專利名稱：保護血管內皮細胞功能的中藥復合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種中藥復合物及其制備方法，尤其是一種用于保護血管內皮細胞功能的中藥復合物和它的制備方法。
背景技術：
冠心病是目前最常見的多發(fā)的心血管疾病，在我國的發(fā)病率近幾年有明顯增高的趨勢，成為死亡的重要原因之一，尤其是急性心肌缺血嚴重危害人類的身體健康，因而對其發(fā)病機理及其防治的研究，已日益受到學者們的重視。進入九十年代對冠心病急性心肌缺血發(fā)病機理的認識已深入到分子生物學水平。針對冠心病急性心肌缺血的防治，國內外對西藥的研究達到了比較高的水平，但由于其毒副作用較大的缺點，故許多學者轉而投向對中藥的研究，目前雖已取得可喜的進展，但中藥對冠心病急性心肌缺血防治的作用機制，還沒有形成較完整的理論體系，所以，進一步研究中藥防治冠心病急性心肌缺血的機理，具有重要的學術價值和臨床意義。
中醫(yī)學認為冠心病急性心肌缺血屬于“胸痹”范疇，病機主要是氣虛血瘀、痹阻脈絡，不通則痛。因此治療上多以益氣活血化瘀為原則，但中醫(yī)有津血同源理論，且津停為痰，又認為久病入絡，故宜搜風通絡，治血與治風相通，故治療以“益氣搜風祛痰”為治療方法。基于此原則發(fā)明人研制了活心湯，并應用于臨床，已取得了較好的療效。心肌缺血時細胞內皮功能失調是目前研究的熱點，本發(fā)明旨在通過動物實驗，通過分子生物學水平來進一步揭示中藥活心湯對內皮功能的影響作用機制，為中藥抗心肌缺血提供了可靠的理論依據。

發(fā)明內容
1、發(fā)明目的本發(fā)明提供一種保護血管內皮細胞功能的中藥復合物及其制備方法，其目的是解決采用西藥針對冠心病急性心肌缺血的防治，其存在毒副作用較大的缺點，而中醫(yī)對冠心病急性心肌缺血防治的作用機制還沒有形成較完整的理論體系，現(xiàn)在也沒有很好用于治療的中藥復合物等方面存在的問題。
2、技術方案本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種保護血管內皮細胞功能的中藥復合物，其特征在于該中藥復合物主要包括下述重量份的藥物地龍2～4份、水蛭1～3份、陳皮1～3份、半夏1～3份，將上述各中藥原料用水浸泡后經文火煎3次，將每次煎得的藥汁合并，過濾后用100℃水浴濃縮后的藥液即得。
上述中藥復合物中還包括如下重量份的藥物丹參2～4份、黃芪8～10份、生地1～3份、白術2～4份。
一種保護血管內皮細胞功能的中藥復合物的制備方法，其特征在于它按下述步驟進行a.按權利要求1配方的重量份取各藥物；b.將全部藥物用自來水浸泡半小時，用文火煎一小時，倒出藥汁，共煎3次，將藥汁合并；c.將所得藥汁用紗布過濾，過濾后用100℃水浴濃縮至100ml的藥液，即得成品。
3、優(yōu)點及效果通過本發(fā)明技術方案的實施，能夠很好地解決采用西藥針對冠心病急性心肌缺血的防治，其存在毒副作用較大的缺點，而中醫(yī)對冠心病急性心肌缺血防治的作用機制還沒有形成較完整的理論體系，現(xiàn)在也沒有很好用于治療的中藥復合物等方面存在的問題。本發(fā)明具有較好的抗心肌缺血作用，提高N0和NOS的水平，增加NOS的mRNA表達，降低ET水平，降低ECE的mRNA的表達，增強缺血心肌中的NOS陽性免疫反應，降低ET的陽性免疫反應，從而保護血管內皮細胞增加對心肌的保護作用。
四

