專(zhuān)利名稱(chēng)：新的具有止血活性的尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥和蛋白質(zhì)酶學(xué)領(lǐng)域。具體的講，其涉及一種從尖吻蝮蛇(Agkisdroton acutus)蛇毒中提取的一種具有止血活性的類(lèi)凝血酶(Agacutin)的結(jié)構(gòu)特征，純化方法和醫(yī)藥領(lǐng)域方面的用途。該止血效應(yīng)的類(lèi)凝血酶(Agacutin)通過(guò)激活纖維蛋白原而加強(qiáng)凝血，同時(shí)因不激活I(lǐng)I和XIII因子，不會(huì)引起血栓形成。在臨床前研究中得出了高效極低毒性效果。
背景知識(shí) 尖吻蝮蛇又稱(chēng)五步蛇或蘄蛇，分布在華南各省。其蛇毒中的精氨酸酯酶活性較低，無(wú)神經(jīng)毒和激肽釋放酶活性。在其組份中，有幾種以纖維蛋白原為底物的酶在體外能使人血漿或牛纖原凝結(jié)，但在體內(nèi)卻引起各種不同的生理效應(yīng)如降纖抗凝、血小板聚集、血管出血和止血等。F.Kornalic將以纖維蛋白原為底物的蛇毒酶按其作用方式不同分成三類(lèi)I類(lèi)是類(lèi)凝血酶(Thrombin-likeenzyme)或凝血蛋白酶(Thrombic protease)，它僅分解纖維蛋白原的α鏈和/或β鏈的N端肽鏈，釋放A肽(α鏈)和/或B肽(β鏈)，使血液凝固。II類(lèi)是纖維蛋白原裂解酶(Fibrinogenolytic enzyme)，它直接從纖維蛋白原三條肽鏈(α，β和γ)的C端水解，將纖原分解成碎片，血液不被凝固。III類(lèi)是纖溶酶原激活酶(Enzyme activating plasminogen)，它是纖維蛋白溶解的間接或直接激活劑，它通過(guò)激活纖溶酶原產(chǎn)生纖溶酶，來(lái)裂解纖維蛋白或纖維蛋白原。本發(fā)明屬第I類(lèi)。
尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶的研究，最早是1967年的Cheng HC和Ouyang C等，他們于1971年和1972年相繼分離出兩個(gè)類(lèi)凝血酶組份，并經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，它們均有不同程度抗凝作用。肖昌華等從1988年起和管錦華等從1992年起，多次償試從尖吻蝮蛇蛇毒中分離使動(dòng)物凝血時(shí)間縮短的組份，但都因無(wú)法提純，對(duì)其結(jié)構(gòu)無(wú)法準(zhǔn)確定性和定量，未成功。國(guó)外相似的產(chǎn)品有Hemocoagulase、Bothropase和Reptilase，Hemocoagulase它是Klobusitzky和Konig等1936年從Bothrops jararaca蛇毒中部分純化的一個(gè)局部和非胃腸使用的安全止血?jiǎng)?，Bothropase由米蘭Ravizzo公司從Bothrops jararaca蛇毒中提取，Reptilase由Basle Pentapharm公司從Bothrops atrox蛇毒中提取。這些產(chǎn)品僅有立止血(Reptilase)的品種在國(guó)內(nèi)由深圳建安醫(yī)藥公司代理銷(xiāo)售。立止血療效確切，付作用小，臨床適應(yīng)癥廣，優(yōu)于其它止血藥等特點(diǎn)，于1996年進(jìn)入中國(guó)國(guó)家基本藥物目錄。
自從Reptilase進(jìn)入中國(guó)以來(lái)，國(guó)內(nèi)許多研究者都嘗試尋找過(guò)類(lèi)似的止血成分，如中科院上海生化所戚正武曾申請(qǐng)國(guó)家863計(jì)劃，未找到。自1993年起，我們開(kāi)始研究尖吻蝮蛇蛇毒中的類(lèi)凝血酶組分。經(jīng)三年的努力，在提取類(lèi)凝血酶溶栓藥-降纖酶的同時(shí)，我們獲得了三個(gè)新的類(lèi)凝血酶。以后的研究證實(shí)，其中之一具有止血活性，并取名Agacutin。目前由山東北大高科華泰制藥有限公司生產(chǎn)和遼寧諾康醫(yī)藥有限公司總代理的注射用巴曲亭(立止血的國(guó)內(nèi)產(chǎn)品)和邦停(仿立止血)，于2001年被SFDA批準(zhǔn)上市。


