專利名稱：一種免佐劑具有防治人胰島素依賴型糖尿病作用的免疫調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術、蛋白分離純化技術及醫(yī)學相關領域。更具體地，本發(fā)明涉及融合蛋白HSP65-6×p277的構建、表達及分離純化。在醫(yī)學領域中，本發(fā)明是一種免疫調(diào)節(jié)劑，能用于預防和治療人胰島素依賴型糖尿病。
背景技術：
人胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)，包括1型糖尿病和1.5型糖尿病。1型糖尿病，是一種具家族遺傳性的自身免疫性疾病，患者以青少年居多。主要表現(xiàn)為胰島β細胞的大部分被破壞和胰島素的絕對缺乏。目前尚無有效的治療方法，患者需終生依靠胰島素，十分痛苦。1992年后，我國一些地區(qū)根據(jù)WHO diamond Project計劃，在統(tǒng)一方法和標準下，對15歲以下兒童1型糖尿病的發(fā)病率進行了調(diào)查，據(jù)收集到的已發(fā)表的11個地區(qū)的資料中，1988年到1995年期間我國兒童1型糖尿病的年發(fā)病率在0.19/10萬～1.26/10萬，多數(shù)地區(qū)年發(fā)病率在0.5/10萬～0.9/10萬。自20世紀80年代起，兒童1型糖尿病的發(fā)病在我國有不斷增高的趨勢。1.5型糖尿病學名叫“成人隱匿性自身免疫糖尿病”，它是以胰島β細胞破壞為主，因此從本質(zhì)上屬于1型糖尿病。但它的起病又具有隱匿、遲發(fā)的特點，發(fā)病初期服降糖藥治療有效，無需使用胰島素，這又符合2型糖尿病的特點，因此稱它為1.5型糖尿病，這種特殊類型的糖尿病約占患者的10％~15％，我國約有病人800萬。
一般情況下，自身免疫性疾病可通過免疫注射疾病相關的自身抗原來治療。目前已經(jīng)從IDDM病人血清中檢測出許多自身抗體，其中重要的有胰島細胞抗體(islet cell antibody，ICA)，胰島素抗體(insulin antibody，IA)，抗熱休克蛋白60((heat shock protein60，HSP60)抗體，抗谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)抗體等。由此進一步驗證引起疾病的自身抗原有胰島細胞表面抗原-512(ICA-512)，胰島素，HSP60，GAD，此外可能存在的還有胰島素受體，羧肽酶H，外周蛋白等。
當存在多種可能的抗原時，確定其中的優(yōu)勢抗原尤為重要。熱休克蛋白(HSP)是所有的細胞，包括原核細胞和真核細胞在受到溫度的突然增高和其他理化因素的刺激產(chǎn)生應激反應后而形成的一種高度保守蛋白，具有很強的免疫原性，與多種自身免疫性疾病相關，其中與IDDM相關的為HSP60家族。結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中的熱休克蛋白65(MT-HSP65)本身有抗糖尿病作用，但注射免疫會誘發(fā)動脈粥樣硬化，采用粘膜免疫途徑不僅不會誘發(fā)動脈粥樣硬化，而且還能夠保持HSP65本身的抗糖尿病效果。
HSP60是IDDM中極其重要的一個抗原，迄今為止，未見有報道稱由HSP60引發(fā)IDDM，倒是有許多文獻表明，用此種抗原免疫機體能使其在下一次遇到該抗原時對其產(chǎn)生耐受性，阻止自身免疫性疾病的發(fā)生。有人把人工合成的多肽固定在聚乙烯材料上，來進行HSP60的線性抗體表位掃描，發(fā)現(xiàn)糖尿病兒童組的血清中特異性針對p277的抗體水平顯著高于健康兒童組。p277多肽是存在于人HSP60蛋白上437-460的一段特異性多肽，是在IDDM中發(fā)揮作用的特異片段，序列為VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。有文獻報道了一次隨機的，雙盲的二期臨床實驗，實驗結果表明，p277能挽救機體內(nèi)未受損的胰島β細胞的功能(即使機體已表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀)，使其能繼續(xù)釋放內(nèi)源性的胰島素。至于p277的作用機理，可以通過一種抗原能調(diào)控機體對其它抗原反映的現(xiàn)象(亦稱“旁路抑制”理論)來解釋，即一種抗原在炎癥部位激活抑制炎癥因子的Th2型細胞因子可關閉Th1細胞對附近抗原的反應，這也是目前對此較為成熟與合理的解釋。在鼠和人中，與胰島β細胞決定簇作用的主要為CD4+T細胞，而CD4+T細胞按其分泌的細胞因子不同又分為Th1細胞和Th2細胞。Th1細胞主要分泌IL2和IFN-γ，前者能有效刺激T細胞增值，后者為炎癥因子，能引起組織發(fā)炎并誘導β細胞產(chǎn)生IgG2a抗體。而且由于77％的Th1細胞具有細胞毒作用，它可以溶解呈遞自身移植抗原的β細胞，從而使抗體生成降低，降低體液免疫。Th2細胞分泌IL4和IL-10，能降低Th1效應。IL-4促進β細胞產(chǎn)生IgGI抗體，抑制Th1產(chǎn)生前炎癥因子。IL-10通過影響抗原呈遞細胞和巨噬細胞釋放前炎癥因子而抑制Th1活性。至于p277為什么能誘導這種變化，現(xiàn)在認為關鍵在于p277本身的抗原特性、結構等，因為T細胞表型的分化受不同抗原刺激產(chǎn)生不同的結果。因此可考慮用此作為免疫調(diào)節(jié)劑來預防和治療胰島素依賴型糖尿病。
