;還包括以DNA為基礎(chǔ)的外部引導(dǎo)序列,具有SEQ ID NO2所列的序列,均具有引導(dǎo)RNase P切割HCMV聚合酶mRNA片段的特異引導(dǎo)切割活性,其靶位點均在UL54基因的1760-1776。SEQ ID NO1的序列5’-GCACUCGUGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCAGCAGCACCA-3’SEQ ID NO2的序列5’-GCACTCGTGTGCGGTCTCCGCGCGCAGGTTCAAATCCTGCAGCAGCACCA-3’能轉(zhuǎn)錄出如SEQ ID NO1所示序列的外部引導(dǎo)序列的DNA序列,其優(yōu)選序列為上游含有T7啟動子。
      本發(fā)明所述的EGS分子可用于與RNase P聯(lián)用靶定切割HCMV聚合酶基因,具有以下有益效果(1)所構(gòu)建的EGS分子將切割位點設(shè)計在靶mRNA復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的外圍,避免了二者的結(jié)合受靶mRNA高級結(jié)構(gòu)的限制,更方面人為操作并控制;(2)所構(gòu)建的EGS可在體外循環(huán)利用且在體內(nèi)積累,因此EGS/靶RNA要比反義RNA/靶RNA的化學(xué)劑量比小得多,大大提高了EGS的使用效率;(3)所構(gòu)建的EGS與RNase P聯(lián)用的過程產(chǎn)生的是一種以催化方式進行的不可逆切割;(4)利用了細胞內(nèi)源性且含量豐富的RNase P,保證了該酶在細胞環(huán)境中的穩(wěn)定性和高效性;(5)由于對靶mRNA上切割位點的選擇不受特異核苷酸序列的限制,因此對靶位內(nèi)部的單堿基突變相對不敏感。有研究顯示[Plehn-Dujowich D,Altman S.Effective inhibition of influenza virus production in cultured cells by external guidesequences and ribonuclease P.PNAS.1998,957327-7332.],EGS上單個核苷酸的改變并不足以影響EGS/靶RNA復(fù)合物的穩(wěn)定性,從而也不會影響RNase P的切割效率。


      圖1為UL54基因C片段克隆到pGEM3z質(zhì)粒得到PU54-C質(zhì)粒的示意圖;圖2為PU54-C質(zhì)粒酶切分析的凝膠電泳圖;圖3為pUC19-EGS質(zhì)粒酶切分析的凝膠電泳圖;圖4為pUC19-M1 RNA質(zhì)粒酶切分析的凝膠電泳圖;圖5為底物RNA體外轉(zhuǎn)錄片段聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖;圖6為M1 RNA核酶體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖;圖7為EGS-C6體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖;圖8為rEGS-C6引導(dǎo)M1 RNA對底物C片段的切割的電泳分析圖;圖9為dEGS-C6引導(dǎo)M1 RNA對底物C片段的切割的電泳分析圖。
      其中,圖2中,泳道1為Wide Range DNA Ladder Marker,泳道2為PU54-C質(zhì)粒,泳道3為PU54-C質(zhì)粒的EcoR I+Hind III雙酶切產(chǎn)物;圖3中,泳道1為Wide Range DNA Ladder Marker,泳道2為pUC19-C6EGS,泳道3為pUC19-C6EGS質(zhì)粒的EcoR I+Hind III雙酶切產(chǎn)物,泳道4為EGS-C6寡核苷酸片段退火產(chǎn)物;圖4中,泳道1為Wide Range DNA Ladder Marker,泳道2為pUC19-M1 RNA克隆質(zhì)粒,泳道3為pUC19-M1 RNA質(zhì)粒的Kpn I+Xba I雙酶切產(chǎn)物,泳道4為M1 RNA PCR產(chǎn)物;圖5中,泳道1為RNA Marker,泳道2為C片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;圖6中,泳道1為RNA Marker,泳道2為M1 RNA核酶體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;圖7中,泳道1為RNA Marker,泳道2為EGS-C6體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;圖8中,泳道1為RNA Marker,泳道2為底物C片段空白對照,泳道3為底物C片段+M1 RNA+rEGS-C6;圖9中,泳道1為RNA Marker,泳道2為底物C片段空白對照,泳道3為底物C片段+M1 RNA+dEGS-C6。
      具體實施例方式
      實施例1質(zhì)粒和菌種的來源載體質(zhì)粒pGEM3z、pUC19,以及宿主大腸桿菌JM109、DH-5a均購自基因公司,為本領(lǐng)域的常用載體質(zhì)粒和宿主菌。
      主要試劑見表1
      表1