附圖1為對家兔的冠脈結扎前描記到正常心電圖；附圖2為表明家兔急性心肌缺血模型的心電圖；附圖3a為本發(fā)明中藥組的NOS原位雜交圖；附圖3b為模型組的NOS原位雜交圖；附圖3c為西藥組的NOS原位雜交圖；附圖3d為正常組的NOS原位雜交圖；附圖4a為本發(fā)明中藥組的ECE原位雜交圖；附圖4b為模型組的ECE原位雜交圖；附圖4c為西藥組的ECE原位雜交圖；附圖4d為正常組的ECE原位雜交圖；附圖5a為本發(fā)明中藥組的ET免疫組化圖；附圖5b為模型組的ET免疫組化圖；附圖5c為西藥組的ET免疫組化圖；附圖5d為正常組的ET免疫組化圖；附圖6a為本發(fā)明中藥組的NOS免疫組化圖；
附圖6b為模型組的NOS免疫組化圖；附圖6c為西藥組的NOS免疫組化圖；附圖6d為正常組的NOS免疫組化圖。
五具體實施例方式本發(fā)明保護血管內皮細胞功能的中藥復合物，它是用于保護血管內皮細胞功能的藥物，該中藥復合物主要包括下述重量份的藥物地龍2～4份、水蛭1～3份、陳皮1～3份、半夏1～3份，將上述各中藥原料用水浸泡后經文火煎3次，將每次煎得的藥汁合并，過濾后用100℃水浴濃縮后的藥液即得。上述中藥復合物中還包括如下重量份的藥物丹參2～4份、黃芪8～10份、生地1～3份、白術2～4份。本發(fā)明中藥復合物的制備方法按下述步驟進行a.按上述配方的重量份取各藥物；b.將全部藥物用自來水浸泡半小時，用文火煎一小時，倒出藥汁，共煎3次，將藥汁合并；c.將所得藥汁用紗布過濾，過濾后用100℃水浴濃縮至100ml的藥液，即得成品。
本發(fā)明中藥復合物的組方依據如下冠心病病癥的發(fā)生以氣虛為本，血瘀為標，屬本虛標實之癥，故氣虛血瘀是冠心病主要發(fā)病機制。中醫(yī)有津血同源理論，且津停為痰，又認為久病入絡，故宜搜風通絡，治血與治風相通，故治療以“益氣搜風祛痰”為治療方法。本發(fā)明中藥復合物由地龍、水蛭、黃芪、陳皮、半夏、生地、白術等藥物組成。方中黃芪是補氣的要藥，而且善補胸中大氣，大氣旺則氣滯行，血瘀通，即“大氣一轉，其結乃散”之謂；水蛭為破血逐瘀之藥；生地為養(yǎng)血補血之功效；陳皮理氣健脾，燥濕化痰。半夏燥濕化痰，降逆止嘔，清痞散結。地龍清熱息風，通絡；白術補氣健脾燥濕利水。
現(xiàn)代藥理研究證明各藥物成份功能如下黃芪對心血管系統(tǒng)作用，對心臟的作用黃芪水煎劑對離體蛙心無明顯作用，醇提取液可使離體蛙或蟾蜍心臟收縮增強，振幅明顯擴大，大劑量時則產生抑制。黃芪皂甙50μg/ml～200μg/ml劑量時對離體工作鼠心有正性肌力作用，黃芪對缺糖缺氧所致大鼠心肌細胞核畸形改變、核染色質凝集、線粒體腫脹或形成空泡，糖原顆粒減少、結構改變等超微結構，亦有明顯保護作用。有報道，黃芪能使人心肌細胞乳酸脫氫酶及琥珀酸脫氫酶含量有不同程度的增高。有研究表明，黃芪對柯薩奇B3病毒(CVB3)感染大鼠心肌細胞及正常對照心肌細胞的Ca2+內流均呈顯著抑制作用(p＜0.01，p＜0.05)；若在病毒感染1h后加黃芪，經48h培養(yǎng)，對正常對照及感染細胞的Ca2+內流亦有抑制作用(p＜0.05)；同時細胞中CVB3-RNA含量顯著少于病毒對照組(p＜0.001)。提示黃芪具有鈣拮抗作用，可減少病毒感染引起的心肌Ca2+內流量，有可能減輕感染細胞的繼發(fā)性Ca2+損傷；且對細胞中病毒RNA的復制具有抑制作用，顯示了其在病毒性心肌炎臨床治療上的應用價值。高濃度黃芪皂甙(50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)使Wistar大鼠離體工作心臟的心臟收縮性能立即呈劑量依賴性增強，作用與毒毛旋花子甙K(0.72μg/ml)相似，低濃度黃芪皂甙(30μg/ml)使心臟收縮性能立即減弱，提高細胞外鈣不能反轉此效應，洗脫后黃芪皂甙的作用迅速消失，提示黃芪皂甙對心肌有正性肌力作用，與強心甙類藥物相似。
