專利名稱：基于胃泌素釋放肽的腫瘤多肽疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中本發(fā)明提供了一種治療和預(yù)防前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等腫瘤的多肽疫苗。
背景技術(shù)：
胃泌素釋放肽(GRP，gastrin-releasing peptide)是一種腦胃腸道激素，含有27個氨基酸殘基。在體內(nèi)，研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了與胃泌素釋放肽功能相類似的神經(jīng)肽，即神經(jīng)介素B(NMB，neuromedin B)、神經(jīng)介素C(NMC，neuromedin C)。這些肽在C端部分都是非常保守的，而其C端部分正是其發(fā)揮生物活性的重要部位。胃泌素釋放肽及其樣肽的氨基酸序列如下h-GRP (27aa)R -Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2h-NMB (32aa)R’-His-Ser-Arg-Gly-Asn-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH2h-NMC (10aa)Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2R＝Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-MetR’＝Ala-Pro-Leu-Ser-Trp-Asp-Leu-Pro-Glu-Pro-Arg-Ser-Arg-Ala-Ser-Lys-Ile-Arg-Val胃泌素釋放肽及其樣肽具有廣泛的生物學(xué)功能。他們作用于心血管中樞而影響心率和血壓，參與體溫調(diào)節(jié)，參與平滑肌的收縮，促進胃泌素、膽囊收縮素、胰高血糖素等的釋放，抑制動物的攝食行為，改善學(xué)習(xí)和記憶等。
胃泌素釋放肽及其樣肽作為自分泌或旁分泌生長因子能促進腫瘤細胞的增殖。胃泌素釋放肽及其樣肽通過與腫瘤中的相應(yīng)受體結(jié)合，引發(fā)一系列信號傳導(dǎo)途徑及基因調(diào)控，從而促進腫瘤細胞的增殖。胃泌素釋放肽受體家族為G蛋白偶聯(lián)受體，在哺乳動物中目前已發(fā)現(xiàn)3種不同的受體，包括GRP受體(配體主要為GRP)、NMB受體(配體主要為NMB)和BRS3受體(配體尚不清楚)。大量的研究證實在各種腫瘤(結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等)中均有胃泌素釋放肽受體家族的異常表達，且其中以GRP受體為主。胃泌素釋放肽及其樣肽對腫瘤發(fā)生的作用包括刺激腫瘤細胞增殖，影響腫瘤分化、刺激血管生成、增強細胞粘附和細胞轉(zhuǎn)移。由于胃泌素釋放肽及其樣肽與腫瘤的生長與分化有很大的關(guān)系，故有望成為抗腫瘤藥的一個有希望的靶點?，F(xiàn)已證實胃泌素釋放肽及其樣肽的受體拮抗劑以及單克隆抗體可較為有效地抑制前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等腫瘤的腫瘤的生長。
目前已經(jīng)開發(fā)和篩選出了很多胃泌素釋放肽受體家族拮抗劑，如RC-3095是一種較為常見的胃泌素釋放肽受體家族拮抗劑，與GRP受體有較高親和力，在體內(nèi)可以抑制血管生成，并能下調(diào)HER-2受體。在各種裸鼠移植腫瘤模型中，該物質(zhì)均表現(xiàn)出不同程度的抗腫瘤作用。
針對胃泌素釋放肽及其樣肽本身的抗體治療則成為腫瘤治療的另外一條途徑。2A11是一種鼠蛙皮素單克隆抗體，與GRP有很強的親和力。小細胞肺癌(SCLC)細胞會表達和分泌胃泌素釋放肽，2A11在體外可以抑制SCLC細胞的增殖，在體內(nèi)可以抑制鼠SCLC細胞移植瘤的生長。2A11可以有效地拮抗胃泌素釋放肽的作用，從而抑制頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)細胞在體外和體內(nèi)的增殖。
針對胃泌素釋放肽及其樣肽表位開發(fā)多肽疫苗也可能會成為一條腫瘤治療的新途徑，這樣不但可以完全阻斷胃泌素釋放肽及其樣肽刺激腫瘤細胞增殖的作用，還避免了反復(fù)多次給藥的麻煩。胃泌素釋放肽的C端7至8個氨基酸已被證實為其抗原表位，這為多肽疫苗的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。通常，多肽疫苗免疫原性較弱，為增強多肽疫苗的免疫原性，研究者將多肽與熱休克蛋白家族蛋白、白喉毒素、破傷風(fēng)毒素、霍亂毒素、病毒顆粒、脂質(zhì)體等多肽疫苗載體連接(包括融合表達和偶連)，以提升疫苗多肽的免疫原性。本發(fā)明是基于上述考慮而進行，獲得了一種以GRP的C端7肽(SEQ ID NO.1)為靶抗原表位的腫瘤多肽疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于胃泌素釋放肽的腫瘤多肽疫苗。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)該腫瘤多肽疫苗的方法。
本發(fā)明還有一個目的是公開該腫瘤多肽疫苗的用途。
