專利名稱：一種高效免疫活性細(xì)胞群制備及用于抗腫瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。特別涉及一種抗腫瘤免疫活性細(xì)胞-寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞群的制備方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是當(dāng)前危害人類健康的主要疾病之一，在傳染病得到控制的國(guó)家，心腦血管疾病和惡性腫瘤已分別成為死亡原因的第一和第二位。2005年統(tǒng)計(jì)，我國(guó)城市居民死亡第一位是惡性腫瘤，是農(nóng)村居民的第二位死因。
在腫瘤的治療方法中，免疫治療已經(jīng)成為手術(shù)治療、化療和放療之外，最重要、最有希望的治療手段。在過(guò)去的20多年里，腫瘤特異性主動(dòng)免疫治療和過(guò)繼性免疫治療兩個(gè)方面都有很大的發(fā)展。在腫瘤過(guò)繼免疫治療中，先后出現(xiàn)了五種引人注目的免疫效應(yīng)細(xì)胞淋巴因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(LAK細(xì)胞)(Rosenuberg SA，et al，1985)；腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL細(xì)胞)(Itohk，etal，1988)；抗白細(xì)胞分化抗原-3單克隆抗體(CD3單抗)和白細(xì)胞介素-2誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(AK-T細(xì)胞)(Uberti JP，et al，1994)；細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL細(xì)胞)(Aruga A，et al，1991)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)(Schmidt-wolfIGH，et al，1991)。LAK細(xì)胞增殖性能不理想和細(xì)胞毒活性較低且維持時(shí)間較短而漸被淘汰。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，從理論上看最被看好的免疫效應(yīng)細(xì)胞，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞但目前尚無(wú)有效的擴(kuò)增手段，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞來(lái)源受限。白細(xì)胞介素-2誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞都是用抗CD3單抗為刺激因子激發(fā)T淋巴細(xì)胞增殖，具相同的增殖活性。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞還有賴于其他細(xì)胞因子的參與，故細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞比白細(xì)胞介素-2誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞有更強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。但是，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞和白細(xì)胞介素-2誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞及LAK細(xì)胞一樣，也不具備特異性識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的特性。
在眾多腫瘤腫瘤特異性免疫治療方法中，樹突狀細(xì)胞作為新一代疫苗的研究和應(yīng)用，成為近年來(lái)主動(dòng)免疫治療研究中的熱點(diǎn)，DC是已知的最主要的抗原提呈細(xì)胞，具有捕獲、加工處理抗原和向T淋巴細(xì)胞提呈抗原分子，表達(dá)共刺激分子，釋放細(xì)胞因子和白細(xì)胞介素等特性。因此，DC在腫瘤免疫應(yīng)答中起主要免疫調(diào)節(jié)作用。
當(dāng)DC與CIK共培養(yǎng)時(shí)，彼此能相互作用而誘導(dǎo)出比CIK細(xì)胞有更強(qiáng)增殖活性，更高的腫瘤細(xì)胞殺傷活性的細(xì)胞群。(Marten A et al，2001)，國(guó)內(nèi)徐永華等研究用腫瘤抗原沖擊樹突狀細(xì)胞后，與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)獲得DCIK細(xì)胞毒性比CIK高出10-20％。
近年來(lái)的研究表明，細(xì)菌的CpG-ODN可以激活機(jī)體多種免疫細(xì)胞，誘生多種細(xì)胞因子，可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答向Th1型轉(zhuǎn)化，并且人工合成的CpG寡核苷酸(CpG-oligodeoxy nucleotides，CpG-ODN)也可模擬上述反應(yīng)。CpG-ODN與抗原刺激的DC細(xì)胞共同注射到患結(jié)腸癌的鼠體內(nèi)，可明顯提高DC的抗瘤活性，并且全身給藥抑制腫瘤生長(zhǎng)能力比5-FU和甲酰四氫葉酸強(qiáng)(Sipos B，Sting G，2002)，但是，寡核苷酸直接體內(nèi)注射需要?jiǎng)┝枯^大而且連續(xù)注射一周有組織壞死，出血等副作用。
腫瘤抗原沖擊的DCIK細(xì)胞的制備必須要經(jīng)過(guò)手術(shù)等方法取得新鮮腫瘤組織標(biāo)本來(lái)提取抗原，而臨床上相當(dāng)部分病人喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，以及經(jīng)過(guò)放化療后的病人，難于獲取腫瘤抗原。而且為誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫效果大劑量注射CpG-ODN，副作用也較大。因此，改善現(xiàn)有技術(shù)中抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞在增殖性能和細(xì)胞毒活性以及對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性識(shí)別和攻擊活性的不足，從而開發(fā)出一種新的抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞及其制備方法，稱為現(xiàn)實(shí)的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高表達(dá)CD3-CD56、增殖活性高、釋放細(xì)胞因子量大、細(xì)胞毒活性高的高效免疫活性細(xì)胞寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)所獲得的高效免疫活性細(xì)胞群制備及用于抗腫瘤的方法。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是，在Maten，Peter，Sipos及徐永華等人研究的基礎(chǔ)上，分別用細(xì)胞因子誘導(dǎo)樹突細(xì)胞和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，在原有樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)中，加入人工合成的寡核苷酸2006誘導(dǎo)樹突細(xì)胞，然后與同源細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞混合培養(yǎng)，得到一種新的免疫效應(yīng)細(xì)胞群，定名為寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)所獲得的免疫細(xì)胞群。