水蛭(1).抗凝血作用提外實驗表明，水蛭水煎劑有強抗凝血作用，能顯著延長纖維蛋白的凝聚時間。水蛭素是僅從醫(yī)用水蛭中提出的一種有效成分，能與凝血酶結合，形成一種非工價復合物，這種復合物極其穩(wěn)定，而且反應速度極快。水蛭不僅能阻止纖維蛋白原凝固，也能阻止凝血酶催化的進一步血瘀反應，如抑制因子V、VIII的活化及凝血酶誘導的血小板反應，而血液凝固被推遲或完全被阻止。水蛭素能抑制凝血酶誘導的成纖維細胞的增殖和凝血酶對內皮細胞的刺激。。能抑制凝血酶同血小板的結合，血小板受凝血酶刺激的釋放，并能使凝血酶與血小板解離。從而產生極強的抗凝血作用；(2).抗血栓作用纖維蛋白的纖溶作用，作用強于單參和大黃。靜脈注射水蛭素1g/kg，能明顯抑制大鼠體、內血栓的形成水蛭的水提物、水蛭素對ADP誘導的大鼠血小板聚集有顯著的作用；(3).對血脂和血液流變性的影響水蛭能降低大鼠的全血比粘度和血漿比粘度，水蛭水煎劑給肌注地塞米松所致血液流變異性異常的大鼠灌胃，可使全血粘度、血漿粘度、紅細胞壓積顯著降低，纖維蛋白元含量明顯下降，并使甘油三酯含量和β-脂蛋白含量明顯降低，但對膽固醇作用不明顯；(4).對心血管系統(tǒng)的作用30g/kg水蛭素腹腔注射，有明顯增加小鼠心肌營養(yǎng)性血流量的作用。水蛭對家兔主動脈粥樣硬化斑塊有明顯的消退作用，斑塊內膠原纖維增生，膽固醇結晶減少，說明水蛭對防止動脈粥樣硬化有潛在應用價值。水蛭注射液2g/kg耳緣靜脈注射，連續(xù)7天，對家兔實驗性腦血腫模型可顯著抑制血腫壓迫刺激所致腦組織炎性細胞浸潤面積和腦細胞形成實質細胞壞死的范圍，并有促進腦血腫吸收趨勢。因而緩解顱內壓升高。
生地(1).對心血管系統(tǒng)的影響用北京野生地黃制成流浸膏，經實驗證明對蛙心的收縮力有明顯的增強作用，對衰弱的心臟更顯著。但大量能使正常蛙心中毒。用70％懷地黃的乙醇提取物、水提取物給大白鼠實驗性腎性高血壓有明顯的降血壓、改善腎功能、降低病死率的作用。懷地黃水、醇、醚提取液分別給大鼠腹腔注射，用頸總動脈直接測血法，觀察對血壓的影響，結果表明水提取液對急性實驗性高血壓有明顯降壓作用。而醇、醚提取液對高血壓沒有明顯影響，對寒冷(室溫23攝氏度)情況下的血壓則有穩(wěn)定作用。
地龍(1).降壓作用廣地龍熱浸液和乙醇浸出液靜注，對麻醉犬均有顯著降壓作用；給正常大鼠和腎性高血壓大鼠灌胃，亦呈現(xiàn)顯著的降壓作用。地龍B1(除去6-羥基嘌呤的地龍水溶性半純品)灌胃，對正常大鼠和腎性高血壓大鼠也有降壓作用。地龍降壓作用部位在脊髓以上的中樞部分，或直接通過某些內感受器反射地影響中樞神經系統(tǒng)引起部分內臟血管的擴張，從而降低血壓。將溶栓丸(地龍干燥粉末)水浸液給麻醉兔靜注，血壓先輕度上升，隨后下降，維持1～2小時；又大鼠靜注地龍煎劑0.25g/kg，血壓立即下降；與靜注血小板活化因子(PAF)0.25g/kg的降壓過程相似；預先靜注特異性血小板活化因子受體阻斷劑CV6209，則顯著拮抗地龍和PAF的降壓作用。故認為PAF是地龍的重要將壓成分；現(xiàn)從地龍脂質中分離到這種PAF，含量約90～130μg/g。給易卒中自發(fā)性高血壓鼠(SHRSP)喂飼地壟飼料，可降低SHRSP血壓，并對卒中危險因素有預防作用。
(2).抗心律失常作用地壟注射液對氯仿-腎上腺素、烏頭堿、氯化鋇、唑巴因4種方法造成的心律失常有明顯對抗作用，并有抑制心臟傳導作用。
陳皮(1).對心臟的作用陳皮煎劑、醇提取物及橙皮甙均能興奮離體及在位蛙心。橙皮甙靜脈注射，能使在位兔心收縮力加強，輸出量增加，而心率變化不大。陳皮煎劑能擴張冠脈。大劑量的甲基橙皮甙40mg/kg，能使冠脈阻力下降，冠脈流量增加，降低血壓，減慢心率，這種作用可持續(xù)30分鐘以上，但對心肌耗氧量及心肌氧利用率無明顯影響。
