專利名稱：一種預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松癥的活性骨肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥藥品、生化藥品、保健食品領(lǐng)域，具體涉及一種預(yù)防、治療骨質(zhì)松癥的活性骨肽及其制備方法背景技術(shù)我國現(xiàn)有9000多萬人患骨質(zhì)疏松癥，占總?cè)丝诘?.1％，2050年達(dá)到2.2億。隨著世界人口的老齡化，發(fā)生骨質(zhì)疏松癥與骨量減少的人數(shù)日益增多，面對骨質(zhì)疏松癥龐大的患病群體，藥物的需求量逐年增多，從經(jīng)濟(jì)學(xué)觀點看，研究與開發(fā)抗骨質(zhì)疏松癥藥物，特別是具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型藥物及保健食品，對提高人類健康水平和生存質(zhì)量有著重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
目前，用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的藥物有三類(1)抑制破骨細(xì)胞活性藥物雌激素、降鈣素、雙膦酸鹽、異丙氧黃酮等；(2)促進(jìn)成骨生成藥物，如氟化物、甲狀旁腺激素、蛋白質(zhì)合成激素等；(3)礦化作用藥物，如鈣制劑、維生素D等。長期服用這些激素或化學(xué)藥物會對人體產(chǎn)生大量的毒副作用，甚至導(dǎo)致癌癥。開發(fā)安全、有效、低毒順應(yīng)性強(qiáng)的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的藥物是醫(yī)藥工作者的重要任務(wù)。
現(xiàn)代生物技術(shù)認(rèn)識到動物骨中富含多種氨基酸、活性骨肽、膠原蛋白和促骨生長因子，具有預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥及促進(jìn)骨骼發(fā)育的用途。骨肽的制備方法大致分為兩種酸水解和高溫水溶性提取，它們的缺點是選擇性差、生物活性低、骨肽的得率低。
本發(fā)明采用特定條件下的酶水解骨蛋白方法所制備的活性骨肽可克服以上缺點，提高活性骨肽預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥及促進(jìn)骨骼發(fā)育的作用。
本發(fā)明正是基于這種背景和需求而產(chǎn)生的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存的缺點，提供一種采用蛋白酶水解骨蛋白制備活性骨肽的方法及其用于預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松癥。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種采用蛋白酶水解骨蛋白制備活性骨肽的方法，該方法是①取新鮮的動物四肢骨，清洗，消毒，粉碎，在恒溫反應(yīng)罐內(nèi)以蛋白酶控制水解離心分取上清液；②上清液脫脂，濃縮，乙醇提取，濾出上清液；③上清液脫醇，離心超濾，收集濾過液得生物活性骨肽；④活性骨肽原料制成任何一種藥劑學(xué)上所述的劑型。
所述蛋白酶是木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶。
所述動物四肢骨為鹿、牛、豬、羊、馬、犬、兔等動物四肢骨。
所述采用蛋白酶水解骨蛋白制備活性骨肽的方法，在步驟①中動物四肢骨粉碎成1～2mm的骨粒，恒溫反應(yīng)罐溫度為50℃，pH為5；在步驟②中上清液置于0～4℃冰箱中放置24小時，脫脂，加熱至60℃，60分鐘，在50～60℃條件下減壓濃縮，在濃縮液中加入6倍體積濃度為95％的乙醇，冷凍保存36小時，濾出上清液；在步驟③中上清液在50～60℃減壓脫醇，15～25℃離心超濾，聚丙烯(PP)中空纖維膜截留分子量為10000道爾頓的活性骨肽。
采用蛋白酶水解骨蛋白制備的活性骨肽的分子量小于或等于10000道爾頓。
所述劑型為腸道吸收制劑、腸溶膠囊、腸溶片劑、注射劑、凍干粉針劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、口服液、氣霧劑、噴霧劑、滴鼻劑。
一種采用蛋白酶水解骨蛋白制備的活性骨肽的用途，所述活性骨肽用于制備預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥及促進(jìn)骨骼發(fā)育的藥物及保健食品。
本發(fā)明的特點1.本發(fā)明得到的活性骨肽對成骨細(xì)胞的增值、分化作用確定，生物活性高，可用于制備預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥及促進(jìn)骨骼發(fā)育的藥物或保健食品。
