專利名稱：：猴耳環(huán)提取物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及天然植物提取物在藥品或食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：中藥材猴耳環(huán)[Pithecellobiumclypeariaenth./Archidendronclypearia(Jack).Nielsen]為豆科含羞草涎樹屬植物。猴耳環(huán)為喬木，分布于熱帶亞洲。猴耳環(huán)又名圍涎樹、雞三樹等，其葉、種子和果實均可入藥，民間用于燒傷、燙傷的治療?！靶l(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)”中成藥方劑第六冊公開了一種猴耳環(huán)消炎片和膠囊，它是由猴耳環(huán)的水提取物制備的片劑和膠囊劑，在臨床上用于治療上呼吸道感染、急性咽喉炎、急性扁桃體炎、急性腸炎、細菌性痢疾等由炎癥引起的疾病。國內(nèi)外有關(guān)植物猴耳環(huán)的藥理活性和化學(xué)成分的研究并不多，在文獻“HPLC法測定猴耳環(huán)消炎片中沒食子酸的含量”中藥材2000，23(11)708-708報道認為沒食子酸是猴耳環(huán)抗菌消炎的活性成分。但對于猴耳環(huán)提取物的其它作用尚未見有報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是開發(fā)植物猴耳環(huán)的新用途。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案之一是取植物猴耳環(huán)用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物，在制備抗病毒藥物應(yīng)用。另一方案是取植物猴耳環(huán)用水或95％的乙醇溶液提取的提取物，在制備抗氧化食品中的應(yīng)用。在制備抗病毒藥物、抗氧化食品時，可采用一種含植物猴耳環(huán)用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物為活性成分，添加常規(guī)的藥用輔料或食品添加劑制成的組合物。組合物中含猴耳環(huán)提取物活性成分的量視不同的劑型，不同的使用場合而不同，以添加填充劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、包衣劑糖漿劑、防腐劑等制成單位劑量含10～1000mg的猴耳環(huán)提取物干品，按常規(guī)的藥物或食品制劑技術(shù)制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、丸劑、口服液等口服劑型較合適。本發(fā)明的有益效果是開拓了猴耳環(huán)植物的新用途。下面通過具體實施例闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但不以具體實施例限制本發(fā)明。具體實施例方式實施例1、植物猴耳環(huán)水提取物的制備方法采用“衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)”中成藥方劑第六冊公開的制備猴耳環(huán)膠囊劑中的猴耳環(huán)提取方法取猴耳環(huán)幼枝、葉200公斤，加入水2000升，煎煮2小時，共煎煮二次，合并煎葉，濾過，濾液減壓濃縮，干燥制得約30公斤的猴耳環(huán)水提取物干浸膏。實施例2、植物猴耳環(huán)50％的乙醇溶液提取物的制備取猴耳環(huán)干燥葉200公斤，加入50％的乙醇2000升，回流提取3小時。提取液靜置，過濾，濾液減壓濃縮，干燥制得32公斤的猴耳環(huán)50％乙醇溶液提取物干浸膏。實施例3、植物猴耳環(huán)75％的乙醇溶液提取物的制備取猴耳環(huán)干燥葉200公斤，加入75％的乙醇2000升，回流提取3小時。提取液靜置，過濾，濾液減壓濃縮，干燥制得34公斤的猴耳環(huán)得到75％的乙醇溶液提取物干浸膏。實施例4、植物猴耳環(huán)95％的乙醇溶液提取物的制備取猴耳環(huán)干燥葉200公斤，加入95％的乙醇2000升，回流提取3小時。