(2).對血管與血壓的作用陳皮煎劑給兔和狗靜脈注射后血壓迅速升高，還可使犬腎容積減少，腎血管收縮，尿量減少。橙皮甙對麻醉貓的周圍血管有短暫而明顯的擴張作用，但不含氧化物的純品則無效。6-二乙胺基甲基陳皮甙，具有降低冠脈毛細血管脆性的作用。靜脈注射陳皮水溶性注射液0.5ml，在3秒內麻醉大鼠血壓上升(由70～80mmHg上升至130～150mmHg)，維持約3～4秒漸復正常，再次給藥仍出現(xiàn)升壓反應；對麻醉全優(yōu)生要反應。
半夏對循環(huán)系統(tǒng)的作用實驗證明，半夏對離體蛙心和兔心有抑制作用，但對豚鼠離體心臟無明顯影響。半夏給大鼠和犬靜脈注射有一過性的降壓作用，如反復給藥則產生快速耐藥性。半夏煎劑對犬室性心動過速及室性早搏的模型有明顯的抗心律失常的作用。
沈俞鋼等研究表明，具有益氣補腎，活血通絡功效的中藥“益氣通絡丹”能提高冠心病患者血液超氧化物歧化酶(SOD)和NO水平，因而具有良好的治療冠心病作用。丘瑞香等研究“心脈通”膠囊對冠心病患者血管活性性因子調節(jié)作用中發(fā)現(xiàn)其主要成分人參、三七、大黃，降脂作用。能抑制ET釋放，降低ET血漿含量，是一種良好的血管活性因子調節(jié)劑，對血管內皮細胞起保護作用。雷燕等研究表明，主要由紅參、三七組成的“愈心痛”膠囊在明顯降低麻醉犬急性心肌缺血時血漿ET水平的同時，又能提高其NO水平，說明“愈心痛”膠囊能抑制ET的釋放，促進NO生成和釋放，從而實現(xiàn)對缺血心肌的保護作用。王智等給58例冠心病心絞痛患者靜點參麥注射液，兩周后其血液NO水平較治療前顯著升高[14]。譚效澤[15]等用中藥“活血保心沖劑”治療冠心病心絞痛120例，發(fā)現(xiàn)其能顯著升高患者血漿NO合成酶和NO水平，提示“活血保心沖劑”是通過調節(jié)冠心病患者的心血管舒縮因子而發(fā)揮治療作用。謝燕華等“通脈散”治療冠心病心絞痛臨床和實驗研究表明，“通脈散”由三七、乳香、延胡、冰片等10余味中藥組成，具有行氣寬胸、活血止痛、方香溫通之功能。本方活血不破血，行氣不耗氣，溫通而不辛燥。使ET降低，降低血粘度，改善心肌缺血和臨床癥狀。魏紅磊等“保丹飲”顆粒治療冠心病臨床效應比較研究，由生黃芪、黨參、丹參、麥冬、檀香、砂仁、石菖蒲等具有降低ET，有良好的抗心肌缺血作用。陳山泉“血府逐瘀湯”治療冠心病心膠痛臨床研究，結果顯示，可使ET顯著下降，機理是通過中藥作用于平滑肌細胞和心肌細胞，使其合成或分泌ET減少，緩解冠脈痙攣，改善心肌缺血。
實施例1本發(fā)明一種保護血管內皮細胞功能的中藥復合物，該中藥復合物以下述重量的藥物為主要原料地龍20g、水蛭15g、陳皮15g、半夏15g，將上述中藥原料用自來水浸泡半小時，經文火煎3次，每次煎煮一下時，將每次煎得的藥汁合并，用紗布過濾，過濾后用100℃水浴濃縮至100ml的藥液即得。藥材配方中的地龍對心的收縮力有明顯的增強作用，對衰弱的心臟更顯著，水蛭有抗凝血作用，陳皮煎劑能擴張冠脈。大劑量的甲基橙皮甙40mg/kg，能使冠脈阻力下降，冠脈流量增加，降低血壓，減慢心率，這種作用可持續(xù)30分鐘以上，半夏煎劑對犬室性心動過速及室性早搏的模型有明顯的抗心律失常的作用。這幾種藥材合用后可以更好的保護血管內皮、增強心肌功能，達到治療冠心病的目的。
實施例2本發(fā)明中藥復合物以下述重量的藥物為主要原料地龍20g、水蛭15g、丹參20g、陳皮15g、黃芪50g、全蝎15g、生地15g、陳皮15g、半夏15g、白術20g，將上述中藥原料用自來水浸泡半小時，經文火煎3次，每次煎煮一下時，將每次煎得的藥汁合并，用紗布過濾，過濾后用100℃水浴濃縮至100ml的藥液即得。
