專利名稱：一種蛋白a免疫吸附材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用生物材料，具體的是涉及用于血液凈化用的蛋白A免疫吸附材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
很多疾病的發(fā)生與發(fā)展都是由于致病因子在機(jī)體內(nèi)積累的結(jié)果。能特異、有效地通過凈化血液的方法從機(jī)體內(nèi)清除這些致病因子，而又不造成對(duì)機(jī)體的損害，是臨床醫(yī)學(xué)近一二十年來一直不斷探索的問題。免疫吸附治療是血液凈化的一種重要方法，其原理是將某一配體牢固地結(jié)合在一個(gè)固定的載體上構(gòu)建成免疫吸附柱，通過體外循的方法特異性地清除患者血液中的致病因子，凈化血液，從而達(dá)到治療疾病的目的。目前臨床上應(yīng)用免疫吸附能夠通過特異性地清除機(jī)體的自身抗體，治療自身免疫性疾病、器官移植排斥反應(yīng)，以及通過吸附低密度脂蛋白治療高膽固醇血癥及其并發(fā)癥等。由于免疫吸附療法直接從血液中去除致病因子，在治療過程中不丟失血漿有效成分，不輸入異體血漿，可避免交叉感染、過敏反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，而且治療效果顯著，因而具有良好的臨床應(yīng)用前景。
葡萄球菌蛋白A(SPA)是某些金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的一種蛋白質(zhì)，其分子量約為42,000，其氨基末端含有4-5個(gè)高度類似的免疫球蛋白Fc段結(jié)合區(qū)，可與人體血漿中的抗體(如免疫球蛋白IgG)及其免疫復(fù)合物的Fc段特異結(jié)合。如果將SPA固定在某一載體上制備成載體-SPA復(fù)合物免疫吸附柱，當(dāng)人體血漿通過該吸附柱時(shí)，血漿中的抗體及其免疫復(fù)合物就會(huì)被特異性地吸附，一些因抗體和免疫復(fù)合物導(dǎo)致的疾病與癥狀，如自身免疫性疾病、器官移植、惡性腫瘤等即可得到預(yù)防、治療與緩解。免疫吸附治療的關(guān)鍵是免疫吸附柱的研制，具體的說就是免疫吸附柱中免疫吸附材料的合成，所以將SPA固定在載體上的合成技術(shù)至關(guān)重要。目前，臨床上使用的蛋白A免疫吸附材料采用的載體基質(zhì)主要是瓊脂糖凝膠和硅膠，偶聯(lián)試劑一般采用溴化氰、羰基咪唑、環(huán)氧氯丙烷等。由于溴化氰是劇毒物質(zhì)，合成過程對(duì)人體和環(huán)境危害較大；并且用溴化氰方法偶聯(lián)的蛋白基團(tuán)容易脫落進(jìn)入人體，對(duì)病人產(chǎn)生較大的副作用。所以這一合成工藝不甚理想。
賈凌云和夏列波等人發(fā)明了蛋白A-瓊脂糖免疫吸附材料的新方法，它們分別采用羰基二咪唑(申請(qǐng)?zhí)?1106107.3，公開號(hào)CN1367181A)和環(huán)氧氯丙烷(申請(qǐng)?zhí)?1103114.X，公開號(hào)CN1365853A)作為偶聯(lián)試劑活化瓊脂糖載體。雖然這兩種方法剔除了劇毒物質(zhì)溴化氰，其制備的材料使用也更安全，但其制備過程反應(yīng)步驟較多，需要經(jīng)過五步化學(xué)反應(yīng)才能合成吸附材料，方法復(fù)雜，因此得到的吸附材料產(chǎn)品批間差異大，性能不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種無(wú)毒、無(wú)害、SPA吸附效率高以及穩(wěn)定性能好的SPA免疫吸附材料。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的SPA免疫吸附材料的制備方法，該方法無(wú)毒、無(wú)害、反應(yīng)路線較短、操作簡(jiǎn)便，能取代溴化氰法、羰基咪唑法和環(huán)氧氯丙烷法。
本發(fā)明的另一目的是提供上述吸附材料在血液凈化中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是蛋白A免疫吸附材料，是瓊脂糖凝膠與蛋白A偶聯(lián)的高分子材料，其具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)