由于寡核苷酸能夠增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的抗原提呈能力，促進(jìn)樹突狀的功能成熟，而樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)可以顯著提高細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞毒活性，故采用體外寡核苷酸聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞，然后與同源細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)，以獲得增殖活性和細(xì)胞毒活性更強(qiáng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞群。這對(duì)于喪失手術(shù)時(shí)機(jī)以及并稱晚期等各種原因難于獲取病人腫瘤抗原的病例，同樣可以誘導(dǎo)和擴(kuò)增出較高抗癌活性的免疫細(xì)胞群。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案，步驟是(1)外周血單個(gè)核細(xì)胞的制備取腫瘤病人抗凝外周血20-50ml，用生理鹽水對(duì)倍稀釋后，用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，分離所用離心機(jī)之轉(zhuǎn)頭為水平轉(zhuǎn)頭，離心速度為2000rpm，離心20分鐘，然后用Hanks平衡液洗滌2-3次再進(jìn)行顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，最后用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液F12/DMEM11或者AIM-V調(diào)節(jié)細(xì)胞密度秤3-5×10-6/ml的細(xì)胞懸液。
(2)外周血淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞的分離將前述細(xì)胞懸液移入6孔板，每孔3-5ml，置37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱溫育2-3小時(shí)，然后用移液管輕輕沖洗細(xì)胞，將非黏附PBL懸液收集在50ml離心管中，田孔板留下的粘附細(xì)胞作誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞用。
(3)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增在上述外周血淋巴細(xì)胞懸液中添加重組人干擾素，終濃度為1000單位/毫升，然后移入表面積為75平撹厘米的培養(yǎng)瓶中，每瓶裝量20毫升，置于37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中溫育24小時(shí)，然后添加CD3單抗、白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-2，終濃度分別為50納克/毫升、100微克/毫升和800單位/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后用細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)解細(xì)胞濃度為2×10-6/毫升，分配到75平方厘米培養(yǎng)瓶中，每瓶20毫升，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)液為完全F12/DMEM11，或者AIM-V，含白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-2。此后，每瓶48-72小時(shí)按上述相同條件擴(kuò)大培養(yǎng)一次。培養(yǎng)至第8天收集細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞待用。
(4)樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增在前述留有粘附細(xì)胞的6孔板中，每孔加入樹突細(xì)胞培養(yǎng)液3毫升。樹突細(xì)胞培養(yǎng)液為重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白介素-4，終濃度分別是1000單位/毫升和500單位/毫升。置于6孔板與37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，然后在各孔中加入寡核苷酸2006，終濃度3微摩爾/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)，至第5天，加入腫瘤壞死因子，終濃度為100單位/毫升。培養(yǎng)至第8天，用移液管沖洗和收集非粘附和半粘附樹突細(xì)胞待用。
上述寡核苷酸2006為人工合成的寡核苷酸，其序列為5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’，整個(gè)序列硫代化修飾，其中的CpG基序均為去甲基化的，合成及稀釋過(guò)程均要求無(wú)菌。
(5)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)制備寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的免疫細(xì)胞群細(xì)胞細(xì)胞將經(jīng)過(guò)寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的免疫細(xì)胞群誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)，離心棄上清后，分別用細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為6×10-5/ml和2×10-5/ml。等體積混合后移入75平方厘米培養(yǎng)瓶中，每瓶20ml，每隔48-72小時(shí)按以上細(xì)胞密度分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)一次。
以上制備過(guò)程中所用吸管和離心管為聚丙烯材料，6孔板和培養(yǎng)瓶為聚苯乙烯材料。此外，若改用其他規(guī)格培養(yǎng)器皿，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)面積大小調(diào)整上述細(xì)胞懸液接種量，細(xì)胞接種密度調(diào)整到2-5×10-6/ml。