本發(fā)明制得的中藥復命物與西藥對比實驗如下(一).取對比的用的各藥物1.取本發(fā)明實施例1、2制得的中藥復合物藥液；2.西藥合心爽片，30mg/片，由天津田邊制藥廠提供；3.試劑地高辛-dUTP標記試劑盒購自德國Boehringer Mannhein公司；SDS、蛋白酶K、去離子甲酰胺、鮭精DNA等購自華美生物醫(yī)學公司；甘胺酸、Triton-100、多聚甲醛、左旋米唑均為Sigma產品；ET、NO、NOS、ECE原位雜交試劑盒均由北京邦定泰克生物技術有限公司提供，NOS、ECE基因探針其片段長度分別為1.1kb和660bp，按地高辛試劑盒說明書隨機引物法標記探針。
(二).實驗方法(1).實驗分組健康白兔40只，雌雄兼用，隨機分為5組。①空白對照組用生理鹽水3ml/kg；②模型組用生理鹽水3ml/kg；③本發(fā)明制備的活心湯組低劑量組相當于生藥量8.21g/kg；④本發(fā)明制備的活心湯組高劑量組相當于生藥量32.84g/kg；⑤西藥組合心爽2.82mg/kg，上述藥物在試驗前用生理鹽水制成等體積(3ml/kg)混懸液備用，然后對動物進行造模，灌胃給藥。中藥組、西藥組、模型組連續(xù)給藥6天，未次給藥后1小時，冠狀動脈結扎復制心肌缺血模型。
(2).動物造模取兔用戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔麻醉固定于手術臺，無菌操作，在胸骨左緣旁縱行切開3根肋骨，暴露心臟，剪開心包膜，以分離冠狀動脈左前降支為標志。于左心耳根部下方2cm處進針，絲線穿過心肌表層在肺動脈圓錐出針，將直徑2mm的塑料管置于結扎線與血管之間，拉緊結扎線，使塑料管壓迫血管引起冠脈閉塞，造成心肌缺血。
(3).觀測指標及測定方法a.血清NO的測定采用比色法，分別于結扎冠狀動脈15分鐘(結扎前)和結扎后60分鐘，抽血4ml用其中2ml血1500rpm離心10分鐘，分離血清，-30℃凍存。在酶標儀570nm測定樣品吸光值，以亞硝酸鈉為標準品，按標準曲線，可以間接測定NO濃度。
操作表

混勻，37℃準確水浴60分鐘

充分旋渦混勻30秒，室溫靜置10分鐘，3500-4000轉/分，離心10分鐘，取上青顯色。

混勻，室溫靜置10分鐘，蒸餾水調零，550nm，0.5cm光徑，測各管吸光度值。
計算公式NO含量(umo/l)＝測定管吸光度-空白管吸光度/標準吸光度-空白吸光度X標準品濃度X樣品測試前稀釋倍數b.血漿ET的測定采用放射免疫法測ET。具體操作如下取靜脈血2ml，注入含10％EDTA二鈉3μl和抑肽酶40μl的試管中，混勻，4℃，3000rpm離心10min，分離血漿，測定前，使樣本置于室溫或冰水中復融，再次4℃，3000rpm，離心5min，，取上清測定。按下表操作ET RIA力液程序(μl)

以B/T計算NSB，SO結合百分率，以B/BO計算標準及待測樣品結合百分率，在半對數坐標紙上繪制標準曲線，并查出樣品值，或由自動γ計數器預先編制程序，直接給出有關參數，標準曲線及樣品濃度。
c.血清一氧化氮合酶(NOS)的測定采用比色法測定NOS，試劑組成與配制試劑一底物緩沖液6ml×2瓶，-20℃以下避光冷凍保存。臨用前化凍搖勻。試劑二促進劑淡黃色或白色粉劑×3支，稀釋液0.6ml×3支。測試前取稀釋液一支0.6ml加入一支粉劑中充分混勻，然后剩余的試劑可放入-20℃以下冷凍保存，時間不超過一周。試劑三黃色顯色劑6ml×1瓶，4℃避光冷藏保存。試劑四透明劑60ml×2瓶，室溫保存。試劑五終止劑60ml×2瓶，4℃保存。具體操作如下樣本和試劑從冰箱中取出，37℃水浴3分鐘

混勻，37℃水浴準確反應5分鐘