提取液靜置，過濾，濾液減壓濃縮，干燥制得36公斤的猴耳環(huán)得到95％的乙醇溶液提取物干浸膏。下面通過試驗證明本發(fā)明的用途試驗例1、猴耳環(huán)提取物體外抗病毒生物活性試驗實驗材料受試藥物上述實施例1.2.3.4.的樣品以三蒸水配制成70mg干膏/ml，隔水煮沸20分鐘滅菌。陽性對照藥病毒唑(三氮唑核苷Ribavirin)，湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究所產(chǎn)品。雙黃連口服液，哈藥集團三精制藥有限公司生產(chǎn)。病毒流感病毒甲3型(A3)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(ADV3)、腺病毒7型(ADV7)、單純皰疹病毒1型(HSV-1)、單純皰疹病毒2型(HSV-2)、腸道病毒科薩奇B3(CoxB3)，鼻病毒(RV)、腮腺炎病毒用于體外實驗；流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1，用于體內(nèi)實驗。均購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所，本實驗室傳代后保存于-70℃冰箱備用。動物ICR小鼠，體重13～15g，雌雄各半。細胞人喉癌傳代細胞Hep-2株，購自衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所。細胞培養(yǎng)液含10％小牛血清、0.29mg谷氨酰胺/ml、100u/ml青、鏈霉素。細胞維持液除所含小牛血清為2％外，其他含量均同培養(yǎng)液?？共《驹囼灧椒?、對Hep-2培養(yǎng)細胞的毒性試驗方法按常規(guī)實驗操作，將瓶中Hep-2細胞消化下來，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，長成單層細胞后，進行試驗將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液傾去，加入以維持液連續(xù)2倍稀釋的藥液200μl/孔，每稀釋度加4孔，第8行留4孔不加藥作正常細胞對照。將培養(yǎng)板置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，每日用倒置顯微鏡觀察藥液對細胞的影響。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下毒性實驗結(jié)果判斷以下結(jié)果表中的數(shù)字表示藥物對細胞的毒性程度分級“-”表示細胞生長基本正常，未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象；“1”表示中毒細胞發(fā)生率在25％以下；“2”表示中毒細胞發(fā)生率在25％～50％之間；“3”表示中毒細胞發(fā)生率在50％～75％之間；“4”表示中毒細胞已在75％以上。若毒性為“1”及其以下“-”，則視為陰性，可認為此濃度藥樣對細胞無中毒現(xiàn)象，其余的“2”及其以上各級，均視為陽性，即所試藥樣在此濃度對細胞有中毒作用。利用Reed-Muench法計算50％毒性濃度(TC50)。試驗結(jié)果猴耳環(huán)水提取物50％毒性濃度TC50＝0.208mg干浸膏/ml，TC0＝0.145mg干浸膏/ml，猴耳環(huán)50％乙醇提取物50％毒性濃度TC50＝0.198mg干浸膏/ml，TC0＝0.140mg干浸膏/ml，猴耳環(huán)75％乙醇提取物50％毒性濃度TC50＝0.190mg干浸膏/ml，TC0＝0.135mg干浸膏/ml，猴耳環(huán)95％乙醇提取物50％毒性濃度TC50＝0.185mg干浸膏/ml，TC0＝0.130mg干浸膏/ml。同樣方法求得雙黃連口服液的TC50＝2.12mg生藥/ml，病毒唑Ribavirin的TC50＝0.714mg/ml。選擇稀釋度對細胞生長無影響的藥液TC0及其以下濃度作抗病毒實驗。2、各病毒滴度(TCID50)的測定按常規(guī)實驗操作，將瓶中Hep-2細胞消化下來，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，長成單層細胞后，進行病毒毒力滴定試驗，測定出各病毒的滴度(TCID50)。