發(fā)明內(nèi)容
1 本發(fā)明的類(lèi)凝血酶(Agacutin)作用方式與Reptilase相似，它通過(guò)切除纖原分子中的酸性A肽，能使人血漿和牛纖維蛋白原在體外凝固，因不激活XIII和II因子，產(chǎn)生可溶性非交聯(lián)纖維蛋白單體，在傷口處，該單體與其它凝血因子相互作用加速止血效應(yīng)，在完整血管內(nèi)，該單體有幾分鐘半衰期，可迅速被纖溶酶降解清除。該類(lèi)凝血酶(Agacutin)在體外使檸檬酸化血漿凝固，在體內(nèi)可使出凝血時(shí)間顯著縮短，同時(shí)又不造成血栓形成，達(dá)到傷口部位的止血或預(yù)防出血之目的。
2本發(fā)明的目的是提供具有預(yù)防臨床手術(shù)出血、治療外傷出血及全身和局部止血效應(yīng)的尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)，確定其準(zhǔn)確的物理化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和藥學(xué)效果。
3本發(fā)明的目的是提供該尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)的兩條肽鏈的N端15個(gè)氨基酸殘基序列，用于與其它類(lèi)凝血酶的結(jié)構(gòu)區(qū)別。
4本發(fā)明的目的是提供該尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)的止血活性不受肝素的影響，故可發(fā)展成診斷試劑，用于臨床測(cè)定某些使用肝素患者的出、凝血時(shí)間。
5本發(fā)明的目的還在于提供純化具有止血效應(yīng)的尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)的方法，尤其是純化工藝的全面布局和層析條件。
6一種具有防治出血的蛇毒類(lèi)凝血酶(Agacutin)，用SDS-PAGE(T∶C＝12∶3.9)法測(cè)得其全分子量為31KDa，有相近兩個(gè)亞基組成，亞基分子量16Da和15Da(見(jiàn)圖2B)，該酶最適溫度為35℃(見(jiàn)圖4A))，最適pH7.5(見(jiàn)圖4B)，等電點(diǎn)為5.39(見(jiàn)圖5A&B)，根據(jù)文獻(xiàn)和我們的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該類(lèi)凝血酶(Agacutin)結(jié)構(gòu)與立止血完全不同。
7用反相液相色譜法(C-18柱)測(cè)該類(lèi)凝血酶(Agacutin)氨基酸組成為(％)Asp6.2，Thr1.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93和NH32.68(NH3的含量代表Gln和/或Asn的量)。
8該止血效應(yīng)的蛇毒類(lèi)凝血酶(Agacutin)的純化方法，包括尖吻蝮蛇蛇毒的溶解，Sephedex G75凝膠過(guò)濾，兩次DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換和透析構(gòu)成。其特征在于該蛇毒類(lèi)凝血酶(Agacutin)采用DEAE-Sepharose FastFlow色譜填料進(jìn)行快速純化，流速40ml/min，流動(dòng)相A10mM磷酸鹽緩沖液(pH6.9)，B液為含有0.065M氯化鈉的A液，線性洗脫梯度0-0.065M的氯化鈉。
9具體制備該酶的方法是取驗(yàn)證了的尖吻蝮蛇蛇毒，加緩沖液溶解后離心，取上清液上Sephadaex G-75層析柱(見(jiàn)圖1A)，活性峰上DEAE-Sepharose FastFlow層析柱(見(jiàn)圖1B)，DEAE-Sepharose FF活性峰經(jīng)透析后再上第二次DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱(見(jiàn)圖2A)，收集活性峰，即為純品。
10純化后的類(lèi)凝血酶(Agacutin)，用SDS-PAGE(T∶C＝12∶3.9)法測(cè)定的全分子量為31KD，有16KD和15KD兩條多肽鏈組成(見(jiàn)圖2B)。反相HPLC(C-4柱)(見(jiàn)圖3B)和正相HPLC測(cè)定為單一峰(見(jiàn)圖3A)，PAGE為單一帶(見(jiàn)圖3C)，在體外能使新鮮人血漿和牛纖原凝固。N端15個(gè)氨基酸殘基的測(cè)序結(jié)果A亞基DCSSGWSSYEEHQYY；B亞基DSSGWSSYEGHEYYV。
11 體內(nèi)藥效學(xué)驗(yàn)證純化后的尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)經(jīng)新西蘭白兔耳靜脈和臀部肌注注射，實(shí)驗(yàn)采用三個(gè)劑量組
，結(jié)果均使全血凝固時(shí)間(表1)明顯縮短，并使藥效維持24小時(shí)。各實(shí)驗(yàn)劑量組靜脈注射使血纖維蛋白原含量(表2)和血液粘度(表10)有不同程度的減少。對(duì)家兔凝血活酶時(shí)間(表3)、血小板數(shù)量(表4)和質(zhì)量(表5&6)無(wú)明顯影響。對(duì)優(yōu)球蛋白凝固時(shí)間(表7)無(wú)影響，而對(duì)優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間(表8)，大劑量可時(shí)其縮短，中小劑量無(wú)明顯影響。本品耳靜脈注射10分鐘內(nèi)起效，30分鐘達(dá)高峰，試驗(yàn)設(shè)立立止血陽(yáng)性對(duì)照組和生理鹽水陰性對(duì)照組，不論肌注還是靜注，相同劑量的本品與立止血對(duì)照組比較，兩者藥效相近，但優(yōu)于生理鹽水組對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈剪斷出血實(shí)驗(yàn)(表9)，該品(0.5、1.0、2.0U/Kg)腹腔注射，各劑量組小鼠尾靜脈出血時(shí)間與生理鹽水組和立止血組相比，均有不同程度的縮短，其中0.5u/kg劑量組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。
12常用適用途徑有肌肉注射，靜脈注射，可局部或全身使用等。
13藥效學(xué)見(jiàn)表1～8。
表1尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)對(duì)新西蘭兔全血凝固時(shí)問(wèn)的影響(