在本發(fā)明的第一個方面提供了一種基于胃泌素釋放肽的腫瘤多肽疫苗。作為本發(fā)明的一個具體實施方式
，該腫瘤多肽疫苗為六段GRP18-27重復(fù)串聯(lián)肽段融合于HSP65 C端形成的融合多肽，其氨基酸序列見SEQ ID NO.3。GRP18-27為人胃泌素釋放肽羧基端十肽，氨基酸序列見SEQ ID NO.2，含有抗原表位序列(見SEQ ID NO.1)。GRP18-27分子量小，免疫原性弱，直接用GRP18-27作免疫原很難在體內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。為增強多肽疫苗的免疫原性，必須采用大分子蛋白作為免疫載體，與GRP18-27在體內(nèi)融合表達。HSP65是指源于用作卡介苗的分枝桿菌來源的熱激蛋白，國際基因庫登錄號是M17705。HSP65已被證實具有活化巨噬細胞和釋放諸多細胞因子的功能，是一種良好的免疫佐劑。將抗原表位多肽與HSP65融合表達，能強化多肽疫苗的免疫原性，不需添加佐劑就能激發(fā)機體產(chǎn)生強烈免疫應(yīng)答。為進一步增強基于胃泌素釋放肽腫瘤多肽疫苗的免疫原性，我們將六段GRP18-27與HSP65融合?？乖砦欢嚯闹貜?fù)多次，可以增加抗原表位的劑量，增加整個抗原的分子量，從而增加抗原表位多肽的免疫原性。將六段GRP18-27與HSP65融合表達所獲得的基于胃泌素釋放肽的腫瘤多肽疫苗表示為“HSP65-GRP6”。
在本發(fā)明的第二方面，提供了生產(chǎn)該基于胃泌素釋放肽腫瘤多肽疫苗的方法，其技術(shù)路線詳述如下1.含兩段重復(fù)抗原表位GRP2基因的設(shè)計和獲得在不改變兩段GRP18-27串聯(lián)多肽氨基酸序列GNHWAVGHLMGNHWAVGHLM的前提下，選用大腸桿菌偏愛的密碼子，借助于計算機設(shè)計兩條寡核苷酸，通過PCR法獲得重復(fù)抗原表位多肽基因(簡稱GRP2基因)的核苷酸片斷，5’端添加了NheI的識別位點，3’端添加了XbaI和HindIII識別位點。重要的一點是GRP2的第十八位氨基酸亮氨酸(Leu)的密碼子選用TTA，以便于陽性克隆的篩選。因為載體質(zhì)粒采用單酶切，插入GRP2基因時會有正向插入和反向插入兩種情況。如果是正向插入則TTA表達為Leu，HSP65-GRP2(n+1)蛋白的分子量比HSP65-GRP2n蛋白要大20個氨基酸；如果是反向插入則TTA反向序列TAA為終止密碼子，由于提前終止HSP65-GRP2(n+1)蛋白的分子量比HSP65-GRP2n蛋白的分子量小。所以誘導(dǎo)表達后通過SDS-PAGE即可判斷正向正確插入GRP2基因的陽性重組子。
2.重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRP2的構(gòu)建GRP2基因經(jīng)NheI、HindIII切割插入經(jīng)NheI、HindIII切割的pET28a-HSP65-βhCGCTP37(結(jié)構(gòu)示意圖見附圖1)質(zhì)粒中，組成重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRP2，仍然留有單一位點NheI。
3.重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRP6的構(gòu)建及相應(yīng)的重組基因工程菌的構(gòu)建GRP2基因經(jīng)NheI、XbaI切割插入經(jīng)NheI切割的pET28a-HSP65-GRP2質(zhì)粒中，組成重組質(zhì)粒DET28a-HSP65-GRP4。在此基礎(chǔ)上重復(fù)操作一次可再插入兩段GRP2基因，得到融合表達的重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRP6，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組基因工程菌。
4.工程菌發(fā)酵及重組HSP65-GRP6蛋白的獲得以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，玉米漿培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵參數(shù)如下溫度36-38℃，pH6.8-7.2。發(fā)酵后離心收集工程菌，反復(fù)凍融裂解菌體，離心獲得上清可溶性蛋白，硫酸銨分級沉淀，10％-20％硫酸銨沉淀中含有目的融合蛋白，沉淀重新溶解后經(jīng)離子交換柱層析純化，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以判斷純化的HSP65-GRP6蛋白的純度。
本發(fā)明的第三方面是該基于胃泌素釋放肽的腫瘤多肽疫苗的用途。將純化的該基于胃泌素釋放肽的腫瘤多肽疫苗直接免疫動物，激發(fā)機體的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生胃泌素釋放肽的特異性抗體。在醫(yī)學(xué)上，該疫苗能用于預(yù)防和治療前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等腫瘤。


圖1質(zhì)粒pET28a-HSP65-βhCGCTP37結(jié)構(gòu)2重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRP6結(jié)構(gòu)圖。
