專利名稱：鎮(zhèn)靜催眠的復方酸棗仁油與梔子油組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種中藥組成的藥品，特別涉及一種鎮(zhèn)靜催眠的復方酸棗仁油與梔子油的組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
經(jīng)典中藥文獻記載酸棗仁具有養(yǎng)肝、寧心、安神之功效；梔子具有清熱瀉火，除煩安神之功效。二者是常用養(yǎng)心、安神、除煩的中藥對藥，主治虛煩不得眠，常成對出現(xiàn)于養(yǎng)心安神中藥復方中。
根據(jù)申請人所作地資料檢索，有關(guān)酸棗仁油和梔子油的相關(guān)研究報道和專利申請如下
現(xiàn)代藥理學研究報道，酸棗仁和梔子仁的水溶性部位(酸棗仁總苷、梔子醇提物)是他們的中樞神經(jīng)作用有效部位。
酸棗仁油的相關(guān)研究報道酸棗仁油具有調(diào)節(jié)血脂作用，壓榨提取法提取酸棗仁油具有中樞神經(jīng)作用。
有關(guān)酸棗仁油專利申請酸棗仁油降脂滴丸的配方及其制備方法(94107184)；酸棗仁的加工方法(00104496)，超臨界二氧化碳萃取法提取酸棗仁油和酸棗仁粉。
截止目前為止，申請人還沒有見到梔子油的研究報道和專利申請，也沒有檢索到有關(guān)復方酸棗仁與油梔子油的組方比例、復方制劑的制備工藝，和有關(guān)復方酸棗仁油與梔子油組合物的鎮(zhèn)靜、催眠和促進學習記憶的功效和應(yīng)用，及其復方酸棗仁油與梔子油組合物的協(xié)同鎮(zhèn)靜催眠作用的相關(guān)文獻和專利申請。
在制藥領(lǐng)域，二氧化碳萃取法和軟膠囊制備是成熟工藝。
經(jīng)申請人進行的資料檢索，給出下列和本發(fā)明相關(guān)的文獻作為參考
1.王鋼力，陳德冒，趙淑杰.梔子屬植物化學成分研究進展[J].中國中藥雜志，1996，21(2)67。
2.吉力，徐植靈，潘炯光.梔子果實揮發(fā)油的GC-MS分析[J].中國藥學雜志，1993，28(7)398.
3.李志孝，孟延發(fā).梔子多糖的分離及其性質(zhì)[J].生物化學與生物物理學報，1993，25(3)301。
4.張書楣.梔子的藥理研究[J].國外研究參考，1976，(9)17-17。
5.劉曉庚，陳梅梅.黃梔子果、籽中油脂化學成分分析[J].糧食與油脂，2001，16，30-31。
6.梁惠玲，鄭惠蘭，陳泗英.黃梔子花中的色素[J].云南植物研究，1991，13(1)95-95。
7.楊靜玉，吳春福.內(nèi)源性睡眠誘導物質(zhì)油酰胺研究進展[M].藥理學進展，2004。
8.郭長彬，宋宏銳.內(nèi)源性睡眠誘導物質(zhì)油酰胺的研究進展[J].中國藥物化學雜志2000，10(4)；300-310。
9.Yang JY，Wu CF，Wang F，Song HR，Pan WJ，Wang YL.The serotonergicsystem may by involved in the sleep-inducing action of oleamide in rats.NaunynSchmi edebergs Arch Pharmacol 2003；368457-462。
10.Coyne L，Lees G，Nicholson RA，Zheng J，Neufield KD.The sleep hormoneoleamide modulates inhibitory ionotropic receptors in mammalian CNS in vitro.Br J Pharmaco.2002；1351977-1987。
11.Yost CS，Hampson AJ，Leonoudakis D，Koblin DD，Bornheim LM，GrayAT.Oleamidepotentiates benzodiazepine-sensitive gamma-aminobutyric acidreceptor activity but does not alter minimum alveolar anesthetic concentration.Anesth Analg 1998；861294-1300。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于，提供一種鎮(zhèn)靜催眠和促進學習記憶的復方酸棗仁油與梔子油組合物。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供梔子油用于制備鎮(zhèn)靜催眠和促進學習記憶藥物的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案
一種鎮(zhèn)靜催眠和促進學習記憶的復方酸棗仁油與梔子油組合物，其特征在于，該組合物由酸棗仁油與梔子油組成，其劑量比例為2∶1。
