專利名稱：：制備微膠粒的方法和所述微膠粒的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及基因治療領域，特別涉及制備適合將多核苷酸傳遞給受治療者的肽-脂質-多核苷酸復合體的方法。如此產生的肽-脂質-多核苷酸復合體可有效抑制患者腫瘤疾病的進展。
背景技術：
：貫穿該申請中，各種出版物、專利和公開的專利說明書以作者和日期或以專利識別號引入。就在權利要求之前提供了出版物的全部著書目錄的引文。這些出版物、專利和公開的專利說明書的公開內容這里作為參考文獻引入本發(fā)明公開內容中以更充分描述本發(fā)明所屬領域的狀態(tài)?；蛑委熓巧镝t(yī)學研究最近形成的領域，該領域極其有望治療急性和慢性疾病并有潛力給分子醫(yī)學帶來革命性的時代。然而，盡管已做了大量臨床前和臨床研究，常規(guī)使用基因治療來治療人類疾病尚不成熟。仍存在對基因治療重要的未滿足的需求，這就是創(chuàng)建有效導向受治療者中感興趣的特定細胞，同時控制有害副作用的基因傳遞系統(tǒng)?；蛑委熤荚趯⒅委熒现匾幕驅牖颊叩捏w細胞。在臨床實驗中對基因傳遞治療已經顯示出順應性的疾病包括，癌癥(黑素瘤，乳腺癌，淋巴瘤，頭部和頸部癌，卵巢癌，結腸癌，前列腺癌，腦癌，慢性髓細胞白血病，非小細胞肺癌，肺腺癌，結腸直腸癌，成神經細胞瘤，神經膠質瘤，成膠質細胞瘤，星形細胞瘤和其它癌癥)，AIDS，囊性纖維化，腺苷脫氨酶缺乏，心血管疾病(再狹窄，家族性高膽固醇血癥，外周動脈疾病)，戈謝病，α1-抗胰蛋白酶缺乏，類風濕性關節(jié)炎和其它疾病。期望成為臨床試驗對象的人類疾病包括血友病A和B，帕金森氏病，眼病，著色性干皮病，高血壓，肥胖。ADA缺乏是1990年KennethCulver進行的第一次人類“基因傳遞”實驗成功治療的疾病。參見Culver，K.W.(1996)inGeneTherapyAPrimerforPhysicians，SecondEd.，MaryAnnLiebert，Inc.Publ，NewYork，pp.1-198?；蛑委煹闹饕康氖切迯突蛉〈蛔兊幕颍{節(jié)基因表達和信號傳導，操縱免疫系統(tǒng)，或導向惡性和其它細胞進行破壞。參見Anderson，W.F.(1992)Science256808-813；Lasic，D.(1997)inLiposomesinGeneDelivery，CRCPress，pp.1-295；BoulikaS，T.(1998)GeneTher.Mol.Biol.11-172；Martin，F.和Boulikas，T.(1998)GeneTher.Mol.Biol.1173-214；Ross，G.等人(1996)人.GeneTher.71781-1790。人類癌癥是有效基因治療方法將為之提供特別有效臨床益處的特殊疾病情況?；蛑委熤委熯@種疾病的概念包括刺激免疫反應以及操縱影響惡性表型的各種可替換細胞功能。盡管很多人類腫瘤無免疫原性或免疫原性弱，但是非體內用細胞因子基因GM-CSF，IL-12，IL-2，IL-4，IL-7，IFN-γ和TNF-α轉導患者細胞，隨后給患者細胞接種疫苗(如真皮內)以加強T淋巴細胞介導的抗腫瘤作用(癌癥免疫治療)可加強和指派免疫系統(tǒng)消滅癌細胞。用編碼腫瘤抗原基因進行DNA疫苗接種和用合成腫瘤肽疫苗進行免疫治療是目前正在測試的進一步發(fā)展。在人類臨床實驗中用于癌癥基因治療的基因包括大量腫瘤抑制基因(p53，RB，BRCA1，E1A)，反義癌基因(反義c-fos，c-myc，K-ras)，和自殺基因(HSV-tk，與9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤組合，胞嘧啶脫氨酶與5-氟胞嘧啶組合)。已經建議用于癌癥基因治療的其它重要基因包括bcl-2，MDR-1，p21，p16，bax，bcl-xs，E2F，IGF-I，VEGF，制管張素，CFTR，LDL-R，TGF-β和leptin。妨礙這些基因治療成功實施的一個主要障礙是有效傳遞有效劑量多核苷酸到達腫瘤部位的困難。因此，轉染能力增強的基因傳遞系統(tǒng)將非常有利。已經提出了大量不同的載體技術和基因傳遞方法并測試了體內傳遞基因，包括病毒載體和各種核酸包封技術?？晒┻x擇的用于基因的病毒傳遞載體包括小鼠逆轉錄病毒，重組腺病毒載體，腺伴隨病毒，HSV，EBV，HIV載體和桿狀病毒。非病毒基因傳遞方法使用陽離子或中性脂質體，直接注射質粒DNA和聚合物。已經測試了增強基因傳遞效率的各種策略，如促融合肽與脂質體或聚合物組合來增加質粒DNA從核內體釋放。已經發(fā)現每種基因傳遞技術都擁有不同的優(yōu)勢和弱點。重組逆轉錄病毒穩(wěn)定整合到染色體中，但需要宿主DNA合成來插入。腺病毒可感染不分裂細胞，但引起消除治療性轉導細胞的免疫反應。腺伴隨病毒(AAV)是非致病性的且不引起免疫反應，但是需要新的生產策略來得到用于臨床前和臨床研究的高AAV滴度。野生型AAVs整合到染色體19中，而重組AAVs喪失了位點特異性整合并且也可以持續(xù)作為游離體。單純皰疹病毒(HSV)載體可感染不復制細胞，如神經元細胞，并且對外源DNA具有高負載能力，但引起細胞毒性作用。看來每種傳遞系統(tǒng)都將不依賴其它系統(tǒng)而發(fā)展且每種傳遞系統(tǒng)都將表明對于某些應用的優(yōu)勢和弱點。目前，逆轉錄病毒最普遍用于人臨床試驗，其后是腺病毒，陽離子脂質和AAV。由于完善基因治療技術的挑戰(zhàn)已經變得很明顯，已經建議用各種另外的傳遞系統(tǒng)來繞開用標準技術觀察到的困難。例如，使用移植給患者組織的聚合物包封的同種或同種異體細胞的基于細胞的基因傳遞可用于分泌治療蛋白。此方法正在使用睫狀神經營養(yǎng)因子基因對肌萎縮性側索硬化的試驗中進行檢測，并可以延及到因子VIII和IX對血友病，白介素基因、分泌多巴胺的細胞治療帕金森氏病，神經營養(yǎng)因子對早老性癡呆和其它疾病的作用。發(fā)展中的其它技術包括，含Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)的載體清除轉染細胞中不期望的病毒DNA序列，使用組織特異性啟動子在特定細胞類型中表達基因，或使用識別細胞表面分子的配體指導基因載體到達特定細胞類型中。已建議用于提高基因治療技術功效的另外方法包括設計爆炸腫瘤細胞的p53“基因炸彈”，開發(fā)HIV-1病毒改造基因傳遞載體，與聚合物或陽離子脂質的病毒聯合改善基因傳遞，細胞核定位信號肽與寡核苷酸連接指導基因到達核中，分子轉換系統(tǒng)的發(fā)展允許基因隨意開啟或關閉。然而，由于廣泛的疾病情況需要基因治療，以及發(fā)展這種疾病的治療方法的復雜性，仍需要進行基因治療的改進技術。本發(fā)明提供了解決這些問題的方法和組合物。發(fā)明公開內容公開了一種將DNA和負電荷藥物包封到其內和外膜雙層具有不同脂質成分的脂質體中的方法。該脂質體在靜脈內注射給動物和人后能夠到達原發(fā)腫瘤及其轉移灶。該方法包括DNA與在10-90％乙醇中陽離子脂質和肽分子摩爾比例接近中和比例的混合物之間形成微膠粒；陽離子肽指定細胞核定位并具有賦予膜融合而改善復合體通過細胞膜的入口的疏水部分。以其陽離子部分插入的這些肽指向凝聚的DNA，它們的疏水鏈與脂質的疏水鏈一起埋在微膠粒膜單層中。DNA/脂質/肽微膠粒轉變成脂質體是通過與預先制備的脂質體或脂質混合，隨后用水溶液稀釋和透析以去除乙醇并允許脂質體形成和通過膜擠出得到高產量的直徑低于160nm的包入和包封DNA。包封的DNA對消滅各種人實體腫瘤有高的治療功效，包括但不限于乳腺癌和前列腺癌。質粒是用攜帶抗癌基因的DNA構建的，包括但不限于p53，RB，BRCA1，E1A，bcl-2，MDR-1，p21，p16，bax，bcl-xs，E2F，IGF-IVEGF，制管張素，制瘤素，內皮他丁，GM-CSF，IL-12，IL-2，IL-4，IL-7，IFN-γ，TNF-α，HSV-tk(與9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤組合)，大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(與5-氟胞嘧啶組合)并與包封的順鉑或與類似的全身傳遞的抗腫瘤藥物組合抑制癌癥。附圖簡述圖1闡明了導向癌的脂質體復合體的結構。圖2闡明了質粒DNA與各種活性劑以及陽離子脂質的各種制劑凝聚，轉染K562人紅白血病細胞培養(yǎng)物后，對β-半乳糖苷酶報道基因表達水平的影響的結果。圖3闡明了SCID小鼠中的腫瘤尋靶。