圖3重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRP6 C端部分基因測序結(jié)果。
圖4 SDS-PAGE電泳顯示HSP65-GRP6的融合表達和純化以。1.標準分子量蛋白；2.載荷pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導(dǎo)后)；3.載荷pET28a-HSP65-GRP6質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導(dǎo)后)；4.載荷pET28a-HSP65質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細胞全蛋白(乳糖誘導(dǎo)后)；5.分離純化的融合蛋白HSP65-GRP6；6.分離純化的HSP65。
圖5各免疫組小鼠血清中抗GRP抗體的ELISA測定結(jié)果顯示只有HSP65-GRP6能誘發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗GRP抗體。1.標準分子量蛋白；2.GFP-(GRP18-27)；3.GFP。
圖6小鼠血清的Western測定結(jié)果顯示HSP65-GRP6實驗組小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生特異性的抗GRP抗體。圖例 生理鹽水陰性對照組； HSP65皮下給藥組；■HSP65-GRP6皮下給藥組圖7各免疫組小鼠體內(nèi)腫瘤的大小。A.生理鹽水陰性對照組；B.HSP65皮下給藥組；C.HSP65-GRP6皮下給藥組。
圖8各免疫組小鼠體內(nèi)腫瘤的平均重量。結(jié)果顯示經(jīng)HSP65-GRP6免疫的小鼠的腫瘤要比經(jīng)HSP65免疫的小鼠和注射生理鹽水的正常小鼠的腫瘤小(P＜0.01)。圖例 生理鹽水陰性對照組； HSP65皮下給藥組；■HSP65-GRP6皮下給藥組具體實施方式
材料
(1)菌株和質(zhì)粒宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究有關(guān)的實驗室一般都有保存。
質(zhì)粒pET28a購自Novagen公司。
卡介苗由上海生物制品公司生產(chǎn)，該制品中含有牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)。
質(zhì)粒pET28a-HSP65-βhCGCTP37由本實驗室構(gòu)建并保存。
質(zhì)粒pET28a-HSP65由本實驗室構(gòu)建并保存，HSP65蛋白也由本實驗室分離純化。
GFP-(GRP18-27)融合蛋白也由本實驗室提純。
(2)酶和試劑分子克隆工具酶和試劑、細菌基因組、質(zhì)粒抽提試劑盒為普洛麥格(Promega)公司產(chǎn)品，PCR回收試盒和瓊脂糖膠回收試劑盒為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品。
(3)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，配方見參考文獻Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。該書是基因工程技術(shù)的經(jīng)典著作，在許多高校圖書館都有收藏。
玉米漿培養(yǎng)基含有玉米漿25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
(4)Cellouse-DEAE DE-52為Whatman公司產(chǎn)品。
(5)辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠二抗為武漢博士德公司產(chǎn)品。
(6)3、3’、5、5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、過氧化氫尿素和牛血清白蛋白(BSA)為美國西格馬(sigma)公司產(chǎn)品。
(7)96孔酶標板為美國康寧(Corning)公司產(chǎn)品。
(8)硝酸纖維素膜為美國Millipore公司產(chǎn)品。
方法質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌在基因工程研究領(lǐng)域，這些都是常規(guī)操作方法，參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
重組蛋白表達量的測定參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法進行。
實施例1 HSP65-GRP6重組基因工程菌的構(gòu)建1.重復(fù)抗原表位GRP2基因的設(shè)計和獲得在不改變兩段GRP18-27串聯(lián)多肽氨基酸序列GNHWAVGHLMGNHWAVGHLM的前提下，借助于計算機軟件設(shè)計兩條引物P1和P2，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