其中 代表瓊脂糖凝膠，X代表C2～6的直鏈烷基，或者代表CH2-CH2-On，其中n＝1～9，SPA-NH2為蛋白A。
上述蛋白A免疫吸附材料，其特征是X代表-CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-或者-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。
瓊脂糖凝膠是一種天然多糖，含有豐富的羥基，它可參與多種化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為活性基團(tuán)，然后與蛋白A反應(yīng)固定在瓊脂糖凝膠載體上。本發(fā)明的基本構(gòu)想是選用偶聯(lián)試劑雙縮水甘油醚類試劑，作為活化瓊脂糖凝膠的試劑。這些活化試劑都含有兩個(gè)環(huán)氧基團(tuán)，是一類具有很高反應(yīng)活性的試劑，其中的一個(gè)環(huán)氧基團(tuán)可與瓊脂糖凝膠上的羥基反應(yīng)，另一個(gè)環(huán)氧基團(tuán)可在溫和的條件下與SPA上的氨基反應(yīng)，從而將SPA以共價(jià)鍵方式固定在瓊脂糖凝膠上。
上述蛋白A免疫吸附材料的制備方法是以瓊脂糖凝膠為載體，將瓊脂糖凝膠與偶聯(lián)試劑雙縮水甘油醚類試劑反應(yīng)形成活化瓊脂糖凝膠，然后與蛋白A的氨基偶聯(lián)，形成瓊脂糖凝膠蛋白A免疫吸附材料，具體在于a、偶聯(lián)試劑雙縮水甘油醚類試劑與瓊脂糖凝膠在0.4～1.0mol/L的堿性水溶液中，于20～40℃下反應(yīng)；瓊脂糖凝膠在反應(yīng)液中所占的體積比為30％～50％；
b、步驟a反應(yīng)結(jié)束后，將活性瓊脂糖凝膠過濾，用蒸餾水沖洗至中性；C、步驟b所得的活性瓊脂糖凝膠溶于PH緩沖液中，控制pH值在8.0～10.0范圍內(nèi)，加入蛋白A，0～40℃反應(yīng)16～20小時(shí)；D、步驟c所得產(chǎn)物進(jìn)行端基封閉反應(yīng)。
反應(yīng)方程式如下 其中，X代表-CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-，或者CH2-CH2-On其中n＝1～9 為瓊脂糖凝膠，SPA-NH2為蛋白A。
具體的偶聯(lián)試劑為乙二醇雙縮水甘油醚、1，4-丁二醇雙縮水甘油醚、1，6-己二醇雙縮水甘油醚或聚乙二醇雙縮水甘油醚中的任一種。
SPA是一個(gè)具有約42,000分子量的大分子，與其特異性結(jié)合的抗體及其免疫復(fù)合物分子更大，其分子量是幾十萬(wàn)到上百萬(wàn)，SPA要保持其吸附能力，需要保證與瓊脂糖鍵合后，其空間立體結(jié)構(gòu)不變形，同時(shí)大分子抗體及其免疫復(fù)合物與SPA的接觸也需要足夠的空間，SPA免疫吸附材料的微環(huán)境對(duì)其吸附能力影響很大。SPA只有充分裸露在瓊脂糖凝膠載體外面，被吸附的抗體及其免疫復(fù)合物才能盡可能地?zé)o空間障礙地與SPA接觸，充分發(fā)揮SPA的吸附能力。如果在材料表面與SPA之間有一定長(zhǎng)度的間隔臂，使SPA與材料表面保持一定的距離，將保證其空間結(jié)構(gòu)不變，同時(shí)抗體及其免疫復(fù)合物能不受空間障礙地與SPA盡可能接觸，提高材料上SPA的吸附效率。本發(fā)明選擇的偶聯(lián)試劑乙二醇雙縮水甘油醚主鏈含有10個(gè)原子(X＝CH2CH2)、1，4-丁二醇雙縮水甘油醚主鏈含有12個(gè)原子(X＝CH2CH2CH2CH2)、1，6己二醇雙縮水甘油醚主鏈含有14個(gè)原子(X＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2)具有較長(zhǎng)的長(zhǎng)度，將SPA固定在瓊脂糖凝膠上后SPA能夠充分暴露在材料表面，這樣制得的材料SPA的吸附效率較高，降低了生產(chǎn)成本。同樣，選擇聚乙二醇醚雙縮水甘油醚作為偶聯(lián)試劑(X＝CH2-CH2-On)也得到較好的結(jié)果。
