專利名稱：血管生成抑制多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一類高效抑制血管生成多肽及其制備方法和用于抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤血管生成抑制劑是近年來在腫瘤治療中引起重視的一類藥物，這方面的研究已經(jīng)取得一些進(jìn)展，可望在今后成為一類新的有希望的腫瘤治療藥物。腫瘤新生血管形成的概念是Algureza在1947年提出的，他指出增長的腫瘤的一個(gè)重要特征是能夠從宿主引發(fā)新的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成。1971年，F(xiàn)olkman提出假設(shè)，認(rèn)為腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成，并認(rèn)為實(shí)體瘤早期可分泌腫瘤血管生成因子，刺激宿主毛細(xì)血管增生。新生血管不僅可以提供腫瘤所需要的營養(yǎng)和氧氣，排除代謝產(chǎn)物，而且是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的途徑(Folkman，J.，J.Natl.Cancer Inst.1990；824-6)。因此，阻斷新生血管形成可能成為阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的手段，從而激發(fā)了對促血管生成分子和抗血管生成分子的廣泛研究。在這些血管生成抑制劑中，尤其以血管抑素(angiostatin)和內(nèi)皮抑素(endostatin)最引人注目，兩者均已在美國進(jìn)入臨床試驗(yàn)，盡管這些血管抑制劑呈現(xiàn)出非常誘人的前景，但其缺陷也非常明顯迄今為止的血管生成藥物，如內(nèi)皮抑素、血管抑素等作用靶點(diǎn)不明確，它們對血管的專一性和選擇性還不夠好，效果有限，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)中用量很高，在小鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)時(shí)，血管抑素用量達(dá)數(shù)百毫克/公斤體重，內(nèi)皮抑素達(dá)到數(shù)十毫克/公斤體重，當(dāng)這些血管生成抑制劑在人體內(nèi)使用時(shí)，使用劑量相應(yīng)也會(huì)很高。這樣大的藥物使用劑量勢必增加日后該類藥物毒副作用發(fā)生的可能性，造成該類藥物質(zhì)量控制難度加大、生產(chǎn)規(guī)模和生產(chǎn)成本增大、藥物價(jià)格居高。
一個(gè)好的抗血管生成藥物應(yīng)該有對新生血管的標(biāo)記分子具有選擇性，這樣才能達(dá)到對新生血管的導(dǎo)向性作用，從整體上提高藥物對血管生成的抑制作用做到只使用很低劑量的藥物，就能達(dá)到高效的抑制血管生成效果。有研究報(bào)道(Cattaneo MG，et al.Exper.CellRes.，2003)，內(nèi)皮抑素的活性主要是由氨基酸序列的第6-49個(gè)氨基酸產(chǎn)生，該研究制備了內(nèi)皮抑素的第6-49個(gè)氨基酸序列的多肽，即Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe(I)
并將此多肽I與內(nèi)皮抑素進(jìn)行藥理試驗(yàn)研究，結(jié)果顯示，其抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和體外抑制血管生成活性與內(nèi)皮抑素相當(dāng)。臨床需要活性更強(qiáng)的該類藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種多肽，通過對內(nèi)皮抑素的第6-49氨基酸進(jìn)行修飾，修飾后的多肽具有比內(nèi)皮抑素更強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性及腫瘤靶向性。
本發(fā)明的多肽，其序列為X-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Y其中X的序列為缺失、Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys，Y的序列為缺失、Arg-Gly-Asp、Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp，Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys并且X或Y至少一個(gè)不缺失。
即在多肽I的羧基端連有Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys 或氨基端連接有Arg-Gly-Asp、Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp，Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys，可以X、Y都連接，也可以只連X或只連Y，但不能X和Y都不連，即不能X和Y都缺失。
部分多肽的序列為Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe；Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe；Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp；Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe；Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-PhePhe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-CysPhe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。
Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp。
優(yōu)選的多肽為Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe(以下簡稱EDSM-1)或Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys(以下簡稱EDSM-2)。
本發(fā)明的多肽的制備方法如下(1)合成含有X或Y整合素結(jié)合序列肽段的血管生成抑制劑基因序列，以此序列為模板，設(shè)計(jì)上下游引物，在引物序列的5’端和3’端加上適合克隆的酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增，獲得基因，將基因克隆于載體中，篩選陽性克隆，核苷酸序列分析鑒定；(2)基因與原核表達(dá)載體重組，形成表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在；(3)進(jìn)行包涵體蛋白分離、溶解和復(fù)性，并進(jìn)行離子交換層析分離純化蛋白產(chǎn)物，收集穿過液，凍干。
本發(fā)明通過將抑制血管生成的小肽兩端加上不同的含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的序列，構(gòu)建了一種對整合素具有結(jié)合作用和親和性的血管生成抑制劑。
本發(fā)明的的多肽可以合成。還可以用基因工程方法制備，應(yīng)用PCR擴(kuò)增得到目的基因，克隆于原核表達(dá)載體，用基因工程手段獲得產(chǎn)物，所得產(chǎn)物與同類產(chǎn)品比較，具有高效、特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抗腫瘤效果，并且用量小，相應(yīng)減少了藥物治療的副作用。
體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)中顯示本發(fā)明的多肽能夠大幅度改善和提高現(xiàn)有血管生成抑制劑抑制腫瘤的效果，副作用小，并且用量小，降低了成本，說明本發(fā)明設(shè)計(jì)并制備的高效血管生成抑制劑科學(xué)、合理、可行有效，能夠作為血管生成抑制劑特別是實(shí)體腫瘤的治療藥物。


圖1 HPLC純化EDSM-1分析結(jié)果圖2 EDSM-1體內(nèi)抑制肝臟腫瘤效果圖3 EDSM-1體內(nèi)抑制肺癌效果具體實(shí)施方式