采用免疫調(diào)節(jié)劑可以克服傳統(tǒng)的口服或注射胰島素及器官移植等方法的諸多缺點，更重要的是它能挽救未損傷的β細胞，使其繼續(xù)釋放內(nèi)源性的胰島素。然而p277作為只具有20幾個氨基酸的多肽，免疫原性很弱，這在一定程度上限制了其作用的發(fā)揮。通常，多肽疫苗需要加入佐劑，才能激發(fā)機體產(chǎn)生足夠強的免疫應答。許多常用的佐劑，如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑等僅能用于動物，不能用于人體人體可用的佐劑目前僅有鋁佐劑，而這種佐劑常常對多肽疫苗不能起到強化免疫原性的作用。本發(fā)明采用HSP65與六段p277融合表達，其中HSP65具有“在位”佐劑的功能，可以非特異性刺激T細胞或作用于巨噬細胞，起到呈遞特異性抗原的作用；抗原表位六段重復又可以增大表位劑量，從而提高藥效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種強化多肽免疫原性的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種具有防治人胰島素依賴型糖尿病作用的免疫調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的再一目的是提供生產(chǎn)該免疫調(diào)節(jié)劑的方法。
本發(fā)明的又一目的是提供了該免疫調(diào)節(jié)劑的免疫途徑。
本發(fā)明的最終目的是該免疫調(diào)節(jié)劑的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種強化多肽免疫原性的方法，這種方法是將六段重復的抗原表位多肽串聯(lián)基因反復插入HSP65基因的下游，使多重復串聯(lián)抗原表位多肽與HSP65融合表達。這種強化多肽免疫原性方法的原理是(1)將抗原表位多肽重復多次，可以增加抗原表位的劑量，增加整個抗原的分子量，從而增加抗原表位多肽的免疫原性；(2)通過重復抗原表位基因的反復循環(huán)克隆實現(xiàn)抗原表位的多次重復；(3)分枝桿菌HSP65具有在位佐劑的功能，將抗原表位多肽重復片斷與分枝桿菌HSP65基因融合表達的蛋白作為免疫調(diào)節(jié)劑，可以不需添加佐劑，誘發(fā)機體產(chǎn)生強烈的免疫應答。而且，將HSP65基因與抗原表位融合表達可省去抗原表位多肽與在位佐劑HSP65化學偶聯(lián)的步驟。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑可簡寫為HSP65-n×p277，n指用于串聯(lián)排列的重復抗原表位p277的個數(shù)，且大于1，抗原表位之間可以直接相聯(lián)，也可以有間隔的氨基酸殘基。在疫苗研究中，表位之間可以在空間上相鄰也可以不相鄰。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種具有防治人胰島素依賴型糖尿病作用的免疫調(diào)節(jié)劑。該免疫調(diào)節(jié)劑采用本發(fā)明的第一方面所述的方法進行設計。在免疫調(diào)節(jié)劑分子中，(重復抗原表位)n等于6，即含有六段(但不限于)作為抗原表位的源于人HSP60(437-460)的抗原表位多肽p277。為了敘述方便，在實施例中，本發(fā)明含六段p277抗原表位用“6×p277”表示。HSP65是指來源于牛分枝桿菌的熱激蛋白，基因庫登錄號是M17705。將抗原表位多肽與HSP65融合表達，能強化多肽疫苗的免疫原性，不需添加佐劑就能激發(fā)機體產(chǎn)生強烈免疫應答，用于防治人胰島素依賴型糖尿病。將六段抗原表位與HSP65融合表達所獲得的具有防治人胰島素依賴型糖尿病作用的免疫調(diào)節(jié)劑表示為“HSP65-6×p277”。
在本發(fā)明的第三方面，提供了生產(chǎn)該免疫調(diào)節(jié)劑的方法，其技術路線詳述如下1.p277基因的設計與獲得p277是人HSP60上的一段437VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED460氨基酸序列，該序列是HSP60對IDDM發(fā)揮作用的特異片段。我們將442和447位的C(半胱氨酸)用V(纈氨酸)來置換，以增強肽段的穩(wěn)定性，兩者具有相同的免疫特性。根據(jù)多肽p277氨基酸序列，選擇原核和真核生物均適用的密碼子，借助于計算機設計兩條寡核苷酸鏈，分別作為上游、下游引物，并在上游引物5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶BamHI的酶切位點，下游引物5’端加上終止密碼子和限制性核酸內(nèi)切酶HindIII的酶切位點，兩條引物互補序列為20個堿基，通過聚合酶鏈式反應(PCR)法獲得p277多肽基因的核苷酸序列。
2.HSP65基因的設計與獲得在不改變HSP65氨基酸序列的前提下，選用原核和真核生物均適用的密碼子，借助于計算機設計兩條寡聚核苷酸鏈，從市售的卡介苗提取的DNA中通過PCR法獲得HSP65基因的核苷酸序列，5’端添加了Nco I的識別位點，3’端添加了Nhe I和Bgl II的識別位點。
3.pED-p277重組基因工程菌的構建p277基因經(jīng)BamHI、HindIII切割插入經(jīng)BamHI、HindIII切割的pED質(zhì)粒載體中，組成融合表達的重組質(zhì)粒PED-p277，重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
4.PED-HSP65-p277重組基因工程菌的構建HSP65基因經(jīng)Nco I、Bgl II切割插入經(jīng)Nco I、BamHI切割的pED-p277質(zhì)粒中，BglII和BamHI為同尾酶，組成融合表達的重組質(zhì)粒pED-HSP65-p277，重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌BL21獲得重組基因工程菌。