混勻，530nm處，1cm光徑，蒸餾水調零，測各管吸光度值。酶活性意義每毫克組織蛋白每分鐘生成的1nmolNO為一個活性單位。
計算公式為總NOS活力(U/ML)＝總NOS測定管OD值-空白管OD值/呈色物納摩爾消光系數X反應液總體積/取樣量X1/比色光徑X反應時間÷1000＝總NOS測定管OD值-空白管OD值/38.3*10-6X2.41+30×1/15÷1000d.原位雜交結扎冠脈后2小時，立即取下兔心臟，冰生理鹽水洗去殘血，采用兔的心臟標取缺血區(qū)和非缺血區(qū)心肌組織約0.5cm大小，液態(tài)氮凍存，原位雜交前于室溫下復溫后，作5-6um厚連續(xù)冰凍切片，將其貼于有0.1％多聚賴氨酸的載波片上，曬干，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。原位雜交冰凍切片用4％多聚甲醛溶液固定5分鐘，乙醇脫水，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)和0.1NHCL液室溫下作用各10、20分鐘，蛋白酶K(lug/ml)消化15分鐘，2×標準枸櫞酸鹽水洗(SSC)5分鐘，4％多聚甲醛后固定10分鐘，PBS洗15分鐘，每張切片上滴加預雜交液50ul，42℃預雜交2小時；棄取預雜交液，每片滴加40ul雜交液于濕盒中42℃過夜，次日經6×SSC，45％甲酰胺，2×SSC各洗片2次，每次15分鐘，BufferI浸泡1分鐘，BufferII浸泡30分鐘，再次BufferI浸泡1分鐘，滴加BufferI稀釋的抗體結合物(1∶2500)，室溫反應30分鐘，BufferI洗15分鐘，共2次，再用BufferIII平衡2分鐘；加入顯色液避光顯色6小時，以TE液終止反應后脫水，固封，核酸雜交陽性物呈紫蘭色。用無探針和RNAseA處理作為陰性對照。
e.免疫組化染色(1)冰凍切片以95％乙醇固定1min，吹干；(2)1.4％牛血清封閉，濕盒中37℃，60min，PBS洗；(3)滴加I抗，為抗兔NOS血清，濕盒中37℃，60min，PBS洗；(4)滴加1∶1000II抗，濕盒中37℃，60min，PBS洗；(5)DAB顯色10min，封片，鏡檢?？乖栃孕盘枮榧毎麧{內呈蘭色顆粒，以正常兔血清代替I抗作陰性對照。正常對照組用非缺血區(qū)心肌組織切片。
f.圖象分析用聯(lián)有NIKON光學顯微鏡的8520型自動圖象分析儀原位定量測量各組心肌組織的NOS陽性反應顆粒面積百分比和光密度值(OD)。每1動物取1張切片，每片隨機取3個視野，各組織塊全部測得一均值，用F檢驗進行統(tǒng)計學處理。
(四).數據處理結果用X±SD表示，顯著性比較采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包，采用方差分析和q檢驗。相關性采用直線相關分析。
實驗結論(1).心電圖冠脈結扎前描記到正常心電圖，ST段位于等電位線，結扎冠狀動脈后可見ST段弓背上抬，T波逐漸高聳，整個缺血期缺血性ST-T變化非常明顯，表明家兔急性心肌缺血模型造成，見圖1、2。
(2).本發(fā)明藥物活心湯對兔心肌缺血的血清NO的含量變化的影響本實驗采用比色法測定血清NO的含量，結果表明模型組結扎冠脈左前降支缺血模型NO含量為86.23±17.73umo/l，空白對照組NO含量為140.31±13.36umo/l，與空白對照組比較P＜0.01有顯著性差別。低劑量中藥組NO含量為105.40±25.24umo/l，高劑量中藥組NO含量為134.65±8.62umo/l，低劑量和高劑量中藥組與模型組比較均有顯著性差異P＜0.01。西藥組NO含量為138.20±33.60umo/l，西藥組與模型組對比，P＜0.05有顯著性差異。中藥與西藥組之間無顯著性差異，P＞0.05。低劑量組與高劑量組之間無顯著性差異，P＞0.05.，但高劑量組效果好于低劑量組。存在量效關系。