n＝7) *P＜0.05給藥前后的t檢驗(yàn) 表2尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)新西蘭白兔纖維蛋白原含量的影響(

n＝7) *P＜0.05，**P＜0.01給藥前后的t檢驗(yàn) 表3尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)對(duì)新西蘭白兔APTT的影響(

n＝7) *P＜0.05，**P＜0.01給藥前后的t檢驗(yàn) 表4尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)對(duì)血小板數(shù)量的影響(

n＝7) *P＜0.05與生理鹽水組相比 表5尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)對(duì)血小板釋放活性的影響(

n＝7) 表6尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)對(duì)血小板體外聚集率的影響(

n＝7) *P＜0 05，**P＜0.01，***P＜0.001與生理鹽水組相比 表7尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)對(duì)優(yōu)球蛋白凝固時(shí)間(ECT)的影響(

n＝7) **P＜0.01與生理鹽水組相比 表8尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)對(duì)優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間(ELT)的影響(

n＝7) *P＜0.05，**P＜0.01與生理鹽水組相比 表9尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)對(duì)小鼠剪尾出血時(shí)間的影響 **P＜0.01，與生理鹽水組相比 表10尖吻蝮蛇類(lèi)凝血酶(Agacutin)對(duì)新西蘭兔全血粘度(mPaS)的影響(

n＝7) *P＜0.05給藥前后的t檢驗(yàn)