5.PED-HSP65-6×p277重組基因工程菌的構建在不改變串聯(lián)多肽氨基酸序列的前提下，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，借助于計算機設計兩條寡聚核苷酸鏈，通過PCR法獲得重復抗原表位多肽基因的核苷酸序列，5’端添加了Xba I的識別位點，3’端添加了Nhe I的識別位點。p277基因經(jīng)Xbal、Nhel切割插入經(jīng)Nhel切割的PED-HSP65-p277質(zhì)粒載體中，組成融合表達的重組質(zhì)粒PED-HSP65-2×p277，HSP65后仍然留有單一酶切位點Nhel，在此基礎上重復操作可再插入一段p277基因，即插入p277基因6次則得到融合表達的重組質(zhì)粒pED-HSP65-6×p277，重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。重要的一點是p277最后一個氨基酸是天冬氨酸，其密碼子為GAT，以便于陽性克隆的篩選。因為載體質(zhì)粒采用單酶切，插入p277基因時會有正向和反向兩種情況，如果是正向插入則GAT表達為天冬氨酸，HSP65-p277蛋白的分子量比HSP65蛋白要大2800左右；如果是反向插入則GAT變?yōu)門AG，為終止密碼子，HSP65-p277蛋白的分子量與HSP65蛋白的分子量相等。所以用SDS-PAGE考馬斯亮藍染色電泳可判斷正向正確插入p277基因的重組克隆。
6.工程菌發(fā)酵及重組HSP65-6×p277融合蛋白的獲得以LB為基礎培養(yǎng)基，玉米漿培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵參數(shù)如下溫度36-38℃，pH6.8-7.2。發(fā)酵后離心收集工程菌，反復凍融裂解菌體，離心獲得上清可溶性蛋白，硫酸銨分級沉淀，30％-40％硫酸銨沉淀中含有目的融合蛋白，沉淀重新溶解后經(jīng)DEAE陰離子交換柱層析純化，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以判斷純化的HSP65-6×p277的純度。
在本發(fā)明的第四方面是提供了該免疫調(diào)節(jié)劑的免疫途徑。結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中的熱休克蛋白65(MT-HSP65)本身有抗糖尿病作用，但用該蛋白注射免疫會誘發(fā)動脈粥樣硬化，采用粘膜免疫途徑不僅不會誘發(fā)動脈粥樣硬化，而且還能夠保持HSP65本身的抗糖尿病效果。在本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑中，MT-HSP65不僅具有抗糖尿病的作用，而且還起到了“在位”佐劑的功能，將抗原表位多肽p277多次重復串聯(lián)與HSP65融合表達，能強化p277的免疫原性，不需添加佐劑就能激發(fā)機體產(chǎn)生強烈免疫應答，可以通過粘膜給藥來防治人胰島素依賴型糖尿病。利用鼻粘膜給藥進行粘膜免疫簡便易行，藥物經(jīng)鼻粘膜部豐富毛細血管吸收后直接進入體循環(huán)，使藥物不良反應的發(fā)生機率大為降低，體液免疫是粘膜免疫效應的主要過程，即產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，sIgA的多聚體結構能增強其對抗原的親和力，而且sIgA表面特殊的糖成分或糖鏈有助于使其粘附于粘膜的表面和抵抗蛋白水解酶的消化作用。通過鼻粘膜給藥還可免受胃腸道中酶的破壞和肝臟對藥物的首過清除效應，有利于提高生物利用度和血藥濃度，可極大地減少藥物用量。同時IgG，IgM，IgE等免疫球蛋白在粘膜反應中也起著不可忽視的重要作用。
在本發(fā)明的第五方面是該免疫調(diào)節(jié)劑的用途，如上所述，此種免疫調(diào)節(jié)劑能用于防治人胰島素依賴型糖尿病的發(fā)生。我們選用國際上通用的胰島素依賴型糖尿病的動物模型NOD(non-obese diabetic mouse，NOD)小鼠，隨機分成五組，每組十只，分別是HSP65-6×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫組，HSP65-1×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫組，HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫組，PBS空白對照組，卵清蛋白滴鼻對照組。分別于4周齡、7周齡、10周齡3次免疫，蛋白都用PBS溶解，不加其他佐劑，每次免疫劑量為100μg/只。每月測小鼠體內(nèi)血糖水平及相應的抗體滴度。結果顯示，HSP65-6×p277、HSP65-1×p277和HSP65都可以不同程度的抑制NOD小鼠糖尿病的發(fā)生，這可能由于熱休克蛋白高度保守，MT-HSP65和人的HSP60中含有相似的抗原表位，當以可溶性的方式粘膜免疫時可以誘導機體產(chǎn)生免疫耐受，從而起到降低針對胰島β細胞的免疫損傷來防治糖尿病的發(fā)生。這樣一來通過粘膜免疫HSP65不僅不會誘發(fā)動脈粥樣硬化，而且還具有“在位”佐劑的功能并同時能夠保持其本身的抗糖尿病效果。將其與多次重復p277組成重組蛋白，明顯優(yōu)于單獨使用p277，更有利于防治人胰島素依賴型糖尿病的發(fā)生。


圖1載體質(zhì)粒pED-HSP65-p277以及重組質(zhì)粒pED-HSP65-6×p277結構圖。
圖2重組質(zhì)粒pED-HSP65-6×p277C端部分基因測序結果。