此結果表明本發(fā)明的中藥活心湯能明顯地提高缺血心肌的一氧化氮水平。(見表1)表1HXHY處理兔心肌缺血一氧化氮(NO)變化(x±SD)

▲P＜0.05與模型組比較▲▲P＜0.01與模型組比較(3).本發(fā)明中藥藥液對兔心肌缺血的血漿ET含量變化的影響本發(fā)明實驗采用放射免疫方法測定血獎ET的含量，結果表明模型組結扎冠脈左前降支缺血模型ET的含量為311.41±12.57ng/l，空白對照組ET的含量為100.08±4.23ng/l，與空白對照組比較P＜0.01有顯著性差別。說明模型造摸成立。應用低劑量本發(fā)明中藥組后ET的含量168.03±26.02ng/l，高劑量中藥組ET的含量為127.85±13.35ng/l，本發(fā)明低劑量和高劑量中藥組與模型組比較均有顯著性差異P＜0.01。西藥組ET的含量為153.37±24.58ng/l，西藥組與模型組比較均有顯著性差異P＜0.01，本發(fā)明中藥與西藥組之間無顯著性差異，P＞0.05，本發(fā)明中藥低劑量組與高劑量組之間無顯著性差異，P＞0.05。但高劑量組效果好于低劑量組。存在量效關系。
此實驗結果表明本發(fā)明中藥活心湯能明顯地抑制缺血心肌的內皮素釋放。(見表2)表2HXHY處理兔心肌缺血內皮素(ET)變化(x±SD)

▲P＜0.05與模型組比較▲▲P＜0.01與模型組比較(4).本發(fā)明中藥藥液對兔心肌缺血的血漿NOS含量變化的影響本實驗結果表明模型組結扎冠脈左前降支缺血模型組NOS含量為8.44+0.87U/ml，空白對照組NOS含量為26.36+3.07U/ml，與空白對照組比較P＜0.01有顯著性差別。心肌缺血模型成立。低劑量中藥組NOS含量為18.92+1.21U/ml，高劑量中藥組NOS含量為22.01±1.39U/ml，低劑量和高劑量中藥組與模型組比較均有顯著性差異P＜0.01，西藥組NOS的含量為23.93+1.76U/ml，西藥組與模型組比較均有顯著性差異P＜0.01，低劑量組與高劑量組之間無顯著性差異，P＞0.05。但高劑量組效果好于低劑量組。存在量效關系。
此結果表明本發(fā)明中藥活心湯能明顯地提高缺血心肌的NOS水平。(見表3)表3HXHY處理兔心肌缺血一氧化氮合成酶(NOS)變化(X±SD)

▲P＜0.05與模型組比較▲▲P＜0.01與模型組比較(5).本發(fā)明中藥活心湯對兔缺血心肌的NOSmRNA表達的影響在非缺血區(qū)心肌細胞可見大量的NOSmRNA表達的紫蘭色的陽性反應顆粒分布在胞漿中，由于顆粒密集，使整個細胞成蘭色模型組缺血心肌組織NOSmRNA表達量較少，且范圍局限，本發(fā)明活心湯大劑量組NOSmRNA蘭色雜交顆粒密布于心肌胞漿內，西藥組表達也較豐富。原位雜交結果心肌缺血時NOS呈表達下降，用本發(fā)明中藥活心湯后NOS表達升高。
此結果表明本發(fā)明中藥活心湯能明顯地提高缺血心肌的NOS mRNA的表達水平，見圖3a、圖3b、圖3c、圖3d。
(6).本發(fā)明中藥活心湯對兔缺血心肌的ECE mRNA表達的影響以地高辛標記的ECE探針與心肌組織mRNA原位雜交，陽性雜交信號為深蘭色細顆粒狀，均位于胞漿內，主要分布在胞核周圍。模型組缺血心肌組織ECE呈高度表達，細胞漿內可見大量的細密蘭色顆粒，而本發(fā)明活心湯大劑量組可見雜交信號蘭色顆粒明顯低于模型組。西藥組的雜交信號蘭色顆粒明顯低于模型組。非缺血區(qū)心肌組織僅有少量的較弱的陽性雜交信號。原位雜交結果心肌缺血時ECE呈高度表達分布，用中藥活心湯后ECE表達降低，此結果表明本發(fā)明中藥活心湯能明顯地抑制缺血心肌的ECEmRNA表達，見圖4a、圖4b、圖4c、圖4d。