具體操作為將各病毒以細胞維持液作10倍連續(xù)稀釋7個濃度，倒去細胞板中培養(yǎng)液，將每稀釋度病毒液加入板中4孔，每孔100μl，留1行不加病毒液改加維持液作為正常細胞對照，補足維持液到200μl/孔。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日開始觀察細胞病變(CPE)3天，以最后1日的CPE為準(zhǔn)(判斷標(biāo)準(zhǔn)同下)，以Reed-Muench法計算各病毒的TCID50。結(jié)果按上述方法滴定結(jié)果如下3、對病毒致細胞病變作用的影響方法取已長成單層細胞的培養(yǎng)板，倒掉培養(yǎng)液，接種100TCID50的不同病毒液100μl于細胞孔，每一種病毒接種一塊細胞板，留一行不接種病毒作正常細胞對照。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中吸附2小時，倒掉病毒液，用不含小牛血清的Eagle’s維持液洗細胞面1次后，加入從最大無毒濃度TC0起倍比稀釋6個濃度的各個藥液(包括對照藥)200μl/孔，各濃度加3孔。同時設(shè)病毒對照、正常細胞對照。置37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，每日在倒置顯微鏡下鏡檢CPE進展。細胞病變程度的判斷“-”細胞生長正常，無病變出現(xiàn)；“1”細胞病變約占整個單層細胞的＜25％；“2”細胞病變約占整個單層細胞的25％～50％；“3”細胞病變約占整個單層細胞的50％～75％；“4”細胞病變約占整個單層細胞的75％～100％。根據(jù)以上細胞病變五級標(biāo)準(zhǔn)判斷，利用Reed-Muench法計算50％有效濃度(EC50)，并求出治療指數(shù)(TI＝TC50/EC50)，TI值越高，表明藥效作用越強。結(jié)果實驗證明，猴耳環(huán)水提取物或醇提取物對流感病毒甲3型(A3)、副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、單純皰疹病毒1和2型(HSV-1，HSV-2)、腸道病毒CoxB3、鼻病毒(RV)、腮腺炎病毒均顯示出有一定的抑制作用，其中對副流感病毒抑制作用最強，而對腺病毒3型(ADV3)和7型(ADV7)未顯示出明顯的抗病毒活性，見下表。表1猴耳環(huán)提取物對常見呼吸道病毒的作用注(1)表中猴耳環(huán)提取物EC50單位為mg提取物干膏/ml，雙黃連為mg生藥/ml。(2).表中“+”為有抑制作用，“-”為無抑制作用，EC50為50％有效濃，TI為治療指數(shù)TI＝TC50/EC50。結(jié)論……試驗例2、猴耳環(huán)提取物的體內(nèi)抗病毒生物活性試驗受試藥物上述實施例1.2.3.4.的樣品以三蒸水配制成0.7g干膏/ml、0.35g干膏/ml和0.18g干膏/ml，隔水煮沸20分鐘滅菌。陽性對照藥病毒唑(三氮唑核苷Ribavirin)和雙黃連口服液。試驗方法1、將小鼠按體重隨機分組，每組10只。于感染前1天開始灌胃給藥，正常對照組和病毒感染對照組給同體積蒸餾水，每日2次，連續(xù)5天。2、感染當(dāng)日，將除正常對照組外的各組小鼠，以乙醚輕度麻醉，用15LD50的流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1，滴鼻感染小鼠。3、于感染后第4天先稱小鼠體重，再解剖取肺稱肺重。4、計算肺指數(shù)值＝100×肺重/體重，進行t檢驗，計算藥物對肺炎的抑制率。表2猴耳環(huán)水提取物對小鼠流感病毒性肺炎的作用注*表中P值為各組與病毒對照組比較結(jié)果。表3猴耳環(huán)50％乙醇提取物對小鼠流感病毒性肺炎的作用表4猴耳環(huán)75％乙醇提取物對小鼠流感病毒性肺炎的作用表5猴耳環(huán)95％乙醇提取物對小鼠流感病毒性肺炎的作用注*表中P值為各組與病毒對照組比較結(jié)果。結(jié)論體內(nèi)實驗顯示，猴耳環(huán)水提取物和50％、75％、95％的乙醇溶液提取物對流感病毒性小鼠肺炎，所試大、中、小三個劑量，均有明顯抑制作用(P＜0.01)。