申請人按照醫(yī)藥學的要求，經(jīng)過各種實驗已得到證明，本發(fā)明的復方酸棗仁油與梔子油組合物鎮(zhèn)靜催眠和促進學習記憶的作用大于單味的2倍劑量的酸棗仁油、梔子油的作用，說明他們產(chǎn)生協(xié)同作用，證明了復方酸棗仁油與梔子油組合物能夠用于制備鎮(zhèn)靜催眠和促進學習記憶藥物的應(yīng)用。同時也證明了梔子油具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥及促進學習記憶的作用。
申請人已經(jīng)著手準備酸棗仁油與梔子油復方新藥或功能食品的研究和申報相關(guān)工作，開發(fā)復方酸棗仁與梔子油的復方及其梔子油的藥用產(chǎn)品。


圖1是小鼠自主活動次數(shù)的估計邊緣均數(shù)圖。

具體實施例方式
酸棗仁、梔子配對機理酸棗仁甘酸性平，善養(yǎng)肝血，益心陰而寧心安神，善治心肝血虛引起的心煩失眠、驚悸怔忡等。梔子仁苦寒，清熱瀉火，涼血解毒，取仁入藥，擅入心經(jīng)，長于清心透邪，除煩解郁而安神定志，多用治心經(jīng)留熱之心中懊儂、虛煩不眠等。二藥合用，相輔同用，相輔相成，為治血虛陰虧、熱擾神明而致心煩失眠之常用藥對。酸棗仁養(yǎng)心血斂心陰而治本，梔子仁導熱下行，清心經(jīng)之火而治標。酸苦并投(一酸一苦)，斂泄合用(一斂一泄)，標本兼顧，共奏養(yǎng)血斂陰，除煩安神之功。一般酸棗仁用10～15g，梔子仁10g。臨床應(yīng)用二者常伍用于血虛陰虧，熱擾神明之心煩盜汗，失眠多夢，心悸怔忡。
1.復方酸棗仁與油梔子油的組方和組方比例(正交試驗)
1.1材料
(1)動物健康昆明種ICR小鼠18～22g，♀。由西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心提供(陜醫(yī)動字第08-004，二級合格動物)。
(2)藥品酸棗仁油、梔子油由超臨界CO2萃??；地西泮(Diazepam injection)由上海徐東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號041001。
(3)儀器YLS-1A小鼠自主活動記錄儀
1.2方法
采用光電管法。取90只小鼠均衡隨機分為9組，每組10只，用萃取物----酸棗仁油、梔子油組方L9(34)，因梔子有毒性，故劑量不宜過大。按實驗計劃表安排實驗，測試前將90只小鼠禁食12h，次晨9時起均按0.01ml/20g、0.02ml/20g、0.04ml/20g灌胃給藥，60min后，用YLS-1A小鼠自主活動記錄儀依次記錄各組小鼠30min的自主活動次數(shù)。1.3結(jié)果
正交試驗小鼠自主活動次數(shù)的實驗結(jié)果和用極差法分析結(jié)論見表1-1、1-2、1-3、1-4、1-5及圖1。
表1-1酸棗仁油、梔子油正交試驗設(shè)計的實驗計劃表及結(jié)果(x±s，n＝10)
表1-2藥物相互作用分析
注a R Squared＝.188(Adjusted R Squared＝.108)
采用SPSS11.5分析，以小鼠自主活動次數(shù)為變量，通過對各目標效應(yīng)檢驗，單變量組間比較的方差分析可知酸棗仁油在組方中的作用強(P＜0.01)為主藥，梔子油的作用弱(0.05＜P＜0.25)為輔藥。交互作用雖無統(tǒng)計學意義(P＞0.5)，但兩藥組方的模型是有意義的(P＜0.05)。從變量(小鼠自主活動次數(shù))的估計邊緣均數(shù)圖可知(圖1)酸棗仁油、梔子油在劑量0.02ml/20g、0.04ml/20g線交叉，故兩藥存在交互作用。
表1-3 酸棗仁油、梔子油正交試驗設(shè)計的直觀分析圖
由直觀分析圖可知酸棗仁油的極差大，作用強，為主效應(yīng)；梔子油的極差小，作用弱，為輔效應(yīng)。
表1-4 酸棗仁油、梔子油正交試驗設(shè)計的交互作用表
由交互作用表可知酸棗仁油以0.02ml/10g，梔子油以0.01ml/10g為最優(yōu)劑量組合。最優(yōu)劑量比為2∶1。
表1-5 酸棗仁油、梔子油正交試驗設(shè)計的方差分析表
由方差分析表可知酸棗仁油、梔子油的方差分析結(jié)果P＞0.05，但酸棗仁油的方差大，為主效應(yīng)；梔子油的方差小，為輔效應(yīng)。
綜上所述酸棗仁油、梔子油組成復方抑制小鼠自主活動，是有顯著性意義的；組方中，酸棗仁油為主藥，梔子油為輔藥；酸棗仁油、梔子油的最優(yōu)劑量比例為2∶1；酸棗仁油以0.02ml/10g，梔子油以0.01ml/10g為最優(yōu)劑量組合，該組合抑制小鼠的自主活動作用最為明顯。故酸棗仁油以0.02ml/10g，梔子油以0.01ml/10g設(shè)為中劑量組，酸棗仁油、梔子油以2∶1的劑量比組方，進行拆方研究及藥效學實驗。
