專利名稱：一種新型真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程，特別是涉及一種真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
姬松茸(Agaricus blazei Murrill)是一種食藥兼用擔子菌，屬于蘑菇科，蘑菇屬，其子實體和菌絲體中含有多糖、植物凝集素、核酸-蛋白復合物、甾醇類物質(zhì)等生物活性物質(zhì)。目前，姬松茸多糖的研究大多以子實體多糖或液態(tài)培養(yǎng)的菌絲體多糖為主，而對其發(fā)酵液多糖研究較少。
姬松茸多糖的主要生物活性為免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性，是理想的藥品原料和功能性食品。但由于栽培條件要求高等因素，其子實體供應(yīng)量遠遠不能滿足市場需求。由于液態(tài)深層發(fā)酵具有生產(chǎn)周期短、可工廠化周年生產(chǎn)、便于管理等優(yōu)點，對于姬松茸還可以克服培養(yǎng)周期長達三個月左右、對溫濕度等栽培條件要求較為苛刻、而且固體栽培生物學效率低，產(chǎn)量不穩(wěn)，病蟲害發(fā)生較多等不利因素。因此，采用液態(tài)深層發(fā)酵的方法生產(chǎn)姬松茸多糖是解決之道。此法除可生產(chǎn)與姬松茸子實體營養(yǎng)價值相似的菌絲體外，還可獲得含有大量活性物質(zhì)的發(fā)酵液，其中豐富的多糖類物質(zhì)目前尚未進行充分研究。以發(fā)酵液中生物活性多糖為基礎(chǔ)生產(chǎn)的藥品、功能性食品將有巨大的市場潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的制備方法，利用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基對姬松茸菌株進行液體培養(yǎng)、胞外多糖分離、多糖純化、活性檢測。可以作為注射或口服免疫調(diào)節(jié)制劑的原料。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種新型真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的制備方法，其姬松茸液體培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基配方蔗糖2-6％，豆粕0.5-1.5％，麩皮0.1-0.5％，生長因子0.1％，pH5.0-6.5；培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25-32℃，搖床轉(zhuǎn)速100-160rpm，裝液量為25-100ml/250ml，培養(yǎng)時間5-7d。
如上所述的一種新型真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的制備方法，在利用發(fā)酵罐進行深層發(fā)酵時，以pH控制發(fā)酵有利于胞外多糖的生產(chǎn)；在罐壓0.3~0.5Mpa，攪拌速度60-100rpm，空氣流量0.4-1.0v/vmin，pH控制在5.0-6.5。
如上所述的一種新型真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的制備方法，依照上述方法制備的真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的結(jié)構(gòu)為分子中葡萄糖和甘露糖的比例為3∶1，其主鏈由3個葡萄糖分子通過β-(1→6)糖苷鍵連在一起，再以α-(1→6)或β-(1→6)與甘露糖連接而構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)如下
本發(fā)明的優(yōu)點與效果是本發(fā)明真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的制備方法，利用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基對姬松茸菌株進行液體培養(yǎng)、胞外多糖分離、多糖純化、活性檢測?？色@得含有大量活性物質(zhì)的發(fā)酵液、豐富的多糖類物質(zhì)。以發(fā)酵液中生物活性多糖為基礎(chǔ)生產(chǎn)的藥品、功能性食品將有巨大的市場潛力?？梢宰鳛樽⑸浠蚩诜庖哒{(diào)節(jié)制劑的原料。


圖1為本發(fā)明多糖水解液的高效液相色譜圖；圖2為本發(fā)明多糖的紅外光譜；圖3為本發(fā)明多糖的13C-NMR譜圖；圖4為本發(fā)明多糖的1H-NMR譜圖。
具體實施例方式
姬松茸液體培養(yǎng)或發(fā)酵培養(yǎng)基配方蔗糖2-6％，豆粕0.5-1.5％，麩皮0.1-0.5％，生長因子0.1％，pH5.0-6.5；最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25-32℃，搖床轉(zhuǎn)速100-160rpm，裝液量為25-100ml/250ml，培養(yǎng)時間5-7d。在此條件下，姬松茸菌絲體的生物量和胞外多糖產(chǎn)量分別可達14.2g/L、1.35g/L。