圖3SDS-PAGE電泳顯示重組質(zhì)粒pED-HSP65-6×p277的融合表達。1.大腸桿菌BL21細胞全蛋白；2.載荷pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導后)；3.載荷pET28a-HSP65質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導后)；4.載荷pED-HSP65-6×p277質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導后)；5.標準分子量蛋白。
圖4SDS-PAGE電泳顯示HSP65-6×p277蛋白的純化.1.標準分子量蛋白；2.大腸桿菌BL21細胞全蛋白；3.載荷pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導后)；4.乳糖誘導6小時后載荷pED-HSP65-6×p277質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；5.分離的融合蛋白HSP65-6×p277。
圖5SDS-PAGE電泳顯示HSP65-1×p277蛋白及HSP65蛋白的純化.1.標準分子量蛋白；2.乳糖誘導6小時后載荷pED-HSP65質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白；3.分離的HSP65-1×p277蛋白；4.分離的HSP65蛋白。
圖6ELISA測定結果顯示HSP65-6×p277和HSP65-1×p277蛋白經(jīng)粘膜免疫都能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗p277的抗體。
圖7Westernblot檢測結果顯示HSP65-6×p277能誘發(fā)NOD小鼠產(chǎn)生抗p277抗體。A蛋白轉膜后用麗春紅染色顯示相應的蛋白條帶；B雜交后顯色結果。1.標準分子量蛋白；2.氧化態(tài)rhVEGF-p277；3.還原態(tài)rhVEGF-P277；4.氧化態(tài)rhVEGF；5.還原態(tài)rhVEGF。
圖8各組NOD小鼠免疫后不同月齡血清中血糖的含量。結果顯示HSP65-6×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫以及HSP65-1×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫均可以顯著降低NOD小鼠血糖含量，HSP65給藥組NOD小鼠的血糖也有不同程度的降低。
具體實施例方式
(1)菌株，細胞系和質(zhì)粒宿主菌E.coliBL21(Escherichia coliBL21)是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究有關的實驗室一般都有保存。
質(zhì)粒pET28a購自Novagen公司。
卡介苗由上海生物制品公司生產(chǎn)，該制品中含有牛結核分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)。
質(zhì)粒pED由本實驗室構建并保存。
質(zhì)粒pET28a-HSP65由本實驗室構建并保存，HSP65蛋白也由本實驗室分離純化。
(2)酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、細菌基因組、質(zhì)粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產(chǎn)品PCR回收試盒和瓊脂糖膠回收試劑盒為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品。
(3)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，配方見參考文獻Salmbrook J，F(xiàn)ristsh EF，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。該書是基因工程技術的經(jīng)典著作，在許多高校圖書館都有收藏。
玉米漿培養(yǎng)基含有玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
(4)Cellouse-DEAE DE-52為Whatman公司產(chǎn)品。
(5)辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗為武漢博士德公司產(chǎn)品。
(6)3、3’、5、5’一四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、過氧化氫尿素和牛血清白蛋白(BSA)為美國西格馬(sigma)公司產(chǎn)品。
(7)96孔酶標板為美國康寧(Corning)公司產(chǎn)品。
(8)硝酸纖維素膜為美國Millipore公司產(chǎn)品。
(9)測定血清中血糖濃度的儀器為Hitachi Automatic Analyzer(Model-7150，Tokyo，Janpan)。
方法分子生物學操作方法質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應、限制性核酸內(nèi)切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉化大腸桿菌在基因工程研究領域，這些都是常規(guī)操作方法，參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYColdspringHarborLaboratoryPress，1989，pp.16-340。