2.復方酸棗仁與油梔子油對小鼠的鎮(zhèn)靜作用和拆方研究
2.1材料
(1)動物健康昆明種ICR小鼠18～22g，二級合格動物，♀，由西安交通大學實驗動物中心提供(陜醫(yī)動字第08-004)。
(2)藥物酸棗仁油、梔子油由超臨界CO2萃取；地西泮(Diazepam injection由上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號041001；與生理鹽水配成0.1％水溶液)
(3)儀器YLS-1A小鼠自主活動記錄儀
2.2方法
采用光電管法。取♀小鼠90只，分層隨機分為9組，復方酸棗仁與油梔子油分別按6ml/kg、3ml/kg、1.5ml/kg灌胃，酸棗仁油大(4ml/kg)、中(2ml/kg)劑量組，梔子油大(2ml/kg)、中(1ml/kg)劑量組，地西泮陽性對照組按3mg/kg給藥，對照組給予等體積的生理鹽水，bid，連續(xù)給藥15d，在d0、d1、d3、d5、d10、d15上午9:00時，給藥60min后，用YLS-lA小鼠自主活動記錄儀依次記錄各組小鼠30min的自主活動次數(shù)，結(jié)果見表1(x±s，n＝10)。
2.3結(jié)果
表2-1 復方酸棗仁與油梔子油對小鼠自主活動的影響(x±s，n＝10)
注與NS組比較**P＜0.01；*P＜0.05；與復方中劑量相比，++P＜0.01；+P＜0.05。
該實驗將復方酸棗仁油與梔子油的拆方實驗與其及各單味藥的鎮(zhèn)靜作用結(jié)合在一起進行研究，一次實驗即可觀察復方酸棗仁與油梔子油的拆方研究結(jié)果，又可觀察它們是否具有鎮(zhèn)靜作用。當復方或各單味藥的自主活動與生理鹽水組比較有顯著性差異時，表明其有鎮(zhèn)靜作用；當復方與兩單味藥中劑量組比較有顯著性意義時，即AB＞A也＞B，表示兩單味藥有相加作用；當復方與兩單味藥大劑量組比較有顯著性意義時，即AB＞2A也＞2B，表示兩單味藥有協(xié)同作用。發(fā)現(xiàn)單味酸棗仁油、單味梔子油、復方酸棗仁油與梔子油均抑制小鼠自主活動，表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)靜作用；復方酸棗仁油與梔子油起效慢，于用藥第5天才逐漸產(chǎn)生明顯的抑制小鼠自主活動的作用，但隨用藥時間延長抑制作用逐漸增強，且無耐受現(xiàn)象。而地西泮起效快，于用藥1天后即表現(xiàn)出明顯的抑制小鼠自主活動的作用，但隨用藥時間的延長該作用逐漸減弱，出現(xiàn)了耐受現(xiàn)象。組方中，以復方中劑量抑制小鼠的自主活動作用為佳，出現(xiàn)倒U形現(xiàn)象。復方中劑量抑制自主活動的作用比大、中劑量的酸棗仁油、梔子油的作用都強，與大劑量酸棗仁油比較，在用藥第10天有顯著性意義，與大、中劑量的梔子油在用藥第10天亦有顯著性意義，故呈明顯的協(xié)同作用。(表2-1)
3復方酸棗仁油與梔子油對小鼠的催眠作用
3.1材料
(1)動物健康昆明種ICR小鼠18～22g，♀。由西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心提供(陜醫(yī)動字第08-004，二級合格動物)。
(2)藥品酸棗仁油、梔子油采用超臨界CO2萃?。晃彀捅韧租c(Pentobarbitalsodium，Sigma產(chǎn)品，上?；瘜W試劑公司分裝，批號F20030816)；地西泮(Diazepaminjection利君制藥廠，批號050318)；
3.2方法
(1)復方酸棗仁與油梔子油對催眠劑量戊巴比妥鈉的小鼠睡眠時間的影響
取♀小鼠70只，分層隨機分為7組，復方酸棗仁與油梔子油分別按6ml/kg、3ml/kg、1.5ml/kg灌胃，地西泮模型組按3mg/kg給藥，2ml/kg中劑量酸棗仁組，1ml/kg中劑量梔子油組，對照組給予等體積的生理鹽水，60min后，各組均ip戊巴比妥鈉50mg/kg，以翻正反射消失為睡眠潛伏期；以翻正反射消失至恢復為睡眠持續(xù)時間。結(jié)果見表1
(2)復方酸棗仁與油梔子油對閾下催眠劑量的戊巴比妥鈉的作用影響
取♀小鼠70只，分層隨機分為7組，復方酸棗仁與油梔子油分別按6ml/kg、3ml/kg、1.5ml/kg灌胃，2ml/kg中劑量酸棗仁組，1ml/kg中劑量梔子油組，地西泮模型組按3mg/kg給藥，對照組給予等體積的生理鹽水，60min后，各組均ip戊巴比妥鈉25mg/kg，記錄睡眠小鼠數(shù)。結(jié)果見表2
3.3結(jié)果
表3-1 復方酸棗仁與油梔子油對催眠劑量戊巴比妥鈉的小鼠睡眠時間的影響(x±s)
注:為對比組，**P＜0.01；*P＜0.05-P＞0.05
表3-2 復方酸棗仁與油梔子油對閾下催眠劑量的戊巴比妥鈉的作用影響(x±s)
注:為對比組，**P＜0.01；*P＜0.05-P＞0.05