兩條引物核苷酸序列如下P15’CGGGCTAGCGGCAACCACTGGGCGGTGGGGCACTTAATGGGCAACCACTGGGCGGTG 3’
P25’CCCAAGCTTATCTAGACATTAAGTGCCCCACCGCCCAGTGGTTGCCCATTAAGTGCCC 3’引物P1中引入了NheI酶切位點，引物P2中引入了HindIII和XbaI酶切位點。
以寡核苷酸片段P1和P2按一定比例混合，二者互為引物和模板進行PCR擴增獲得GRP2基因片斷。
PCR反應(yīng)體系100pmol P1，100pmol P2，2μl dNTP(10mM)以及5單位的Pfu DNA聚合酶，總體系為50μl。
PCR反應(yīng)條件94℃ 10min；94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 45s，循環(huán)數(shù)30；72℃ 10min。
2.質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRP2的構(gòu)建將擴增純化后的GRP2 DNA片段，用NheI和HindIII進行雙酶切，酶切后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。
采用堿裂解法對pET28a-HSP65-βhCGCTP37進行抽提，抽提得到的質(zhì)粒也用NheI和HindIII進行雙酶切。酶切反應(yīng)結(jié)束后用膠回收純化試劑盒回收大片段。
將上述酶切回收后得到的GRP2 DNA片段和pET28a-HSP65-βhCGCTP37質(zhì)粒大片段進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)，篩選含HSP65-GRP2融合蛋白基因的重組質(zhì)粒，稱pET28a-HSP65-GRP2。由于該融合蛋白比HSP65-βhCGCTP37融合蛋白小約20個氨基酸，所以可以誘導(dǎo)表達后通過SDS-PAGE比較分子量大小來判斷陽性克隆。
3.質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRP6的構(gòu)建及相應(yīng)重組基因工程菌的構(gòu)建將擴增純化后的GRP2DNA片段，用NheI和XbaI進行雙酶切，酶切后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。
采用堿裂解法對上步構(gòu)建的pET28a-HSP65-GRP2質(zhì)粒進行抽提，抽提得到的質(zhì)粒用NheI進行單酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收后，進行去磷酸化處理。去磷酸化處理后，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收質(zhì)粒片斷。
將上述回收后得到的GRP2DNA片段和pET28a-HSP65-GRP2質(zhì)粒片段進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)，篩選含HSP65-GRP4融合蛋白基因的重組質(zhì)粒，稱pET28a-HSP65-GRP4。
限制性內(nèi)切酶NheI和XbaI是同尾酶，酶連后形成的粘合位點不再被NheI或XbaI識別，因此重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRP4中仍然只留有一個NheI酶切位點。在此基礎(chǔ)上重復(fù)上述操作可再插入一段GRP2基因，獲得重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRP6，其結(jié)構(gòu)示意圖見附圖2。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)篩選后獲得重組基因工程菌BL21/pET28a-HSP65-GRP6，命名為PEHG6。從該工程菌中提取重組質(zhì)粒，委托上海博亞生物技術(shù)有限公司進行核酸的序列分析，進一步驗證HSP65-GRP6融合蛋白基因及其讀碼框的正確性，其測序結(jié)果見附圖3。
實施例2 HSP65-GRP6基因在大腸桿菌中的表達從PEHG6平板上挑取單菌落接種含有50μg/ml卡那霉素LB液體培養(yǎng)基，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，按1％比例轉(zhuǎn)接種入新鮮的玉米漿液體培養(yǎng)基(50μg/ml卡那霉素)中，37℃培養(yǎng)4小時后，加入終濃度為0.5mmol/L的α-乳糖誘導(dǎo)大腸桿菌表達T7RNA聚合酶，繼續(xù)培養(yǎng)從而表達融合蛋白HSP65-GRP6。誘導(dǎo)后6小時取少量菌液，離心回收菌體，SDS-PAGE電泳再經(jīng)薄層掃描顯示已經(jīng)實現(xiàn)了HSP65-GRP6多肽基因的融合表達，融合蛋白占細菌總蛋白的30％左右，結(jié)果見附圖4。
