專利名稱：一個新的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶及其止血活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥和蛋白質(zhì)酶學(xué)領(lǐng)域。具體的講，其涉及一種從尖吻蝮蛇(Agkisdroton acutus)蛇毒中提取的一種具有止血活性的類凝血酶(Agacutase)的結(jié)構(gòu)特征和醫(yī)藥領(lǐng)域方面的用途。該止血效應(yīng)的類凝血酶(Agacutase)通過激活纖維蛋白原而加強凝血，同時因不激活I(lǐng)I和XIII因子，不會引起體內(nèi)血栓形成。
背景知識尖吻蝮蛇又稱五步蛇或蘄蛇，分布在華南各省。其蛇毒中的精氨酸酯酶活性較低，無神經(jīng)毒和激肽釋放酶活性。在其組份中，以纖維蛋白原為底物的酶分布十分豐富，這些酶在體外能使人血漿和牛纖原凝結(jié)，但在體內(nèi)卻引起各種不同的生理效應(yīng)如降纖抗凝、血小板聚集、血管出血和止血等。Kornalic F將以纖維蛋白原為底物的蛇毒酶按其作用機理分成三類I類是類凝血酶(Thrombin-like enzyme)或凝血蛋白酶(Thrombic protease)，它僅分解纖維蛋白原的α鏈和/或β鏈的N端肽鏈，釋放A肽(α鏈)和/或B肽(β鏈)，使血液凝固。II類是纖維蛋白原裂解酶(Fibrinogenolytic enzyme)，它直接從纖維蛋白原三條肽鏈(α，β和γ)的C端水解，將纖原分解成碎片，血液不被凝固。III類是纖溶酶原激活酶(Enzyme activating plasminogen)，它是纖維蛋白溶解的間接或直接激活劑，它通過激活纖溶酶原產(chǎn)生纖溶酶，來裂解纖維蛋白或纖維蛋白原。本發(fā)明在低濃度給藥劑量(≤1U/kg)下屬第I類，在給藥劑量大于1.5單位/kg時，由于對血纖維蛋白原較高的活力，大量消耗纖原，引起血管t-PA的釋放，會激活纖溶酶原產(chǎn)生溶拴效應(yīng)。
尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的研究，最早是1967年的Cheng HC和Ouyang C等，他們于1971年和1972年相繼分離出兩個類凝血酶組份，經(jīng)動物實驗驗證，它們均有不同程度抗凝作用，其中的Acutin，分子量41KD，后被發(fā)展成降纖酶。肖昌華等從1988年起和管錦華等從1992年起，多次償試從尖吻蝮蛇蛇毒中分離使動物凝血時間縮短的組份，但都因無法提純，對其結(jié)構(gòu)無法準(zhǔn)確定性和定量，未成功。2001年，由沈陽賽諾科技發(fā)展有限公司、長春市斯達(dá)生物技術(shù)有限責(zé)任公司和北京賽生科技發(fā)展有限公司聯(lián)合成功地在國內(nèi)生產(chǎn)立止血產(chǎn)品，該產(chǎn)品自矛頭蝮蛇(Bathrops atrox)提取，分子量36000±5000Da，市場名巴曲停，英文名Hemocoagulase。2005年遼寧錦州醫(yī)學(xué)院牟萍等自長白山白眉蝮蛇(Agkistrodon blomhoffii ussurensis)中提取35.5KDa的具有止血活性的類凝血酶，該類凝血酶N端15個氨基酸殘基測序發(fā)現(xiàn)，與立止血一致，該類凝血酶仿制立止血，被發(fā)展成商品名為邦停上市。2006年西北師范大學(xué)王艷妮等自廣西園斑蝰蛇(Viper russellii)毒提取了具有止血活性的X因子激活劑，該凝血酶在極低劑量(0.000313U/kg)下，對小鼠和大鼠顯示良好的止血活性。
國外相似的產(chǎn)品有Hemocoagulase，Bothropase和Reptilase。Hemocoagulase它是Klobusitzky和Konig等1936年從Bothrops jararaca蛇毒中部分純化的一個局部和非胃腸使用的安全止血劑，Bothropase由米蘭Ravizzo公司從Bothrops jararaca蛇毒中提取，Reptilase由BaslePentapharm公司從Bothrops atrox蛇毒中提取。這些產(chǎn)品僅有立止血(Reptilase)的品種在國內(nèi)由深圳建安醫(yī)藥公司代理銷售。立止血療效確切，付作用小，臨床適應(yīng)癥廣，優(yōu)于其它止血藥等特點，于1996年進(jìn)入中國國家基本藥物目錄。
自從Reptilase進(jìn)入中國以來，國內(nèi)許多研究者都嘗試尋找過類似的止血成分，如中科院上海生化所戚正武研究員曾申請國家863計劃，但未成功。自1993年起，我們開始研究尖吻蝮蛇蛇毒中的類凝血酶組分。經(jīng)13年的努力，我們獲得了五個新的類凝血酶。以后的研究證實，至少兩種具有止血活性。本文的類凝血酶取名Agacutase。