2、本發(fā)明得到的活性骨肽分子量小于或等于10000道爾頓，制成腸道吸收制劑，易于被人體吸收和利用，避免口服給藥后胃酸水解和肝臟的首過效應(yīng)，顯著提高生物利用度。
3、本發(fā)明制備的活性骨肽方法，采用蛋白酶對骨蛋白進(jìn)行選擇性受控水解，其工藝條件溫和，均在60℃以下操作，有利于保留小分子多肽的生物活性。
4、本發(fā)明得到的活性骨肽急性毒性試驗結(jié)果表明，本發(fā)明產(chǎn)品安全可靠。


圖1是本發(fā)明工藝流程圖；圖2是100mg/L活性骨肽培養(yǎng)液作用大鼠顱骨細(xì)胞礦化骨結(jié)節(jié)圖；圖3是50mg/L活性骨肽培養(yǎng)液作用大鼠顱骨細(xì)胞礦化骨結(jié)節(jié)圖；圖4是25mg/L活性骨肽培養(yǎng)液作用大鼠顱骨細(xì)胞礦化骨結(jié)節(jié)圖；圖5是12.5mg/L活性骨肽培養(yǎng)液作用大鼠顱骨細(xì)胞礦化骨結(jié)節(jié)圖；圖6是空白培養(yǎng)液作用大鼠顱骨細(xì)胞礦化骨結(jié)節(jié)圖；具體實施方式
下面的實施例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不應(yīng)該是對本發(fā)明范圍的限制實施例一取鹿新鮮四肢骨20kg，用常水洗凈血漿、去掉筋膜、肌肉，用蒸餾水沖洗3次，紫外消毒，入清潔的骨破碎機(jī)中，粉碎成骨粒1～2mm，加蒸餾水100kg，在恒溫反應(yīng)罐中加熱至50℃，用HCl溶液調(diào)節(jié)pH值5.0，攪拌下加入木瓜蛋白酶溶液，酶活力為≥6000U/mg，攪拌70～80r/min6小時，離心，取上清液，放置室溫，置于0～4℃冰箱內(nèi)24h，脫脂。加熱至60℃，60min，50～60℃真空濃縮器濃縮，濃縮液加入6倍體積的95％乙醇溶液，冷凍保存36小時，濾出上清，50～60℃真空濃縮器回收乙醇至無醇味，用5L無菌蒸餾水溶解，3000r/min離心15min，上清超濾(膜截留分子量為10000)，收集濾液，即得生物活性鹿骨小分子多肽類。
用本發(fā)明制備的活性骨肽對新生大鼠顱骨進(jìn)行體外培養(yǎng)，進(jìn)行了成骨細(xì)胞增殖、分化試驗，以證明采用本發(fā)明制備的活性骨肽所具有預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松癥、促進(jìn)骨骼發(fā)育的作用細(xì)胞培養(yǎng)于無菌條件下，取新生大鼠顱骨，用PBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗數(shù)次，剔除結(jié)締組織，剪碎，0.25％胰蛋白酶消化10min，棄酶液，加入0.1％的透明質(zhì)酸酶和0.2％I型膠原酶消化液，37℃恒溫振蕩消化30min，取上清，2000r/min離心10min，取沉淀細(xì)胞用不含血清的DMEN培養(yǎng)液洗滌、離心一次，再取沉淀細(xì)胞以10％的胎牛血清DMEN(L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉)培養(yǎng)基重懸，如此反復(fù)消化顱骨碎片5次，將分次收集的細(xì)胞混勻，細(xì)胞數(shù)1×105.ml-1，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h換液，以后每隔2～3d換液一次，細(xì)胞融合后，用0.25％胰蛋白酶消化、傳代。
1.活性骨肽對新生大鼠成骨細(xì)胞增殖作用取0.25％胰蛋白酶消化融合成片的成骨細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液，5×104.ml-1，接種于96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔，24小時后將培養(yǎng)液換成1％的胎牛血清DMEN培養(yǎng)基，90μl/孔，同時加入各種濃度的活性骨肽，使其終濃度為含原液的0.1、1、10、25、50mg/L，對照組加入等量的三蒸水，加藥后24、48、96小時加入MTT(噻唑藍(lán)法)20μl，37℃孵育4小時，吸出培養(yǎng)液，加入150μl DMEM(Dulbcco’s Modifed Eagle Medium)培養(yǎng)液，待結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀測定吸光值，檢測波長570nm，參比波長630nm。檢測結(jié)果見表1表1活性骨肽對新生大鼠成骨細(xì)胞增殖率的測定結(jié)果(x±S，n＝8)