由于空間的障礙，大分子的SPA與帶有乙二醇雙縮水甘油醚等活化的載體反應(yīng)后，將還有一些未反應(yīng)完的環(huán)氧基團(tuán)，這些基團(tuán)是產(chǎn)生非特異性吸附的潛在因素，必須將其惰性化。本發(fā)明選用甘氨酸乙酯鹽酸鹽或乙醇胺其中的一種作為封端試劑，除去未反應(yīng)的環(huán)氧活性基團(tuán)。
本發(fā)明還包括所述的蛋白A免疫吸附材料在血液凈化中的應(yīng)用。
基于以上敘述，本發(fā)明的顯著優(yōu)勢(shì)和效果是1、選用乙二醇(或丁二醇、己二醇及聚乙二醇醚)雙縮水甘油醚作為活化瓊脂糖凝膠的試劑，克服了溴化氰活化的毒性和不穩(wěn)定性，從而增加了合成的安全性，延長(zhǎng)了材料的使用壽命；2、乙二醇(或丁二醇、己二醇及聚乙二醇醚)雙縮水甘油醚分子含有一定的長(zhǎng)度，這樣就在瓊脂糖凝膠載體表面與蛋白A之間引入了間隔臂，為蛋白A與抗體及抗體抗原復(fù)合物的結(jié)合創(chuàng)造了足夠的空間，改善了材料的微環(huán)境，從而提高了蛋白A對(duì)免疫球蛋白及免疫復(fù)合物的結(jié)合效率，減少了吸附劑的用量，降低了生產(chǎn)成本。
3、瓊脂糖凝膠載體通過乙二醇(或丁二醇、己二醇及聚乙二醇醚)雙縮水甘油醚活化后，由于帶有間隔臂，與蛋白A反應(yīng)的環(huán)氧基團(tuán)具有更高的活性，從而能提高蛋白A的鍵合量。
4、活化與連接間隔臂于一步反應(yīng)同時(shí)完成，從而使制備過程大為簡(jiǎn)化，減少了產(chǎn)品的批間差異。
5、吸附材料的吸附效率高，再生性能好。
以上的優(yōu)勢(shì)在臨床治療上表現(xiàn)為提高了臨床治療效果、安全性和可靠性。體外血漿吸附試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的蛋白A免疫吸附材料對(duì)人體免疫球蛋白特別是IgG具有特異性吸附。
具體實(shí)施例方式
以下詳述本發(fā)明的實(shí)施例。應(yīng)理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)而進(jìn)行的改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例一含有環(huán)氧基的活性瓊脂糖凝膠(Sepharose 6FF)的合成1.瓊脂糖凝膠與乙二醇雙縮水甘油醚的反應(yīng)在5L的反應(yīng)器中加入瓊脂糖凝膠(Sepharose 6FF)1.5升，0.8mol/L的NaOH水溶液1000ml，混合均勻，加入乙二醇雙縮水甘油醚1000ml后，置于恒溫?fù)u床中，在20℃下反應(yīng)2小時(shí)。結(jié)束反應(yīng)，將凝膠過濾，用大量蒸餾水沖洗至中性。將活化好的介質(zhì)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆?。用硫代硫酸鈉法檢測(cè)用這種方法活化的凝膠中的環(huán)氧基團(tuán)數(shù)量，測(cè)得每毫升至少有45μmol的環(huán)氧活性基團(tuán)。
2.瓊脂糖凝膠與丁二醇雙縮水甘油醚的反應(yīng)在5L的反應(yīng)器中加入瓊脂糖凝膠(Sepharose 6FF)1升，1mol/L的NaOH水溶液1000ml，混合均勻，加入丁二醇雙縮水甘油醚1000ml后，置于恒溫?fù)u床中，在35℃下反應(yīng)2小時(shí)。結(jié)束反應(yīng)，將凝膠過濾，用大量蒸餾水沖洗至中性。將活化好的介質(zhì)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆?。用硫代硫酸鈉法檢測(cè)用這種方法活化的凝膠中的環(huán)氧基團(tuán)數(shù)量，測(cè)得每毫升至少有40μmol的環(huán)氧活性基團(tuán)。