圖3A顯示了X-Gal染色前和后具有大和小的人乳房腫瘤的SCID小鼠，檢測傳遞基因的表達。兩個腫瘤都變?yōu)樯钏{色。藍色的強度與β半乳糖苷酶基因的表達成比例。圖3B顯示了在初次染色的小腫瘤中，注射區(qū)的皮膚和腸道是首先變藍的器官。圖3C是動物背部的視圖。在去除皮膚(頂部)后，兩個腫瘤清晰可見。小腫瘤染成深色和大腫瘤染成淺藍色在染色初期很明顯(底部)。圖3D是動物前面的視圖。去除皮膚后，兩個腫瘤清晰可見。在底部的圖中，兩個腫瘤染成深色在染色后期很明顯。圖3E顯示了染色后期兩個腫瘤染成深色的正面(頂部)和背面(底部)高放大視圖。也可見到小腫瘤周圍的血管系統(tǒng)染色(底部)。表格簡述表1是能夠形成微膠粒的分子列表。表2列出了幾種促融合肽并描述了它們的性能，連同參考文獻。表3列出了簡單的細胞核定位信號(NLS)肽。表4顯示了“二分”或“分開”NLS肽。表5列出了缺乏精氨酸/賴氨酸簇的“非正NLS”肽。表6列出了具有核仁定位信號(NoLS)的肽。表7列出了在無膜蛋白激酶上具有親核簇的肽。表8列出了DNA修復蛋白上的細胞核定位信號肽。表9列出了轉錄因子中的NLS肽。表10列出了其它核蛋白中的NLS肽。發(fā)明實施方式定義除非另外指出，本發(fā)明的實施將利用常規(guī)的免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA技術。這些方法在下列出版物中描述。如參見Sambrook，等人MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL，2ndEdition(1989)；CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，F.M.Ausubel，等人eds.，(1987)；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress，Inc.)；PCRAPRACTICALAPPROACH，M.MacPherson，等人，IRLPressatOxfordUniversityPress(1991)；PCR2APRACTICALAPPROACH，MacPherson等人，eds.(1995)；ANTIBODIES，ALABORATORYMANUAL，Harlow和Lane，eds.(1988)；和ANIMALCELLCULTURE，R.I.Freshney，ed.(1987)。如說明書和權利要求中使用的，單數形式“一個”和“該”包括復數引用，除非上下文清楚地另外指出。例如，術語“一個細胞”包括大量細胞，包括其混合物。術語“包括”意在指包括引用的元件的組合物和方法，但不排除其它。“主要由……組成”當用于限定組合物和方法時，應該是指排除對組合有任何主要重要性的其它元件。因此，這里定義的主要由元件組成的組合物將不排除來自分離和純化方法的微量污染物和藥物可接受載體，如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等等?！坝伞M成”應該是指排除更多其它成分的微量元件和給予本發(fā)明組合物的基本方法步驟。這些轉換術語中每一個限定的實施方案都在本發(fā)明的范圍內。術語“多核苷酸”和“核酸分子”可互換使用，指的是聚合形式的任何長度的核苷酸。多核苷酸可以含有脫氧核糖核酸、核糖核酸和/或其類似物。核苷酸可以具有任何三維結構，并可以執(zhí)行任何功能，已知的或未知的。術語“多核苷酸”包括，例如，單、雙鏈和三螺旋分子，基因或基因片段，外顯子，內含子，mRNA，tRNA，rRNA，核酶，cDNA，重組多核苷酸，支鏈多核苷酸，質粒，載體，任何序列的分離DNA，任何序列的分離RNA，核酸探針和引物。核酸分子也可以包括修飾的核酸分子?！盎颉笔侵负兄辽僖粋€可讀框的，轉錄和翻譯后能夠編碼特定多肽或蛋白的多核苷酸。“基因產物”是指當基因轉錄和翻譯時產生的氨基酸(如肽或多肽)。這里使用下列縮寫DDAB二甲基雙十八烷基溴化銨(同N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化銨)；DODACN，N-二油基-N，N-二甲基氯化銨；DODAP1，2-二油?；?3-二甲基銨丙烷；DMRIEN-[1-(2，3-二肉豆蔻氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)溴化銨；DMTAP1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基銨丙烷；DOGS雙十八烷基氨基甘氨酰精胺；DOTAP(同DOTMA)N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨；DOSPAN-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N，N-二甲基三氟醋酸銨；DPTAP1，2-二棕櫚酰-3-三甲基銨丙烷；DSTAP1，2-二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷；DOPE，1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺；DC-Chol，3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)甲氨酰)膽固醇。參見Gao等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.179280-285(1991)。這里使用的術語“藥物可接受陰離子”是指在藥物制劑中提供無毒鹽的有機和無機酸的陰離子。這種陰離子的實例包括鹵化物陰離子、氯化物、溴化物和碘化物的陰離子，無機陰離子如硫酸根、磷酸根和硝酸根，和有機陰離子。有機陰離子可以來自簡單的有機酸，如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對-甲苯磺酸等等。藥物可接受鹽的制備在Berge，等人，J.Pharm.Sci.661-19(1977)中描述，這里引入作為參考。生理可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑是在使用的劑量和濃度下對接受者無毒的，包括緩沖液如磷酸、檸檬酸和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于大約10個殘基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽反離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如Tween，Pluronics或聚乙二醇(PEG)。PEG分子也包含具有與PEG分子末端共價連接的附加細胞核定位信號(NLS)的促融合肽。術語“陽離子脂質”是指在生理pH下帶凈正電荷的大量脂質種類中的任何一種。這種脂質包括但不限于DDAB，DMRIE，DODAC，DOGS，DOTAP，DOSPA和DC-Chol。另外，可得到大量商業(yè)上的陽離子脂質制劑，可用于本發(fā)明中。這些包括，例如LIPOFECTIN(包含DOTMA和DOPE的商業(yè)上可得到的陽離子脂質，來自GIBCO/BRL，GrandIsland，N.Y.，USA)；LIPOFECTAMINE(包含DOSPA和DOPE的商業(yè)上可得到的陽離子脂質體，來自GIBCO/BRL)；和TRANSFECTAM(在乙醇中包含DOGS的商業(yè)上可得到的陽離子脂質，來自PromegaCorp.，Madison，Wis.，USA)。本發(fā)明進一步提供了多種制備包入治療藥物的微膠粒的方法。該方法可特別有效地生產具有總的凈負電荷的藥物或成分如DNA、RNA或負電荷小分子的微膠粒。例如，DNA可包含在質粒載體中并編碼治療蛋白，如野生型p53，HSV-tk，p21，Bax，Bad，IL-2，IL-12，GM-CSF，制管張素，內皮他丁和制瘤素。在一個實施方案中，該方法需要將有效量治療劑與有效量陽離子脂質組合?？捎糜诒景l(fā)明方法中的陽離子脂質包括但不限于，DDAB二甲基雙十八烷基溴化銨；DMRIEN-[1-(2，3-二肉豆蔻氧基)丙基]-N，N二甲基-N-(2-羥乙基)溴化銨；DMTAP1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基銨丙烷；DOGS雙十八烷基氨基甘氨酰精胺；DOTAP(同DOTMA)N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨；DPTAP1，2-二棕櫚酰-3-三甲基銨丙烷；DSTAP1，2-二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷。一方面，負電荷治療劑內包含的大約30至90％比例的磷酸鹽在有效濃度乙醇被脂質分子(負電荷過剩)上的正電荷中和形成靜電微膠粒復合體中。一方面，乙醇溶液是約20％至約80％的乙醇。在另一個方面，乙醇濃度是大約30％。然后，乙醇/陽離子脂質/治療劑復合體與有效量促融合-親核肽綴合物組合。一方面，有效量的綴合物是大約0.0至大約0.3的比例范圍(肽上的正電荷比磷酸基上的負電荷)以中和治療劑的磷酸基上殘余的大部分負電荷，由此導致復合體幾乎完全中和。最佳條件使復合體略帶負電荷。然而，當陽離子脂質上的正電荷超過DNA上的負電荷時，過量的正電荷被DPPG(二棕櫚酰磷脂酰甘油)及其衍生物，或被最終微膠粒復合體中的其它陽離子脂質分子中和。在可供選擇的實施方案中，可以通過添加選自精胺、亞精胺和中和一定百分比(1-20％)磷酸基的鎂或其它二價金屬離子的DNA凝聚劑來改進上面的方法。在另外的實施方案中，陽離子脂質與有效量促融合脂質DOPE以各種摩爾比例組合，例如，以大約1∶1陽離子脂質∶DOPE的摩爾比例。在可供選擇的實施方案中，陽離子脂質與有效量促融合/NLS肽綴合物組合。促融合/NLS肽綴合物的實例包括但不限于(KAWLKAF)3(SEQIDNO1)，GLFKAAAKLLKSLWKLLLKA(SEQIDNO2)，LLLKAFAKLLKSLWKLLLKA(SEQIDNO3)，以及原型(疏水3-親核1-疏水2-親核1)2-3的所有衍生物，其中疏水是A，I，L，V，P，G，W，F中任何一個和親核是K，R或H中任何一個，每第3個或第4個氨基酸含正電荷殘基，形成α螺旋并使凈正電荷指向螺旋的相同方向。另外的實例包括但不限于來自流感病毒血細胞凝聚素HA-2的GLFKAIAGFIKNGWKGMIDGGGYC(SEQIDNO4)；來自HIV的TAT的YGRKKRRQRRR(SEQIDNO5)；MSGTFGGILAGLIGLL(K/R/H)1-6(SEQIDNO6)，來自鴨乙型肝炎病毒S蛋白的N末端區(qū)，但添加了一至六個正電荷賴氨酸、精氨酸或組氨酸殘基，以及這些的組合，能夠直接與質粒或寡核苷酸DNA的磷酸基相互作用，抵消由陽離子脂質提供的部分正電荷。GAAIGLAWIPYFGPAA(SEQIDNO7)來自埃博拉病毒跨膜蛋白的促融合肽；載脂蛋白(apo)AII肽的殘基53-70(C-末端螺旋)；HIV-1跨膜糖蛋白gp41的23個殘基促融合N末端肽；來自Alzheimer′sβ-淀粉樣肽的29-42個殘基的片段；仙臺病毒的融合肽和N末端七元重復序列；卵磷脂膽固醇?；D移酶的56-68個螺旋片段。包括在這些實施方案中的是這些肽的較短型，已知可誘導單層脂質囊泡或類似衍生的一切融合衍生中添加了一至六個正電荷賴氨酸、精氨酸或組氨酸殘基(K/R/H)1-6，能夠直接與質粒或寡核苷酸DNA的磷酸基相互作用，抵消由陽離子脂質提供的部分正電荷。促融合/NLS綴合物中的促融合肽代表這些肽序列的疏水氨基酸序列段和較小片段，它們包括在插入到內質網的膜或分泌蛋白中使用的所有信號肽序列。另外，該綴合物代表這些肽序列的跨膜結構域和較小片段。在本發(fā)明的一個方面中，促融合/NLS肽綴合物中的NLS肽成分衍生于促融合疏水肽。然而，對于含側接脯氨酸(P)或甘氨酸(G)的至少四個正電荷氨基酸的蛋白中的五個或更多親核氨基酸序列段來說，有源自大量已知NLS肽以及由細胞核蛋白數據庫檢索得到的，添加了5-6個氨基酸的親核細胞核定位信號(NLS)。NLS肽的實例在表1-8中顯示。促融合/NLS肽綴合物中的NLS肽成分是含有上述NLS，但在肽的中心部分被附加的K，R，H殘基進一步修飾或在N或C末端用P或G修飾的合成肽。在另外的方面中，促融合/NLS肽綴合物源自所述促融合疏水肽，但在NLS的位置添加了H4-6(四至六個組氨酸殘基)片段。在組氨酰殘基是正電荷的pH5-6微膠粒形成，但在生物學液體的接近中性的pH時失去它們的電荷，因此從它們的靜電相互作用中釋放質粒或寡核苷酸DNA。促融合肽/NLS肽綴合物通過提供內源性蛋白酶切割位點的短氨基酸序列段彼此連接。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，用于本發(fā)明的優(yōu)選原型促融合/NLS肽綴合物的結構是PKKRRGPSP(L/A/I)12-20(SEQIDNO8)，其中(L/A/I)12-20是12-20個含A，L，I，Y，W，F的疏水氨基酸和其它疏水氨基酸的序列段。通過轉變?yōu)橹|體，本發(fā)明進一步提供了用上述方法制備的微膠粒。有效量的脂質體(直徑從大約80至大約160nm)，或有效量的由膽固醇(從大約10％至大約50％)，中性磷脂如氫化大豆卵磷脂(HSPC)(從大約40％至大約90％)，和大約1至大約7摩爾百分比的衍生形成囊泡的脂質PEG-DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)組成的脂質溶液添加到微膠粒溶液中。在具體的實施方案中，脂質體由形成囊泡的脂質和聚乙二醇衍生的大約1至大約7摩爾百分比的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)組成。權利要求20的成分，其中聚乙二醇具有大約1,000至5,000道爾頓之間的分子量。微膠粒轉變?yōu)橹|體同時乙醇濃度伴隨降低，這可以通過脂質體復合體經過可透過膜來透析或通過擠出通過膜降至80-160nm直徑而去除乙醇來完成。本發(fā)明進一步提供了用上述方法制備的包封治療劑的脂質體。這里也提供了將治療劑如質粒DNA或寡核苷酸通過靜脈內或其它類型注射微膠?；蛑|體傳遞給體內組織細胞的方法。這個方法通過微膠?；蛑|體復合體長時間循環(huán)特異性導向原發(fā)腫瘤和轉移灶，這是由于其表面PEG鏈的暴露，其小的尺寸(80-160nm)和實體腫瘤從中心到其外周的流體靜水壓降低支持腫瘤血管系統(tǒng)優(yōu)先滲出到腫瘤細胞外間隙。這里描述的使用微膠?；蛑|體復合體傳遞質粒或寡核苷酸DNA穿過腫瘤的細胞膜屏障的方法是可行的，因為復合體中存在促融合肽。尤其是，提供了靜脈內注射復合體后，將質?；蚬押塑账酓NA傳遞給肝、脾和骨髓的方法。進一步提供的是將治療基因傳遞到癌癥和非癌癥患者的肝、脾和骨髓中而產生分泌形式的治療蛋白的方法，所述治療基因包括但不限于用于治療血友病的因子VIII或IX，多藥物耐藥性，用于癌癥免疫治療的細胞因子基因，緩解疼痛的基因，緩解糖尿病的基因和可導入肝、脾和骨髓組織中的基因。公開的療法也提供了降低腫瘤大小的方法，該方法通過將攜帶一個或多個選自p53，RB，BRCA1，E1A，bc1-2，MDR-1，p21，p16，bax，bcl-xs，E2F，IGF-IVEGF，制管張素，制瘤素，內皮他丁，GM-CSF，IL-12，IL-2，IL-4，IL-7，IFN-γ，TNF-α，HSV-tk(與9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤組合)，大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(與5-氟胞嘧啶組合)的抗癌基因的包封的質粒DNA與針對控制細胞周期或信號途徑的基因的包封的反義寡核苷酸(反義c-fos，c-myc，K-ras)、核酶或形成三聯體的寡核苷酸組合?？梢酝ㄟ^將攜帶一個或多個抗癌基因的包封的質粒DNA與包封的或游離的抗腫瘤藥物組合來改進這些方法，所述抗腫瘤藥物由下列一組組成阿霉素，制管張素，硫唑嘌呤，博萊霉素，busulfane，喜樹堿，卡鉑，卡莫司汀，chlorambucile，chlormethamine，chloroquinoxaline磺胺，cisplatin，環(huán)磷酰胺，cycloplatam，阿糖胞苷，達卡巴嗪，更生霉素，柔紅霉素，didox，阿霉素，內皮他丁，enloplatin，雌莫司汀，依托泊苷，extramustinephosphat，氟胞嘧啶，氟脫氧尿苷，氟尿嘧啶，硝酸鎵，羥基脲，碘苷，干擾素，白介素，leuprolide，lobaplatin，羅氮芥，甘露莫司汀，氮芥，mechlorethaminoxide，苯丙氨酸氮芥，巰基嘌呤，氨甲喋呤，普卡霉素，mitobronitole，絲裂霉素，霉酚酸，nocodazole，制瘤素，oxaliplatin，紫杉醇，溴新斯的明，鉑-三胺復合體，普卡霉素，強的松龍，強的松，丙卡巴肼，蛋白激酶C抑制劑，puromycine，司莫司汀，信號傳導抑制劑，螺鉑，streptozotocine，stromelysin抑制劑，紫杉酚，呋氟尿嘧啶，端粒酶抑制劑，替尼泊苷，沙利度胺，硫咪嘌呤，thioguanine，噻替派，tiamiprine，三胺嗪，三亞胺苯醌，trifosfamide，酪氨酸激酶抑制劑，嘧啶苯芥，阿糖腺苷，長春堿，vincaalcaloids，長春新堿，長春地辛，vorozole，折尼拉汀，zeniplatin和凈司他丁。