專利名稱：瘢痕抑制復合膜劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥配制品，具體地說是一種適于減少瘢痕愈合的瘢痕抑制復合膜劑。
背景技術(shù)：
瘢痕組織一般被認為是人體創(chuàng)傷修復過程中的必然產(chǎn)物。它的形成與增生一直在困擾著人們。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，生活水平的提高，人們對美的要求也越來越高。如何盡可能地加快創(chuàng)面的愈合，最大限度地恢復組織原有的結(jié)構(gòu)和功能，是現(xiàn)代創(chuàng)傷修復研究的重點和難點。近年來，隨著胎兒外科基礎(chǔ)研究的發(fā)展，細胞外基質(zhì)成份在組織修復過程中對瘢痕形成的調(diào)控作用日益受到人們的關(guān)注。特別是胎兒創(chuàng)面細胞外基中高濃度、高分子量的透明質(zhì)酸對胎兒創(chuàng)傷無瘢痕愈合作用，越來越引起人們的重視。透明質(zhì)酸是一種線性多糖，是細胞外基質(zhì)中的重要組成成份，在傷口愈合過程中與靶細胞膜上的受體結(jié)合而發(fā)揮多種生物學作用。目前，它被認為是胎兒無瘢痕愈合的重要因素。本發(fā)明人曾研制了透明質(zhì)酸外敷膜，用于對外科手術(shù)切口愈合的影響的研究，發(fā)現(xiàn)其確有抑制瘢痕形成的作用，但也發(fā)現(xiàn)其有延緩傷口愈合的作用。另外，該外敷膜在術(shù)后3～5天時透明質(zhì)酸可保持較高的濃度，而隨著時間的延長以及表皮層的愈合，細胞排列也由疏松到緊密，透明質(zhì)酸滲透能力隨之減弱，其進入組織內(nèi)的含量也減少，加上透明質(zhì)酸在局部被內(nèi)源性透明質(zhì)酸酶所降解，導致傷口局部的透明質(zhì)酸有效量維持時間短，傷口無瘢痕愈合效果不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要提供一種抑制傷口瘢痕形成，促進傷口愈合的瘢痕抑制復合膜劑。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明復合膜劑它由以下重量份比的組分組成透明質(zhì)酸1份，表皮生長因子0.1～2份，成膜劑6～10份。
其中的成膜劑，可選用聚乙烯醇，也可選用羧甲基纖維素鈉。
本發(fā)明復合膜劑的優(yōu)選配方為透明質(zhì)酸1份，表皮生長因0.5-1份，成膜劑8-9份。
本發(fā)明復合膜劑制備方法為將透明質(zhì)酸、表皮生長因子、聚乙烯醇按所述份比稱取。先用無菌生理鹽水配制聚乙烯醇溶液，待完全溶解后，再分別放入表皮生長因子和透明質(zhì)酸，攪拌配制成凝膠，然后將凝膠平鋪于玻璃板上，置低溫干燥箱干燥后，在超凈臺內(nèi)切割成長5.5cm、寬1.0cm的膜。
本發(fā)明復合膜劑可用于各種原因造成的傷口愈合。
在使用時，一般可直接貼敷于傷口表面，對于有滲液的傷口也可直接貼敷。
本發(fā)明復合膜劑，具有良好的成膜性，可持續(xù)維持創(chuàng)面透明質(zhì)酸的作用，有效避免內(nèi)源性酶對透明質(zhì)酸和表皮生長因子的降解。同時，可模擬胎兒無瘢痕愈合時的濕潤環(huán)境。
本發(fā)明創(chuàng)新之處在于通過反復實驗篩選，選擇表皮生長因子與透明質(zhì)酸進行合理伍用，從而使其產(chǎn)生了意想不到的協(xié)同作用。
本發(fā)明復合膜劑，具有以下有益效果1、本發(fā)明復合膜劑可在較長時間內(nèi)維持透明質(zhì)酸在傷口創(chuàng)面所發(fā)生的作用，同時可促進內(nèi)源性透明質(zhì)酸的產(chǎn)生，因而，可更有效地抑制瘢痕的形成。