采用兩組比較t檢驗，復方酸棗仁油與梔子油對戊巴比妥鈉誘導的睡眠潛伏期以及睡眠持續(xù)期均有影響，其可縮短睡眠潛伏期、延長睡眠持續(xù)期，與正常組比較有非常顯著性意義。酸棗仁油對戊巴比妥鈉誘導的睡眠持續(xù)期與正常組相比亦有顯著性意義。復方酸棗仁與油梔子油中劑量組與中劑量的單味酸棗仁油、單味梔子油比較，其縮短睡眠潛伏期有顯著性意義，呈明顯的相加作用；延長睡眠持續(xù)期則無顯著性意義。采用Fisher精確概率法(雙側(cè)檢驗)計算，復方酸棗仁油與梔子油對閾下催眠劑量戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠個數(shù)的影響與正常組相比有明顯的顯著性意義，表明其與戊巴比妥鈉有明顯的協(xié)同作用；復方酸棗仁與油梔子油中劑量組與中劑量的單味酸棗仁油、單味梔子油組比較則有顯著性意義，表明酸棗仁油與梔子油呈明顯的相加作用。單味酸棗仁油、單味梔子油對閾下催眠劑量戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠個數(shù)與正常組比較，亦有顯著性意義。因此復方酸棗仁油與梔子油、單味酸棗仁油、單味梔子油有誘導閾下催眠劑量戊巴比妥鈉小鼠入睡，復方酸棗仁油與梔子油、單味酸棗仁油尚有協(xié)同催眠劑量戊巴比妥鈉小鼠的睡眠作用，產(chǎn)生明顯的催眠效應(yīng)；且復方中兩藥存在相加作用。
4.復方酸棗仁油與梔子油的抗驚厥作用
4.1材料
(1)動物健康昆明種ICR小鼠18～22g，♀。由西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心提供(陜醫(yī)動字第08-004，二級合格動物)。
(2)藥品酸棗仁油、梔子油由超臨界CO2萃??；戊四氮(Pentetrazole，上海新亞藥廠制造，批號610325)；苯巴比妥鈉(Phenobarbital sodium天津金耀氨基酸有限公司，批號0501281)
4.2方法
(1)復方酸棗仁油與梔子油的抗戊四氮引起的陣攣性驚厥作用
取♀小鼠50只，分層隨機分為5組，復方酸棗仁與油梔子油分別按40ml/kg、20ml/kg、10ml/kg灌胃，苯巴比妥鈉模型組按40mg/kg給藥，對照組給予等體積的生理鹽水，60min后，均ip37.5mg/kg戊四氮溶液，觀察小鼠的陣攣性驚厥。
(2)復方酸棗仁油與梔子油的抗戊四氮引起的強直性驚厥作用
取♀小鼠50只，分層隨機分為5組，復方酸棗仁與油梔子油分別按40ml/kg、20ml/kg、10ml/kg灌胃，苯巴比妥鈉模型組按40mg/kg給藥，對照組給予等體積的生理鹽水，60min后，均ip100mg/kg戊四氮溶液，觀察小鼠的陣攣性驚厥、強直性驚厥。
4.3結(jié)果
復方酸棗仁油與梔子油均未發(fā)現(xiàn)有對抗戊四氮引起的陣攣性驚厥以及強直性驚厥的作用。苯巴比妥鈉則有對抗作用。
5.復方酸棗仁油與梔子油學習記憶的實驗研究
5.1材料
(1)動物昆明種ICR小鼠，♀，陜醫(yī)動字第08-004，二級合格動物，體重18~22g，西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。
(2)藥品酸棗仁油、梔子油由超臨界CO2萃??；地西泮(Diazepam injection利君制藥廠，批號050318)；氫溴酸東莨菪堿(Scopolamine Hydrobromide)，徐州萊恩藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號0311181；環(huán)己米特(環(huán)己酰亞胺，cycloheximide)，Sigma公司產(chǎn)品；乙醇(ethanol)，西安化學試劑廠，批號051024。
(3)儀器避暗、跳臺兩用儀(西安交通大學醫(yī)學院設(shè)備科制造)。
5.2方法
實驗分3批進行，每批隨機分為復方大、中、小劑量組，分別按6mL.kg-1、4mL.kg-1、2mL·kg-1ih，酸棗仁油中劑量組2mL·kg-1給藥，梔子中劑量組1mL·kg-1，地西泮組3mL·kg-1，正常對照組3mL·kg-1，各記憶障礙模型均另設(shè)一組模型組，每組10只小鼠，各組小鼠每天上午9:00給藥1次，連續(xù)給藥10天。
(1)避暗法
第11天上午9:00時開始，進行學習訓練，并進行學習記憶指標測定。將小鼠背朝暗箱口放入明箱，將小鼠第一次雙前足接觸暗箱銅柵遭電擊的時間作為入室潛伏期，并記錄5min內(nèi)的入室錯誤次數(shù)。以此作為學習成績。24h后，在相同的時間段內(nèi)，重復測試入室潛伏期、錯誤次數(shù)，觀察其記憶保持情況。
①復方酸棗仁油與梔子油對正常小鼠學習記憶的影響
第11天，測試并記錄各組小鼠的入室潛伏期和5min內(nèi)入室錯誤次數(shù)。結(jié)果見表5-1。
②復方酸棗仁油與梔子油對記憶獲得障礙模型小鼠學習記憶的影響