重組蛋白表達量的測定參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press.1989，方法進行。
實施例1HSP65-6×p277多肽基因的設計、合成和克隆根據(jù)MT-HSP65基因和p277多肽基因的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，在計算機的輔助下設計出6條寡核苷酸片段。首先通過PCR法合成p277多肽基因，將該基因克隆到pED的L-ansB-C基因的C端，轉化大腸桿菌得到重組質(zhì)粒命名pED-p277。再以pET28a-HSP65質(zhì)粒為模板，通過PCR的方法獲得MT-HSP65基因，將該基因替換pED-p277中的L-ansB-C基因，轉化大腸桿菌得到重組質(zhì)粒命名pED-HSP65-p277。重復克隆p277基因得到重組質(zhì)粒pED-HSP65-2×p277；再重復克隆p277基因，直至得到重組質(zhì)粒pED-HSP65-6×p277。具體方法如下6條寡核苷酸PI5’-GCTGGATCCAGTTCTGGGTGGTGGCGTTGCTCTGCTGCGCGTTATCCCGGCTCTGG-3’P25’-GTCAAGCTTA ATCTTCGTTAGCCGGGGTCAGGGAGTCCAGAGCCGGGATA ACGCGC-3’P35’-TTG ACC ATG GCC AAG ACAATT GCG TAC-3’P45’-TAAAAGATCTGCGCTAGCGAAATCCATGCCACCCAT-3’P55’-ATGGGCTAGCGTTCTGGGTGGTGGTGTTGCTCTGCTGCGCGTTATCCCGGCTCTG-3’P65’-TATGTCTAGAATCTTCGTTAGCTGGGGTCAGGGAGTCCAAAGCCGGGATAACGCG-3’通過PCR獲得p277多肽基因?qū)⒐押塑账崞蜳1和P2按一定比例混合，二者互為引物和模板，94℃，30sec，58℃，30sec，72℃，30sec，共30個循環(huán)72℃，10min。將擴增獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和HindIII消化，與用相同限制性內(nèi)切酶消化的pED質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌BL21，所獲得的轉化子中含連有p277多肽基因的重組質(zhì)粒pED-p277。
通過PCR獲得HSP65多肽基因以P3為上游引物，P4為下游引物，pET28a-HSP65質(zhì)粒為模板，經(jīng)94℃變性5min，然后以94℃變性1min、62℃復性1min、72℃延伸2min，共進行35個循環(huán)后，再72℃延伸10min。將擴增所得PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒純化后用限制性核酸內(nèi)切酶Ncol和Bgl II消化，與用Ncol和BamHI消化的pED-p277質(zhì)粒連接，其中Bgl II和BamHI為同尾酶，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌BL21，所獲得的轉化子中含HSP65-p277融合蛋白基因的重組質(zhì)粒pED-HSP65-p277。結構框架見圖1。
通過PCR獲得HSP65-6×p277多肽基因以寡核苷酸片段P5和P6按一定比例混合，二者互為引物和模板，經(jīng)94℃變性5min，然后以94℃變性1min、58℃復性50sec、72℃延伸30sec共進行30個循環(huán)后，再72℃延伸10min。將擴增獲得的PCR產(chǎn)物p277用限制性內(nèi)切酶Xbal和Nhel消化，與用限制性內(nèi)切酶NheI消化的pED-HSP65-p277質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌BL21，所獲得的轉化子中含HSP65-2×p277多肽融合蛋白基因的重組質(zhì)粒pED-HSP65-2×p277。限制性內(nèi)切酶Xbal和Nhel是同尾酶，酶連后形成的粘合位點不再被Xbal或Nhel識別，因此重組質(zhì)粒pED-HSP65-2×p277中仍然只留有一個Nhel酶切位點。再將PCR擴增產(chǎn)物p277用限制性內(nèi)切酶Xbal和Nhel消化，與用限制性內(nèi)切酶Nhel消化的質(zhì)粒pED-HSP65-2×p277連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌BL21，所獲得的轉化子中含HSP65-3×p277多肽融合蛋白基因的重組質(zhì)粒pED-HSP65-3×p277；六次進行這一過程得到含HSP65-6×p277多肽融合蛋白基因的重組質(zhì)粒pED-HSP65-6×p277，其結構框架見圖1。
實施例2HSP65-6×p277基因在大腸桿菌中的表達將重組質(zhì)粒pED-HSP65-6×p277轉化大腸桿菌BL21。從生長有不同轉化子平板上挑取單菌落接種含有50ug/ml卡那霉素LB液體培養(yǎng)基，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，按1％比例轉接種入新鮮的玉米漿液體培養(yǎng)基(50ug/ml卡那霉素)中，37℃培養(yǎng)4小時后，加入終濃度為0.5mmol/L的α-乳糖誘導大腸桿菌表達T7RNA聚合酶，繼續(xù)培養(yǎng)從而表達融合蛋白HSP65-6×p277。誘導后每隔1小時取少量菌液，離心回收菌體，SDS-PAGE電泳再經(jīng)薄層掃描顯示已經(jīng)實現(xiàn)了HSP65-6×p277多肽基因的融合表達。融合蛋白在誘導后6小時達到穩(wěn)定的最大表達量，融合蛋白占細菌總蛋白的40％左右，結果見圖3。