發(fā)明內(nèi)容
1本發(fā)明的類凝血酶(Agacutase)作用方式與Reptilase相似，能使人血漿和牛纖維蛋白原在體外凝固，因不激活XIII和II因子，產(chǎn)生可溶性非交聯(lián)纖維蛋白單體。在傷口處，該單體與其它凝血因子相互作用加速止血效應(yīng)，在完整血管內(nèi)，該單體有幾分鐘半衰期，可迅速被纖溶酶降解清除。該類凝血酶(Agacutase)在體外使檸檬酸化血漿凝固，在體內(nèi)可使出凝血時間顯著縮短，同時又不造成血栓形成，達(dá)到傷口部位的止血或預(yù)防出血之目的。
2本發(fā)明的目的是提供具有預(yù)防臨床手術(shù)出血、治療外傷出血及全身和局部止血效應(yīng)的尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutase)，確定其準(zhǔn)確的物理化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征和藥學(xué)效果。
3本發(fā)明的目的是提供該尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutase)肽鏈的N端15個氨基酸殘基序列，用于與其它類凝血酶的結(jié)構(gòu)區(qū)別。
4一種具有防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)，用SDS-PAGE(T∶C＝12∶4.9)法測得其分子量為37KDa，由單肽鏈組成，該酶最適溫度為37℃(見圖7))，最適pH7.5(見圖8)，等電點為5.86(見圖9，10)，根據(jù)文獻(xiàn)和我們的試驗結(jié)果證實，該類凝血酶(Agacutase)結(jié)構(gòu)與立止血、巴曲停、邦停、和我們此前申請的Agacutin等完全不同。
5用生化方法純化后的類凝血酶(Agacutase)，SDS-PAGE(T∶C＝12∶3.9)法測定的分子量為37KD(見圖1)，正相HPLC測定為單一峰(見圖2)，PAGE為單一帶(見圖3)。比較幾種尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶的分子大小和結(jié)構(gòu)(圖2、3、4、5、6)，發(fā)現(xiàn)Agacutase與Acutin和Agacutin具有明顯不同的分子大小和結(jié)構(gòu)。該類凝血酶在體外能使新鮮人血漿和牛纖原凝固，血漿凝結(jié)比活大于500單位/mg。N端15個氨基酸殘基測序結(jié)果Val-Ile-Gly-Gly-Asn-Glu-Cys-Asp-Thr-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。
6體內(nèi)藥效學(xué)驗證純化后的尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutase)經(jīng)新西蘭白兔耳靜脈注射，實驗采用三個劑量組
，在給藥后10，30，60，180分鐘，使全血凝固時間(表1)明顯縮短。各實驗劑量組靜脈注射使血纖維蛋白原含量(表2)有不同程度的減少。對家兔凝血活酶時間(表3)、血小板數(shù)量(表4)無明顯影響。對優(yōu)球蛋白溶解時間(表5)，該類凝血酶在大劑量下，可使溶解時間略縮短。本試驗設(shè)立立止血陽性對照組和生理鹽水陰性對照組，肌注后，相同劑量的本品與立止血對照組比較，兩者藥效相近，但優(yōu)于生理鹽水組對照組。
7常用適用途徑有肌肉注射，靜脈注射，可局部或全身使用等。
8藥效學(xué)見表1～6。
表1尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutase)對新西蘭兔全血凝固時間的影響(x±s，n＝3)

*P＜0.05，**P＜0.01給藥前后的t檢驗表2尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutase)對新西蘭白兔纖原含量的影響(x±s，n＝3)

*P＜0.05，**P＜0.01給藥前后的t檢驗表3尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutase)對新西蘭白兔APTT的影響(x±s，n＝3)

表4尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutase)對血小板數(shù)量的影響(x±s，n＝3)

表5類凝血酶(Agacutase)對優(yōu)球蛋白溶解時間(ELT)的影響(x±s，n＝3)