第11天上午9:00時，除正常生理鹽水對照組外，各組小鼠均依次ip0.015％東莨菪堿溶液1.5mg/kg造成記憶獲得障礙模型。15min后，開始進行學習訓練，記錄各組小鼠的入室潛伏期和5min內(nèi)錯誤次數(shù)。24h后，在與訓練日相同的時段再次測試，記錄各組小鼠的入室潛伏期和3min內(nèi)錯誤次數(shù)，結(jié)果見表5-2。
③復方酸棗仁油與梔子油對記憶鞏固障礙模型小鼠學習記憶的影響
第11天上午9:00時開始，進行學習訓練，并進行學習記憶指標測定。除正常生理鹽水對照組ip生理鹽水外，各組小鼠均于訓練后立即ip環(huán)己酰亞胺溶液120mg/kg造成記憶鞏固障礙模型。24h后，在與訓練日相同的時段再次測試，記錄各組小鼠的入室潛伏期和5min內(nèi)電擊次數(shù)。結(jié)果見表5-3。
④復方酸棗仁油與梔子油對記憶再現(xiàn)障礙模型小鼠學習記憶的影響
第11天上午9:00時開始，進行學習訓練并進行學習記憶指標測定。24h后，在與訓練日相同的時段，除正常對照組ih生理鹽水外，各組小鼠均ih20％乙醇溶液10ml/kg造成記憶再現(xiàn)障礙模型。30min后，再次測試并記錄各組小鼠的入室潛伏期和5min內(nèi)電擊次數(shù)。結(jié)果見表5-4。
(2)跳臺法
第11天上午9:00時，開始測試。取小鼠放在跳臺儀的箱內(nèi)，使之適應(yīng)3min，然后立即給銅柵通以36V交流電，小鼠受到電擊逃至安全臺上，再次從安全臺上下來，以兩前足同時接觸銅柵遭到電擊為錯誤反應(yīng)，觀察記錄3min內(nèi)小鼠跳下跳臺的錯誤反應(yīng)次數(shù)，以此作為學習成績。24h后重復測驗1次，觀察其記憶保持情況。
①復方酸棗仁與油梔子油對正常小鼠學習記憶的影響
第11天，取小鼠放在跳臺儀的箱內(nèi)，使之適應(yīng)3min，然后立即給銅柵通以36V交流電，記錄3min內(nèi)小鼠跳下跳臺的錯誤次數(shù)。結(jié)果見表5-5。
②復方酸棗仁油與梔子油對記憶獲得障礙模型小鼠學習記憶的影響
第11天進行訓練，除正常對照組ip生理鹽水外，其余各組小鼠均ip東莨菪堿溶液1.5mg/kg造成記憶獲得障礙模型。10min后，取小鼠放在跳臺儀的箱內(nèi)，使之適應(yīng)3min，然后立即給銅柵通以36V交流電，記錄5min內(nèi)小鼠跳下跳臺的錯誤次數(shù)。24h后，在與訓練日相同的時段再次測試，記錄小鼠第一次跳下跳臺的潛伏期和3min內(nèi)錯誤次數(shù)，結(jié)果見表5-6。
③復方酸棗仁油與梔子油對記憶鞏固障礙模型小鼠學習記憶的影響
第11天進行訓練，取小鼠放在跳臺儀的跳臺上，使之適應(yīng)3min，然后立即給銅柵通以36V交流電，記錄5min內(nèi)小鼠跳下跳臺的錯誤次數(shù)，并立即ip環(huán)己酰亞胺溶液120mg/kg造成記憶鞏固障礙模型。24h后，在與訓練日相同的時段再次測試，記錄小鼠第一次跳下跳臺的潛伏期和3min內(nèi)錯誤次數(shù)，結(jié)果見表5-7。
④復方酸棗仁油與梔子油對記憶再現(xiàn)障礙模型小鼠學習記憶的影響
第11天進行訓練，取小鼠放在跳臺儀的箱內(nèi)，使之適應(yīng)3min，然后立即給銅柵通以36V交流電，記錄5min內(nèi)小鼠跳下跳臺的錯誤次數(shù)。24h后于重復測試前30min，除正常生理鹽水對照組外，各組小鼠均ip20％乙醇溶液0.1ml/10g造成記憶再現(xiàn)障礙模型。記錄小鼠第一次跳下跳臺的潛伏期和3min內(nèi)錯誤次數(shù)，結(jié)果見表5-8。
5.3結(jié)果
表5-1 藥物對正常小鼠學習記憶(避暗法)的影響(x±s，n＝10)
注與NS組比較，*P＜0.05、**P＜0.01。
表5-2復 方酸棗仁油與梔子油對記憶獲得障礙模型小鼠學習記憶(避暗法)的影響
(x±s，n＝11)
注與模型組比較，*P＜0.05、**P＜0.01；與復方中劑量比較，單味藥P＞0.05。
表5-3 復方酸棗仁油與梔子油對記憶鞏固障礙模型小鼠學習記憶(避暗法)的影響
(x±s，n＝8)
注與模型組比較，*P＜0.05、**P＜0.01；與復方中劑量比較，單味藥P＞0.05。
表5-4 復方酸棗仁與油梔子油對記憶再現(xiàn)障礙模型小鼠學習記憶(避暗法)的影響
(x±s，n＝10)
注與模型組比較，*P＜0.05、**P＜0.01；與復方中劑量比較，單味藥P＞0.05。
表5-5 復方酸棗仁油與梔子油對正常小鼠學習記憶(跳臺法)的影響
(x±s，n＝10)
注與NS組比較。
表5-6 復方酸棗仁與油梔子油對記憶獲得障礙模型小鼠學習記憶(跳臺法)的影響
(x±s，n＝11)
注與模型組比較，*P＜0.05、**P＜0.01；與復方中劑量比較，單味藥P＞0.05。