2、本發(fā)明復合膜可明顯促進傷口愈合中III型膠原的形成，有效提高了傷口愈合的質(zhì)量。
本發(fā)明的有益效果通過以下實驗得到了驗證。
實驗材料與方法儀器和試劑超低溫冰箱日本三洋公司MDF-382多功能照相顯微鏡日本OLYMPUSAX-60超薄切片機奧地利LEICARM2125多探頭γ計數(shù)器中國儀器廠FT-630低溫離心機上海TGL-16G透明質(zhì)酸山東臨朐華元生物有限公司Mr2×106生物素標記HA結(jié)合蛋白美國Sigma公司表皮生長因子上海大江股份有限公司生物制藥公司兔抗大鼠EGF抗體北京中山生物技術(shù)公司生物素標記山羊抗兔IgG北京中山生物技術(shù)公司辣根酶HRP標記鏈霉卵白素北京中山生物技術(shù)公司
DBA顯色試劑盒北京中山生物技術(shù)公司PCIII放免試劑盒上海海研醫(yī)學生物技術(shù)中心實驗動物及分組健康雄性SD大鼠72只，四月齡，體重350～400g。由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，醫(yī)動字第04057號。隨機將動物分為四組，每組18只動物，分別為本發(fā)明復合膜實驗組(簡稱實驗組)、表皮生長因子膜實驗組(簡稱陽性對照組1)、透明質(zhì)酸膜治療組(簡稱陽性對照組2)及聚乙烯醇膜對照(簡稱空白對照組)動物分籠飼養(yǎng)，統(tǒng)一飼料，自由飲食。
本發(fā)明復合膜的制備，同前所述。
透明質(zhì)酸膜、表皮生長因子膜、聚乙烯醇膜的制備方法與本發(fā)明復合膜相同，透明質(zhì)酸、表皮生長因子的含量與本發(fā)明復合膜中的相應含量相同。
動物實驗過程大鼠背部剪毛后，10％硫化鈉脫毛，溫水清洗，拭干。次日在2％戊巴比妥鈉4-5mg/100g腹腔麻醉下，常規(guī)消毒鋪巾，于背部脊柱兩側(cè)旁開1cm處，分別做長約5cm的切口，切開皮膚、皮下組織，深達肌層；止血后，角針、3～0絲線縫合傷口。將本發(fā)明復合膜，表皮生長因子膜，透明質(zhì)酸膜和聚乙烯醇膜浸無菌生理鹽水后，按分組分別貼于四組動物傷口，外用無菌紗布包扎。每日更換外敷膜一次，至術(shù)后14天。
樣本收集及處理動物處死及取材分別于術(shù)后3、5、7、9、14、21天，每個時間點上實驗組、陽性對照組1、陽性對照組2及空白對照組每組隨機取三只動物，六個切口，在2％戊巴比妥鈉4-5mg/100g腹腔麻醉下，切取距切口兩側(cè)各0.5cm、以切口為中軸的全層皮膚及皮下組織，隨后斷頸處死動物。
樣本處理切取2cm長傷口全層皮膚標本，10％甲醛溶液固定備組織學檢查；剩余標本塊在4℃條件下，去除皮下組織，剔除毛發(fā)，組織塊拭干后，置入液氮冷凍，-70℃條件下保存?zhèn)銲II型膠原(type III procollagen，PCIII)含量檢測用。
光鏡觀察經(jīng)10％甲醛固定的標本，酒精剃度脫水，二甲苯透明，浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，切片機切成6μm切片備用。
透明質(zhì)酸免疫組化染色石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3％H2O2室溫下孵育5～10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，0.1mol枸櫞酸緩沖液(PH值6.0)行保持抗原修復，溫度保持98℃，20分鐘。滴加按1∶75比例稀釋的HABP-Bion，4℃條件下孵育過夜。PBS沖洗3次，每次5分鐘。標本滴加1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30分鐘后PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加DAB顯色5分鐘。自來水充分沖洗，蘇木精復染細胞核，常規(guī)脫水后封片，進行組織學觀察。