使用高效免疫活性細(xì)胞群用于抗腫瘤的方法，裸鼠右耳皮下接種人源前列腺癌細(xì)胞Alva411×10-7/只，一周后成瘤率100％，14天后會(huì)陰部轉(zhuǎn)移100％，開始連續(xù)腹腔接種寡核苷酸誘導(dǎo)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞懸液2-3×10-8/只/次，隔日一次，共4次，至35天，生理鹽水對(duì)照組生存率0％(0/4)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞治療組20％(1/5)，樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞治療組50％(3/6)，寡核苷酸誘導(dǎo)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞群治療組為70％(6/8)，而寡核苷酸誘導(dǎo)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞組瘤重明顯小于細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞組瘤重。與樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞組瘤重差異不明顯。
本發(fā)明的有益效果是，上述共培養(yǎng)得到的寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的免疫細(xì)胞群細(xì)胞與淋巴因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞、細(xì)胞一樣為非均質(zhì)細(xì)胞群，其主要生物學(xué)特性有1.細(xì)胞組成寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的免疫細(xì)胞群的細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞占98％以上和少量樹突細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞中個(gè)亞群所占比例具有個(gè)體差異和印體外培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短而有一定變化范圍。一般為CD3+CD4+T細(xì)胞20-40％，CD3+CD8+T細(xì)胞50-80％，CD3+CD56+T細(xì)胞20-60％。
2.增殖活性高寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的免疫細(xì)胞群的增殖活性比同源樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)的免疫細(xì)胞群和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞強(qiáng)大。體外擴(kuò)增3周后，寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的免疫細(xì)胞群比同源樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)的免疫細(xì)胞群和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞分別大1-1.5倍和4-8倍。
3.釋放細(xì)胞因子量大寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的免疫細(xì)胞群釋放干擾素的量是同源細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的3-6倍，是同源樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)的免疫細(xì)胞群細(xì)胞的0.5-1倍。
4.細(xì)胞毒活性高與同源細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞組比較寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的免疫細(xì)胞群組體外對(duì)特異靶細(xì)胞的殺傷作用高出20-30％，略高于同源樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)的免疫細(xì)胞群，人癌動(dòng)物模型治療試驗(yàn)表明，較寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的免疫細(xì)胞群組動(dòng)物的平均存活期是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞組動(dòng)物的3倍，是同源樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞群組動(dòng)物的0.5倍。
樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子共培養(yǎng)免疫細(xì)胞群主要用于自體瘤的治療，術(shù)后即時(shí)施治有效防轉(zhuǎn)移防復(fù)發(fā)。也能夠作為化療的輔助治療，此外，寡核苷酸有道德樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)所獲得的免疫細(xì)胞群也能夠用于某些傳染性疾病的免疫治療。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
1.外周血單個(gè)核細(xì)胞的制備取腫瘤病人抗凝外周血35ml，生理鹽水對(duì)倍稀釋后，用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，分離所用的離心機(jī)轉(zhuǎn)頭為水平轉(zhuǎn)頭，離心速度為2000rpm，離心20分鐘。然后用Hanks平衡液洗滌PBMC2次，再進(jìn)行顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，最后用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液完全F12/DMEM11或者AIM-V調(diào)節(jié)細(xì)胞密度成4×10-6/ml的細(xì)胞懸液。
2.外周血淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞的分離將細(xì)胞懸液移入6孔板，每孔加4ml，置37C，5％CO2飽和濕度培箱溫育2.5小時(shí)，然后用移液管輕輕沖洗細(xì)胞，將非粘附外周血淋巴細(xì)胞懸液收集在50ml離心管中，6孔板中留下的粘附細(xì)胞作誘導(dǎo)樹突細(xì)胞用。
3.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增在上述外周血淋巴細(xì)胞懸液中添加重組人干擾素終濃度為1000u/ml，然后移入表面積為75平方厘米的培養(yǎng)瓶中，每瓶裝量20毫升，置于37C，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中溫育24小時(shí)。之后，每瓶添加鼠抗人CD3單克隆抗體，白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-2，終濃度分別為50ng/ml、100u/ml和800u/ml。繼續(xù)培養(yǎng)60小時(shí)后顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后用CIK細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為3×10-5/ml，分配到75平方厘米培養(yǎng)瓶中，每瓶20ml，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；CIK細(xì)胞培養(yǎng)液完全F12/DMEM11或者AIM-V，含IL-1，IL-2，濃度分別是100u/ml、800u/ml。此后，每隔60小時(shí)按上述相同條件擴(kuò)大培養(yǎng)一次。培養(yǎng)至第8天收集細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞待用。