      其他主要試劑的配方見表2表2


      本實施例所涉及的所有引物合成由上海博亞公司以及北京奧康公司完成,所涉及的所有測序工作由上海博亞公司以及上海生工公司完成。
      (一)EGS靶位的確定高引導(dǎo)活性的EGS序列具備一定的特性,其識別的底物RNA在剪切位點-1、+1和+2位點處分別是嘧啶U/C、G和C的話,可能有利于切割位點雙螺旋二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定;此外,底物RNA的-2位點不能與EGS上的堿基配對(NCCA-3’必須游離)[Kufel J,Kirsebom LA.Different cleavage sites are aligneddifferently in the active site of M1 RNA,the catalytic subunit of Escherichia coliRNase P.PNAS.1996(93)6085-6090.],否則NCCA-3’這一引導(dǎo)M1 RNA切割的重要游離信號有可能失去功能。根據(jù)上述資料,利用Genetool軟件搜索UL54全基因(GENEBANK登錄號為LOCUS 9625671),得到具備這些特征的若干靶位點。針對EGS靶位在UL54基因中的分布情況,將UL54基因劃分為若干小片段,分別進行克隆,選擇自身含有T7啟動子的pGEM3z作為克隆載體。從中選出4個基因片段,命名為A、B、C、D四個片段。在研究M1GS核酶切割UL54基因片段的實驗(Su YZ,Li HJ,Li YQ,Chen HJ,Tang DS,Zhang X,Jiang H,ZhouTH.In Vitro Construction of Effective M1GS Ribozymes Targeting HCMV UL54RNA Segments.Acta Biochim Biophys Sin.2005 Mar;37(3)210-4)中發(fā)現(xiàn),上述底物小片段中,C片段的C6位點被M1GS核酶特異性切割的效率較高。因此,本發(fā)明選擇了長度為510bp的C片段作為底物。
      本發(fā)明選取的靶位點在UL54基因中的具體位置及序列如表3表3

      1、C片段的克隆C片段的全序列UL54基因的1367-1876序列1367 acgc cgccgccttt1381 ccctcggctt ctcacaacaa tccggccagc acggccgcca ccaaggtgta tattgcgggt1441 tcggtggtta tcgacatgta ccccgtatgc atggccaaga ctaactcgcc taactataag1501 ctcaacacta tggccgagct ttacctgcgg caacgcaagg atgacctgtc ctacaaggac1561 atcccgcgtt gtttcgtggc taatgccgag ggccgcgccc aggtaggccg ttactgtctg1621 caggacgccg tattggtgcg cgatctgttc aacaccatta attttcacta cgaggccggg1681 gccatcgcgc ggctggctaa aattccgttg cggcgtgtca tctttgacgg acagcagatc1741 cgtatctaca cctcgctgct ggacgagtgc gcctgccgcg attttatcct gcccaaccac1801 tacagcaaag gtacgacggt gcccgaaacg aatagcgttg ccgtgtcacc taacgccgct1861 atcatctcta ccgccg
      C片段克隆到pGEM3z載體中的方案見圖1。
      2、PU54-C質(zhì)粒的鑒定對PU54-C重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證,結(jié)果顯示雙酶切產(chǎn)物大小在500bp左右(圖2中第3泳道),此帶與C片段的理論大小(510bp,雙酶切片段實際長度520bp)相符。
      (二)RNA-based EGS的獲得1、EGS DNA的合成針對EGS-C6合成了4條短的DNA寡核苷酸片段如下a.5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGCACTCGTGTGCG-3’(35nt)b.5’-GTCTCCGCGCGCAGGTTCAAATCCTGCAGCAGCACCA-3’(37nt)c.5’-AACCTGCGCGCGGAGACCGCACACGAGTGCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’(48nt)d.5’-AGCTTGGTGCTGCTGCAGGATTTG-3’(24nt)在設(shè)計時已將T7啟動子設(shè)計在EGS-C6上游,因此,4種寡核苷酸片段以等摩爾數(shù)混合后退火生成含有T7啟動子的EGS-C6 DNA片段,具體反應(yīng)體系如表4表4