實施例3 重組蛋白HSP65-GRP6的分離純化誘導(dǎo)表達后的工程菌經(jīng)離心回收菌體，將菌體懸浮在菌體裂解液(pH8.0，50mM磷酸鹽緩沖液，0.02％溶菌酶)中，37℃攪拌30分鐘，加入DNase將DNA消化至溶液不粘稠為止，離心回收上清，用硫酸按分級沉淀，目的蛋白主要在10％-20％硫酸按沉淀中。將沉淀的融合蛋白重新溶解在離子交換緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8.0)中，透析脫鹽，離心后取上清進行陰離子交換柱層析，DEAE纖維素DE-52柱(2.6×40cm)，用離子交換緩沖液(20mMTris-HCl，pH8.0)/NaCl梯度洗脫，分段收集進行SDS-PAGE電泳檢測，HSP65-GRP6在170-200mM NaCl的洗脫峰中，用SDS-PAGE電泳檢查制備樣品的純度，結(jié)果見附圖4。
實施例4 HSP65-GRP6免疫原性研究選用7-8周齡Balb/c雌性小鼠，設(shè)HSP65皮下給藥組、HSP65-GRP6皮下給藥組和生理鹽水陰性對照組，每組各8只。除生理鹽水組外所有小鼠都進行卡介苗預(yù)免疫，凍干的卡介苗用生理鹽水配制成5×106CFU/ml，每只鼠皮下注射100μl。預(yù)免疫兩周后，進行第一次免疫，分別皮下注射100μl(0.5μg/μl于生理鹽水)的HSP65、HSP65-GRP6蛋白。生理鹽水組注射相同量的生理鹽水。以后每隔2周加強免疫一次，共進行3次加強免疫。每次免疫后2周，內(nèi)眥取血一次，共五次，血量為0.1-0.2ml，離心，取血清冷凍保存。
用純化的GFP-(GRP18-27)融合蛋白4℃過夜包被96孔ELISA酶標板，每孔100μl含100ng融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃滿孔封閉一小時。免疫后取血所得抗血清，用5％BSA(于pH7.5的PBS中)稀釋100倍，然后每孔加入100μl稀釋后的抗血清于37℃作用1小時。用PBST(含0.1％Tween-20)洗滌6次后加入100μl以1∶20000稀釋的羊抗小鼠IgG二抗(辣根過氧化物酶標記)，每孔100μl，37℃作用1小時。用PBST洗滌6次，每孔加入100μl過氧化氫尿素和3、3`、5、5`-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液于37℃顯色20分鐘后，加入50μl 2MH2SO4終止反應(yīng)，并于450nm波長下，測定各孔吸光度值。結(jié)果見附圖5。從結(jié)果中可以看出，表明只有HSP65-GRP6皮下給藥組小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生特異性的抗GRP抗體。
實施例5 抗胃泌素釋放肽Western檢測將純化的GFP-(GRP18-27)融合蛋白、GFP與標準分子量蛋白經(jīng)15％的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，于30V電壓電泳過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上；用pH7.5 TBS緩沖液(含0.1％ Tween-20)漂洗膜數(shù)次后在室溫下將膜放入5％BSA封閉液中攪動孵育2小時，再用pH7.5 TBS緩沖液(含0.1％ Tween-20)漂洗2次，每次5min；實施例4或6中所得的抗血清稀釋10倍后與硝酸纖維索膜37℃下攪動孵育1小時，用pH7.5 TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)將膜漂洗4次，每次5min；加入稀釋400倍的羊抗小鼠IgG-HRP(辣根過氧化物酶)二抗，再與硝酸纖維素膜37℃下攪動孵育1小時后，用pH7.5 TBS緩沖液(含0.1％Tween-20)將膜漂洗4次，每次5min；最后加入DAB顯色試劑顯色10分鐘。具體操作方法參考Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.888-898。小鼠血清的Western檢側(cè)結(jié)果見附圖6，在硝酸纖維素膜與HSP65-GRP6皮下給藥組小鼠的血清作用后，經(jīng)DAB顯色在膜上呈現(xiàn)相應(yīng)的印跡帶，表明HSP65-GRP6融合蛋白能誘發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗胃泌素釋放肽抗體。
實施例6 基于胃泌素釋放肽腫瘤多肽疫苗的藥效學(xué)研究用無菌的生理鹽水將HSP65和HSP65-GRP6稀釋至終濃度為1μg/μl。取7-8周齡Balb/c雌性小鼠，設(shè)HSP65皮下給藥組、HSP65-GRP6皮下給藥組和生理鹽水陰性對照組，每組各8只。除生理鹽水組外所有小鼠都進行卡介苗預(yù)免疫，凍干的卡介苗用生理鹽水配制成5×106CFU/ml，每只鼠皮下注射100μl。預(yù)免疫兩周后，進行第一次免疫，分別皮下注射100μl(0.5μg/μl于生理鹽水)的HSP65、HSP65-GRP6蛋白。生理鹽水組注射相同量的生理鹽水。以后每隔2周加強免疫一次，共進行3次加強免疫。最后一次免疫后第8天，于各組小鼠右側(cè)胸前皮下接種0.1ml(107個/mL)EMT6小鼠乳腺癌細胞，觀察記錄腫瘤生長情況。于腫瘤細胞接種后第14天，將全部動物眼球取血后處死，剝?nèi)∧[瘤組織，稱重，比較各組腫瘤的大小。每組腫瘤大小見附圖7，平均重量見附圖8?？梢钥闯觯睇}水陰性對照組和HSP65皮下給藥組的乳腺癌腫瘤大小無明顯差異，而HSP65-GRP6皮下給藥組的腫瘤的生長得到了明顯抑制，抑瘤率為48.19％。