下列實施例旨在闡明，而非限制本發(fā)明。脂質體的組成脂質體是由同心的脂質雙層組成的用顯微鏡可見的囊泡。在結構上，脂質體大小和形狀范圍從長管到球形，直徑從幾百埃至幾分之一毫米。選擇形成囊泡的脂質以達到提供外層的脂質成分的最終復合體的特殊程度的流動性和剛性。這些脂質是中性(膽固醇)或雙極性的且包括磷脂，如卵磷脂(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)和其它類型的雙極性脂質，包括但不限于1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，碳氫鏈長度范圍是14-22，并且是飽和的，或具有一個或多個C＝C雙鍵。能夠單獨，或與其它脂質成分組合產生穩(wěn)定脂質體的脂質的實例是磷脂，如氫化大豆卵磷脂(HSPC)，卵磷脂，磷脂酰乙醇胺，溶血卵磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，腦磷脂，心磷脂，磷脂酸，腦苷脂，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，二油酰卵磷脂(DOPC)，二棕櫚酰卵磷脂(DPPC)，二棕櫚酰油酰卵磷脂(POPC)，二棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-馬來酰亞氨基-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)?？蓳饺胫|體的另外的非含磷脂質包括硬脂胺，十二胺，十六胺，肉豆蔻酸異丙基酯，三乙醇胺-月桂硫酸酯，烷基-芳基硫酸酯，棕櫚酸乙酰酯，蓖麻油酸甘油酯，硬脂酸十六烷基酯，兩性丙烯酸聚合物，聚乙氧基化脂肪酸酰胺和上面提及的陽離子脂質(DDAB，DODAC，DMRIE，DMTAP，DOGS，DOTAP(DOTMA)，DOSPA，DPTAP，DSTAP，DC-Chol)。負電荷脂質包括能夠形成囊泡的磷脂酸(PA)，二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和雙十六烷基硫酸酯。用于本發(fā)明的優(yōu)選脂質是膽固醇，氫化大豆卵磷脂(HSPC)和衍生的形成囊泡的脂質PEG-DSPE。典型地，基于脂質體總的大小和層狀結構的性質，脂質體可分為三類。這三類，如紐約學院科學會議″LiposomesandTheirUseinBiologyandMedicine，″1977年12月提出的，是多層囊泡(MLVs)，小單層囊泡(SUVs)和大單層囊泡(LUVs)。SUVs直徑范圍從大約20至50nm，由環(huán)繞含水隔室的單一脂質雙層組成。單層囊泡也可以制備成直徑從大約50nm至600nm的大小。盡管單層是相當均一大小的單一隔室囊泡，但MLVs的大小可在不超過10,000mn或左右的范圍內發(fā)生很大變化，其結構是多隔室且含有一個以上的單一雙層。LUV脂質體如此得名是因為其范圍從大約600nm至30,000nm的大直徑；它們也含有一個以上的單一雙層?？梢杂煤芏喾椒ㄖ苽渲|體，但不是所有的都能產生三種不同類型的脂質體。例如，依靠將金屬探針直接浸入MLVs懸液的超聲分散是制備SUVs的普通方法。制備MLV類的脂質體通常包括將脂質溶于適當的有機溶劑中，然后在氣體或空氣流下去除溶劑。這在容器表面留下了干燥脂質薄膜。然后為了使脂質材料脫離容器側邊，將水溶液振蕩引入容器中。這個過程可分散脂質，使其形成脂質聚集體或脂質體。LUV類脂質體可以通過脂質薄層用蒸餾水或某種水溶液緩慢水合而制備。另外，可以通過凍干制備脂質體。這個過程包括在氮氣流下將脂質溶液干燥成膜。然后將此膜溶于揮發(fā)性溶劑中，冰凍，并置于凍干裝置上以去除溶劑。為了制備含藥物的藥物制劑，將藥物溶液添加到凍干的脂質中，于是形成脂質體。制備陽離子脂質體/陽離子肽/核酸微膠粒陽離子脂質體，除了鞘氨醇和原始生活型的一些脂質外，不會自然產生。本發(fā)明使用單鏈兩親物，它們是包括但不限于C12和C16鏈的烷基三甲基銨表面活性劑的氯化和溴化鹽，縮寫為DDAB(同DODAB)或CTAB。這些分子的分子幾何學決定臨界微膠粒濃度(溶液中的游離單體與微膠粒中的分子之比)。兩種狀態(tài)之間的脂質交換是高度動態(tài)過程；磷脂臨界微膠粒濃度值低于10-8M且在脂質體中更穩(wěn)定；然而，單鏈洗滌劑，如硬脂胺，稀釋或在毫秒內靜脈內注射時可從脂質體膜中浮出(Lasic，1997)。陽離子脂質包括但不限于，DDAB二甲基雙十八烷基溴化銨(同N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化銨)；DODACN，N-二油基-N，N-二甲基氯化銨；DODAP1，2-二油?；?3-二甲基銨丙烷；DMRIEN-[1-(2，3-二肉豆蔻氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)溴化銨；DMTAP1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基銨丙烷；DOGS雙十八烷基氨基甘氨酰精胺；DOTAP(同DOTMA)N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨；DOSPAN-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N，N-二甲基三氟醋酸銨；DPTAP1，2-二棕櫚酰-3-三甲基銨丙烷；DSTAP1，2-二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷；DOPE，1，2-sn-二油酰磷脂酰乙醇胺；DC-Chol，3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)甲氨酰)膽固醇。已經用兩種方法之一制備了基因傳遞中使用的基于脂質的載體。在一個方法中，將核酸導入由陽離子脂質和中性脂質的混合物制成的預先形成的脂質體中。由此形成的復合體具有不明確和復雜的結構，血清存在時轉染效率大大降低。預先形成的脂質體是商業(yè)可獲得的LIPOFECTIN和LIPOFECTAMINE。第二個方法包括在中性脂質不存在下DNA與單或聚陽離子脂質形成復合體。這些復合體在乙醇存在下制備且在水中不穩(wěn)定。另外，血清消極影響這些復合體(參見Behr，Acc.Chem.Res.26274-78(1993))。商業(yè)可獲得聚陽離子脂質的實例是TRANSFECTAM。將DNA包封入基于脂質的制劑的其它努力沒有克服這些問題(參見Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)；和Deamer的美國專利4,515,736)。核苷酸聚合物可以是單鏈DNA或RNA，或雙鏈DNA或DNA-RNA雜種。雙鏈DNA的實例包括結構基因，基因包括調控和終止區(qū)，和自身復制系統(tǒng)如質粒DNA。特別優(yōu)選的核酸是質粒。單鏈核酸包括反義寡核苷酸(與DNA或RNA互補)，核酶和形成三聯體的寡核苷酸。為了增加穩(wěn)定性，將優(yōu)選用穩(wěn)定的非磷酸二酯鍵，包括，例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫酸硒酸酯，甲基膦酸酯或O-烷基磷酸三酯鍵取代一些或全部核苷酸鍵的一些單鏈核酸。陽離子脂質體/陽離子肽/核酸微膠粒包封至中性脂質體中與促融合肽/NLS綴合物共同使用的提供顆粒內層的陽離子脂質可以是選自DDAB，DODAC，DMRIE，DMTAP，DOGS，DOTAP(DOTMA)，DOSPA，DPTAP，DSTAP，DC-Chol的大量物質中的任何一種。陽離子脂質與DOPE組合。在一組實施方案中，優(yōu)選的陽離子脂質是DDAB∶DOPE1∶1。這里使用的提供顆粒外層的中性脂質可以是在生理pH下以不帶電荷或中性兩性離子形式存在的大量脂質種類中的任何一種。