      此外,由于在設(shè)計時已經(jīng)將退火產(chǎn)物兩端用來克隆的酶切位點(EcoR I和Hind III)留出,故退火產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測大小合適后無須酶切即可直接用于和載體質(zhì)粒pUC19連接反應(yīng)。
      2、包含所述EGS的重組表達載體的制備對EGS-C6產(chǎn)物和pUC19載體雙酶切、連接,試劑、用量及反應(yīng)條件見表5
      表5

      酶切完畢,用苯酚/氯仿抽提純化,乙醇沉淀干燥后,溶解于10μl滅菌三蒸水,-20℃存放。為了獲得更高的陽性克隆篩選率,對pUC19質(zhì)粒載體雙酶切產(chǎn)物進行去磷酸化處理,見表6表6

      反應(yīng)完畢,苯酚/氯仿抽提純化,乙醇沉淀干燥后,溶解于10μl滅菌三蒸水,-20℃存放。
      然后將含有T7啟動子的EGS DNA片段的雙酶切產(chǎn)物和經(jīng)去磷酸化處理的pUC19質(zhì)粒載體雙酶切產(chǎn)物進行連接(克隆片段摩爾數(shù)∶載體摩爾數(shù)>5∶1),連接反應(yīng)的標準反應(yīng)體系如表7表7