在進行發(fā)酵罐深層發(fā)酵時，以pH控制發(fā)酵有利于胞外多糖的生產(chǎn)。在罐壓0.3~0.5Mpa，攪拌速度60-100rpm，空氣流量0.4-1.0v/vmin，pH控制在5.0-6.5的條件下，生物量和胞外多糖產(chǎn)量分別可達23.9g/L、2.4g/L。
胞外多糖分離將姬松茸發(fā)酵液離心或過濾，除去菌絲體，發(fā)酵液減壓濃縮，加入冷乙醇沉淀，得出粗多糖。
多糖純化粗多糖經(jīng)過Sevag法脫蛋白、H2O2脫色、透析、DEAE-纖維素離子交換層析、Sephadex G-200凝膠過濾后，獲得純多糖。
如圖所示圖1由該多糖完全水解液的峰面積可知，該多糖分子中葡萄糖和甘露糖的比例約為3∶1。
圖2該多糖在3406.75cm-1處有吸收峰，是O-H鍵的伸縮振動，表明多糖存在分子內(nèi)和分子間的氫鍵；在2929.50cm-1處的強吸收峰表明分子中有糖類C-H鍵的伸縮振動；1647.38cm-1和1422.66cm-1處是多糖類的特征吸收峰；1149cm-1～1017cm-1之間的吸收峰是糖類C-O鍵的吸收峰；在810cm-1處有甘露糖的特征吸收峰；在749.99cm-1處有葡萄糖的特征吸收峰；573.70cm-1～416.56cm-1之間的吸收峰，尤其是416.56cm-1處的強吸收峰，是吡喃環(huán)碳骨架的吸收峰。930cm-1～950cm-1之間無吸收，890cm-1處有吸收，說明分子中有α型和β型糖苷鍵。
圖3共振信號主要化學位移小于5.0ppm，且化學位移大于5.0處也有吸收峰，表明分子中以β型糖苷鍵為主，也含有α型糖苷鍵。δ值在4.95ppm處、5.2～5.4ppm處有吸收峰，表明分子中有葡萄糖和甘露糖。
圖4δ值為100.3ppm、101.9ppm處有吸收峰，表明分子中含有葡萄糖和甘露糖；δ值為86.52ppm附近無吸收，表明無C3取代；δ在70～78ppm范圍內(nèi)有吸收，表明無C4取代；δ在60.6ppm、60.0ppm附近有吸收，表明不存在C6取代；而68.8ppm處的吸收峰是C6發(fā)生取代后的位移，表明分子中部分C6被取代，另一部分未被取代。
綜合以上單糖組分HPLC分析、紅外光譜分析和核磁共振分析結(jié)果，可知該多糖分子中葡萄糖和甘露糖的比例為3∶1，其主鏈由3個葡萄糖分子通過β-(1→6)糖苷鍵連在一起，再以α-(1→6)或β-(1→6)與甘露糖連接而構(gòu)成。
權(quán)利要求
1.一種新型真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的制備方法，其特征在于姬松茸液體培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基配方蔗糖2-6％，豆粕0.5-1.5％，麩皮0.1-0.5％，生長因子0.1％，pH5.0-6.5；培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25-32℃，搖床轉(zhuǎn)速100-160rpm，裝液量為25-100ml/250ml，培養(yǎng)時間5-7d。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的制備方法，其特征在于在利用發(fā)酵罐進行深層發(fā)酵時，以pH控制發(fā)酵有利于胞外多糖的生產(chǎn)；在罐壓0.3~0.5Mpa，攪拌速度60-100rpm，空氣流量0.4-1.0v/vmin，pH控制在5.0-6.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的制備方法，其特征在于依照上述方法制備的真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的結(jié)構(gòu)為分子中葡萄糖和甘露糖的比例為3∶1，其主鏈由3個葡萄糖分子通過β-(1→6)糖苷鍵連在一起，再以α-(1→6)或β-(1→6)與甘露糖連接而構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)如下
全文摘要
一種新型真菌胞外抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性多糖的制備方法，涉及一種生物工程，其姬松茸液體培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件為蔗糖2－6％，豆粕0.5－1.5％，麩皮0.1－0.5％，生長因子0.1％，pH5.0－6.5；培養(yǎng)溫度25－32℃，搖床轉(zhuǎn)速100－160rpm，裝液量為25－100ml/250ml，培養(yǎng)時間5－7d。利用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基對姬松茸菌株進行液體培養(yǎng)、胞外多糖分離、多糖純化、活性檢測?？色@得含有大量活性物質(zhì)的發(fā)酵液、豐富的多糖類物質(zhì)。以發(fā)酵液中生物活性多糖為基礎(chǔ)生產(chǎn)的藥品、功能性食品將有巨大的市場潛力?？梢宰鳛樽⑸浠蚩诜庖哒{(diào)節(jié)制劑的原料。
文檔編號A61P37/02GK1900299SQ20061004723
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日
發(fā)明者張卉, 孫麗霞, 陶明明 申請人:沈陽化工學院