實施例3重組蛋白HSP65-6×p277的分離純化誘導表達后的工程菌經(jīng)離心回收菌體，將菌體懸浮在菌體裂解液(pH8.0，50mM磷酸鹽緩沖液，0.02％溶菌酶)中，37℃攪拌30分鐘，加入DNase將DNA消化至溶液不粘稠為止，離心回收上清，用硫酸按分級沉淀，目的蛋白主要在35％-45％硫酸按沉淀中。將沉淀的融合蛋白重新溶解在pH6.8磷酸鹽緩沖液中，透析脫鹽，離心后取上清進行陰離子交換柱層析，DEAE纖維素DE-52柱(2×60cm)，用PB/NaCI梯度洗脫，分段收集進行SDS-PAGE電泳檢測，HSP65-6×p277在120～150mmolNaCI處的洗脫峰中，用SDS-PAGE電泳檢查制備樣品的純度，見圖4。HSP65-1×p277蛋白和HSP65蛋白由本實驗室保存，用SDS-PAGE電泳檢查其純度，見圖5。
實施例4HSP65-6×p277重組蛋白的免疫原性研究選用4周齡雌性NOD小鼠，隨機分成五組，每組十只，分別是HSP65-6×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫組，HSP65-1×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫組，HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫組，PBS空白對照組，卵清蛋白滴鼻對照組。分別于4周齡、7周齡、10周齡3次免疫，蛋白都用PBS溶解，不加其他佐劑，每次免疫劑量為100μg/只。每次免疫后3周內(nèi)眥取血一次，血量為0.5-0.8ml，離心，取血清冷凍保存。
用純化的重組人血管內(nèi)皮生長因子121和p277的融合蛋白(rhVEGF-p277)4℃過夜包被96孔ELISA酶標板，每孔100μl含50μg融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃滿孔封閉一小時。免疫后取血所得抗血清用5％BSA(于pH7.5的PBS中)稀釋100倍，然后每孔加入100μl稀釋后的抗血清于37℃作用1小時。用PBST(含0.1％Tween-20)和自來水間隔洗滌6次后加入100μl以1∶20000稀釋的羊抗小鼠IgG二抗(辣根過氧化物酶標記)，每孔100μl，37℃作用1小時。PBST和自來水間隔洗滌6次，每孔加入100μl過氧化氫尿素和3，3’-5，5’一四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液于37℃顯色30分鐘后，加入50μl 2MH2SO4終止反應，并于450nm波長下，測定各孔吸光度值。結果見圖6。HSP65-6×p277和HSP65-1×p277免疫組都能誘發(fā)NOD小鼠產(chǎn)生特異的抗p277抗體，但HSP65-6×p277組抗體值明顯優(yōu)于HSP65-1×p277組。
實施例5抗p277特異抗體的Western檢測將純化后的rhVEGF、還原態(tài)rhVEGF-p277和氧化態(tài)rhVEGF-p277用15％SDS-PAGE電泳后，于30V電壓電泳過夜轉移到硝酸纖維素膜上，然后以5％BSA溶液室溫封閉2小時。實施例5和例6中所得抗血清稀釋20倍后，與硝酸纖維素膜上的抗原于37℃作用1小時后，以pH7.5TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；加入稀釋400倍的羊抗小鼠或兔IgG(辣根過氧化物酶標記)二抗，于37℃作用1小時，再以pH7.5TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；最后，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色。具體操作方法參考Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.888-898。氧化態(tài)rhVEGF-p277(泳道2)由于其鏈間二硫鍵的作用，部分蛋白質(zhì)形成二聚體，在PAGE膠上表現(xiàn)為分子量分別為17kD和34kD的雙條帶，還原態(tài)rhVEGF-p277(泳道1)為單體，在膠上表現(xiàn)為分子量為16kD的單條帶。由于NOD小鼠血清中有抗p277抗體的存在，因此可以分別和膜上16kD和32kD的rhVEGF-p277蛋白帶雜交，但不和rhVEGF雜交(泳道4和5)，證實了HSP65-6×p277和HSP65-1×p277實驗組都能誘發(fā)NOD小鼠產(chǎn)生特異的抗p277的抗體。結果見圖7。
實施例6HSP65-6×p277重組蛋白的藥效學研究選用4周齡雌性NOD小鼠，隨機分成五組，每組十只，分別是HSP65-6×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫組，HSP65-1×p277融合蛋白鼻腔粘膜免疫組，HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫組，PBS空白對照組，卵清蛋白滴鼻對照組。分別于4周齡、7周齡、10周齡3次免疫，蛋白都用PBS溶解，不加其他佐劑，每次免疫劑量為100μg/只。每次免疫后3周內(nèi)眥取血一次，血量為0.5-0.8ml，離心，取血清5小時內(nèi)用全自動生化分析儀測定血糖含量。結果見圖8。結果顯示HSP65-6×p277蛋白鼻腔粘膜免疫組，HSP65-1×p277蛋白鼻腔粘膜免疫組可以顯著降低NOD小鼠血糖含量。以血糖濃度≥11.1mmol/只判為糖尿病。各組發(fā)病率見下表。結果表明重組蛋白HSP65-6×p277鼻腔粘膜免疫組效果最好，至8月齡時NOD鼠尚無糖尿病的發(fā)生。HSP65-1×p277蛋白鼻腔粘膜免疫組HSP65蛋白鼻腔粘膜免疫組也能對NOD小鼠糖尿病的發(fā)生也有一定的預防作用。