△與空白對照組比較P＜0.01數(shù)據(jù)顯示，活性骨肽25mg/L、50mg/L劑量組對新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞有顯著增殖作用。本實驗說明，活性骨肽刺激大鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖，在決定新骨形成中起重要作用，可預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松癥以及促進(jìn)骨骼發(fā)育。
2.活性骨肽對新生大鼠成骨細(xì)胞ALP(堿性磷酸酶)活性的作用
細(xì)胞培養(yǎng)液加入活性骨肽的量及對照組設(shè)置與成骨細(xì)胞增值率測定的設(shè)置相同，方法為置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5d，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗孔2次，加入PNPF孵育液150μl，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min，加入0.4mol.L-1NaOH 50μl終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀檢測A值(吸光度值)，波長405nm。檢測結(jié)果見表2表2活性骨肽對新生大鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的測定結(jié)果(x±S，n＝8)

△與空白對照組比較P＜0.01數(shù)據(jù)顯示，活性骨肽0.1mg/L、1mg/L、10mg/L劑量組新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性顯著升高，說明骨形成作用增強(qiáng)。堿性磷酸酶是參與骨代謝的重要蛋白，通過分解磷酸酯、增加局部無機(jī)磷酸的濃度而促進(jìn)骨基質(zhì)鈣化，促進(jìn)骨骼發(fā)育及骨的形成。
3.活性骨肽急性毒性試驗取小鼠20只，觀察活性骨肽300mg/ml腹腔注射給藥0.4ml/20g所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況，7日內(nèi)無異常反應(yīng)、無死亡。小鼠急性毒性試驗結(jié)果是人用量的3500倍，證明本發(fā)明產(chǎn)品安全可靠。
4.活性骨肽對大鼠顱骨細(xì)胞體外培養(yǎng)礦化骨結(jié)節(jié)的作用通對大鼠顱骨細(xì)胞培養(yǎng)觀察，說明100mg/L、50mg/L、25mg/L活性骨肽培養(yǎng)液對大鼠顱骨細(xì)胞培養(yǎng)礦化骨結(jié)節(jié)的作用較強(qiáng)，礦化骨結(jié)節(jié)的數(shù)量，100mg/L培養(yǎng)液24孔板每孔可達(dá)4010個礦化骨結(jié)節(jié)，根據(jù)培養(yǎng)液的濃度依次遞減。見附圖2至6。
5.腸溶膠囊釋放度測定結(jié)果

在人工腸溶液中50分鐘時全部崩解并釋放。在人工胃液中5小時，膠囊不崩解、變形。說明活性骨肽腸溶膠囊可避免胃酸的水解，在腸部吸收，提高了活性骨肽的生物利用度。
6.活性骨肽腸溶膠囊對切除卵巢SD大鼠抗骨質(zhì)疏松作用取3月齡的雌性SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只。假手術(shù)組、切除卵巢組、切除卵巢+己烯雌酚組、切除卵巢+低劑量活性骨肽(5mg.kg-1)組、切除卵巢+中劑量活性骨肽(20mg.kg-1)組、切除卵巢+高劑量活性骨肽(80mg.kg-1)組。給藥3個月后，檢測①股骨礦含量鈣(Ca)、磷(P)含量測定；②骨形態(tài)計量學(xué)分析測定骨小梁密度、骨小梁面積、皮質(zhì)骨面積、皮質(zhì)骨面積。
結(jié)果見表4表4活性骨肽腸溶膠囊對SD大鼠抗骨質(zhì)疏松作用(x±S，n＝10)

注△P＜0.05，△△△P＜0.001與假手術(shù)組比較；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.01與切除卵巢模型組比較本實驗說明活性骨肽中、高劑量組的骨鈣含量與切除卵巢模型組比較有顯著升高的作用(P＜0.001)；經(jīng)活性骨肽治療的切除卵巢大鼠骨小梁數(shù)目明顯增多、變粗、排列略整，骨小梁體積明顯增大，大劑量組接近假手術(shù)組，與切除卵巢模型組比較有顯著性差異(P＜0.001)；經(jīng)活性骨肽治療的切除卵巢大鼠皮質(zhì)骨明顯增加，骨髓腔變小，個別大鼠皮質(zhì)骨厚度接近假手術(shù)組，皮質(zhì)裂隙變小。