      3、轉(zhuǎn)化體的制備、篩選、鑒定和測序取5μl連接液加入100μl大腸桿菌感受態(tài)細胞中,混勻,冰浴30min。42℃恒溫90s,勿晃動。立即轉(zhuǎn)移到冰水浴。加入400μl LB液體培養(yǎng)基,37℃水浴30-45min。取0.1~0.2mL轉(zhuǎn)化菌液涂布含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基。同時涂布無氨芐青霉素的對照。37℃生化培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)15min或更久,待菌液吸收完全后,倒置培養(yǎng)16~20hr。觀察轉(zhuǎn)化情況,挑菌落鑒定。平皿倒置保存于4℃冰箱。
      從轉(zhuǎn)化菌落中挑單菌落于5mL含50μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基試管中,高速振蕩培養(yǎng)6hr;甘油保存菌種后12000g/30s收集剩余菌體。將細菌沉淀溫和重懸于50μl TE中,加入等體積苯酚/氯仿,溫和振蕩后12000g/5min離心,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中用于瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒大小。選出克隆成功的質(zhì)粒后,對余下質(zhì)粒樣品進行苯酚/氯仿抽提,乙醇沉淀。獲得樣品可用于PCR以及酶切驗證。M1 RNA亞克隆質(zhì)粒pUC19-M1 RNA甘油菌送公司測序。
      4、EGS克隆質(zhì)粒的制備、鑒定采用質(zhì)粒抽提試劑盒與堿裂解法制備。
      試劑盒法采用Omega公司的小量質(zhì)粒抽提試劑盒,具體過程見其說明書。
      堿裂解法過程為接種轉(zhuǎn)化有pUC19質(zhì)粒載體的細菌(1%接種量)至LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜。12000g/30s收集菌體(1.5mL培養(yǎng)物),管口朝下甩凈培養(yǎng)基。將菌體沉淀重新懸浮于1mL STE中,12000g/30s收集菌體。甩凈STE,將細菌沉淀溫和重懸于100μl冰預(yù)冷的溶液I中。加200μl新配制的溶液II,溫和顛倒eppendorf管數(shù)次。加150μl冰預(yù)冷的溶液III,溫和顛倒數(shù)次使試劑充分混合。4℃,12000g/5min,上清轉(zhuǎn)移到另一離心管。等量苯酚/氯仿抽提。加2~2.5倍體積的無水乙醇,混勻后碎冰中沉淀DNA大約15min。4℃,12000g/15min,傾上清。加400μl 70%乙醇,溫和旋轉(zhuǎn)eppendorf管,使乙醇充分接觸管內(nèi)表面,4℃,12000g/5min。傾上清。用槍頭小心吸走管壁上的液體,室溫干燥沉淀30min。用50μl含RNase A(20μg/mL)的TE溶解沉淀。
      對pUC19-C6EGS質(zhì)粒進行雙酶切鑒定雙酶切結(jié)果顯示,其產(chǎn)物片段小于100bp(圖3第3泳道),此帶與EGS的理論大小(約80bp)相符,也與寡核苷酸片段退火結(jié)果相符(圖3第4泳道),電泳結(jié)果初步表明克隆成功。
      對pUC19-C6EGS質(zhì)粒進行PCR鑒定測序結(jié)果與C片段的序列相同,證實了克隆的正確。
      (三)DNA-based EGS的設(shè)計DNA-based EGS的設(shè)計原則與RNA-based EGS相同,所不同的只是它不需要體外轉(zhuǎn)錄生成EGS,直接化學(xué)合成即可,其合成序列分別為dEGS-C65’-GCACTCGTGTGCGGTCTCCGCGCGCAGGTTCAAATCCTGCAGCAGCACCA-3’(50nt)將合成的DNA-based EGS(dEGS-C6)稀釋成200pmol/μl,-20℃存放。
      (四)M1 RNA的克隆與鑒定采用自身不含T7啟動子的pUC19載體,在引物設(shè)計時人工加入T7啟動子,用于克隆片段的體外轉(zhuǎn)錄。
      對M1 RNA的克隆質(zhì)粒pUC19-M1 RNA進行雙酶切鑒定雙酶切結(jié)果顯示,產(chǎn)物約在400bp左右(圖4第3泳道),此帶與M1 RNA的理論大小(377bp,雙酶切片段實際長度386bp)相符;PCR結(jié)果顯示,產(chǎn)物為一條約400bp左右的高度特異性的帶(圖4第4泳道),此特異性條帶與M1 RNA的理論大小及雙酶切結(jié)果均相符,電泳結(jié)果初步表明克隆成功。
      對M1 RNA的克隆質(zhì)粒pUC19-M1 RNA進行PCR鑒定測序結(jié)果完全證實了克隆的正確(見附錄1)。
      對pUC19-M1RNA質(zhì)粒進行PCR鑒定測序結(jié)果與M1 RNA的序列(GENEBANK登錄號為M17569.1 GI147685)相同,證實了克隆的正確。
      1 gaagctgacc agacagtcgc cgcttcgtcg tcgtcctctt cgggggagac gggcggaggg61 gaggaaagtc cgggctccat agggcagggt gccaggtaac gcctgggggg gaaacccacg121 accagtgcaa cagagagcaa accgccgatg gcccgcgcaa gcgggatcag gtaagggtga181 aagggtgcgg taagagcgca ccgcgcggct ggtaacagtc cgtggcacgg taaactccac241 ccggagcaag gccaaatagg ggttcataag gtacggcccg tactgaaccc gggtaggctg301 cttgagccag tgagcgattg ctggcctaga tgaatgactg tccacgacag aacccggctt361 atcggtcagt ttcacct(五)體外轉(zhuǎn)錄1、底物UL54基因小片段的體外轉(zhuǎn)錄對C片段進行同位素標記的體外轉(zhuǎn)錄底物UL54基因C片段和D片段的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下(依表8順序依次加入,以防止轉(zhuǎn)錄緩沖液中的亞精胺使DNA沉淀)
      表8

      反應(yīng)完畢,每50μl轉(zhuǎn)錄體積加入1μl無RNA酶的胰DNA酶I(1mg/mL),混合均勻于37℃溫育15~30min。加入150μl DEPC的滅菌三蒸水,用等體積苯酚∶氯仿/異戊醇(25∶24/1)抽提。加入20μl 3M NaAc和3倍體積(660μl)的無水乙醇,混勻后冰浴1小時,4℃下12000g離心25min。小心吸走上清,將eppendorf管放置于超凈臺內(nèi)吹干(大約15分鐘,不用完全干透)。重新用200μl無RNA酶污染的水溶解沉淀(適當(dāng)指彈管底幫助溶解完全),加入20μl 3MNaAc;加入3倍體積(660μl)的無水乙醇,混勻后在-20℃放置備用。
      使用前,取出適量,4℃下12000g離心25min,小心吸走上清。每管加入300μl 75%乙醇洗滌沉淀,4℃下12000g離心25min,小心吸走上清,晾干后使用。底物RNA片段命名為UL54-C。
      底物RNA體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果底物C片段線性轉(zhuǎn)錄模板體外轉(zhuǎn)錄后得到實際長度分別為525nt的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,8%PAGE(7M Urea)分離,如圖5所示,電泳結(jié)果顯示條帶清晰,兩底物片段成分純凈,可用于同位素摻入轉(zhuǎn)錄和核酶的體外切割實驗。
      2、M1 RNA核酶的體外轉(zhuǎn)錄M1GS核酶的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下(依表9順序依次加入,以防止轉(zhuǎn)錄緩沖液中的亞精胺使DNA沉淀)
      表9