基因序列表atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac gccctcgccgatgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgeaacgt cgtcctggaa aagaagtggg gtgcccccacgatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgccgagctggtca aagaggtagc caagaagacc gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgctggcccaggc gttggttcgc gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacgcggcatcgaa aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaaggagcagattg cggccaccgc agcgatttcg gcgggtgacc agtccatcgg tgncctgatc gccgaggcgatggacaaggt gggcaacgag ggcgtcatca ccgtcgagga gtccaacacc tttgggctgc agctcgagctcaccgagggt atgcggttcg acaagggcta catctcgggg tacttcgtga ccgacccgga gcgtcaggaggcggtcctgg aggaccccta catcctgctg gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat ctgctgccgctgctcgagaa ggtcatcgga gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag gacgtcgagg gcgaggcgctgtccaccctg gtcgtcaaca agatccgcgg caccttcaag tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggcgaccgccgca aggcgatgct gcaggatatg gccattctca ccggtggtca ggtgatcagc gaagaggtcggcctgacgct ggagaacgcc gacctgtcgc tgctaggcaa ggcccgcaag gtcgtggtca ccaaggacgagacoaecatc gtcgagggcg ccggtgacac cgacgccatc gccggacgag tggcccagat ccgccaggagatcgagaaca gcgactccga ctacgaccgt gagaagctgc aggagcggct ggccaagctg sccggtggtgtcgcggtgat caaggccggt gccgccaccg aggtcgaact caaggagcgc aagcaccgca tcgaggatgcggttcgcaat gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc gccggtgggg gtgtgacgct gttgcaagcggccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa ggcgacgagg cgaccggcgc caacatcgtg aaggtggcgctggaggcccc gctgaagcag atcgccttca actccgggct ggagccgggc gtggtggccg agaaggtgcgcaacctgccg gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt gtctacgagg atctgctcgc tgccggcgttgctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg ctgcagaatg cggcgtccat cgcggggctg ttcctgaccaccgaggccgt cgttgccgac aagccggaaa aggagaaggc ttccgttccc ggtggcggcg acatgggtggcatggatttc gctagcgttc tgggtggtgg cgttgctctg ctgcgcgtta tcccggctct ggactccctgaccccggcta acgaagattc tagcgttctg ggtggtggcg ttgctctgct gcgcgttatc ccggctctggactccctgac cccggctaac gaagattcta gcgttctggg tggtggcgtt gctctgctgc gcgttatcccggctctggac tccctgaccc cggctaacga agattctagc gttctgggtg gtggcgttgc tctgctgcgcgttatcccgg ctctggactc cctgaccccg gctaacgaag attctagcgt tctgggtggt ggcgttgctctgctgcgcgt tatcccggct ctggactccc tgaccccggc taacgaagat tctagcgcag atccagttctgggtggtggc gttgctctgc tgcgcgttat cccggctctg gactccctga ccccggctaa cgaagat表1