這種脂質選自二?；字Ｄ憠A，二?；字Ｒ掖及?，神經酰胺，鞘磷脂，腦磷脂和腦苷酯。在一組實施方案中，優(yōu)選含有碳鏈長度在C14至C22的飽和，單或雙不飽和脂肪酸的脂質。通常，弱飽和脂質更容易調整大小，特別是當為了過濾滅菌，脂質體大小必須低于大約0.16微米時。考慮到脂質體大小，最終制劑中脂質體的剛性和穩(wěn)定性，其不泄露包封的DNA的保存期和在血流中的穩(wěn)定性，通常引導選擇中性脂質提供本發(fā)明基因載體的外包被層。含鏈長度和飽和程度變化的各種?；湹闹|可以得到或可以用熟知技術分離或合成。在另一組實施方案中，使用碳鏈長度在C14至C22的范圍內的脂質。優(yōu)選，用于本發(fā)明的中性脂質是氫化大豆卵磷脂(HSPC)，膽固醇和PEG-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或PEG神經酰胺。制備脂質體的方法在幾項頒發(fā)的專利，例如美國專利4,229,360；4,224,179；4,241,046；4,737,323；4,078,052；4,235,871；4,501,728和4,837,028，以及在文章Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)和Hope等人，Chem.Phys.Lip.4089(1986)中已經描述了制備各種脂質體形式的各種方法。這些方法不能制備所有三種不同類型的脂質體(MLVs，SUVs，LUVs)。例如，依靠將金屬探針直接浸入MLVs懸液的超聲分散是制備SUVs的普通方法。制備MLV類的脂質體通常包括將脂質體溶于適當的有機溶劑中，然后在氣體或空氣流下去除溶劑。這在容器表面留下了干燥脂質薄膜。然后為了使脂質材料脫離容器側邊，將水溶液振蕩引入容器中。這個過程可分散脂質，使其形成脂質聚集體或脂質體。LUV類脂質體可以通過脂質薄層用蒸餾水或某種水溶液緩慢水合而制備。另外，可以通過凍干制備脂質體。這個過程包括在氮氣流下將脂質溶液干燥成膜。然后將此膜溶于揮發(fā)性溶劑中，冰凍，并置于凍干裝置上以去除溶劑。為了制備含藥物的藥物制劑，將藥物溶液添加到凍干的脂質中，于是形成脂質體。脂質體制備后，可以調整脂質體大小以獲得期望的大小范圍和脂質體大小相對窄的分布。優(yōu)選，預先形成的脂質體大小達大約80至160mn的平均直徑(體內給予前，過濾滅菌的大小上限)。可利用幾種技術將脂質體調整到期望的大小。浴或探針超聲處理脂質體懸液使得大小進行性下降至大小低于大約0.05微米(50mn)的小單層囊泡。脂質體通過小孔聚碳酸酯擠出是我們將脂質體大小降至相對完全確定的大小分布的優(yōu)選方法。該脂質體可以成功通過小孔膜擠出，以完成脂質體大小漸降。用于以脂質包被DNA的一種方法是通過洗滌劑從陽離子脂質/DNA/洗滌劑復合體中受控耗盡。此方法可得到在血漿中具有穩(wěn)定性的復合體。Hofland等人(1996)通過透析DOSPA/DOPE/DNA/辛基糖苷的混合物，已經制備了這種復合體。本發(fā)明的包含陽離子脂質體/核酸復合體的藥物組合物是根據標準技術制備的并進一步包含藥物可接受載體。通常，將使用普通鹽水作為藥物可接受載體。對于體內給藥，優(yōu)選腸胃外給予藥物組合物，即，靜脈內，腹膜內，皮下，鞘內，注射到脊髓，肌肉內，關節(jié)內，門靜脈注射或腫瘤內。更優(yōu)選，靜脈內或腫瘤內快速濃注給予藥物組合物。在其它方法中，可以通過將制劑直接施用于組織而使藥物制劑與靶組織接觸。該施用可以通過局部“開放”或“封閉”步驟進行。術語“局部”是指將藥物制劑直接施用于暴露在環(huán)境中的組織，如皮膚，施用于身體的任何表面，鼻咽，外耳道，眼內給藥和給予任何體腔的表面，吸入肺中，生殖器粘膜等等?！伴_放”步驟是包括切割患者皮膚并直接顯現藥物制劑所施用的其下組織的那些步驟。這通常通過手術步驟完成，如胸廓切開術到達肺，剖腹術到達腹部內臟，或其它直接手術方法到達靶組織?！胺忾]”步驟是非侵入性步驟，內部靶組織不直接顯現，但通過皮膚上的小傷口插入儀器而到達。例如，可以通過針灌洗將制劑給予腹膜。同樣，可以在腰穿過程中通過灌注將藥物制劑給予腦脊膜或脊髓，隨后如通常實踐用于脊椎麻醉或脊髓的室椎影造影對患者進行合適的定位。另外，可以通過內窺鏡裝置給予制劑。實施例材料和方法DDAB，DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)和這里使用的多數其它脂質購自AvantiPolarLipids；PEG-DSPE來自Syngena。質粒pLF的改造用XbaI切割pGL3-C(Promega)并使用大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段進行平端連接。然后用HindIII切割，凝膠純化攜帶熒光素酶基因的1689bp片段。用SmaI和HindIII切割pGFP-N1質粒(Clontech)，凝膠中分離的4.7kb片段與熒光素酶片段連接。JM109大腸桿菌細胞轉化，選擇20個集落；它們中大約一半顯示了存在插入片段；用BamHI和XhoI切割含插入片段的8個克隆進一步證實熒光素酶基因的存在；它們中七個是陽性。放射性標記的質粒pLF由在3H-胸腺嘧啶核苷-5′-三磷酸酯或32p無機磷酸鹽(5mCi)(Dupont/NEN，Boston，Mass.)中培養(yǎng)大腸桿菌產生并使用如上述的標準技術純化。DLS測量使用CoulterN4M光線散射儀，在90°角，設置200秒的運轉時間，使用4至25微秒樣品時間。使用塑料比色杯，20℃和0.01泊粘度下獲得1ml樣品體積中的顆粒大小分布的掃描。在一個方面，該發(fā)明提供了捕獲DNA進入脂質的方法，該方法增加每體積單位質粒的含量，降低用于捕獲質粒或寡核苷酸DNA的陽離子脂質的毒性。DNA變得隱藏在最終復合體的內膜雙層中。此外，賦予了基因傳遞復合體在體液中長期循環(huán)時間和優(yōu)選滲出到實體腫瘤和它們的轉移灶和結中。在靜脈內注射攜帶基因的載體后，通過人或動物身體多數部位中它們的脈管系統(tǒng)發(fā)生滲出。這是由于它們的尺寸小(100-160nm)，它們在其外膜雙層中的中性至略帶負電荷脂質的含量，以及它們被PEG包裹而發(fā)生的。這些基因傳遞載體到達細胞外腫瘤間隙后能夠通過細胞膜屏障，因為存在與親核肽綴合的促融合肽。推測載體在脂質膜上某一預先確定的方向，其正末端朝向DNA和其疏水尾埋藏在疏水脂質雙層內側。內吞后，易變的NLS-促融合肽鍵被切割，與質粒DNA結合的剩余NLS肽協助它的細胞核攝取。這特別發(fā)生在導向不分裂細胞時，如肝、脾或骨髓細胞，它們代表了這些載體而不是實體腫瘤滲出和集中的主要部位。有機溶劑從期望的脂質成分中制備微膠粒的合適溶劑是乙醇、甲醇或其它脂肪醇如丙醇、異丙醇、丁醇、叔丁醇、異丁醇、戊醇和己醇。兩種或多種溶劑的混合物可以用于實施本發(fā)明。也應理解可與乙醇溶液混溶的，甚至是少量混溶的任何溶劑可用于提高微膠粒形成及其隨后轉變?yōu)橹|體，包括氯仿、二氯甲烷、二乙基醚、環(huán)己烷、環(huán)戊烷、苯和甲苯。陽離子脂質在另外的實施方案中，這里描述的包囊DNA的脂質體進一步包含有效量的陽離子脂質。陽離子脂質已經廣泛用于基因傳遞；大量臨床試驗(到1997年12月為止220項RAC許可總方案中有34項)使用陽離子脂質。盡管許多細胞培養(yǎng)研究已經在文獻中記載，用陽離子脂質在體內進行全身基因傳遞一直非常有限。所有臨床方案都使用皮下、真皮內和腫瘤內和顱內注射以及鼻內、胸膜內或氣霧劑給予，而不是I.V.傳遞，因為陽離子脂質和DOPE的毒性(見Martin和Boulikas，1998)。由DOPE和基于二?；谆@丙烷(分別是二油酰，二肉豆蔻酰，二棕櫚酰，二硬脂酰-三甲基銨丙烷或DOTAP，DMTAP，DPTAP，DSTAP)的陽離子脂質或DDAB配制的脂質體在體外與吞噬細胞(巨噬細胞和U937細胞)培養(yǎng)，但不接近非吞噬T淋巴細胞時，具有輕微毒性。毒性等級順序是DOPE/DDAB＞DOPE/DOTAP＞DOPE/DMTAP＞DOPE/DPTAP＞DOPE/DSTAP；毒性由陽離子脂質體對一氧化氮(NO)和巨噬細胞激活產生的TNF-α合成的作用確定。進行I.V.注射前的另一個待考慮的方面是負電荷血清蛋白可相互作用并使陽離子脂質體失活(Yang和Huang，1997)。發(fā)現用于質粒傳遞的凝聚劑包括聚賴氨酸，轉鐵蛋白-聚賴氨酸，第五代聚(氨基胺)(PAMAM)樹狀聚合物(dendrimer)，聚(乙烯亞胺)和幾種陽離子脂質(DOTAP，DC-Chol/DOPE，DOGS/DOPE和DOTMA/DOPE)可不同程度地激活補體系統(tǒng)。