圖1A粗毒的SephadexG-75凝膠色譜分離。實(shí)驗(yàn)條件4.5×100cm色譜柱、0.01M濃度的磷酸鹽緩沖液(pH6.9)洗脫液和6ml/min流速。B對(duì)SephadexG-75洗脫2號(hào)活性峰的第一次DEAE-Sepharose FF離子交換分離。實(shí)驗(yàn)條件梯度杯2000ml×2、平衡緩沖液0.01M磷酸液緩沖液(pH6.9)、0-0.065M NaCI線性梯度(pH6.9)、3×20cm色譜柱和15ml/min流速。
圖2A第二次DEAE-Sepharose FF柱色譜。實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)第一次DEAE-Sepharose FF線性洗脫條件。B類(lèi)凝學(xué)酶Agacutin的SDS-PAGE分析(T∶C＝12∶5.84)。Lane1和2∶10和20μg樣品，Lane3分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(14.4-97.4kDa)。
圖3A類(lèi)凝血酶(Agacutin)凝膠HPLC分析。實(shí)驗(yàn)條件色譜柱(BIOSEPSEC-S2000，Pharmacia-LKB Co.，2.6×150mm)、0.2 M磷酸鹽緩沖液(pH6.9)和1ml/min流速。B類(lèi)凝血酶(Agacutin)的反相HPLC分析。實(shí)驗(yàn)條件C4柱(Hypersil C4，2.6×40mm)、1ml/min流速、0.1％三氟乙酸水溶液和乙晴梯度。C類(lèi)凝血酶(Agacutin)的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(T∶C＝7.5∶5.84)。Lane1和2∶10和20μg樣品。
圖4A溫度-活性曲線。BpH-活性曲線。凝結(jié)實(shí)驗(yàn)條件0.2ml人拘櫞酸化血漿+0.2mlAgacutin酶溶液(0.2U)，37℃保溫測(cè)活。
圖5類(lèi)凝血酶(Agacutin)的等電聚焦電泳。A聚丙烯酰胺等電聚焦圖。Lane1標(biāo)準(zhǔn)等電點(diǎn)蛋白和Lane2Agacutin酶。BpH值與凝膠長(zhǎng)度關(guān)系曲線。