*P＜0.05，**P＜0.01與生理鹽水組相比表6尖吻蝮蛇類凝血酶(Agacutase)對小鼠剪尾出血時間的影響

*P＜0.05，與生理鹽水組相比


圖1類凝血酶Agacutase的SDS-PAGE分析(T∶C＝12∶4.9)。Lane1和2Agacutase(37KDa)，Lane3標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(14.4～97.4KDa)。
圖2類凝血酶(Agacutase)凝膠HPLC分析。實驗條件色譜(色譜柱BIOSEPSEC-S2000，Phenomenx型號，7.8×300mm，Pharmacia-LKB Co.；色譜儀島津LC-10A)、0.2M磷酸鹽緩沖液(pH6.8)和1ml/min流速。
圖3類凝血酶(Agacutase)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(T∶C＝7.5∶4.9)分析。Lane1Agacutin；Lane2和3Acutin；Lane4和5Agacutase；Lane6標(biāo)準(zhǔn)蛋白(未標(biāo)出)。
圖4尖吻蝮蛇蛇毒不同類凝血酶(Agacutase和Acutin)的SDS-PAGE分析(T∶C＝12∶4.9)。Lane1和2Agacutase(37KDa)，Lane3Acutin(41KDa)，Lane4標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白(14.4～97.4KDa)。
圖5尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutin)凝膠HPLC分析。
圖6尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Acutin)凝膠HPLC分析。
圖7溫度-活性曲線。凝結(jié)實驗條件0.2ml人拘櫞酸化血漿+0.2mlAgacutase酶溶液(0.2U)，不同溫度保溫測活。
圖8pH-活性曲線。凝結(jié)實驗條件0.2ml人拘櫞酸化血漿+0.2mlAgacutase不同pH酶溶液(0.2U)，37℃保溫測活。
圖9類凝血酶(Agacutase)的等電聚焦電泳分析。Lane AAgacutase；LaneBAgacutin；Lane C標(biāo)準(zhǔn)等電點蛋白(未標(biāo)出)。
圖10pH值與凝膠長度關(guān)系曲線。
具體實施例方式1類凝血酶Agacutase.的活性用生物化學(xué)方法純度的Agacutase，見結(jié)果(圖1、2、3)；凝膠正相為單一峰，SDS-PAGE和PAGE電泳帶為單一條帶。制劑成品每支含1單位類凝血酶(1單位的類凝血酶Agacutase是指在37℃保溫條件下，使0.2ml人新鮮血漿在60±5秒凝結(jié)的酶量)。
2結(jié)構(gòu)特征用生物化學(xué)方法制備的類凝血酶Agacutase，測其分子量(SDS-PAGE法)為37kDa，等點電5.86；最使溫度37℃；最適pH7.5。N端15個氨基酸殘基的測序Val-Ile-Gly-Gly-Asn-Glu-Cys-Asp-Thr-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。實驗結(jié)果見圖7-10。
3體內(nèi)藥效學(xué)研究用生物化學(xué)方法制備的Agacutase，制劑成品[1單位/瓶，凍干粉劑，內(nèi)含1％微分子右旋糖酐敷料(敷料由中國藥品鑒定所提供)，在新西蘭白兔和小鼠體內(nèi)進(jìn)行了藥學(xué)評估。陽性對照品立止血(Reptilase)，批號770604，市售，1單位/瓶，瑞士巴塞爾素高大藥廠生產(chǎn)。兩種凍干粉針臨用前用滅菌注射用水注入瓶，輕輕振搖，速溶。小白鼠，17-22g，雌雄兼有；新西蘭白兔，2-3kg體重，雌雄兼有，由南方醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。制劑由耳靜脈給藥，直接心臟取全血。實驗結(jié)果見表1-6。
權(quán)利要求
1.一種防治出血的尖吻蝮蛇蛇毒類凝血酶(Agacutase)，其特征在于其分子量37KDa，單肽鏈組成，最適溫度37℃，最適pH7.5，等電點5.86。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類凝血酶，其特征在于N端15個氨基酸殘基的序列Val-Ile-Gly-Gly-Asn-Glu-Cys-Asp-Thr-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的類凝血酶，其特征在于在體外，促進(jìn)人枸櫞酸化血漿凝固和能使牛纖維蛋白原凝固，血漿凝結(jié)比活大于500單位/mg，在體內(nèi)，低劑量使凝血時間縮短。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的類凝血酶，其特征在于可預(yù)防臨床手術(shù)出血，治療外傷出血及全身和局部止血。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的類凝血酶，其特征在于不僅可肌肉注射，還可靜脈注射和靜脈滴注，不僅全身，還可局部使用。
全文摘要
本發(fā)明的類凝血酶涉及生物醫(yī)藥和酶學(xué)領(lǐng)域。具體地講，涉及一種從尖吻蝮蛇蛇毒中提取的、具有止血活性酶的結(jié)構(gòu)特征，純化方法和醫(yī)藥領(lǐng)域用途。該酶分子量為37KDa(SDS－PAGE法)，單肽鏈組成，其N端15個氨基酸殘基的序列Val－Ile－Gly－Gly－Asn－Glu－Cys－Asp－Thr－Asn－Glu－His－Arg－Phe－Leu。HPLC為單峰。該酶最適溫度為37℃，最適pH 7.5，等電點為5.86。血漿凝結(jié)試驗在60±5秒，同時可使纖原凝結(jié)，血漿比活大于500U/mg。該酶在體內(nèi)使全血凝固時間顯著縮短，不造成血栓形成，用于預(yù)防臨床手術(shù)出血、治療外傷出血、全身和局部止血。
文檔編號A61K38/48GK1958790SQ20061003668
公開日2007年5月9日 申請日期2006年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月27日
發(fā)明者唐松山 申請人:唐松山