      反應(yīng)完畢,每50μl轉(zhuǎn)錄體積加入1μl無RNA酶的胰DNA酶I(1mg/mL),混合均勻于37℃溫育15~30min。加入150μl DEPC的滅菌三蒸水,用等體積苯酚∶氯仿/異戊醇(25∶24/1)抽提。加入20μl 3M NaAc和3倍體積(660μl)的無水乙醇,混勻后冰浴1小時,4℃下12000g離心25min。小心吸走上清,將eppendorf管放置于超凈臺內(nèi)吹干(大約15分鐘,不用完全干透)。重新用200μl無RNA酶污染的水溶解沉淀(適當(dāng)指彈管底幫助溶解完全),加入20μl 3MNaAc;加入3倍體積(660μl)的無水乙醇,混勻后在-20℃放置備用。
      使用前,取出適量,4℃下12000g離心25min,小心吸走上清。每管加入300μl 75%乙醇洗滌沉淀,4℃下12000g離心25min,小心吸走上清,晾干后使用。底物RNA片段即為M1 RNA核酶。
      M1 RNA核酶體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果M1 RNA核酶的線性轉(zhuǎn)錄模板體外轉(zhuǎn)錄后,得到實際長度為377nt的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,8%PAGE(7M Urea)分離,如圖6所示,電泳結(jié)果顯示條帶清晰,M1 RNA成分純凈,可以用于體外切割實驗。
      3、RNA-based EGS的體外轉(zhuǎn)錄EGS-C6的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下(依表10順序依次加入,以防止轉(zhuǎn)錄緩沖液中的亞精胺使DNA沉淀)
      表10

      反應(yīng)完畢,每50μl轉(zhuǎn)錄體積加入1μl無RNA酶的胰DNA酶I(1mg/mL),混合均勻于37℃溫育15~30min。加入150μl DEPC的滅菌三蒸水,用等體積苯酚∶氯仿/異戊醇(25∶24/1)抽提。加入20μl 3M NaAc和3倍體積(660μl)的無水乙醇,混勻后冰浴1小時,4℃下12000g離心25min。小心吸走上清,將eppendorf管放置于超凈臺內(nèi)吹干(大約15分鐘,不用完全干透)。重新用200μl無RNA酶污染的水溶解沉淀(適當(dāng)指彈管底幫助溶解完全),加入20μl 3MNaAc;加入3倍體積(660μl)的無水乙醇,混勻后在-20℃放置備用。
      使用前,取出適量,4℃下12000g離心25min,小心吸走上清。每管加入300μl 75%乙醇洗滌沉淀,4℃下12000g離心25min,小心吸走上清,晾干后使用。底物RNA片段命名為rEGS-C6。
      RNA-based EGS體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果EGS-C6的線性轉(zhuǎn)錄模板體外轉(zhuǎn)錄后,得到實際長度均為50nt的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,8%PAGE(7M Urea)分離,如圖7所示,電泳結(jié)果顯示條帶清晰,EGS RNA成分純凈,可以用于引導(dǎo)體外切割實驗。
      (六)EGS引導(dǎo)下M1 RNA對底物RNA片段的體外切割實驗1、RNA-based EGS引導(dǎo)下M1 RNA對底物RNA片段的體外切割P28、42-44將保存于乙醇中的底物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、M1 RNA核酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及相應(yīng)的EGS轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以1∶2∶5的比例(220μl∶440μl∶1100μl)取樣,其中底物與相應(yīng)EGS以1∶5比例(220μl∶1100μl)在一管中混合,M1 RNA單獨作為一管(440μl)。同時取220μl底物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的乙醇保存液為單獨一管作對照用。使用前,取出適量,4℃下12000g離心25min,小心吸走上清。每管加入300μl 75%乙醇洗滌沉淀,4℃下12000g離心25min,小心吸走上清,晾干后使用。每管均用8μl DEPC處理的三蒸水溶解。其后按照表11反應(yīng)體系進行操作表11

