專利名稱：一種艾里莫芬內(nèi)酯酸天然產(chǎn)物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)和藥理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，涉及一種艾里莫芬內(nèi)酯酸天然產(chǎn)物及其醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
目前，由于工業(yè)發(fā)展帶來的環(huán)境污染等問題，人類的生存環(huán)境質(zhì)量不斷下降，腫瘤疾病的發(fā)病率和致死率也不斷上升。然而目前臨床所用的細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物的選擇性不高，導(dǎo)致對正常細(xì)胞的惡性殺傷，限制了該類藥物的普遍使用性。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)新的選擇性高的細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物是世界范圍內(nèi)的研究熱點。我們也致力于這類藥物的研究。
黑紫橐吾Ligularia atroviblacea(Franch.)Hand.-Mazz.是菊科橐吾屬植物，云南民間用于清熱解毒及治療感冒、咳嗽用。本發(fā)明人在對菊科橐吾屬植物和菊科千里光屬的提取及化學(xué)成分研究中，曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)其中含有大量的艾里莫芬烷內(nèi)酯，如近年來發(fā)明人發(fā)現(xiàn)巖生千里光中的艾里莫芬烷內(nèi)酯具有對腫瘤細(xì)胞HL-60，A549和KB株均有一定的細(xì)胞毒性(趙昱等，Chinese Chemical Letters，2002年，13卷第4期，333-334頁)。此外，本發(fā)明人還報道了雞足千里光的幾個艾里莫芬烷內(nèi)酯也對KB細(xì)胞株和A-549細(xì)胞株有一定的細(xì)胞毒性(趙昱等，Chinese Chemical Letters，2002年，13卷第8期，754-757頁；趙昱等，Chinese Chemical Letters，2005年，16卷第3期，362-364頁)。但是，對于黑紫橐吾的化學(xué)成分研究和生物活性研究尚未見報道。據(jù)此，本發(fā)明人對該種植物進行了生物追蹤的化學(xué)分離及結(jié)構(gòu)鑒定，得到了本發(fā)明中所述的一個具有新穎結(jié)構(gòu)的艾里莫芬內(nèi)酯酸類化合物；并根據(jù)全世界尤其是中國的常發(fā)腫瘤疾病譜及腫瘤細(xì)胞的敏感性，選擇了人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL-60)，鼻咽癌細(xì)胞(CNE)，口腔上皮癌細(xì)胞(KB)，人子宮頸癌細(xì)胞(Hela)和小鼠淋巴樣瘤細(xì)胞(P388D1)，共五株腫瘤細(xì)胞株作為體外細(xì)胞毒活性藥理評價的指標(biāo)。結(jié)果顯示出其有抑制上述腫瘤細(xì)胞生長的作用，由此完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種艾里莫芬烷內(nèi)酯酸化合物，其化學(xué)名稱是3β-當(dāng)歸酰氧基-艾里莫芬-7(11)-烯-12，8β-內(nèi)酯-14-酸，具有下列結(jié)構(gòu) 本發(fā)明的另一個目的是提供化合物(A)及其鹽在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞生長活性的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的化合物(A)及其鹽在制備抑制人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL-60)、鼻咽癌細(xì)胞(CNE)、口腔上皮癌細(xì)胞(KB)、人子宮頸癌細(xì)胞(Hela)和小鼠淋巴樣瘤細(xì)胞(P388D1)生長活性的藥物中的應(yīng)用。
橐吾屬植物中一般富含艾里莫芬烷內(nèi)酯，其提取方法多為有機溶劑浸泡抽提或者回流提取，回收溶劑后，所得浸膏進行溶劑分配和/或各種層析方法，結(jié)合重結(jié)晶技術(shù)純化而得。
本發(fā)明中化合物(A)的制備方法如下由黑紫橐吾的地下部分經(jīng)醇水或酮水系統(tǒng)提取、有機溶劑柱層析、制備性薄層層析和重結(jié)晶方法純化。具體包括下列步驟a.用醇水或者酮水混合溶劑提取經(jīng)粉碎的藥材，濃縮提取液回收醇溶劑或酮溶劑；b.將步驟a得到的浸膏經(jīng)石油醚、醋酸乙酯、正丁醇進行溶劑分配；將得到的醋酸乙酯提取物進行柱層析，用有機溶劑洗脫，薄層層析檢測，分別收集含有化合物(A)的流份，再經(jīng)制備薄層或者葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析，梯度洗脫，薄層層析檢測，含化合物(A)的流份分別減壓揮干溶劑，選用適當(dāng)有機溶劑進行重結(jié)晶，得到純品。