陽性對照組不加抗體，其余步驟同上。
結(jié)果判定標準棕黃色顯色為強陽性，黃色為陽性，淺黃色為弱陽性，未顯色為陰性。
表皮生長因子免疫組化染色石蠟切片脫蠟至水，3％甲醛-雙氧水室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，0.01mPBS(PH7.4)緩沖液洗5分鐘，用0.1m枸櫞酸緩沖液(PH6.0)微波抗原修復98℃20分鐘，自然冷卻至室溫，0.01mPBS(PH7.4)緩沖液洗5分鐘，滴加10％正常山羊血清(0.01mPBS/PH7.4緩沖液稀釋)封閉游離的結(jié)合位點，減少非特異性染色，滴加一抗0.01mPBS(PH7.4)緩沖液1∶100稀釋4℃冰箱過夜，0.01mPBS(PH7.4)緩沖液洗3次，每次5分鐘，滴加生物素標記的二抗IgG工作液(羊抗兔)，37℃水浴鍋內(nèi)孵育30分鐘，0.01mPBS(PH7.4)緩沖液洗3次，每次2分鐘。滴加辣根酶HRP標記鏈霉卵白素工作液(三抗)，37℃水浴鍋內(nèi)孵育30分鐘，0.01mPBS(PH7.4)緩沖液洗3次，每次5分鐘，DNB顯色劑顯色5分鐘，自來水終止顯色。常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。
陽性對照組用PBS替代一抗，其余步驟同上。
實驗結(jié)果判定棕黃色顯色為強陽性，黃色顯色為陽性，淺黃色為弱陽性，未顯色為陰性。
III型前膠原(PCIII)含量測定取冷凍的皮膚標本100mg，冰浴條件下剪碎后，加無菌生理鹽水1ml，經(jīng)玻璃勻漿器在冰浴條件下勻漿，制成組織勻漿溶液，勻漿液以10000r/m在低溫高速離心機中4℃條件下離心15min，用微量移液器提取上清液。
所有上清液根據(jù)PCIII放免試劑盒中標準曲線的要求(40-640μg/L)進行稀釋，按試劑盒要求操作，用自動γ計數(shù)器進行檢測，以ng/mg記錄皮膚組織中的PCIII含量。
統(tǒng)計學處理采用EAS6.12統(tǒng)計軟件對測得的各組樣本PC含量進行單因素方差分析及多個樣本均數(shù)的倆倆比較，差異標準定為P＜0.05。
實驗結(jié)果


圖1傷后5天，空白對照組表皮層HA免疫組染色示圖；圖中表示傷后5天，空白對照組表皮層HA免疫組染色為陰性表達。
圖2傷后5天，陽性對照組1表皮上層EGF表達示圖；圖中表示傷后5天，陽性對照組1表皮上層EGF表達增強。
圖3傷后5天，實驗組表皮層HA表達示圖；圖中表示傷后5天，實驗組表皮層HA表達陽性，表皮上層強陽性表達。
圖4傷后5天，陽性對照組2全層HA表達示圖；圖中表示傷后5天，陽性對照組2全層HA表達陽性，表皮HA表達弱于實驗組。
圖5傷后5天，陽性對照組1表皮上層EGF表達示圖；圖中表示陽性對照組1表皮上層EGF表達強陽性。
圖6傷后14天，空白對照組角化層形成示圖；圖中表示傷后14天，空白對照組角化層形成明顯，膠原纖維排列成束，與切口線垂直。
圖7傷后14天，實驗組角化層形成示圖；圖中表示傷后14天，實驗組角化層形成較空白對照組輕，表皮層厚度基本正常、平坦，膠原束較細小，排列相對疏松。
圖8傷后14天，陽性對照組1皮膚愈合示圖；圖中表示傷后14天，陽性對照組1皮膚愈合與實驗組無明顯差異。
圖9傷后14天，陽性對照組2皮膚愈合示圖；圖中表示傷后14天，陽性對照組2皮膚愈合與實驗組無明顯差異。