      在進行上述酶切反應(yīng)的同時,設(shè)置空白對照反應(yīng),空白對照反應(yīng)體系如表12表12

      反應(yīng)完畢,加入等體積反應(yīng)終止液(RNA加樣緩沖液)終止反應(yīng)(空白對照也加等體積反應(yīng)終止液)。立即進行PAGE分離。
      體外切割產(chǎn)物的理論預(yù)計EGS引導(dǎo)M1 RNA切割C底物產(chǎn)生的產(chǎn)物片段理論大小見下表13表13

      體外切割產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果在標準體外切割條件下,將底物(α-32P-UTP標記)、核酶以及相應(yīng)的RNA-based EGS按照1∶2∶5的摩爾比例混合反應(yīng)1hr,經(jīng)8%濃度的7M Urea聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、壓屏、掃描,得到如圖8所示的切割圖片。
      對底物C片段的體外切割結(jié)果(圖8)顯示,rEGS-C6能夠成功引導(dǎo)M1RNA對底物C片段進行切割,生成一個特異性的產(chǎn)物,片段大小符合理論預(yù)計的5’產(chǎn)物大小,而3’產(chǎn)物由于片段過小沒有顯影出來(圖8第3泳道)。
      2、DNA-based EGS引導(dǎo)下M1 RNA對底物RNA片段的體外切割P29、44-47將保存于乙醇中的底物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與M1 RNA核酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以1∶2的比例(220μl∶440μl)取樣,各自一管,同時取220μl底物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的乙醇保存液為單獨一管作對照用。各自單獨離心、洗滌、晾干,每管均用8μl DEPC處理的三蒸水溶解。DNA-based EGS按200pmol/μl稀釋后待用。其后按照如下表14反應(yīng)體系進行操作表14