本發(fā)明中的制備方法中，醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇或它們的混合物。優(yōu)選乙醇。醇水混合溶劑可以是醇和水以任意比例混合的溶劑，優(yōu)選乙醇和水的混合溶劑，尤其優(yōu)選60-95％的乙醇水溶液。酮可以是丙酮、甲乙酮、丁酮或它們的混合物，酮水混合溶劑可以是酮和水以任意比例混合的溶劑，優(yōu)選丙酮和水的混合溶劑，尤其優(yōu)選丙酮含量大于60％的酮溶液。
步驟b中重結(jié)晶溶劑可以是1至6個碳的直鏈或支鏈酯類、醚類、醇類、酮類或者它們的混合物。優(yōu)選丙酮和醋酸乙酯。步驟b中柱層析所用介質(zhì)可以是硅膠、硅藻土、反相硅膠、大孔樹脂、氧化鋁、葡聚糖凝膠(Sephadex)類。優(yōu)選硅膠。洗脫溶劑可以是醚、酯、酮、氯仿、二氯甲烷、醇或者是它們二者或三者的混合物。優(yōu)選石油醚與丙酮或石油醚與醋酸乙酯的混合溶劑或者氯仿與甲醇的混合溶劑進行梯度洗脫。
本發(fā)明中的藥材可以是黑紫橐吾Ligularia atroviblacea(Franch.)Hand.-Mazz.的任一部位，即可以是其根、莖、葉、種子、皮、果實，也可以是它們的混合物。優(yōu)選其地下部分。
本發(fā)明的化合物(A)或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到具有腫瘤細(xì)胞生長抑制活性從而可以用于防治腫瘤的藥物組合物。上述各類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。
本發(fā)明的化合物(A)或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與現(xiàn)已上市的抗腫瘤藥物如鉑類藥物順鉑(DDP)、喜樹堿類藥物伊立替康(Irinatecan，CPT-11)、長春花堿類藥物失碳長春花堿(Vinorebine，NVB，諾維本)、脫氧胞昔類藥物吉西他濱(Gemcitabine，Gemzar，健擇)、足葉乙甙(Etoposide)、紫杉醇(Paclitaxel)等聯(lián)合使用，制備得到防治腫瘤疾病類藥物組合物。該類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。
本發(fā)明的化合物(A)具有重要的生物活性，體外對五株腫瘤細(xì)胞，包括人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL-60)、鼻咽癌細(xì)胞(CNE)、口腔上皮癌細(xì)胞(KB)、人子宮頸癌細(xì)胞(Hela)和小鼠淋巴樣瘤細(xì)胞(P388D1)的細(xì)胞毒活性試驗表明此類艾里莫芬烷內(nèi)酯酸化合物(具體見實施例)對人體腫瘤細(xì)胞生長具有抑制作用，有可能發(fā)展成為新的防治腫瘤藥物。
具體實施例方式
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面首先用實施例的形式說明化合物(A)制備的過程，實施例給出了代表性化合物的部分物理和化學(xué)及波譜學(xué)數(shù)據(jù)。必須說明，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
其次分別用該艾里莫芬烷內(nèi)酯酸化合物對五種腫瘤細(xì)胞株生長的抑制作用的藥理實驗結(jié)果，說明其在抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域中的新用途。藥理實施例給出了該化合物的部分活性數(shù)據(jù)。必須說明，本發(fā)明的藥理實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
實施例1化合物(A)的制備取5.0公斤干燥的黑紫橐吾地下部分粉碎成粉末，加50升95％乙醇浸泡。在室溫下浸泡3次，每次7天。乙醇提取液合并，減壓回收溶劑至干得到462克浸膏，用3公升水分散，再依次用60-90°石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取。減壓回收醋酸乙酯提取液得到89.0克浸膏。該浸膏用800克100-200目硅膠柱層析，氯仿-甲醇(50∶0-0∶1)梯度洗脫。薄層層析檢測合并相同流份，含有化合物(A)的流份集中在20∶1和10∶1洗脫液中。減壓揮干溶劑得浸膏6.9克，再經(jīng)柱層析(200-300目)和制備薄層(60-90°石油醚-醋酸乙酯8∶1)純化，最終得到化合物(A)(120mg)。
化合物(A)的物理和光譜數(shù)據(jù)無色粉末；熔點200-202℃(丙酮)；[α]D20-136.5(c 0.30，甲醇)；紫外λmax(甲醇)nm224；IR vmaxKBr(cm-1)2985，1768，1714，1706，1654；電噴霧質(zhì)譜ESI-MS(m/z)361[M-H]-；高分辨電噴霧質(zhì)譜HR-ESI-MS(m/z)361.1742(計算值[C20H26O6+H]+361.1729)；13C和1H NMR譜圖數(shù)據(jù)見表1。
表1.化合物(A)的13C-NMR和1H-NMR譜數(shù)據(jù)*


*(在氘代甲醇中測定)。
實施例2化合物(A)對KB細(xì)胞的細(xì)胞毒活性KB(口腔上皮癌)細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的鏈霉素。細(xì)胞以每孔5×103的濃度加入到96孔板中，在37℃含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