圖10傷后7天，空白對照組綠色著色帶示圖；圖中表示傷后7天，空白對照組綠色著色帶較寬，切口線膠原束致密，與切口線垂直、呈層狀排列示圖；圖11傷后7天，實驗組綠色著色帶示中表示傷后7天，實驗組綠色著色帶較窄，纖細膠原束疏松排列；圖12傷后7天，陽性對照組1膠原束情況示圖；圖中表示傷后7天，陽性對照組1膠原束情況接近實驗組，膠原束較粗。
圖13傷后7天，陽性對照組2與陽性對照組1比較示圖。
圖中表示傷后7天，陽性對照組2與陽性對照組1相近。HA免疫組化染色觀察空白對照組表皮層HA免疫組染色在傷后3天、5天均為陰性(見圖1)，在7、9天基底層為陽性，表皮上層仍為陰性，真皮層染色由弱陽性轉(zhuǎn)為陽性；EGF組化染色在傷后3天，表皮染色陰性，弱陽性。5天、7天時，表皮上層染色增強(見圖2)，9天時又轉(zhuǎn)為陰性，成纖維細胞和毛囊染色呈陽性。
實驗組3、5、7、9天，表皮層HA染色均為陽性，表皮上層染色基本強陽性(見圖3)，9天，EGF在表皮上層的染色為強陽性，在基底層，毛囊、汗腺的表達呈弱陽性。實驗組中的EGF和HA在表皮和真皮的表達均強于空白對照組并分布于表皮全層，與胚胎皮膚EGF、HA分布接近。
陽性對照組2同樣可見到表皮、真皮HA呈陽性表達，但其在表皮的表達弱于實驗組；在3、5天時全層表達呈強陽性(見圖4)，7、9天呈陽性，表達也弱于實驗組。陽性對照組1，在3天時，表皮層HA的表達陽性，以后轉(zhuǎn)為陰性，真皮層表達接近陽性對照組2；陽性對照組1，在3、5天時，表皮上層EGF染色呈強陽性(見圖5)，7、9天陽性，到9天時基底層和汗腺呈纖維細胞染色由陽性轉(zhuǎn)為陰性。
這說明本發(fā)明復合膜可釋放EGF和HA，并使其滲透到皮膚中，表現(xiàn)出良好的透皮作用，有利于傷口愈合。同時也表明本發(fā)明復合膜中的EGF、HA具有協(xié)同作用。
本發(fā)明復合膜對表皮愈合的影響表皮受損后，缺損處周圍表皮斷端的基底細胞首先開始向創(chuàng)面遷移，皮膚受損較深時，遷移的表皮細胞可來自于殘存的毛囊。損傷后數(shù)小時，細胞開始分裂增生，當遷移的表皮細胞彼此相遇時，由于接觸抑制，細胞的遷移和分裂活動均停止?；准毎_始進一步分化，最終形成表皮的各個層次。
本實驗觀察到術(shù)后3日時，空白對照組表皮未愈合，實驗組和陽性對照組1表皮完全愈合，陽性對照組2上皮部分愈合。
空白對照組在傷后7天時，表皮層愈合，真皮未完全愈合，真皮成纖維細胞胞體粗大，成層狀聚集排列，與切口線垂直，并可見慢性炎細胞浸潤。至傷后14天時，傷口處角化層形成明顯，膠原纖維排列成束，與切口線垂直(見圖6)。
實驗組，傷后7天，真皮層愈合，成纖維細胞胞體較小，胞核細長，疏松排列。至傷后14天時，角化層形成較空白對照組輕，表皮層厚度基本正常、平坦，膠原束細小，排列相對疏松(見圖7)。
在傷后7天時，陽性對照2組真皮層未完全愈合，陽性對照1、2組，真皮層內(nèi)均可見慢性炎細胞浸潤，成纖維細胞形態(tài)、排列類似于實驗組。傷后14天，兩組皮膚愈合與實驗組無明顯差異(見圖8、9)。
實驗結(jié)果表明雖然HA延遲傷口愈合，但實驗組仍表現(xiàn)為表皮愈合加快，說明將HA和EGF聯(lián)合使用，可以產(chǎn)生協(xié)同作用，有利于傷口的愈合。
本發(fā)明復合膜對傷口愈合中膠原形成的的影響膠原是細胞外基質(zhì)成分，其主要功能是提供傷口的強度和完整性，也可參與細胞以及細胞與細胞間質(zhì)之間的粘附、信號傳導等。一般認為III型膠原含量越高，瘢痕纖維化程度越低，膠原纖維就越細。因此，測定III型前膠原含量可作為一個衡量愈合組織質(zhì)量的可靠標準。前膠原(procollagen)是在細胞內(nèi)合成并分泌至細胞外的膠原，它是原膠原的前體，原膠原是膠原纖維的基本分子單位。本實驗選用放免法測定III型前膠原(PCIII)。