實(shí)施例1EDSM-1基因和EDSM-2的克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建取內(nèi)皮抑素基因?yàn)槟０?；合成上游引物和下游引物，其中上游引物加入了NdeI酶切位點(diǎn)；下游引物含有Arg-Gly-Asp序列和XhoI位點(diǎn)。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳回收、純化后，進(jìn)行NdeI和XhoI酶切，克隆到原核表達(dá)載體PET-23a，PCR篩選陽性克隆，核苷酸序列分析證實(shí)序列發(fā)生了設(shè)計(jì)的突變。
合成的引物15’GGAATTCCATATGTTC CAG CCG GTG CTC CAC CTG GTT 3’合成的引物25’CCGCTCGAG ATCACCTCG CACCACCACCACCGGCGCGGAAGGTGCCCGCCAG3’
合成的引物35’CCGCTCGAGGCAGAAGCAGTCACCACGGCAGTCGCATGCACCACCACCACCGGCGCGGAAGGTGCCCGCCAG3’其中，引物1編碼了NdeI位點(diǎn)和Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe的部分序列，引物2、3編碼XhoI位點(diǎn)和含有Arg-Gly-Asp序列的基因，引物1和2編碼EDSM-1，1和3編碼EDSM-2。
為了比較本發(fā)明所設(shè)計(jì)的血管生成抑制劑EDSM-1和EDSM-2的實(shí)際效果，本實(shí)例中我們同時(shí)克隆表達(dá)了內(nèi)皮抑素基因。
重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組菌經(jīng)過1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)后，收獲細(xì)胞并超聲破菌，離心分離上清和沉淀，15％SDS-PAGE電泳分析，將考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE掃描(UVP White/Ultraviolet transilluminator)，分析表達(dá)結(jié)果。EDSM包涵體的分離、溶解與復(fù)性超聲破菌，離心分離，將包涵體沉淀用8M尿素溶解，10000rpm離心5min，上清液4℃透析，透析液為bufferA(10mM Tris-HCl，pH7.4)，6-8h換液一次，共換液3次，最后透析一次，透析液為buffer B(1mM氧化型谷胱甘肽和1mM還原型谷胱甘肽，10mM Tris-HCl，pH7.4)，樣品直接進(jìn)行SP-Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech)層析。柱床平衡洗滌均用buffer A，用0.6M NaCl，Tris-HCl，pH7.4和1M NaCl，Tris-HCl，pH7.4分步洗脫，將洗脫液混合，buffer A透析后凍干濃縮。此方法適用于本發(fā)明的多肽的分子層析，HPLC純化EDSM-1分析結(jié)果，如圖1所示。
實(shí)施例2動(dòng)物體內(nèi)抗肺癌實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)的鼠Lewis肺癌細(xì)胞用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm離心5min，重懸于PBS，在C57BL/6(6-8周)小鼠體側(cè)皮下接種5×105細(xì)胞0.1ml。當(dāng)腫瘤平均體積達(dá)到200mm3-300mm3，隨機(jī)將小鼠分組，每組7只，其中一組接受EDSM-1治療，一組用內(nèi)皮抑素治療，以上兩組劑量均為10mg/kg/d，對照注射PBS。治療采用在接種腫瘤對側(cè)皮下注射方法。每天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積，采用公式腫瘤體積＝長×寬2×0.52，治療效果用給定時(shí)間內(nèi)的腫瘤抑制率表示(1-T/C)×100％，T＝治療組腫瘤體積，C＝對照組腫瘤體積。
結(jié)果表明，在第9天時(shí)，EDSM-1的腫瘤抑制率為79％，而內(nèi)皮抑素的腫瘤抑制率為53％(兩兩比較P＜0.05)，如圖2所示。同樣方法測得的另外一個(gè)突變體EDSM-2的腫瘤抑制率為65％。
以上實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明的高效血管生成抑制劑能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)的腫瘤生長。
實(shí)施例3小鼠HAC肝癌模型抑瘤效應(yīng)將培養(yǎng)的鼠HAC肝癌細(xì)胞株用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm離心5min，重懸于PBS，在C57BL/6(6-8周)小鼠體側(cè)皮下接種5×105細(xì)胞0.1ml。當(dāng)腫瘤平均體積達(dá)到200mm3-300mm3，隨機(jī)將小鼠分組，每組7只，治療采用在接種腫瘤對側(cè)皮下注射方法。每天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積，采用公式腫瘤體積＝長×寬2×0.52，治療效果用給定時(shí)間內(nèi)的腫瘤抑制率表示(1-T/C)×100％，T＝治療組腫瘤體積，C＝對照組腫瘤體積。
分陰性對照組(蒸餾水)、陽性對照組(內(nèi)皮抑素)與EDSM-1、EDSM-2治療組進(jìn)行研究，皮下注射給藥，結(jié)果表明，在第9天時(shí)，EDSM-1治療組抑瘤率為65％，陽性對照內(nèi)皮抑素組53％，如圖3所示。同樣方法試驗(yàn)的另外一個(gè)突變體EDSM-2的腫瘤抑制率為60％。(兩兩比較P＜0.05)。
多肽序列表<110>申請人姓名中國藥科大學(xué)<120>發(fā)明名稱高效血管生成抑制多肽及其制備方法和應(yīng)用<160>序列表中序列的個(gè)數(shù)8<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符1<211>序列長度51個(gè)氨基酸<212>序列的類型PRT<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-3 6 9 12 15Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-18 21 24 27 30 33Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45 48 51<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符2<211>序列長度47個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-3 6 9 12 15Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-18 21 24 27 30 33Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符3<211>序列長度51個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列
<400>序列標(biāo)識符Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-3 6 9 12 15Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-18 21 24 27 30 33Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp36 39 42 45 48 51<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符4<211>序列長度47個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-3 6 9 12 15Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-18 21 24 27 30 33Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp36 39 42 45<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符5<211>序列長度58個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-3 6 9 12 15Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-18 21 24 27 30 33Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-36 39 42 45 48 51Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe54 57