表5-7 復方酸棗仁油與梔子油對記憶鞏固障礙模型小鼠學習記憶(跳臺法)的影響
(x±s，n＝8)
注與模型組比較，*P＜0.05、**P＜0.01；與復方中劑量比較，單味藥P＞0.05。
表5-8 復方酸棗仁油與梔子油對記憶再現(xiàn)障礙模型小鼠學習記憶(跳臺法)的影響
(x±s，n＝10)
注與模型組比較，*P＜0.05、**P＜0.01；與復方中劑量比較，單味藥P＞0.05。選用t(t’)檢驗、部分指標選用非參檢驗(W-M-W法)。
對于正常小鼠，復方酸棗仁油與梔子油能減少正常小鼠的入室錯誤次數(shù)，與給予生理鹽水的正常組比較有顯著性意義，說明復方酸棗仁油與梔子油有促進正常小鼠的學習記憶作用(表5-1，表5-5)。
對于記憶獲得障礙模型小鼠，訓練時，復方酸棗仁油與梔子油能明顯縮短小鼠入暗室的潛伏期，并減少入室錯誤次數(shù)。訓練后，復方酸棗仁與油梔子油能明顯延長小鼠入暗室的潛伏期并減少入室錯誤次數(shù)；減少跳下跳臺的錯誤次數(shù)。酸棗仁油、梔子油也可減少訓練時、訓練后小鼠的入室錯誤次數(shù)；延長訓練后入室潛伏期，減少跳臺錯誤次數(shù)。說明復方酸棗仁與油梔子油、酸棗仁油、梔子油對記憶獲得障礙模型小鼠的學習記憶有促進作用(表5-2，表5-6)。
對記憶鞏固障礙模型小鼠，訓練時，復方酸棗仁與油梔子油能明顯減少正常小鼠的入室錯誤次數(shù)。訓練后，復方酸棗仁與油梔子油能延長小鼠的入室潛伏期，明顯減少入室錯誤次數(shù)；減少跳臺錯誤次數(shù)。酸棗仁油、梔子油對訓練時、訓練后的小鼠均可減少其入室錯誤次數(shù)。說明復方酸棗仁與油梔子油、單味的梔子油能改善記憶鞏固障礙小鼠的學習記憶能力(表5-3，表5-7)。
對記憶再現(xiàn)障礙模型小鼠，訓練時，復方酸棗仁與油梔子油能縮短正常小鼠的入室潛伏期，減少入室錯誤次數(shù)；能減少跳臺錯誤次數(shù)。訓練后，復方酸棗仁與油梔子油能明顯延長小鼠入室潛伏期及減少入室錯誤次數(shù)；能減少跳臺錯誤次數(shù)。酸棗仁油、梔子油也可減少訓練時的小鼠入室潛伏期及入室錯誤次數(shù)；減少訓練后跳臺錯誤次數(shù)。說明復方酸棗仁與油梔子油、單味的酸棗仁油、單味的梔子油能改善記憶再現(xiàn)障礙小鼠的學習記憶能力(表5-4，表5-8)。
6.梔子油對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響
6.1梔子油對小鼠自主活動的影響
取小鼠60只，隨機分為6組，每組10只，給藥組分別按10ml/kg、3ml/kg、1ml/kgi.g，陽性對照組給予3mg/kg地西泮，正常組給予等體積的生理鹽水，60min后，用YLS-1A小鼠自主活動記錄儀依次記錄各組小鼠15min的自主活動次數(shù)。結(jié)果見表6-1。
采用兩組比較t檢驗。大劑量梔子油(10mg/kg)在給藥3天時可明顯抑制小鼠自主活動，此作用隨用藥劑量增加而增強，且隨用藥時間延長未產(chǎn)生明顯耐受現(xiàn)象。地西泮雖然作用較強，但10天后產(chǎn)生了耐受性。
表6-1 梔子油對小鼠自主活動的影響(x±s)
注*P＜0.05，**P＜0.01；與NS組比較；各組上行為實測值，下行為變化率。
6.2梔子油對不同劑量戊巴比妥鈉作用的影響
(1)梔子油對閾下催眠劑量的戊巴比妥鈉的小鼠誘導睡眠作用的影響
取小鼠75只，隨機分為5組，每組15只，給藥組分別按10ml/kg、3ml/kg、1ml/kg灌胃給與梔子油，陽性對照組給予3mg/kg地西泮，正常組給予等體積的生理鹽水作對照。灌胃給藥1h后，每組均i.p閾下催眠劑量的戊巴比妥鈉(25mg/kg)觀察小鼠睡眠情況(入睡動物數(shù))。由于樣本數(shù)偏小(有0、1)，采用Fisher精確概率法(雙側(cè)檢驗)進行統(tǒng)計處理。研究表明，大劑量梔子油(10mg/kg)和地西泮對閾下催眠劑量的戊巴比妥鈉的小鼠誘導睡眠作用有非常顯著性意義。結(jié)果見表6-2。
表6-2 梔子油對閾下催眠劑量的戊巴比妥鈉的小鼠誘導睡眠作用的影響(x±s)
注*P＜0.05，**P＜0.01，與NS組比較。
(2)梔子油對催眠劑量戊巴比妥鈉的小鼠睡眠時間的影響
取小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，給藥組分別按10ml/kg、3ml/kg、1ml/kgi.g，陽性對照組給予3mg/kg地西泮，正常組給予等容積的生理鹽水作對照。60min后，各組動物均i.p戊巴比妥鈉50mg/kg，以翻正反射消失時間、睡眠持續(xù)時間為指標，記錄各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)期。結(jié)果見表6-3。
表6-3 梔子油對催眠劑量戊巴比妥鈉的小鼠睡眠時間的影響(x±s)
注**P＜0.01，與NS組比較。