細(xì)胞存活率的測定用改良MTT法。細(xì)胞經(jīng)過24小時的孵育后，分別將新配的化合物(A)的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中化合物(A)最終濃度分別為100μg/mL，33.3μg/mL，11.1μg/mL和3.7μg/mL。72小時后，加入10μL MTT(5mg/mL)的磷酸鹽緩沖液，再繼續(xù)在37℃培養(yǎng)4小時后，離心5分鐘除去未轉(zhuǎn)化的MTT，每孔中加入200μL二甲亞砜，以溶解還原的MTT晶體甲臜(formazan)，所形成的formazan用酶標(biāo)儀在570nm波長下比色，細(xì)胞存活率由樣品相對于對照品的比值計算。其中化合物(A)對KB細(xì)胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應(yīng)曲線得到。
化合物(A)的IC50為9.97×10-5M；陽性對照順鉑對KB細(xì)胞的IC50為5.67×10-6M。
實驗結(jié)論KB細(xì)胞是測試化合物對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的有效工具和評價指標(biāo)。本實驗表明該艾里莫芬內(nèi)酯酸天然產(chǎn)物對KB細(xì)胞具有較強的細(xì)胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有抗腫瘤作用的藥物。
實施例3化合物(A)對HL-60細(xì)胞的細(xì)胞毒活性HL-60(人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞)用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％小牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素。細(xì)胞以每孔1×104個密度接種到96孔板中，在37℃含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
細(xì)胞存活率的測定用改良MTT法，具體方法同實施例2。其中化合物(A)對HL-60細(xì)胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應(yīng)曲線得到。
化合物(A)的IC50為2.08×10-4M；而陽性對照順鉑對HL-60細(xì)胞的IC50為2.07×10-5M。
實驗結(jié)論本實驗表明該艾里莫芬內(nèi)酯酸天然產(chǎn)物對HL-60細(xì)胞具有較強的細(xì)胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有治療白血病及相關(guān)腫瘤作用的藥物。
實施例4化合物(A)對CNE細(xì)胞的細(xì)胞毒活性CNE(鼻咽癌)細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的鏈霉素。以每孔5×103細(xì)胞的濃度加入到96孔板中，在37℃含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
細(xì)胞存活率的測定用改良MTT法，具體方法同實施例2。其中化合物(A)對CNE細(xì)胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應(yīng)曲線得到。
化合物(A)的IC50為1.67×10-4M；而陽性對照順鉑對CNE細(xì)胞的IC50為4.62×10-6M。
實驗結(jié)論本實驗表明該艾里莫芬內(nèi)酯酸天然產(chǎn)物對CNE細(xì)胞具有較弱的細(xì)胞毒性。
實施例5化合物(A)對Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒活性Hela(人子宮頸癌)細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的鏈霉素。細(xì)胞以每孔5×103的濃度加入到96孔板中，在37℃含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
細(xì)胞存活率的測定用改良MTT法，具體方法同實施例2。其中化合物(A)對Hela細(xì)胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應(yīng)曲線得到。
化合物(A)的IC50為8.89×10-5M；而陽性對照順鉑對Hela細(xì)胞的IC50為4.20×10-6M。
實驗結(jié)論本實驗表明該艾里莫芬內(nèi)酯酸天然產(chǎn)物對Hela細(xì)胞具有較強的細(xì)胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有抗子宮頸癌及相關(guān)腫瘤作用的藥物。