SEQUENCE LISTING(序列表)<110>中國藥科大學(xué)<120>基于胃泌素釋放肽的腫瘤多肽疫苗<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>7<212>PRT<213>GRP21-27(Homo sapiens)<400>1Trp Ala Val Gly His Leu Met1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>GRP18-27(Homo sapiens)<400>2Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met1 5 10<210>3<211>608<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>
<400>3Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu1 5 10 15
Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro20 25 30Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile35 40 45Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro50 55 60Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr65 70 75 80Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln85 90 95Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro100 105 110Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu115 120 125Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala130 135 140Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile145 150 155 160Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Ala Ile Thr Val Glu165 170 175Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg180 185 190Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg195 200 205
Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys210 215 220Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly225 230 235 240Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala245 250 255Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val260 265 270Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln275 280 285Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly290 295 300Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys305 310 315 320Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp325 330 335Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu340 345 350Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala355 360 365Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu370 375 380
Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn385 390 395 400Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr405 410 415Leu Leu Gln Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp420 425 430Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu435 440 445Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu450 455 460Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly465 470 475 480Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val485 490 495Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu500 505 510Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser515 520 525Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe Ala Ser Gly Asn530 535 540His Trp Ala Val Gly His Leu Met Gly Asn His Trp Ala Val Gly His545 550 555 560Leu Met Ser Ser Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met Gly Asn565 570 575
His Trp Ala Val Gly His Leu Met Ser Ser Gly Asn His Trp Ala Val580 585 590Gly His Leu Met Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met Ser Arg595 600 60權(quán)利要求
1.基于胃泌素釋放肽的腫瘤多肽疫苗，其特征在于疫苗多肽氨基酸序列中含有至少1拷貝的SEQ ID NO.1結(jié)構(gòu)的序列，該疫苗多肽可由基因工程表達方法或化學(xué)合成方法或分離萃取方法獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤多肽疫苗，其特征在于該疫苗多肽可以與但不局限與熱休克蛋白家族蛋白、白喉毒素、破傷風(fēng)毒素、霍亂毒素、病毒顆粒、脂質(zhì)體等多肽疫苗載體連接，提升疫苗多肽的免疫原性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的腫瘤多肽疫苗，其特征在于該疫苗多肽是以大于1拷貝的SEQID NO.2結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)串聯(lián)后融合到分枝桿菌HSP65的C端所形成的融合多肽，每拷貝SEQ ID NO.2序列之間可以直接相連，也可以有其他氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3所述的腫瘤多肽疫苗，其特征在于該疫苗多肽是6拷貝的SEQ IDNO.2結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)串聯(lián)后融合到牛結(jié)核分枝桿菌HSP65的C端所形成的多肽，具有SEQ IDNO.3的氨基酸序列。
5.一種制備權(quán)利要求3或4所述的腫瘤多肽疫苗的方法，通過基因工程的方法將6拷貝但不局限于6拷貝的SEQ ID NO.2結(jié)構(gòu)的序列融合于HSP65的下游，獲得相應(yīng)的重組基因工程菌。工程菌經(jīng)發(fā)酵后在大腸桿菌中表達出融合蛋白，經(jīng)硫酸銨分級沉淀，陰離子交換樹脂DEAE纖維素純化，得到了基于胃泌素釋放肽的腫瘤多肽疫苗。
6.權(quán)利要求1、2、3或4所述的腫瘤多肽疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中包括將腫瘤多肽疫苗溶于一定的介質(zhì)中，可以與也可以不與佐劑混合，進行免疫，用于預(yù)防和治療乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等腫瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的腫瘤多肽疫苗，其特征在于可與其他藥物載體組合制成藥物組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的腫瘤多肽疫苗，其特征在于可與其他藥物活性成分組合制成藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于胃泌素釋放肽的腫瘤多肽疫苗。該腫瘤多肽疫苗以人胃泌素釋放肽的羧基端七肽(SEQ ID NO.1)為靶抗原表位設(shè)計。該多肽疫苗免疫機體后能誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性的抗胃泌素釋放肽抗體。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，該多肽疫苗可用于預(yù)防和治療前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等腫瘤。
文檔編號A61P35/00GK1830489SQ200610039428
公開日2006年9月13日 申請日期2006年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月11日
發(fā)明者劉景晶, 歐陽可棟, 吳國君, 過為, 吳潔, 曹榮月 申請人:中國藥科大學(xué)