采用兩組比較t檢驗，地西泮(3mg/kg)及梔子油各劑量組(1、3、10ml/kg)對睡眠持續(xù)期的作用均有非常顯著性意義，梔子油的催眠作用還表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系(r＝0.674，n＝30，p＜0.01)；未觀察到地西泮及梔子油對睡眠潛伏期的顯著性影響。
6.3梔子油對抗戊四氮所致小鼠驚厥作用的影響
取小鼠40只，隨機分為4組，給藥組分別按0.4L/kg、0.2L/kg i.g，陽性對照組給予0.04g/kg苯巴比妥鈉，模型組給予等體積的生理鹽水作對照，均i.p戊四氮溶液0.1g/kg，以強直性驚厥為指標，記錄小鼠的驚厥數(shù)、死亡數(shù)、驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)期。結(jié)果見表6-4。
表6-4 梔子油對抗戊四氮所致小鼠驚厥作用的影響(x±s)
注*P＜0.05，與模型組比較
采用兩組比較t檢驗(部分為t’檢驗)。苯巴比妥鈉完全對抗了戊四氮所致小鼠驚厥；大劑量梔子油延長小鼠驚厥潛伏期的作用有顯著性意義，說明梔子油具有一定的抗驚厥作用。
6.4梔子油對小鼠學習記憶的影響
(1)避暗法將50只小鼠均衡隨機分為5組，每組10只，♀，分組如下梔子油大、中、小劑量組按10ml/kg、3ml/kg、1ml/kg i.g，陽性對照組給予3mg/kg地西泮i.g，正常組給予等體積的生理鹽水作對照。qd，連續(xù)10d。第11d記錄各只小鼠的入室潛伏期和5min內(nèi)電擊錯誤次數(shù)。研究表明，大劑量梔子油可減少電擊錯誤次數(shù)，表明梔子油具有一定的促進學習技藝作用，結(jié)果見表6-5。
表6-5 梔子油對小鼠入室潛伏期和5min內(nèi)電擊錯誤次數(shù)的影響(x±s)
注*P＜0.05，與NS組比較。
(2)跳臺法將50只小鼠均衡隨機分為5組，每組10只，♀，分組如下梔子油大、中、小劑量組按10ml/kg、3ml/kg、1ml/kgi.g，陽性對照組給予3mg/kg地西泮，正常組給予等體積的生理鹽水作對照。qd，連續(xù)10d。第11天早9:00時開始實驗。先將小鼠放在跳臺儀箱內(nèi)，使之適應(yīng)3min，然后立即給銅柵通以36V交流電，記錄5min內(nèi)小鼠跳下跳臺的錯誤次數(shù)。根據(jù)研究表明，未觀察到梔子油可減少跳臺錯誤次數(shù)，結(jié)果見表6-6。
表6-6 梔子油對小鼠5min內(nèi)的跳臺錯誤次數(shù)的影響(x±s)
注與NS組比較，采用兩組比較t檢驗。
7.討論
酸棗仁油與梔子油組成的復方，對于抑制小鼠自主活動具有顯著性意義；組方中，酸棗仁油為主藥，梔子油為輔藥；酸棗仁油與梔子油組合的最優(yōu)劑量比例為2∶1；酸棗仁油以0.02ml/10g，梔子油以0.01ml/10g為最優(yōu)劑量組合，該組合物抑制小鼠的自主活動作用最為明顯。
復方酸棗仁與油梔子油、單味的酸棗仁油、單味的梔子油均抑制小鼠自主活動，表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)靜作用；復方酸棗仁油與梔子油起效慢，但隨用藥時間延長，抑制作用逐漸增強，且無耐受現(xiàn)象。組方中酸棗仁油與梔子油在鎮(zhèn)靜作用方面呈明顯的協(xié)同作用。
復方酸棗仁油與梔子油、單味的酸棗仁油、單味的梔子油均有誘導閾下催眠劑量戊巴比妥鈉小鼠入睡的作用，并具有促進催眠劑量戊巴比妥鈉小鼠的睡眠作用；酸棗仁油與梔子油對戊巴比妥鈉閾上和閾下催眠劑量小鼠的睡眠作具有協(xié)同作用。
復方酸棗仁油與梔子油、單味的酸棗仁油、單味的梔子油對小鼠學習記憶的影響，采用避暗、跳臺訓練時或訓練后不同時間，給予不同化學藥品，分別造成小鼠獲得性、鞏固性和再現(xiàn)性記憶缺損模型，以觀察復方酸棗仁與油梔子油、酸棗仁油、梔子油對小鼠學習記憶不同階段的影響。東莨菪堿作為M-膽堿受體拮抗劑，可降低大腦皮層和海馬膽堿能系統(tǒng)活性，對記憶的獲得產(chǎn)生阻抑效應(yīng)，能顯著破壞動物學習和記憶的獲得，是一種公認的記憶獲得障礙工具藥；環(huán)己米特(環(huán)己酰亞胺)是蛋白質(zhì)合成抑制劑，可干擾記憶鞏固過程；而乙醇為致缺氧劑，使腦組織缺血缺氧，可明顯干擾記憶的再現(xiàn)。本實驗用地西泮作陰性對照藥，發(fā)現(xiàn)其對正常和記憶缺損小鼠能延長入室潛伏期、增加入室錯誤次數(shù)；縮短錯誤跳臺潛伏期及增加錯誤跳臺次數(shù)；產(chǎn)生記憶損傷作用。而復方酸棗仁與油梔子油能減少正常小鼠入室錯誤次數(shù)。對記憶獲得障礙模型、記憶鞏固障礙模型、記憶再現(xiàn)障礙模型小鼠訓練時的入暗室潛伏期有縮短作用，減少入室錯誤次數(shù)及錯誤跳臺次數(shù)；對訓練后的入暗室潛伏期有延長作用，也可減少訓練后的入室錯誤次數(shù)及錯誤跳臺次數(shù)。酸棗仁油、梔子油也可減少訓練時、訓練后記憶障礙模型小鼠的入室錯誤次數(shù)；延長訓練后入室潛伏期，減少跳臺錯誤次數(shù)。因此，復方酸棗仁與油梔子油對正常和記憶缺損小鼠的學習記憶功能均有改善和提高作用；單味的酸棗仁油、單味的梔子油對記憶缺損小鼠的學習記憶功能也有改善和提高作用；未發(fā)現(xiàn)酸棗仁油與梔子油在學習記憶方面的相加或協(xié)同作用。