實施例6化合物(A)對P388D1的細(xì)胞毒活性P388D1(小鼠淋巴樣瘤)細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％小牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素。細(xì)胞以每孔5×103個密度接種到96孔板中，在37℃含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
細(xì)胞存活率的測定方法用改良MTT法。細(xì)胞經(jīng)24小時的孵育后，分別將新配的化合物(A)的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中化合物的最終濃度分別為100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、5μg/mL。72小時后，加入10μL MTT(5mg/mL)的生理鹽水溶液，再繼續(xù)在37℃，5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時，每孔中加入150μL二甲亞砜，振蕩溶解生成的MTT晶體甲臜(formazan)，所形成的甲臜用酶標(biāo)儀在570nm波長下比色，細(xì)胞存活率由樣品OD值對于對照OD值的比值計算。其中化合物(A)對P388D1細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)由劑量效應(yīng)曲線得到。
化合物(A)的IC50為6.15×10-5M；而陽性對照順鉑對P388D1細(xì)胞的IC50為1.03×10-6M。
實驗結(jié)論本實驗表明該艾里莫芬內(nèi)酯酸天然產(chǎn)物對P388D1細(xì)胞具有較強的細(xì)胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有抗子宮頸癌及相關(guān)腫瘤作用的藥物。
權(quán)利要求
1.一種艾里莫芬內(nèi)酯酸化合物，化學(xué)名為3β-當(dāng)歸酰氧基-艾里莫芬-7(11)-烯-12，8β-內(nèi)酯-14-酸，具有以下結(jié)構(gòu)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的艾里莫芬內(nèi)酯酸化合物在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的艾里莫芬內(nèi)酯酸化合物的鹽在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的艾里莫芬內(nèi)酯酸化合物在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用，其特征是在制備抑制人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、口腔上皮癌細(xì)胞、人子宮頸癌細(xì)胞和小鼠淋巴樣瘤細(xì)胞中任一種腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的艾里莫芬內(nèi)酯酸化合物的鹽在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用，其特征是在制備抑制人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、口腔上皮癌細(xì)胞、人子宮頸癌細(xì)胞和小鼠淋巴樣瘤細(xì)胞中任一種腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的艾里莫芬內(nèi)酯酸化合物在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用，其特征是所述的艾里莫芬內(nèi)酯酸化合物或及鹽，與制劑允許的賦形劑或藥用輔料組合在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的艾里莫芬內(nèi)酯酸化合物在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的應(yīng)用，其特征是所述制劑形式為注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種艾里莫芬烷內(nèi)酯酸化合物，其化學(xué)名稱是3β－當(dāng)歸酰氧基－艾里莫芬－7(11)－烯－12，8β－內(nèi)酯－14－酸。本發(fā)明提供一種艾里莫芬烷內(nèi)酯酸化合物及其鹽具有體外抑制五種腫瘤細(xì)胞株，即人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL－60)、鼻咽癌細(xì)胞(CNE)、口腔上皮癌細(xì)胞(KB)、人子宮頸癌細(xì)胞(Hela)和小鼠淋巴樣瘤細(xì)胞(P388D1)的生物活性，可在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞生長活性的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK1923827SQ20061005357
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月25日
發(fā)明者趙昱, 周長新, 施樹云, 王曉雨, 巫秀美, 張勇民, 白驊 申請人:浙江大學(xué)