用長鏈聚賴氨酸，樹狀聚合物(dendrimer)，聚(乙烯亞胺)和DOGS看到了強烈的補體激活。用聚乙二醇修飾預先形成的DNA復合體表面(Plank等人，1996)可大大降低補體激活。陽離子脂質通過使生物膜，包括原生質、內體和溶酶體膜失去穩(wěn)定性而增加轉染效率。分離的溶酶體與低濃度DOTAP培養(yǎng)使β-半乳糖苷酶的自由活性顯著增加，甚至使酶釋放到培養(yǎng)基中。這證明脂質可強烈地使溶酶體膜失去穩(wěn)定性。認為失穩(wěn)機制包括陽離子脂質體和溶酶體膜的陰離子脂質之間的相互作用，因此允許脂質雙層間融合。這個過程在pH5時沒有在pH7.4時明顯，陰離子兩親脂質能夠部分阻礙這種膜的失穩(wěn)(Wattiaux等人，1997)。與在pH7.4下100％帶電荷的DOTAP和DMRIE相比，用pH敏感性熒光團監(jiān)測DC-CHOL僅大約50％帶電荷。這個差異降低了脂質體外表面上的電荷，提出促進含DC-CHOL的雙層較早從質粒DNA解離，增加DNA-脂質復合體從內體釋放到胞質(ZuidamandBarenholz，1997)。盡管陽離子脂質已經廣泛用于基因傳遞，但是極少研究使用全身I.V.注射陽離子脂質體-質粒復合體。這是由于動物模型，而不是人中脂質成分的毒性。I.V.注射給予兩種類型結構類似的陽離子脂質，DOTMA和DOTAP，顯示轉染效率主要由陽離子脂質的結構和陽離子脂質與DNA的比例決定；熒光素酶和GFP基因在不同器官的表達是短暫的，高峰水平在4和24小時之間，到第4天降至低于高峰水平的1％(Song等人，1997)。脂質體傳遞基因或寡核苷酸后可導向體內很多不同器官。通過小鼠尾靜脈靜脈內注射陽離子脂質體-質粒復合體，主要導向肺，較少程度上導向肝、脾、心臟、腎和其它器官(Zhu等人，1993)。給i.p.接種了包含K-ras點突變的AsPC-1胰腺癌細胞的裸鼠腹膜內注射表達反義K-rasRNA的質粒-脂質體復合體和PCR分析表明注射的DNA傳遞到除了腦之外的各種器官中(Aoki等人，1995)。發(fā)現DOTAP膽固醇/DNA復合體制備的許多因素包括DNA脂質體比例，適度超聲處理，加熱和擠出對于提高全身傳遞很重要；當使用大小在200-450nm之間的DNA脂質體復合體的同源群體時，得到最高基因表達。低溫電子顯微鏡顯示在這些制劑中，DNA在凹入的脂質體內部兩層脂質雙層間凝聚，這是被認為有助于體內高轉染效率和廣泛組織分布的因素(Templeton等人，1997)。提高脂質體介導的基因傳遞到體細胞的步驟包括質粒在血液循環(huán)中的存留，進入入口和轉運通過細胞膜，從內體隔室釋放到細胞質中，細胞核通過細胞核被膜的孔復合體?？慷?，由適當啟動子/增強子調控元件驅動的表達，和質粒在細胞核中長期持續(xù)存在(Boulikas，1998a)。質粒與精胺凝聚在另外的實施方案中，這里描述的脂質體包封的DNA與精胺和/或亞精胺凝聚。DNA可作為與聚陽離子如聚賴氨酸，或堿性蛋白如魚精蛋白，總組蛋白或特定的組蛋白組分的復合體呈遞給培養(yǎng)物中的細胞(BoulikasandMartin，1997)。質粒DNA與硫酸魚精蛋白之間的相互作用，隨后添加DOTAP陽離子脂質體，為質粒DNA抗酶促消化提供更好的保護。與DOTAP/DNA復合體相比，通過尾靜脈注射該方法使在小鼠中的基因表達水平始終較高。每只小鼠50μg熒光素酶-質粒得到了每mg肺中提取的組織蛋白含20ng熒光素酶蛋白，這早在注射后1小時檢測到，在6小時達到高峰，之后下降。與I.V.注射相比，門脈內注射魚精蛋白/DOTAP/DNA導致肺中基因表達降低大約100倍。內皮細胞是lacZ轉基因表達的主要部位(LiandHuang，1997)。使用單價陽離子脂質體制劑(DC-Chol和脂質轉染物)，硫酸魚精蛋白增強質粒傳遞到幾種不同類型的體外細胞中。在多價陽離子脂質體制劑lipofectamine中，這種作用不太明顯(Sorgi等人，1997)，在細胞培養(yǎng)和動物研究中發(fā)現精胺增強DNA-陽離子脂質體復合體的轉染效率。這種源于生物的聚胺在高濃度下引起脂質體融合，最可能是由一分子的精胺(四個正電荷氨基)與兩個或多個分子的脂質的極性頭部基團之間同時相互作用而促進的。在低濃度(0.03-0.1mM)下，它促進脂質體-DNA復合體固定到細胞表面并顯著增強轉染效率(Boulikas，未出版)。聚陽離子聚凝胺，魚精蛋白，DEAE-葡聚糖和聚-L-賴氨酸顯著增加在細胞培養(yǎng)物中腺病毒介導的基因傳遞的效率。認為這是通過中和了降低腺病毒介導的基因傳遞效率的膜糖蛋白所帶負電荷而起作用的(Arcasoy等人，1997)。寡核苷酸傳遞在另外的實施方案中，脂質體包封寡核苷酸DNA。寡核苷酸包封到脂質體中增加它們的治療指數，防止在培養(yǎng)細胞中和在人血清中降解，和降低對細胞的毒性(ThierryandDritschilo，1992；Capaccioli等人，1993；Lewis等人，1996)。然而，多數研究已經在細胞培養(yǎng)物中進行，很少在動物體內進行。在這些方法能夠進展到臨床研究前仍需要大量改進。ZelphatiandSzoka(1997)已經發(fā)現熒光標記的寡核苷酸與DOTAP脂質體的復合體，使用主要涉及未包被囊泡的細胞內途徑進入細胞。寡核苷酸從點狀細胞質區(qū)域重新分布到細胞核中。這一過程不依賴于內體囊泡的酸化。寡核苷酸的細胞核攝取依賴于幾個因素，如顆粒的電荷，其中正電荷復合體是增加細胞核攝取所需的。DOTAP使特異性抗熒光素酶寡核苷酸的反義活性增加超過100倍。不同陽離子脂質組分的寡核苷酸-脂質體復合體的物理化學研究表明細胞膜中其它脂質上的磷脂酰乙醇胺或負電荷是與陽離子脂質體-寡核苷酸復合體有效融合從而促進進入細胞所需的。Lappalainen等人(1997)報道了類似的結果。與聚陽離子DOSPA和單陽離子DDAB(DOPE作為輔助脂質)復合的地高辛標記的寡脫氧核苷酸(ODNs)被培養(yǎng)物中CaSki細胞通過內吞接納。發(fā)現細胞核膜形成對抗細胞核引入在核周區(qū)域蓄積的ODNs的屏障。盡管DOSPA/DOPE脂質體可將ODNs傳遞到胞質溶膠中，但是它們不能介導細胞核引入ODNs。相反，含凈正電荷的寡核苷酸-DOSPA/DOPE復合體從囊泡釋放到細胞質中。確定DOSPA/DOPE介導細胞核引入寡核苷酸。插入在帶DOTAP的陽離子脂質顆粒的DOPE-血紅素(三鐵原卟啉IX)綴合物保護寡核糖核苷酸不被人血清降解和增加寡核糖核苷酸被2.2.15人肝細胞瘤細胞攝取。只有在顆粒中凈負電荷時，血紅素的增強作用才明顯(Takle等人，1997)。在I..V.尾注射后，111In標記的和由DC-Chol和DOPE組成的脂質體最初被肝攝取，有一些蓄積在脾和皮膚中，很少量在肺中。陽離子脂質體與寡核苷酸硫代磷酸酯預先溫育促使脂質在肺中戲劇性但短暫地蓄積，逐漸重新分布到肝中。肺攝取的機制包括在注射后15分鐘通過栓塞，肺毛細管內包埋寡核苷酸大聚集體。注射后24小時，標記的寡核苷酸最初位于Kupffer細胞的吞噬泡中。在體內沒有觀察到細胞核攝取寡核苷酸(Litzinger等人，1996)。聚乙二醇(PEG)包裹的脂質體在另外的實施方案中，這里描述的包封DNA的脂質體進一步包括用PEG包裹步驟2(圖1)中的最終復合體。通常期望脂質與提供半衰期延長的聚合物，如聚乙二醇(PEG)綴合。使用的衍生脂質包括PEG修飾的DSPE或PEG神經酰胺。添加PEG成分防止復合體聚集，增加顆粒(脂質體、蛋白、其它復合體、藥物)的循環(huán)持續(xù)時間并增加脂質-核酸復合體傳遞到靶組織中。參見Maxfield等人，Polymer16505-509(1975)；Bailey，F.E.等人，inNonionicSurfactants，Schick，M.J.，ed.，pp.794-821(1967)；Abuchowski，A.等人，J.Biol.Chem.2523582-3586(1977)；Abuchowski，A.等人，CancerBiochem.Biophys.7175-186(1984)；Katre，N.V.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8414871491(1987)；Goodson，R.等人BioTechnology8343-346(1990)。報道了與PEG的綴合使免疫原性和毒性降低。參見Abuchowski等人，J.Biol.Chem.2523578-3581(1977)。美國專利5,013,556中描述了通過用PEG包裹，脂質體血液循環(huán)時間增加的程度。