試驗例3、猴耳環(huán)提取物抗氧化生物活性的測定1、體外抗氧化能力實驗——氧自由基清除能力(ORAC)法ORAC法是一種測定物質(zhì)總抗氧能力的方法，以一種α-生育酚的水溶性類似物-Trolox(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid，6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸)作為標(biāo)準(zhǔn)對照。(1)反應(yīng)試劑和供試品溶液的配制熒光物質(zhì)用75mM的磷酸鉀緩沖液(75mMKH2PO4、75mMK2HPO4)配成63μM的儲備液，置于4℃避光保存，測試前用該緩沖液稀釋100倍。AAPH即2，2′-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，2，2′-偶氮(二瞇基丙烷)二氯化氫，于實驗前用75mM的磷酸鉀緩沖液配成18.3mM的溶液。Trolox用75mM的磷酸鉀緩沖液配成10μM的原液，測試前用該緩沖液稀釋成所需濃度。各種猴耳環(huán)提取物和陽性藥VC均用75mM的磷酸鉀緩沖液配成100mM的原液，測試前用該緩沖液稀釋成所需濃度。(2)活性的測定本實驗采用的ORAC測定參照文獻[Assaysforhydrophilicandlipophilicantioxidantcapacity(oxygenradicalabsorbancecapacity(ORACFL))ofplasmaandotherbiologicalandfoodsamples[J].J.Agric.FoodChem.2003，51(11)3273-3279]方法進行。實驗方法96孔板每個孔中加入不同濃度的待測樣品溶液20μL，再加入75mM磷酸鉀緩沖液20μL和AAPH140μL(終濃度12.8mM)，最后加入熒光物質(zhì)(disodiumfluorescein)20μL(終濃度63nM)啟動反應(yīng)，迅速將96孔板置于熒光酶標(biāo)儀(預(yù)置溫度37℃)中開始測定，每組平行設(shè)3個復(fù)孔。采用動力學(xué)方式，每2min測定一個點，至熒光強度衰減為零為止。測定結(jié)果表達為ORAC值，ORAC值越大，抗氧化能力越強。ORAC值的計算式為(3)實驗結(jié)果<tablesid="table7"num="007"><tablewidth="648">組別ORAC猴耳環(huán)水提取物(62.5ug/ml)0.60猴耳環(huán)50％乙醇提取物(62.5ug/ml)0.70猴耳環(huán)75％乙醇提取物(62.5ug/ml)0.82猴耳環(huán)95％乙醇提取物(62.5ug/ml)0.80維生素C(0.78uM)0.69</table></tables>猴耳環(huán)水提取物和各濃度醇提取物都有一定的抗氧化能力。猴耳環(huán)50％、75％、95％乙醇提取物的抗氧化能力強于維生素C。2、評價抗氧化活性——1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)自由基清除法(1)DPPH·溶液和供試品溶液的配制DPPH·用無水乙醇配成2×10-4M的溶液，置于4℃避光保存。各猴耳環(huán)提取物和陽性藥均用無水乙醇配成1mg/mL的原液，測試前用無水乙醇稀釋成所需濃度。(2)活性的測定將不同濃度的供試品溶液100μL和2×10-4MDPPH·溶液100μL加入96孔板各孔中，同時以不加DPPH·(以100μL無水乙醇代替DPPH·)的供試品溶液各濃度作為對照以消除供試品本身顏色對測試結(jié)果的干擾，并設(shè)DPPH·陰性對照(以100μL無水乙醇代替供試品)，每組平行設(shè)4個復(fù)孔。將96孔板放入酶標(biāo)儀中，震蕩1min，并于此條件下保存(室溫、避光)，30min后測試其在517nm處的吸光度OD值，按如下公式計算供試品的自由基清除率。半數(shù)有效濃度(EC50)通過不同濃度下供試品清除率計算得出，表示供試品的活性。(3)實驗結(jié)果猴耳環(huán)水提取物以及各濃度醇提取物都有很強的抗氧化活性，而且猴耳環(huán)50、75、95％乙醇提取物的抗氧化活性高于維生素C。試驗結(jié)果說明猴耳環(huán)水提取物和猴耳環(huán)50、75、95％乙醇提取物都有抗病毒和抗氧化作用，而且，95％乙醇提取物的作用最強。但95％乙醇提取物的成本最高，所以通常采用猴耳環(huán)水提取物在實際中應(yīng)用。