3、瓊脂糖凝膠與己二醇雙縮水甘油醚的反應(yīng)在5L的反應(yīng)器中加入瓊脂糖凝膠(Sepharose 6FF)1升，0.5mol/L的KOH水溶液1000ml，混合均勻，加入己二醇雙縮水甘油醚1000ml后，置于恒溫?fù)u床中，在20℃下反應(yīng)2小時(shí)。結(jié)束反應(yīng)，將凝膠過濾，用大量蒸餾水沖洗至中性。將活化好的介質(zhì)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆?。用硫代硫酸鈉法檢測(cè)用這種方法活化的凝膠中的環(huán)氧基團(tuán)數(shù)量，測(cè)得每毫升至少有40μmol的環(huán)氧活性基團(tuán)。
4、瓊脂糖凝膠與聚乙二醇雙縮水甘油醚的反應(yīng)在5L的反應(yīng)器中加入瓊脂糖凝膠(Sepharose 6FF)1升，0.7mol/L的NaOH水溶液1000ml，混合均勻，加入聚乙二醇雙縮水甘油醚(n＝9)1000ml后，置于恒溫?fù)u床中，在20℃下反應(yīng)2小時(shí)。結(jié)束反應(yīng)，將凝膠過濾，用大量蒸餾水沖洗至中性。將活化好的介質(zhì)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆谩Ｓ昧虼蛩徕c法檢測(cè)用這種方法活化的凝膠中的環(huán)氧基團(tuán)數(shù)量，測(cè)得每毫升至少有35μmol的環(huán)氧活性基團(tuán)。
實(shí)施例二蛋白A免疫吸附材料的合成1、活性瓊脂糖凝膠(Sepharose 6FF)與蛋白A反應(yīng)合成免疫吸附材料在5L的反應(yīng)器中加入例一(1～3)中合成的環(huán)氧活性瓊脂糖凝膠(Sepharose 6FF)1升，0.1mol/L的硼酸緩沖液1.5L，pH值控制在8.0～10.0范圍內(nèi)，加入6.0g蛋白A，在30℃恒溫反應(yīng)16小時(shí)，停止反應(yīng)，回收未反應(yīng)的蛋白A，用0.2mol/L的甘氨酸乙酯鹽酸鹽封端未反應(yīng)的環(huán)氧活性基團(tuán)，在室溫反應(yīng)5小時(shí)。用大量蒸餾水沖洗干凈未反應(yīng)組分，保存在0.1mol/L pH＝7.4的磷酸緩沖溶液中，加入防腐劑保存。用紫外法檢測(cè)蛋白A的鍵合量為5～5.5mg/ml。
2、活性瓊脂糖凝膠(Sepharose 6FF)與蛋白A反應(yīng)合成免疫吸附材料在5L的反應(yīng)器中加入例一(4)中合成的環(huán)氧活性瓊脂糖凝膠(Sepharose 6FF)1升，0.1mol/L的硼酸緩沖液1.5L，pH值控制在8.0～10.0范圍內(nèi)，加入6.0g蛋白A，在20℃恒溫反應(yīng)20小時(shí)，停止反應(yīng)，回收未反應(yīng)的蛋白A，用0.2mol/L的乙醇胺封端未反應(yīng)的環(huán)氧活性基團(tuán)，在室溫反應(yīng)5小時(shí)。用大量蒸餾水沖洗干凈未反應(yīng)組分，保存在0.1mol/L pH＝7.4的磷酸緩沖溶液中，加入防腐劑保存。用紫外法檢測(cè)蛋白A的鍵合量為4.3mg/ml。
實(shí)施例三蛋白A免疫吸附材料的動(dòng)物試驗(yàn)將例二(1)中合成的蛋白A免疫吸附材料20ml，其中蛋白A的鍵合量為100mg，放入燒杯中用生理鹽水浸泡1小時(shí)，再裝于Φ20×50mm的柱中，用生理鹽水充分沖洗柱子。以動(dòng)物狗為試驗(yàn)對(duì)象，將狗麻醉后，從狗的股動(dòng)脈中以30ml/min的速度泵出血液，經(jīng)過血漿分離器將血細(xì)胞與血漿分開，以10ml/min的速度將血漿泵入蛋白A吸附柱，吸附后再與血細(xì)胞混合一同泵入狗的股靜脈中。吸附5分鐘后，用生理鹽水沖出柱中血漿直到在280nm的吸收值為零。用0.2mol/L，pH＝2.3甘氨酸-HCl緩沖液洗脫柱中吸附的免疫球蛋白及其免疫復(fù)合物，收集洗脫液。吸附柱再用約150ml的平衡緩沖液平衡柱子，用約1500ml的生理鹽水沖洗平衡緩沖液，再生過程完畢。SDS-PEAG電泳檢測(cè)洗脫物，電泳結(jié)果表明，洗脫液中吸附物主要為IgG，檢測(cè)洗脫下的抗體總量為480mg，在實(shí)驗(yàn)過程中及實(shí)驗(yàn)后24小時(shí)內(nèi)，試驗(yàn)動(dòng)物狗的一切生理指征正常。