MAKTIAYDEE ARRGLERGLN ALADAVKVTL GPRGRNVVLE KKWGAPTITN DGVSIAKEIE LEDPYEKIGAELVKEVAKKT DDVAGDGTTT ATVLAQALVR EGLRNVAAGA NPLGLKRGIE KAVEKVTETL LKGAKEVETKEQIAATAAIS AGDQSIGDLI AEAMDKVGNE GVITVEESNT FGLQLELTEG MRFDKGYISG YFVTDPERQEAVLEDPYILL VSSKVSTVKD LLPLLEKVIG AGKPLLIIAE DVEGEALSTL VVNKIRGTFK SVAVKAPGFGDRRKANLQDM AILTGGQVIS EEVGLTLENA DLSLLGKARK VVVTKDETTI VEGAGDTDAI AGRVAQIRQEIENSDSDYDR EKLQERLAKL AGGVAVIKAG AATEVELKER KHRIEDAVRN AKAAVEEGIV AGGGVTLLQAAPTLDELKLE GDEATGANIV KVALEAPLKQ IAFNSGLEPG VVAEKVRNLP AGHGLNAQTG VYEDLLAAGVADPVKVTRSA LQNAASIAGL FLTTEAVVAD KPEKEKASVP CGGDMGGMDF ASVLGGGVAL LRVIPALDSLTPANEDSSVL GGGVALLRVI PALDSLTPAN EDSSVLGGGV ALLRVIPALD SLTPANEDSS VLGGGVALLRVIPALDSLTP ANEDSSVLGG GVALLRVIPA LDSLTPANED SSADPVLGGG VALLRVIPAL DSLTPANED表權利要求
1.一種免佐劑具有防治人胰島素依賴型糖尿病作用的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于該免疫調(diào)節(jié)劑是將源于HSP60的抗原表位多肽p277基因六次串聯(lián)重復后與源于牛結核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)HSP65融合形成的融合蛋白。
2.按照權利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于該免疫調(diào)節(jié)劑中含有六段源于人HSP60的抗原表位多肽p277，每段p277的氨基酸序列是VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。
3.按照權利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于該免疫調(diào)節(jié)劑的基因序列見附圖1。
4.按照權利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于該免疫調(diào)節(jié)劑的蛋白序列見附圖2。
5.按照權利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其結構可表示為HSP65-n×p277，其特征在于HSP65攜帶有n個人HSP60的抗原表位多肽p277，n＞1。
6.一種免佐劑具有防治人胰島素依賴型糖尿病作用的免疫調(diào)節(jié)劑的制備方法，包括用化學合成法和PCR法合成六段源于人HSP60的抗原表位多肽p277和HSP65的編碼序列DNA，將這些DNA分步插入表達載體，在大腸桿菌中表達出可溶性融合蛋白，經(jīng)硫酸銨分級沉淀、陰離子交換樹脂DEAE纖維素純化，得到防治人胰島素依賴型糖尿病的免疫調(diào)節(jié)劑。
7.按照權利要求6所述得到的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于不需添加佐劑，也不需要將抗原多肽與載體化學偶聯(lián)，通過粘膜免疫途徑能誘發(fā)機體產(chǎn)生HSP65和p277特異的免疫應答。
8.按照權利要求6所述得到的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于能顯著降低NOD小鼠糖尿病的發(fā)生，能夠起到防治胰島素依賴型糖尿病的作用。
9.根據(jù)權利要求6所述得到的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于可與藥物載體或藥物活性成分組合制成藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能用于預防和治療胰島素依賴型糖尿病的免疫調(diào)節(jié)劑。針對抗原多肽的弱免疫原性，將抗原表位多肽基因(源于人HSP60的一段抗原表位p277)六次重復串聯(lián)反復插入源于牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的熱休克蛋白HSP65基因的下游，實現(xiàn)了多重復串聯(lián)抗原表位多肽與HSP65的融合表達。產(chǎn)生的融合蛋白可不需添加佐劑，也不需將抗原多肽與載體化學偶聯(lián)直接用于免疫。該融合蛋白通過粘膜免疫途徑可激發(fā)機體產(chǎn)生高滴度針對p277的抗體，顯著降低NOD小鼠糖尿病的發(fā)生，能夠起到防治1型和1.5型等以胰島素依賴為主要特征的糖尿病的作用。
文檔編號A61P3/00GK1831012SQ20061003773
公開日2006年9月13日 申請日期2006年1月12日 優(yōu)先權日2006年1月12日
發(fā)明者劉景晶, 金亮, 王宇, 朱愛華, 陳慶梅, 李建平, 熊祺琰, 曹榮月, 吳潔 申請人:中國藥科大學