8.結(jié)論
1)酸棗仁油與梔子油組成中藥復方中，酸棗仁油為主藥，梔子油為輔藥；酸棗仁油、梔子油的最優(yōu)劑量比例為2∶1。
2)酸棗仁油與梔子油是中藥對藥，他們組成的復方，符合中醫(yī)理論，在鎮(zhèn)靜催眠作用方面具有交互影響，發(fā)揮了相加或協(xié)同作用，說明復方酸棗仁與油梔子油組方合理，配比合適。
3)復方酸棗仁油與梔子油、單味的酸棗仁油、單味的梔子油(首次發(fā)現(xiàn))具有鎮(zhèn)靜催眠作用。
4)復方酸棗仁油與梔子油、單味的酸棗仁油、單味的梔子油(首次發(fā)現(xiàn))有促進學習記憶的作用。
5)復方酸棗仁油與梔子油的鎮(zhèn)靜作用雖起效慢，但隨用藥時間延長作用逐漸增強，未觀察到耐受現(xiàn)象。
6)梔子油可明顯抑制小鼠自主活動，說明梔子油具有鎮(zhèn)靜作用，此作用隨用藥時間延長而無明顯耐受現(xiàn)象；梔子油可誘導閾下劑量戊巴比妥鈉的小鼠入睡；明顯延長小鼠睡眠時間，與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用，說明梔子油具有催眠作用；對戊四氮引起的小鼠驚厥潛伏期有明顯延長作用，說明梔子油具有抗驚厥作用；梔子油可減少小鼠電擊錯誤次數(shù)，說明梔子油具有還具有一定的促進學習記憶的作用。
研究同時表明，梔子油具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥及促進學習記憶的作用。對于梔子脂肪酸產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、促學習記憶等作用除上述作用機制外，是否還有其它機制，包括與腦細胞直接發(fā)揮作用，有待進一步研究。
傳統(tǒng)醫(yī)學通常是采用梔子的水煎劑治療失眠等疾病，單純采用梔子油者未見報道。與以往資料相比，其產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、催眠作用的成分很可能是其中的植物脂肪酸。近年來，隨著人們對植物脂肪酸越來越多地關(guān)注，對植物脂肪酸有效成分的提取、在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化、生物學效應(yīng)、作用靶點以及信號轉(zhuǎn)導等縱深方面的研究，對植物脂肪酸的綜合利用和開發(fā)，提供了非常廣闊的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種鎮(zhèn)靜催眠的復方酸棗仁油與梔子油組合物，其特征在于，該組合物由酸棗仁油與梔子油組成，其劑量比例為2∶1。
2.復方酸棗仁油與梔子油的組合用于制備鎮(zhèn)靜催眠藥物的應(yīng)用。
3.復方酸棗仁油與梔子油的組合用于制備促進學習記憶藥物的應(yīng)用。
4.梔子油用于制備鎮(zhèn)靜催眠藥物的應(yīng)用。
5.梔子油用于制備促進學習記憶藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鎮(zhèn)靜催眠的復方酸棗仁油與梔子油組合物，正交實驗確定了酸棗仁油處于主藥作用，梔子油處于為輔藥作用；酸棗仁油、梔子油的劑量比例為2∶1。申請人按照醫(yī)藥學的要求，經(jīng)過各種實驗已得到證明，本發(fā)明的復方酸棗仁油與梔子油組合物其復方大于單質(zhì)的酸棗仁油、梔子油的作用，并證明了復方酸棗仁油與梔子油組合物能夠用于制備鎮(zhèn)靜催眠藥物及其用于制備促進學習記憶藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的酸棗仁油與梔子油是中藥對藥組成的復方，符合中醫(yī)理論，在鎮(zhèn)靜催眠作用方面具有交互影響，發(fā)揮了相加或協(xié)同作用，說明復方酸棗仁油與梔子油組合物配方合理，劑量比例合適。同時也證明了梔子油具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥及促進學習記憶的作用。
文檔編號A61P25/00GK1879732SQ200610042809
公開日2006年12月20日 申請日期2006年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月15日
發(fā)明者袁秉祥, 李寶莉 申請人:西安交通大學