實(shí)施例四蛋白A免疫吸附材料的再生性能將例二(1)中合成的蛋白A免疫吸附材料50ml放入燒杯中用生理鹽水浸泡1小時(shí)再裝于Φ40×50mm的柱中，用生理鹽水充分沖洗柱子。將人體免疫球蛋白IgG溶于含有0.85％NaCl，pH＝7.4的0.01M磷酸緩沖溶液中，以30ml/min的速度過柱30分鐘，使人體免疫球蛋白IgG充分吸附在吸附材料上。用0.2mol/L，pH＝2.3甘氨酸-HCl緩沖液作為洗脫劑將吸附在吸附材料上人體免疫球蛋白IgG洗脫下來，收集洗脫液，用紫外法檢測(cè)吸附的人體免疫球蛋白IgG含量。洗脫完畢后，用生理鹽水將柱中的洗脫劑置換出來再生，再將人體免疫球蛋白IgG的磷酸緩沖溶液過柱30分鐘。重復(fù)以上“吸附-洗脫-中和-吸附”操作50次，每次都檢測(cè)吸附的人體免疫球蛋白IgG的量，吸附效率未發(fā)現(xiàn)顯著變化，表明制備的蛋白A免疫吸附材料具有良好的再生性能。
權(quán)利要求
1.一種蛋白A免疫吸附材料，是瓊脂糖凝膠與蛋白A偶聯(lián)的高分子材料，其具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu) 其中 代表瓊脂糖凝膠，X代表C2～6的直鏈烷基，或者代表CH2-CH2-On，其中n＝1～9，SPA-NH2為蛋白A。
2.權(quán)利要求1的蛋白A免疫吸附材料，其特征是X代表-CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-或者-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。
3.權(quán)利要求1或2的蛋白A免疫吸附材料的制備方法，其特征為以瓊脂糖凝膠為載體，將瓊脂糖凝膠與偶聯(lián)試劑雙縮水甘油醚類試劑反應(yīng)形成活化瓊脂糖凝膠，然后與蛋白A的氨基偶聯(lián)，形成瓊脂糖凝膠蛋白A免疫吸附材料，具體在于a、偶聯(lián)試劑雙縮水甘油醚類試劑與瓊脂糖凝膠在0.4～1.0mol/L的堿性水溶液中，于20～40℃下反應(yīng)，瓊脂糖凝膠在反應(yīng)液中所占的體積比為30％～50％；b、步驟a反應(yīng)結(jié)束后，將活性瓊脂糖凝膠過濾，用蒸餾水沖洗至中性；c、步驟b所得的活性瓊脂糖凝膠溶于PH緩沖液中，控制pH值在8.0～10.0范圍內(nèi)，加入蛋白A，0～40℃反應(yīng)16～20小時(shí)；d、步驟c所得產(chǎn)物進(jìn)行端基封閉反應(yīng)。
4.權(quán)利要求3所述的蛋白A免疫吸附材料的制備方法，其特征在于偶聯(lián)試劑為乙二醇雙縮水甘油醚、1，4-丁二醇雙縮水甘油醚、1，6-己二醇雙縮水甘油醚或聚乙二醇雙縮水甘油醚。
5.權(quán)利要求3所述的蛋白A免疫吸附材料的制備方法，其特征還在于端基封閉反應(yīng)是用甘氨酸乙酯鹽酸鹽或乙醇胺與步驟c所得產(chǎn)物中未反應(yīng)完的環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng)封端。
6.權(quán)利要求1或2所述的蛋白A免疫吸附材料在血液凈化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于血液凈化的蛋白A免疫吸附材料及其制備方法。公開了瓊脂糖凝膠與蛋白A偶聯(lián)的高分子材料，該材料以瓊脂糖凝膠為載體基質(zhì)，與雙縮水甘油醚類偶聯(lián)試劑反應(yīng)后得到活性載體，再與蛋白A進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)而得到。該材料的合成方法簡(jiǎn)便、工藝路線短、制備安全；產(chǎn)品具有特異性強(qiáng)、對(duì)免疫球蛋白及其復(fù)合物的吸附效率高、再生性能好的特性，可用于臨床上免疫吸附治療。
文檔編號(hào)A61L101/46GK101069751SQ200610035470
公開日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月10日
發(fā)明者陳校園, 汪志剛, 李光吉, 許春生, 張旭鋒 申請(qǐng)人:廣州康盛生物科技有限公司, 華南理工大學(xué)