具體實(shí)施例方式 1類(lèi)凝血酶Agacutin.的純化和活性10g尖吻蝮蛇蛇毒干粉(購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所和昆明龍津藥業(yè)有限公司)溶解在80ml 0.01M磷酸鹽緩沖液中(pH 6.9)，6000rpm離心20min。上清液上Sephadex G-75凝膠柱(7×100cm層析柱)。洗脫用0.01M磷酸鹽緩沖液(pH6.9)。收集的有效峰上DEAE-SepharoseFast Flow柱色譜(3×20cm層析柱)，洗脫條件用含有0-0.065M NaCI的磷酸鹽緩沖液(pH6.9)洗脫，梯度杯2000ml×2。在有效峰經(jīng)0.01M磷酸鹽緩沖液(pH6.9)透析24h后，透析樣再上DEAE-Sepharose FF柱，重復(fù)第一次DEAE-Sepharose FF柱色譜洗脫條件。將純化的樣品經(jīng)Sephadex G-25柱脫鹽和凍干后，實(shí)驗(yàn)完成。純化過(guò)程見(jiàn)圖1A&B和2B。純度結(jié)果(見(jiàn)圖3A、B&C)凝膠正相和C-4反相HPLC為單一峰，PAGE電泳位但一條帶。每支含1單位類(lèi)凝血酶(1單位的類(lèi)凝血酶Agacutin是指在37℃保溫條件下，使0.2ml人新鮮血漿在60±5秒凝結(jié)的酶量)。每支成品含1單位Agacutin和1％位分子右旋糖苷(購(gòu)自中檢所)。純化過(guò)程總結(jié)如下表 *中間體由于受其它類(lèi)凝血酶活性的干擾，其活性和比活無(wú)法獲得。
2結(jié)構(gòu)特征用以上制備工藝和活性的類(lèi)凝血酶Agacutin測(cè)其亞基分子量(SDS-PAGE法)為16224Da和14736Da，全分子量30960Da；等點(diǎn)電5.39；最使溫度35℃；最適pH7.5-8.0。N端15個(gè)氨基酸殘基的測(cè)序A亞基DCSSGWSSYEEHQYY，B亞基DSSGWSSYEGHEYYV。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2-5。
3體內(nèi)藥效學(xué)研究用以上工藝和結(jié)構(gòu)特征的Agacutin制劑成品[1單位/瓶，凍干粉劑，內(nèi)含1％微分子右旋糖酐敷料(敷料由中國(guó)藥品鑒定所提供)]進(jìn)行了新西蘭白兔和小鼠體內(nèi)進(jìn)行了完整的藥學(xué)評(píng)估。陽(yáng)性對(duì)照品立止血(Reptilase)，批號(hào)770604，市售，1單位/瓶，瑞士巴塞爾素高大藥廠生產(chǎn)。兩種凍干粉針臨用前用滅菌注射用水注入瓶，輕輕振搖，速溶。小白鼠，17-22g，雌雄兼有；新西蘭白兔，2-3kg體重，雌雄兼有，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，由耳靜脈給藥，直接心臟取全血。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1-8。
權(quán)利要求
1.一種防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶(Agacutin)，其特征在于其全分子量31KD，有16KD和15KD兩條多肽鏈組成，等電點(diǎn)5.39。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的止血類(lèi)凝血酶，其特征在于N端15個(gè)氨基酸殘基的測(cè)序A亞基DCSSGWSSYEEHQYY；B亞基DSSGWSSYEGHEYYV。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的止血類(lèi)凝血酶，其特征在于氨基酸組成為(％)Asp6.2，Thr1.43，Ser4.16，Glu8.74，Gly2.14，Ala2.15，Val2.88，Met1.33，Ile2.35，Leu2.28，Tyr2.45，Phe4.16，Lys4.19，His1.58，Arg1.83，Pro1.8，Cys4.34，Trp4.93，NH22.68。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的止血類(lèi)凝血酶，其特征在于在體外，促進(jìn)人枸櫞酸化血漿凝固和能使牛纖維蛋白原凝固，在體內(nèi)使凝血時(shí)間縮短。
5.一種防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒類(lèi)凝血酶的純化方法包括取驗(yàn)證了的尖吻蝮蛇蛇毒，加緩沖液溶解后離心，取上清液上Sephdaex G-75層析柱，活性峰上DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，活性峰經(jīng)透析后再上DEAE-SepharoseFast Flow層析柱，收集活性峰，即為純品。
6.包括權(quán)利要求5所述的該類(lèi)凝血酶的純化方法，其特征在于該蛇毒類(lèi)凝血酶采用FPLC DEAE-Sepharose Fast Flow色譜填料進(jìn)行純化，流速40ml/min。流動(dòng)相A10mmol/L磷酸鹽緩沖液PH6.9，B液為含有0.065mol/L氯化鈉的A液。洗脫梯度呈線性0-0.065mol/L的氯化鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的止血類(lèi)凝血酶，其特征在于可預(yù)防臨床手術(shù)出血，治療外傷出血及全身和局部止血。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的止血類(lèi)凝血酶，其特征在于不僅可肌肉注射，還可靜脈注射和靜脈滴注，不僅全身，還可局部使用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1和7所述的止血類(lèi)凝血酶，其特征在于該酶分子對(duì)血液的凝固不受肝素的影響，故可以制成診斷試劑用于臨床上測(cè)定某些使用肝素患者的出凝血時(shí)間。
10.據(jù)權(quán)利要求7和8所述的止血類(lèi)凝血酶，其特征在于該酶分子可通過(guò)血腦屏障，治療顱出血。
全文摘要
本發(fā)明的類(lèi)凝血酶涉及生物醫(yī)藥和酶學(xué)領(lǐng)域。具體地講，涉及一種從尖吻蝮蛇蛇毒中提取的、具有止血活性酶的結(jié)構(gòu)特征，純化方法和醫(yī)藥領(lǐng)域用途。該酶全分子量為31KD(SDS－PAGE法)，有相近兩個(gè)亞基16KD和15KD組成，其N(xiāo)端15個(gè)氨基酸殘基的測(cè)序A亞基DCSSGWSSYEEHQYY，B亞基DSSGWSSYEGHEYYV。HPLC為單峰。該酶最適溫度為35℃，最適pH 7.5，等電點(diǎn)為5.39。用酸水解測(cè)得該酶有18或20種氨基酸組成。血漿凝結(jié)試驗(yàn)在60±5秒，同時(shí)可使纖原凝結(jié)。該酶在體內(nèi)使全血凝固時(shí)間顯著縮短，不造成血栓形成，用于預(yù)防臨床手術(shù)出血、治療外傷出血、全身和局部止血及診斷某些臨床凝血時(shí)間。
文檔編號(hào)A61K38/48GK101092612SQ20061003604
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2006年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月22日
發(fā)明者唐松山 申請(qǐng)人:唐松山