      在進行上述酶切反應(yīng)的同時,設(shè)置空白對照反應(yīng),空白對照反應(yīng)體系如下表15表15


      反應(yīng)完畢,加入等體積反應(yīng)終止液(RNA加樣緩沖液)終止反應(yīng)(空白對照也加等體積反應(yīng)終止液)。立即進行PAGE分離。
      在標準體外切割條件下,底物(α-32P-UTP標記)、核酶按照1∶2的摩爾比例,加上200pmol相應(yīng)的DNA-based EGS,三者混合反應(yīng)1hr,經(jīng)8%濃度的7MUrea聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、壓屏、掃描,得到如圖9所示的切割圖片。
      對底物C片段的體外切割結(jié)果(圖9)顯示,dEGS-C6能夠成功引導(dǎo)M1RNA對底物C片段進行切割,生成一個特異性的產(chǎn)物,片段大小符合理論預(yù)計的5’產(chǎn)物大小,而3’產(chǎn)物由于片段過小沒有顯影出來(圖9第3泳道)。
      與RNase P核酶聯(lián)用的外部引導(dǎo)基因及其應(yīng)用序列表.TXTSEQUENCE LISTING&lt;110&gt;暨南大學(xué)&lt;120&gt;與RNase P核酶聯(lián)用的外部引導(dǎo)基因C6及其應(yīng)用&lt;130&gt;
      &lt;160&gt;6&lt;170&gt;PatentIn version 3.2&lt;210&gt;1&lt;211&gt;50&lt;212&gt;RNA&lt;213&gt;人工序列&lt;400&gt;1gcacucgugu gcggucuccg cgcgcagguu caaauccugc agcagcacca 50&lt;210&gt;2&lt;211&gt;50&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;400&gt;2gcactcgtgt gcggtctccg cgcgcaggtt caaatcctgc agcagcacca 50&lt;210&gt;3&lt;211&gt;510&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;UL54基因的1367-1876序列&lt;400&gt;3acgccgccgc ctttccctcg gcttctcaca acaatccggc cagcacggcc gccaccaagg1426tgtatattgc gggttcggtg gttatcgaca tgtaccccgt atgcatggcc aagactaact1486cgcctaacta taagctcaac actatggccg agctttacct gcggcaacgc aaggatgacc1546tgtcctacaa ggacatcccg cgttgtttcg tggctaatgc cgagggccgc gcccaggtag1606gccgttactg tctgcaggac gccgtattgg tgcgcgatct gttcaacacc attaattttc1666actacgaggc cggggccatc gcgcggctgg ctaaaattcc gttgcggcgt gtcatctttg1726acggacagca gatccgtatc tacacctcgc tgctggacga gtgcgcctgc cgcgatttta1786tcctgcccaa ccactacagc aaaggtacga cggtgcccga aacgaatagc gttgccgtgt1846cacctaacgc cgctatcatc tctaccgccg 1876&lt;210&gt;4&lt;211&gt;17&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;UL54基因的1760-1776序列&lt;400&gt;4cctcgctgctagacgag17&lt;210&gt;5&lt;211&gt;
      &lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;4條短的DNA寡核苷酸序列&lt;400&gt;5a.5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGCACTCGTGTGCG-3’(35nt)b.5’-GTCTCCGCGCGCAGGTTCAAATCCTGCAGCAGCACCA-3’(37nt)c.5’-AACCTGCGCGCGGAGACCGCACACGAGTGCTATAGTGAGTCGTATTAG-3’(48nt)d.5’-AGCTTGGTGCTGCTGCAGGATTTG-3’(24nt)&lt;210&gt;6&lt;211&gt;377&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;pUC19-M1 RNA質(zhì)粒DNA序列&lt;400&gt;6gaagctgacc agacagtcgc cgcttcgtcg tcgtcctctt cgggggagac gggcggaggg60
      與RNase P核酶聯(lián)用的外部引導(dǎo)基因及其應(yīng)用序列表.TXTgaggaaagtc cgggctccat agggcagggt gccaggtaac gcctgggggg gaaacccacg120accagtgcaa cagagagcaa accgccgatg gcccgcgcaa gcgggatcag gtaagggtga180aagggtgcgg taagagcgca ccgcgcggct ggtaacagtc cgtggcacgg taaactccac240ccggagcaag gccaaatagg ggttcataag gtacggcccg tactgaaccc gggtaggctg300cttgagccag tgagcgattg ctggcctaga tgaatgactg tccacgacag aacccggctt360atcggtcagt ttcacct 37權(quán)利要求
      1.與RNase P核酶聯(lián)用的外部引導(dǎo)基因,其特征在于是以RNA為基礎(chǔ)的外部引導(dǎo)序列,如SEQ ID NO1所示,或是以DNA為基礎(chǔ)的外部引導(dǎo)序列,如SEQ ID NO2所示。
      2.能轉(zhuǎn)錄出如SEQ ID NO1所示的外部引導(dǎo)序列的DNA序列。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA序列,其特征在于其上游含有T7啟動子。
      4.包含如SEQ ID NO2或權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所示的DNA序列的重組表達載體。
      5.用如權(quán)利要求4所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞所得的轉(zhuǎn)化體。
      6.權(quán)利要求1所述的外部引導(dǎo)基因在制備抗HCMV病毒藥物中的應(yīng)用。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了與RNase P核酶聯(lián)用的外部引導(dǎo)基因及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的與RNase P核酶聯(lián)用的外部引導(dǎo)序列,是以RNA為基礎(chǔ)的外部引導(dǎo)序列,具有SEQ ID NO1所列的序列,還包括以DNA為基礎(chǔ)的外部引導(dǎo)序列,具有SEQ IDNO2所列的序列,均具有引導(dǎo)RNase P切割HCMV聚合酶mRNA片段的特異引導(dǎo)切割活性,其靶位點在UL54基因的1760-1776。本發(fā)明所述的EGS是一種用于研究開發(fā)治療HCMV感染疾病及相關(guān)并發(fā)癥的極有應(yīng)用前景和臨床實用價值的基因藥物,在基礎(chǔ)研究和臨床治療等領(lǐng)域已呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。
      文檔編號A61P31/12GK1807619SQ200610032790
      公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月11日
      發(fā)明者周天鴻, 李月琴, 呂靜竹, 李弘劍 申請人:暨南大學(xué)
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