<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符6<211>序列長度54個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-3 6 9 12 15Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-18 21 24 27 30 33Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-36 39 42 45 48 51Arg-Ala-Phe54<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符7<211>序列長度58個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-3 6 9 12 15Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-18 21 24 27 30 33Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-36 39 42 45 48 51Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符8<211>序列長度54個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符
Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-3 6 9 12 15Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-18 21 24 27 30 33Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-36 39 42 45 48 51Cys-Phe-Cys54<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符9<211>序列長度58個(gè)氨基酸<212>序列的類型PRT<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-3 6 9 12 15Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-18 21 24 27 30 33Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45 48 51-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp54 57<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符10<211>序列長度54個(gè)氨基酸<212>序列的類型PRT<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-3 6 9 12 15Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-18 21 24 27 30 33
Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45 48 51-Arg-Gly-Asp54<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符11<211>序列長度65個(gè)氨基酸<212>序列的類型PRT<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-3 6 9 12 15Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-18 21 24 27 30 33Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45 48 51-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60 63<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符12<211>序列長度61個(gè)氨基酸<212>序列的類型PRT<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-3 6 9 12 15Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-18 21 24 27 30 33Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe36 39 42 45 48 51-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符13<211>序列長度54個(gè)氨基酸
<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-3 6 9 12 15Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-18 21 24 27 30 33Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp36 39 42 45 48 51 54<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符14<211>序列長度50個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-3 6 9 12 15Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-18 21 24 27 30 33Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp36 39 42 45 48<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符15<211>序列長度61個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-3 6 9 12 15Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-18 21 24 27 30 33Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly36 39 42 45 48 51
-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符16<211>序列長度57個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-3 6 9 12 15Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-18 21 24 27 30 33Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Ala-Cys-Asp-Cys-36 39 42 45 48 51Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符17<211>序列長度65個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-3 6 9 12 15Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-18 21 24 27 30 33Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-36 39 42 45 48 51Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp54 57 60 63<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符18<211>序列長度61個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)