下面的實施例說明含本發(fā)明提供的猴耳環(huán)提取物為活性成分的組合物。制劑實施例1、片劑取上述實施例1的猴耳環(huán)水提物的干浸膏粉為原料，處方干浸膏200克糊精20克制成1000片制備方法稱取處方量的輔料-糊精，以及處方量的猴耳環(huán)干浸膏混勻，加入75％乙醇50g，攪拌，過篩制粒，干燥2小時，過篩整粒。取制備好的顆粒，用14mm平充壓片，每片含猴耳環(huán)干浸膏0.2g。制劑實施例2、膠囊劑取上述實施例2的干浸膏粉為原料處方猴耳環(huán)50％乙醇提取物干浸膏400克糊精40克制成1000粒制備方法稱取處方量的輔料-糊精，以及處方量的猴耳環(huán)干浸膏混勻，加入75％乙醇20-100g，攪拌，過篩制粒，干燥2小時，過篩整粒。取制備好的顆粒，裝0號膠囊，每粒膠囊含猴耳環(huán)干浸膏0.4g。制劑實施例3、顆粒劑取上述實施例1的猴耳環(huán)水提取物的干浸膏粉為原料處方干浸膏80g甘露醇200g糊精119g檸檬酸0.5g甜橙油3ml制成400g制備方法取蔗糖、甘露醇分別粉碎成細粉，過100目篩，備用。取處方量甘露醇粉、糊精、檸檬酸混勻，另取提取猴耳環(huán)干浸膏，加入上述輔料當(dāng)中，攪拌，再加入85％乙醇適量，攪拌，混合均勻，過12目篩制粒，濕顆粒65～70℃干燥2小時，過10目篩整粒；取處方量甜橙油，加入適量無水乙醇(5ml左右)，混勻，噴加入步烘好的顆粒中，混勻。用顆粒分裝機分裝入鋁箔袋中，每袋裝2.0g。制劑實施例4、糖漿劑取上述實施例1的猴耳環(huán)水提取物的干浸膏粉為原料處方干浸膏40g蔗糖650g對羥基苯甲酸乙脂0.5g檸檬酸0.5g甜橙油3ml蒸餾水適量制成1000ml制備方法將蔗糖加入蒸餾水中，加熱溶解后過濾，加干浸膏、對羥基苯甲酸乙脂、檸檬酸、甜橙油和水至定量。制劑實施例5、口服液取上述實施例3的猴耳環(huán)水提取物的干浸膏粉為原料處方干浸膏40g對羥基苯甲酸乙脂0.5g檸檬酸1.0g甜菊甙2g甜橙香精2ml蒸餾水適量制成1000ml制備方法將干浸膏、檸檬酸、甜菊甙溶于水中，過濾，取對羥基苯甲酸乙脂溶于少量的乙醇中，加入濾液中，補加水定容，再加少許香精，混合均勻后分裝。權(quán)利要求1.一種植物猴耳環(huán)用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物，在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。2.一種植物猴耳環(huán)用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物，在制備抗氧化食品中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的猴耳環(huán)提取物的應(yīng)用，其特征在于其中所說的藥物、食品，是一種含植物猴耳環(huán)用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物為活性成分添加常規(guī)的藥用輔料或食品添加劑的組合物。4.根據(jù)權(quán)利要求3的猴耳環(huán)提取物的應(yīng)用，其特征在于，其中所說的組合物是片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、糖漿劑。全文摘要猴耳環(huán)提取物的新用途，涉及天然植物提取物在藥品或食品中的應(yīng)用。具體是取植物猴耳環(huán)用水或50～95％的乙醇溶液提取的提取物，在制備抗病毒藥物和在制備抗氧化食品中的應(yīng)用?？刹捎煤参锖锒h(huán)水或50～95％的乙醇提取物為活性成分，添加常規(guī)的藥用輔料或食品添加劑，按常規(guī)的藥物或食品制劑技術(shù)制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、丸劑、口服液等口服劑型。猴耳環(huán)水提取物或醇提取物對流感病毒甲3型(A文檔編號A61K9/20GK1850146SQ200610033698公開日2006年10月25日申請日期2006年2月21日優(yōu)先權(quán)日2006年2月21日發(fā)明者吳蓉蓉,黃杰昌,雷佳,唐芝岳申請人:廣州萊泰制藥有限公司