4.樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增在前述留有粘附細(xì)胞的6孔板中，每孔加入樹突細(xì)胞培養(yǎng)液3毫升。樹突細(xì)胞培養(yǎng)液為重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白介素-4，終濃度分別是1000u/ml和500u/ml。置于6孔板與37C，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，然后在各孔中加入寡核苷酸2006，終濃度3微摩爾/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)，至第5天，加入腫瘤壞死因子，終濃度為100u/ml。培養(yǎng)至第8天，用移液管沖洗和收集非粘附和半粘附DC待用。
上述寡核苷酸2006為人工合成的寡核苷酸，其序列為5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3’，整個(gè)序列硫代化修飾，其中的CpG基序均為去甲基化的，合成及稀釋過(guò)程均要求無(wú)菌。
5.樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)制備寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)所獲得免疫細(xì)胞群。
將經(jīng)過(guò)寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)，離心棄上清后，分別用細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為6×7/ml和2×7/ml。等體積混合后移入75平方厘米培養(yǎng)瓶中，每瓶20ml，每隔60小時(shí)按以上細(xì)胞密度分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)一次。
使用高效免疫活性細(xì)胞群用于抗腫瘤的方法，裸鼠右耳皮下接種人源前列腺癌細(xì)胞Alva411×8/只，一周后成瘤率100％，14天后會(huì)陰部轉(zhuǎn)移100％，開始連續(xù)腹腔接種寡核苷酸誘導(dǎo)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞懸液2×8/只/次，隔日一次，共4次，至35天，生理鹽水對(duì)照組生存率0％(0/4)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞治療組20％(1/5)，樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞治療組50％(3/6)，寡核苷酸誘導(dǎo)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞群治療組為70％(6/8)，而寡核苷酸誘導(dǎo)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞組瘤重明顯小于細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞組瘤重。與樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞組瘤重差異不明顯。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤高效免疫活性細(xì)胞群的制備方法，其特征在于，步驟是(1)外周血單個(gè)核細(xì)胞的制備取腫瘤病人抗凝外周血20-50ml，用生理鹽水對(duì)倍稀釋后，用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，分離所用離心機(jī)之轉(zhuǎn)頭為水平轉(zhuǎn)頭，離心速度為2000rpm，離心20分鐘，然后用Hanks平衡液洗滌2-3次再進(jìn)行顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，最后用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度成3-5×10-6/ml的細(xì)胞懸液。(2)外周血淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞的分離將前述細(xì)胞懸液移入6孔板，每孔3-5ml，置37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱溫育2-3小時(shí)，然后用移液管輕輕沖洗細(xì)胞，將非黏附PBL懸液收集在50ml離心管中，田孔板留下的粘附細(xì)胞作誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞用。(3)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增在上述外周血淋巴細(xì)胞懸液中添加重組人干擾素，終濃度為1000單位/毫升，然后移入表面積為75平方厘米的培養(yǎng)瓶中，每瓶裝量20毫升，置于37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中溫育24小時(shí)，然后添加CD3單抗、白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-2，終濃度分別為50納克/毫升、100微克/毫升和800單位/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后用細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)解細(xì)胞濃度為2×10-6/毫升，分配到75平方厘米培養(yǎng)瓶中，每瓶20毫升，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液含完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白介素-1和白介素-2。此后，每瓶48-72小時(shí)按上述相同條件擴(kuò)大培養(yǎng)一次。培養(yǎng)至第8天收集細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞待用。(4)樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增在前述留有粘附細(xì)胞的6孔板中，每孔加入樹突細(xì)胞培養(yǎng)液3毫升。樹突細(xì)胞培養(yǎng)液為重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白介素-4，終濃度分別是1000單位/毫升和500單位/毫升。