典型地，復合體中PEG修飾的磷脂，或PEG-神經酰胺的濃度將是大約1-7％。在具體的優(yōu)選實施方案中，PEG修飾的脂質是PEG-DSPE。設計惰性材料包裹脂質體表面從而掩飾脂質體避開身體的宿主防御系統(tǒng)，顯示顯著增加了脂質體的血漿壽命。這個“表面修飾的”亞支的生物學范例是紅細胞-被密集的一層碳水化合物基團包裹和負責逃避免疫系統(tǒng)檢測并循環(huán)幾個月(在被負責清除脂質體的同一類型細胞清除前)的細胞。1987年產生了第一次突破，那時鑒定了糖脂(腦組織衍生的神經節(jié)苷脂GM1)，當摻入脂質間質內部時，允許脂質體在血流中循環(huán)很多小時(AllenandChonn，1987)。也發(fā)現了第二個糖脂-磷脂酰肌醇可使脂質體在血漿中長期存留并且，由于它是從大豆，而不是腦組織中提取的，據信是藥物更可接受的賦形劑(Gabizon等人，1989)。表面修飾的亞支的主要進展是開發(fā)了聚合物包裹的脂質體(Allen等人1991)。聚乙二醇(PEG)修飾已經使用多年來延長生物蛋白(如酶和生長因子)的半衰期和降低其免疫原性(例如Beauchamp等人，1983)。在1990s早期報道了PEG包裹的脂質體在靜脈內給藥后循環(huán)明顯長的時間。在小鼠和大鼠中見到大約24小時左右的半衰期，在狗中超過30小時。由于其躲避免疫系統(tǒng)攔截的能力，將術語“秘密”用于這些脂質體。PEG親水聚合物形成密集的“構象云”防止其它大分子與表面的相互作用，甚至在保護性聚合物濃度低時(GabizonandPapahadjopoulos，1988；Papahadjopoulos等人，1991；reviewedbyTorchilin，1998)。用兩親PEG5000包裹后，脂質體親水性增加導致網狀內皮系統(tǒng)非特異性攝取降低。然而被PEG包裹的抗肌球蛋白免疫脂質體的半衰期是40分鐘，在靜脈內注射給兔后，它們增加其半衰期至1000分鐘(Torchilin等人，1992)。微膠粒、表面活性劑和小單層囊泡在另外的實施方案中，這里描述的脂質體包封的DNA進一步包括陽離子脂質和凝聚的質粒或寡核苷酸DNA之間在乙醇溶液中形成微膠粒的最初步驟。微膠粒是由某些類型的脂質分子，洗滌劑或表面活性劑在濃度、溶劑和溫度限定的條件下形成的小兩親型膠體顆粒。它們由單一脂質層組成。微膠?？删哂醒b配使得其疏水尾部接觸溶劑(例如在30-60％含水乙醇溶液)的親水頭部基團，或可逆轉它們的結構使得它們的極性頭部接觸溶劑如使乙醇濃度降至低于10％(反微膠粒)。微膠粒系統(tǒng)處于與溶劑分子和環(huán)境的熱力學平衡。這導致恒定的位相改變，特別是當接觸生物材料，如引入細胞培養(yǎng)物中，注射給動物，稀釋，接觸蛋白或其它大分子時。這些改變引起微膠?？焖俜纸饣蛐跄?。這與脂質體雙層高得多的穩(wěn)定性形成對照。單鏈表面活性劑能夠形成微膠粒(見下表1)。這些表面活性劑包括陰離子(十二烷基硫酸鈉，膽酸鹽或油酸鹽)或陽離子(十六烷基-三甲基溴化銨，CTAB)表面活性劑。CTAB，CTAC和DOIC微膠粒比含中性脂質和CTAB(1∶1)的相應SUV顆粒產生更大的溶解間隙(膠體懸浮DNA濃度較低)(Lasic，1997)。表1能夠形成微膠粒的分子層至微膠粒轉變發(fā)生時存在臨界的洗滌劑/磷脂比例。例如，對于含大單層脂質體的十二烷基麥芽糖苷觀察到囊泡-微膠粒轉變。十二烷基麥芽糖苷造成的溶解過程的驚人特征是發(fā)現了一個新相，由含長絲線樣微膠粒，長度超過1至2微米的非常粘的“凝膠樣”結構組成。長循環(huán)復合體需要少許陰離子。因此，用于微膠粒轉變?yōu)橹|體的脂質體含有雙極性脂質(PC，PE)和1-30％負電荷脂質(DPPG)。有毒性的陽離子脂質隱藏在內部脂質體膜雙層中。那些到達實體腫瘤的脂質將發(fā)揮它們引起編程性細胞死亡的毒性作用。編程性細胞死亡會由將毒性藥物或抗腫瘤基因或寡核苷酸傳遞給癌癥細胞而引起，也可以由陽離子脂質(與質粒DNA一起)細胞核定位到細胞核中引起。實際上，大量研究提示質粒DNA被引入核；其易位停駐在靜電附著于DNA上的陽離子脂質分子上。這些陽離子脂質分子通過干擾核小體和引起局部失穩(wěn)的染色質的域結構而發(fā)揮其毒性。這種失調或異常染色質重新組織會在質粒DNA附著進行轉錄，自主復制或通過重組而整合的細胞核間質水平上而產生。已經發(fā)現表面活性劑在制劑如乳劑(包括微乳狀液)和脂質體中的廣泛應用。很多不同類型表面活性劑，天然和合成的，性能分類和分級最普通的方法是通過使用親水/親脂平衡(HLB)。已經綜述了表面活性劑在藥物產品、制劑和乳劑中的應用(Rieger，nPharmaceuticalDosageForms，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1988，p.285)。發(fā)現非離子表面活性劑在藥物和化妝品產品中廣泛應用并可在廣范圍的pH值下使用。通常，根據它們的結構，它們的HLB值范圍從2至大約18。非離子表面活性劑包括，非離子酯如乙二醇酯，丙二醇酯，甘油酯，聚甘油酯，脫水山梨醇酯，蔗糖酯和乙氧基化酯。非離子鏈烷醇酰胺和酯，如脂肪醇乙氧基化物，丙氧基化醇和乙氧基/丙氧基化的，嵌段聚合物也包括在這類中。聚氧乙烯表面活性劑是非離子表面活性劑類的最普遍成員。陰離子表面活性劑包括羧化物如皂類，?；樗猁}，氨基酸的酰胺，硫酸的酯如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸鹽如烷基苯磺酸鹽，酰基羥乙基磺酸鹽，酰基牛磺酸鹽和磺基琥珀酸鹽和磷酸鹽。陰離子表面活性劑類的最重要成員是烷基硫酸酯和皂類。陽離子表面活性劑包括季銨鹽和乙氧基化胺。季銨鹽是這類中最常用的成員。如果表面活性劑分子具有攜帶正或負電荷的能力，該表面活性劑分類為兩性的。兩性表面活性劑包括丙烯酸衍生物，取代烷基酰胺，N-烷基甜菜堿和磷脂。經典的微膠?？赡懿荒苡行ё鳛榛騻鬟f載體，但是可作為包封藥物或核酸的脂質體復合體形成的重要中間體。單鏈表面活性劑-DNA-膠體系統(tǒng)的穩(wěn)定性低于含中性脂質和CTAB(1∶1)的SUV顆粒。然而，第二代微膠粒能夠導向體內腫瘤。Weissigandcoworkers(1998)使用大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)作為模型蛋白導向腫瘤。STI用N-戊二酰-磷脂酰-乙醇胺(NGPE)的疏水殘基修飾并摻入聚乙二醇(分子量5000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)微膠粒(＜20nm)和PEG-DSPE修飾的長循環(huán)脂質體(約100nm)。如使用111In蛋白標記通過蛋白粘連二亞乙基三胺五醋酸，DTPA與大豆胰蛋白酶抑制劑連接而確定，在尾靜脈注射后，PEG-脂質微膠粒比固定在長循環(huán)PEG-脂質體中的相同蛋白在小鼠皮下建立的Lewis肺癌中蓄積更好。裝填有兩親藥物的脂質體分散體可能使相轉變?yōu)槲⒛z粒溶液。將乳白色外觀的脂質體分散體(顆粒大小200nm)轉變成接近透明的微膠粒(顆粒大小低于25nm)來完成從高比例的磷脂與藥物的轉變(從2∶1至1∶1向下)。參見SchutzeandMuller-Goymann(1998)。促融合肽在另外的實施方案中，這里描述的脂質體包封的DNA進一步包括有效量的促融合肽。促融合肽屬于特征為沿長螺旋軸呈疏水性梯度的螺旋兩親肽類。這個疏水性梯度引起肽在膜中傾斜插入，因此使脂質核心失去穩(wěn)定性，由此增強膜融合(Decout等人，1999)。血細胞凝聚素(HA)是流感病毒的均三聚表面糖蛋白。在感染時，它促使低pH下病毒和內體膜之間的膜融合。每個單體由受體結合HA1域和膜相互作用HA2域組成。HA2域的NH2末端區(qū)域(氨基酸1至127)，所謂的“融合肽”插入目標膜中并在觸發(fā)病毒和內體膜之間融合中起決定性作用?；谟秒装彼嶂脫Q區(qū)域5-14的8個氨基酸和旋轉標記電子順磁共振，得到結論該肽形成α螺旋，從膜水平面傾斜近25度，從磷酸基的最大深度15埃(Macosko等人，1997)。使用來自流感病毒血細胞凝聚素HA-2的促融合肽大大增加了細胞攝取轉鐵蛋白-聚賴氨酸-DNA復合體的效率。該肽與聚賴氨酸連接，復合體通過轉鐵蛋白受體介導的內吞而傳遞(Boulikas，1998a綜述)。這個肽具有序列GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGYC(SEQIDNO9)并能夠促使熒光染料鈣黃綠素從卵黃卵磷脂制備的脂質體中釋放，在酸性pH更強。