此實驗結(jié)果說明活性骨肽能明顯改善去卵巢大鼠骨鈣含量和松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨病理形態(tài)，說明活性骨肽具有增加組織的承載力，提高骨骼的抵抗外界沖擊能力，降低骨脆性、防止骨量丟失，能預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。
實施例二分別取新鮮羊、牛、豬、馬、犬、兔等動物的四肢骨，按上述實施例一的方法制備活性骨肽，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)及動物實驗觀察，也有一定的促進(jìn)骨形成的作用，可用于預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松癥。
實施例三分別取新鮮羊、牛、豬、馬、犬、兔等動物的四肢骨，按上述實施例一的方法，分別改用胃蛋白酶，胰蛋白酶、糜蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶，取代木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解所制備的活性骨肽，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)及動物實驗觀察，也有很好的促進(jìn)骨形成的作用，也可用于預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松癥。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松癥的活性骨肽的制備方法，該方法是采用蛋白酶水解骨蛋白制備活性骨肽，其特征是①取新鮮的動物四肢骨，清洗，消毒，粉碎，加入蒸餾水，在恒溫反應(yīng)罐內(nèi)以蛋白酶控制水解，離心分取上清液；②上清液脫脂，濃縮，乙醇提取，濾出上清液；③上清液脫醇，離心超濾，收集濾過液得生物活性骨肽；④活性骨肽原料制成任何一種藥劑學(xué)上所述的劑型。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的采用蛋白酶水解骨蛋白制備活性骨肽的方法，其特征是所述蛋白酶是木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的采用蛋白酶水解骨蛋白制備活性骨肽的方法，其特征是所述動物四肢骨為鹿、牛、豬、羊、馬、犬、兔等動物四肢骨。
4.據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的采用蛋白酶水解骨蛋白制備活性骨肽的方法，其特征是在步驟①中動物四肢骨粉碎成1～2mm的骨粒，恒溫反應(yīng)罐溫度為50℃，pH＝5；在步驟②中上清液置于0～4℃冰箱中放置24小時，脫脂，加熱至60℃，60分鐘，在50～60℃條件下減壓濃縮，在濃縮液中加入6倍體積濃度為95％的乙醇，冷凍保存36小時，濾出上清液；在步驟③中上清液在50～60℃減壓脫醇，15～25℃離心超濾，截留分子量為10000道爾頓活性骨肽。
5.據(jù)權(quán)利要求4所述的采用蛋白酶水解骨蛋白制備活性骨肽的方法，其特征是所得到活性骨肽的分子量小于或等于10000道爾頓。
6.據(jù)權(quán)利要求5所述的采用蛋白酶水解骨蛋白制備活性骨肽的方法，其特征是所述劑型為腸道吸收制劑、腸溶膠囊、腸溶片劑、注射劑、凍干粉針劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、口服液、氣霧劑、噴霧劑、滴鼻劑。
7.一種采用蛋白酶水解骨蛋白制備的活性骨肽的用途，其特征是所述活性骨肽用于制備預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥及促進(jìn)骨骼發(fā)育的藥物及保健食品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松癥的活性骨肽及其制備方法，該方法是①取新鮮的動物四肢骨，清洗，消毒，粉碎，加入蒸餾水，在恒溫反應(yīng)罐內(nèi)以蛋白酶控制水解，離心分取上清液；②上清液脫脂，濃縮，乙醇提取，濾出上清液；③上清液脫醇，離心超濾，收集濾過液得生物活性骨肽；④活性骨肽原料制成任何一種藥劑學(xué)上所述的劑型。本發(fā)明工藝條件溫和，均在60℃以下操作，有利于保留小分子多肽的生物活性，得到的活性骨肽，分子量小于或等于10000道爾頓，對成骨細(xì)胞的增值、分化作用確定，生物活性高，易于被人體吸收和利用，適用于制成腸道吸收制劑，顯著提高生物利用度，并可制成保健食品。
文檔編號A61K35/32GK1843502SQ20061003305
公開日2006年10月11日 申請日期2006年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月16日
發(fā)明者李延平, 崔燎, 鄧亦峰, 吳科鋒, 艾春媚, 劉義, 黃連芳 申請人:廣東醫(yī)學(xué)院