置于6孔板與37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，然后在各孔中加入細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液為完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-2。再加入寡核苷酸2006，終濃度3微摩爾/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)，至第5天，加入腫瘤壞死因子，終濃度為100單位/毫升。培養(yǎng)至第8天，用移液管沖洗和收集非粘附和半粘附樹突細(xì)胞待用。(5)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)制備寡核苷酸誘導(dǎo)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞群。培養(yǎng)液為完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-2。將經(jīng)過(guò)寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)，離心棄上清后，分別用細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為6×10-5/ml和2×10-5/ml。等體積混合后移入75平方厘米培養(yǎng)瓶中，每瓶20ml，置37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔48-72小時(shí)按以上細(xì)胞密度分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)一次，培養(yǎng)至2-3周單次或分次回輸體內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤高效免疫活性細(xì)胞群的制備方法，其特征在于，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液為完全F12/DMEM1∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤高效免疫活性細(xì)胞群的制備方法，其特征在于，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液為完全PRMI-1640。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤高效免疫活性細(xì)胞群的制備方法，其特征在于，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液為完全AIM-V。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤高效免疫活性細(xì)胞群的制備方法，其特征在于，樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增，在培養(yǎng)到第3天，加入寡核苷酸2006，其序列為5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’，整個(gè)序列硫代化修飾，其中的CpG基序均為去甲基化的，合成及稀釋過(guò)程均要求無(wú)菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤高效免疫活性細(xì)胞群的制備方法，其特征在于，所用吸管和離心管為聚丙烯材料，6孔板和培養(yǎng)瓶為聚苯乙烯材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤高效免疫活性細(xì)胞群的制備方法，其特征在于，細(xì)胞培養(yǎng)接種密度為2-5×10-6/ml。
8.使用權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤高效免疫活性細(xì)胞群的制備方法制備的高效免疫活性細(xì)胞群用于抗腫瘤的方法，其特征在于，裸鼠右耳皮下接種人源前列腺癌細(xì)胞Alva411×10-7/只，一周后成瘤率100％，14天后會(huì)陰部轉(zhuǎn)移100％，開始連續(xù)腹腔接種寡核苷酸誘導(dǎo)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞懸液2-3×10-8/只/次，隔日一次，共4次，至35天，生理鹽水對(duì)照組生存率0％(0/4)，細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞治療組20％(1/5)，樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞治療組50％(3/6)，寡核苷酸誘導(dǎo)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞群治療組為70％(6/8)，而寡核苷酸誘導(dǎo)樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞組瘤重明顯小于細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞細(xì)胞組瘤重。與樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞組瘤重差異不明顯。
全文摘要
一種高效免疫活性細(xì)胞群制備及用于抗腫瘤的方法屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。是利用寡核苷酸及細(xì)胞因子誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞，用細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞，然后將樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞按一定比例混合培養(yǎng)，得到一種新的免疫效應(yīng)細(xì)胞群寡核苷酸誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞群。這種細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞細(xì)胞和樹突細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)的免疫細(xì)胞群比較，增殖活性更強(qiáng)，細(xì)胞毒活性遠(yuǎn)高于細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞。寡核苷酸能夠人工合成，對(duì)喪失手術(shù)時(shí)機(jī)以及難以得到腫瘤抗原的病人同樣可以誘導(dǎo)和擴(kuò)增出遠(yuǎn)高于細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞的抗癌活性的免疫細(xì)胞群。適用于自體瘤治療、化療和放療的輔助治療。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1869206SQ200610046748
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月27日
發(fā)明者李麗, 夏元化, 安利佳 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)