本發(fā)明Masson染色觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)傷后7天，空白對照組綠色著色帶較寬，切口兩側(cè)膠原排列相對致密，膠原束粗大，與切口垂直、呈層狀排列(見圖10)。實驗組綠色著色帶較窄，膠原束細，排列相對疏松，部分切口處膠原束排列接近于正常組織(見圖11)。陽性對照1、2組，膠原束情況接近實驗組，但膠原束較實驗組粗大(見圖12、13)。
本實驗中，術(shù)后3、5、7、9、14天，實驗組PCIII含量與陽性對照組1、陽性對照組2比較明顯較高，有顯著性差異(見表1)。說明EGF和HA對促進III型膠原的合成具有協(xié)同作用。
表1 傷后不同時間點皮膚組織中III型前膠原含量

*表示P＜0.05從本實驗可看出，EGF與HA的合用提高了PCIII的含量，其作用優(yōu)于單純EGF和HA的運用，提高了傷口愈合的質(zhì)量。
實施例1將透明質(zhì)酸300mg、表皮生長因子60mg、聚乙烯醇1800mg。先用無菌生理鹽水配制聚乙烯醇溶液，待完全溶解后，再分別放入表皮生長因子和透明質(zhì)酸，攪拌配制成凝膠，然后將凝膠平鋪于玻璃板上，置低溫干燥箱干燥后，在超凈臺內(nèi)切割成長5.5cm、寬1.0cm的膜。膜中藥用含量為透明質(zhì)酸1.01mg/cm2表皮生長因子337ug/cm2實施例2將透明質(zhì)酸300mg、表皮生長因子1500mg、羧甲基纖維素鈉3000mg。先用無菌生理鹽水配制聚乙烯醇溶液，待完全溶解后，再分別放入表皮生長因子和透明質(zhì)酸，攪拌配制成凝膠，然后將凝膠平鋪于玻璃板上，置低溫干燥箱干燥后，在超凈臺內(nèi)切割成長5.5cm、寬1.0cm的膜。
實施例3將透明質(zhì)酸300mg、表皮生長因子300mg、羧甲基纖維素鈉2700mg。先用無菌生理鹽水配制聚乙烯醇溶液，待完全溶解后，再分別放入表皮生長因子和透明質(zhì)酸，攪拌配制成凝膠，然后將凝膠平鋪于玻璃板上，置低溫干燥箱干燥后，在超凈臺內(nèi)切割成長5.5cm、寬1.0cm的膜。
實施例中的組分用量可在本發(fā)明范圍內(nèi)任意選用，均具有本發(fā)明所述效果。
權(quán)利要求
1.一種瘢痕抑制復合膜劑，其特征在于它由以下重量份比的組分組成透明質(zhì)酸1份，表皮生長因子0.1-2份，成膜劑6-10份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瘢痕抑制復合膜劑，其特征在于它由以下重量份比的組分組成透明質(zhì)酸1份，表皮生長因0.5-1份，成膜劑8-9份。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種瘢痕抑制復合膜劑，它由以下重量份比的組分組成透明質(zhì)酸1份，表皮生長因子0.1～2份，成膜劑6～10份。本發(fā)明復合膜劑可在較長時間內(nèi)維持透明質(zhì)酸在傷口創(chuàng)面所發(fā)生的作用，同時可促進內(nèi)源性透明質(zhì)酸的產(chǎn)生，因而，可更有效地抑制瘢痕的形成。本發(fā)明復合膜還可明顯促進傷口愈合中III型膠原的形成，可有效提高傷口愈合的質(zhì)量。
文檔編號A61K31/728GK1939288SQ20061004812
公開日2007年4月4日 申請日期2006年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月10日
發(fā)明者董福生, 任貴云, 趙麗 申請人:河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院