雜交前用RNaseA處理的心肌組織切片和未加探針的陰性對照組均未獲得陽性雜交信號，說明上述原位雜交是特異的。
(7).本發(fā)明中藥活心湯對ET免疫組化反應的影響光鏡下可見，非缺血區(qū)心肌細胞陽性免疫反應顆粒呈蘭色，位于細胞漿內，模型組缺血心肌細胞內顆粒明顯增多，本發(fā)明活心湯組明顯低于模型組，西藥組性免疫反應顆粒亦低于模型組，見圖5a、圖5b、圖5c、圖5d。
(8).本發(fā)明中藥活心湯對NOS免疫組化反應的影響光鏡下可見，非缺血區(qū)心肌細胞大量陽性免疫反應顆粒呈蘭色，位于細胞漿內，模型組缺血心肌細胞內顆粒明顯減少，且染色較淺，本發(fā)明活心湯組高于模型組，西藥組性免疫反應顆粒亦高于模型組，見圖6a、圖6b、圖6c、圖6d。
(9).各組NOS免疫組化反應圖象分析結果見表4表4HXHY處理兔心肌缺血一氧化氮合成酶(NOS)陽性反應顆粒面積百分比和光密度值變化(x±SD)


▲▲P＜0.01與模型組比較▲P＜0.05與模型組比較模型組缺血心肌NOS陽性顆粒面積百分比及光密度值均比非缺血區(qū)顯著減少(P＜0.01)，而各用藥組與模型組比較明顯增加，(P＜0.05；P＜0.01)，各用藥組之間無明顯差異。但高劑量組效果好于低劑量組。存在量效關系。10.心肌缺血組血漿ET和血漿中NO、NOS的關系見表5。從表5可見血漿ET與NO的相關系數r＝-0.917，呈負相關(P＜0.001)。ET與NOS的相關系數r＝-0.950，呈負相關(P＜0.001)。
表5心肌缺血組血漿ET與NO、NOS的相關性分析

注*為ET與NO的相關系數；△為ET與NOS的相關系數。
權利要求
1.一種保護血管內皮細胞功能的中藥復合物，其特征在于該中藥復合物主要包括下述重量份的藥物地龍2～4份、水蛭1～3份、陳皮1～3份、半夏1～3份，將上述各中藥原料用水浸泡后經文火煎3次，將每次煎得的藥汁合并，過濾后用100℃水浴濃縮后的藥液即得。
2.根據權利要求1所述的保護血管內皮細胞功能的中藥復合物，其特征在于上述中藥復合物中還包括如下重量份的藥物丹參2～4份、黃芪8～10份、生地1～3份、白術2～4份。
3.一種保護血管內皮細胞功能的中藥復合物的制備方法，其特征在于它按下述步驟進行a.按權利要求1配方的重量份取各藥物；b.將全部藥物用自來水浸泡半小時，用文火煎一小時，倒出藥汁，共煎3次，將藥汁合并；c.將所得藥汁用紗布過濾，過濾后用100℃水浴濃縮至100ml的藥液，即得成品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種保護血管內皮細胞功能的中藥復合物，該中藥復合物主要包括下述重量份的藥物地龍2～4份、水蛭1～3份、陳皮1～3份、半夏1～3份，將上述各中藥原料用水浸泡后經文火煎3次，將每次煎得的藥汁合并，過濾后用100℃水浴濃縮后的藥液即得。它的制備工藝按下述步驟進行a.上述配方的重量份取各藥物；b.將全部藥物用自來水浸泡半小時，用文火煎一小時，倒出藥汁，共煎3次，將藥汁合并；c.將所得藥汁用紗布過濾，過濾后用100℃水浴濃縮至100ml的藥液，即得成品。本發(fā)明很好的解決采用西藥針對冠心病急性心肌缺血的防治，存在毒副作用較大的缺點，而現(xiàn)在沒有很好用于治療的中藥復合物等方面存在的問題。
文檔編號A61K35/56GK1876078SQ20061004638
公開日2006年12月13日 申請日期2006年4月25日 優(yōu)先權日2006年4月25日
發(fā)明者宮麗鴻 申請人:宮麗鴻