<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-3 6 9 12 15Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-18 21 24 27 30 33Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-36 39 42 45 48 51Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp54 57 60<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符19<211>序列長度72個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-3 6 9 12 15Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-18 21 24 27 30 33Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-36 39 42 45 48 51Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-54 57 60 63 66Asp-Cys-Phe-Cys69 72<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符20<211>序列長度68個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-
3 6 9 12 15Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-18 21 24 27 30 33Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-36 39 42 45 48 51Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60 63 66<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符21<211>序列長度61個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-3 6 9 12 15Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-18 21 24 27 30 33Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-36 39 42 45 48 51Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp54 57 60<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符22<211>序列長度57個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-3 6 9 12 15Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-18 21 24 27 30 33Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-36 39 42 45 48 51
Arg-Ala-Phe-Arg-Gly-Asp54 57<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符23<211>序列長度68個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-3 6 9 12 15Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-18 21 24 27 30 33Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-36 39 42 45 48 51Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60 63 66<210>序列相對應(yīng)的序列標(biāo)識符24<211>序列長度64個(gè)氨基酸<212>序列的類型蛋白質(zhì)<213>生物體人工序列<400>序列標(biāo)識符Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-3 6 9 12 15Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-18 21 24 27 30 33Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-36 39 42 45 48 51Arg-Ala-Phe-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys54 57 60 6權(quán)利要求
1.一種多肽，其序列為X-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Y其中X的序列為缺失、Arg-Gly-Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys；Y的序列為缺失、Arg-Gly-Asp、Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp、Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys或Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys；并且X或Y至少一個(gè)不缺失。
2.權(quán)利要求1的多肽，其序列為Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe或Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys。
3.權(quán)利要求1或2的多肽的制備方法，包括下列步驟(1)合成含有X或Y整合素結(jié)合序列肽段的血管生成抑制劑基因序列，以此序列為模板，設(shè)計(jì)上下游引物，在引物序列的5’端和3’端加上適合克隆的酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增，獲得基因，將基因克隆于載體中，篩選陽性克隆，核苷酸序列分析鑒定；(2)基因與原核表達(dá)載體重組，形成表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在；(3)進(jìn)行包涵體蛋白分離、溶解和復(fù)性，并進(jìn)行離子交換層析分離純化蛋白產(chǎn)物，收集穿過液，凍干。
4.權(quán)利要求1或2的多肽用于制備治療與血管生成相關(guān)疾病的藥物的用途。
5.權(quán)利要求4的用途，其中血管生成相關(guān)疾病是肝癌。
6.權(quán)利要求4的用途，其中血管生成相關(guān)疾病是肺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一類高效抑制血管生成多肽及其制備方法和用于抗腫瘤藥物的應(yīng)用。本發(fā)明通過對內(nèi)皮抑素的第6－49氨基酸進(jìn)行修飾，修飾后的多肽具有比內(nèi)皮抑素更強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性及腫瘤靶向性。
文檔編號A61K38/16GK1827640SQ200610039298
公開日2006年9月6日 申請日期2006年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日
發(fā)明者徐寒梅, 沈子龍, 文良柱 申請人:中國藥科大學(xué)