在0.1-1mM濃度下，使用在培養(yǎng)物中的CEM-SS淋巴細胞這個肽也能夠使反義寡核苷酸的抗HIV潛能增加到高達10倍。這個肽在內體輕微較酸環(huán)境下改變構象，失穩(wěn)并打破了內體膜(Boulikas，1998a綜述)。膜中存在負電荷脂質對于證明有些肽的促融合性能很重要，但對其它性能不重要。而肽的促融合活性，代表推定的fertlin-參與精子-卵融合的精子表面蛋白的融合域，依賴于負電荷脂質的存在，HIV2肽的促融合活性不是這樣(MartinandRuysschaert，1997)。例如，為了分析流感病毒血細胞凝聚素HA的促融合肽上的兩個結構域，設計HA的細胞質尾和/或跨膜結構域被仙臺病毒相應的促融合糖蛋白F的結構域取代的HA-嵌合體。制備細胞質尾被人神經元顆粒蛋白1型(NF1)(殘基1441至1518)或c-Raf-1(殘基51至131)的肽取代的HA構建體，并使用牛痘病毒T7聚合酶瞬時表達系統(tǒng)在CV-1細胞中表達。親本或嵌合HA蛋白介導的CV-1細胞和結合人紅細胞(RBCs)間的膜融合顯示，pH降低后，發(fā)生了含水熒光團鈣黃綠素從預先承載RBCs流向表達蛋白的CV-1細胞的細胞質中。這表明膜融合包括脂質雙層的兩個小葉并導致水融合孔形成(Schroth-Diaz等人，1998)。顯著的發(fā)現是HIV的TAT蛋白能夠穿過細胞膜(GreenandLoewenstein，1998)和TAT的36個氨基酸的結構域，當與異源蛋白化學交聯時，賦予了轉導到細胞中的能力。TAT的11個氨基酸促融合肽(YGRKKRRQRRR(SEQIDNO10))是核仁定位信號(參見Boulikas，1998b)。另一個HIV蛋白，糖蛋白gp41，含有促融合肽。源自gp41胞外域的膜最近區(qū)的線性肽具有作為抗HIV劑和通過采取螺旋構象而抑制傳染性的潛在應用(Judice等人，1997)。23個氨基酸殘基，HIV-1gp41的N末端肽具有使負電荷大單層囊泡失穩(wěn)的能力。缺乏陽離子時，主要結構是成孔α螺旋，而在Ca2+存在下，構象轉變成促融合的，主要是延伸的β型結構。HIV(ala)(含R22→A置換)的融合活性降低70％，而當包括第二個置換(V2→E)時，促融合性完全喪失，爭辯是主動失穩(wěn)含膽固醇的電中性膜的HIV-1融合肽采取的不是α螺旋，而是延伸的結構(Pereira等人，1997)。朊病毒蛋白(PrP)是功能未知的糖蛋白，通常在神經元和神經膠質細胞表面發(fā)現。它參與疾病如牛海綿狀腦病，和人Creutzfeldt-Jakob病，其中PrP轉變?yōu)楦淖冃问?術語稱PrPSc)。根據計算機模擬化計算，PrP的120至133和118至135結構域是傾斜方式插入脂質雙層的傾斜脂質關聯肽并能與脂質體相互作用促使包封鈣黃綠素泄露(Pillot等人，1997b)。Alzheimer淀粉樣肽的C末端片段(氨基酸29-40和29-42)具有與促使體外脂質體融合的病毒蛋白的融合肽相關的性能。這些特性可介導淀粉樣肽與細胞膜的直接相互作用并解釋淀粉樣肽的部分細胞毒性?？紤]到早老性癡呆的病理學和載脂蛋白E(apoE)多態(tài)性之間的流行病學和生物化學關聯，三個普通apoE同種型和淀粉樣肽C末端片段之間的潛在相互作用的研究顯示只有apoE2和apoE3，不是apoE4，是淀粉樣肽促融合和聚集性能的有力抑制劑。認為apoE抗淀粉樣聚集體形成的保護性作用是由形成穩(wěn)定的apoE/淀粉樣肽復合體介導的(Pillot等人，1997a；Lins等人，1999)。當11個氨基酸殘基組成的兩親凈負電荷肽(WAE11)固定于脂質體膜時，強烈提高該肽的促融合性能。該肽的融合活性看來不依賴于pH和膜合并，和目標膜需要通過摻入賴氨酸耦聯磷脂酰乙醇胺(PE-K)的提供的正電荷。而耦聯肽可使囊泡通過與PE-K的非特異性靜電相互作用而聚集，游離肽不能促使PE-K囊泡聚集(Pecheur等人，1997)。大量研究提示肽在插入細胞或脂質體膜的脂質雙層后，其α螺旋二級結構的穩(wěn)定性負責肽的膜融合性能。Zn2+，增強肽的促融合活性，因為它穩(wěn)定α螺旋結構。例如，唾液抗微生物肽的HEXXH(SEQIDNO11)結構域，位于histatin-5的C末端功能域，識別的鋅結合基元是螺旋構象(Martin等人，1999；Melino等人，1999；Curtain等人，1999)。融合肽已經與DNA質粒配制以產生基于肽的基因傳遞系統(tǒng)。用于將質粒凝聚成40至200nm的納米顆粒的YKAKnWK(SEQIDNO12)肽與設計利于質粒從內體釋放的pH敏感性溶解劑GLFEALLELLESLWELLLEA(SEQIDNO13)兩親肽組合，增強含β-半乳糖苷酶報道基因的表達系統(tǒng)(Duguid等人，1998)。見下表2。表2促融合肽促融合脂質DOPE是促融合脂質；彈性蛋白酶切割N-甲氧基-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-DOPE(SEQIDNO19)將此衍生物轉變?yōu)镈OPE(總的正電荷)而將包封的熒光探針，鈣黃綠素傳遞到細胞質中(Pak等人，1999)。與β-內啡肽mRNA區(qū)域互補的30個堿基的寡脫氧核苷酸序列，在其包封到含賦予促融合活性的二棕櫚酰-DL-α-磷脂酰-L-絲氨酸的小單層囊泡(50nm)中后，引起細胞培養(yǎng)物中β-內啡肽產生的濃度依賴性抑制。細胞核定位信號(NLS)在另外的實施方案中，這里描述的脂質體包封的質?；蚬押塑账酓NA進一步包括有效量的細胞核定位信號(NLS)肽。細胞核蛋白通過核孔復合體從它們在細胞質中的合成部位到細胞核中的功能部位的流通由待引入細胞核中的蛋白上的NLSs介導(表3-10，在下面)。蛋白從細胞質運輸到核質包括(i)karyopherinα與NLS-蛋白形成復合體；(ii)karyopherinβ的隨后結合；(iii)在核孔蛋白上復合體與FXFG肽重復序列的結合；(iv)通過p10，Ran-GDP停駐在核孔蛋白和karyopherin雜二聚體上；(v)核孔蛋白上大量結合-解離反應，使引入底物停駐在核質側，伴發(fā)GDP-GTP交換反應，該反應將Ran-GDP轉變?yōu)镽an-GTP并由karyopherinα催化；和(vi)Ran-GTP使得karyopherinα/NLS-蛋白與karyopherinβ解離并釋放到核質中。在多數一級結構已經檢測的非膜絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶中發(fā)現親核和酸性簇(表6)。這些親核簇可能介導激酶分子固定到轉運蛋白上進行它們受調節(jié)的細胞核引入和可能構成細胞核定位信號。與僅位于細胞核中的具有由在側接脯氨酸和甘氨酸螺旋打斷子的六肽內的至少四個精氨酸(R)和賴氨酸(K)組成的強力親核肽的蛋白轉錄因子相比，蛋白激酶通常含有一個組氨酸和三個K+R殘基(Boulikas，1996)。提出這是指定弱NLS結構，引起細胞核引入總細胞質激酶的成分，以及它們微弱停留在不同的離子強度細胞核環(huán)境中。蛋白激酶中推定的NLS肽可能也含有提出進一步減少它們發(fā)揮強NLS作用的能力的疏水性或龐大的芳香氨基酸。參與DNA修復途徑的多數哺乳動物蛋白看來具有在六個氨基酸的序列段中含至少四個R+K的強親核簇(表7)。預計未知蛋白細胞核定位的規(guī)則已經提出從其氨基酸序列預計功能未知的蛋白細胞核定位的幾個簡單規(guī)則(i)NLS被定義為在六肽內的四個精氨酸(R)加賴氨酸(K)；在親核六肽的四元組中存在一個或多個組氨酸(H)，常常在具有細胞質和細胞核功能的蛋白激酶中發(fā)現，可能指定功能可能受磷酸化調節(jié)的弱NLS或可能指定在細胞質和細胞核中都起作用的蛋白(Boulikas，1996)；(ii)K/R簇由α螺旋打斷子G和P側接，由此將NLS置于螺旋-轉角-螺旋或α螺旋末端。負電荷氨基酸(D，E)常常在NLS側翼發(fā)現，在一些情況下可能打斷負電荷NLS簇；(iii)龐大的氨基酸(W，F，Y)不存在于NLS六肽中；(iv)NLS信號可能不由長段疏水氨基酸(如五個)側接；帶電荷和疏水氨基酸的混合物起線粒體導向信號作用；(v)NLSs數量越多，分子越容易引入細胞核(Dworetzky等人，1988)。甚至小蛋白，例如組蛋白(10-22kDa)，需要主動引入來增加它們與小分子通過孔擴散的慢速度相比的引入速度；(vi)信號肽是比NLSs更強的蛋白流通量的決定因素。信號肽指導蛋白到內質網腔進行分泌或插入細胞膜(跨膜域存在)(Boulikas，1994)；(vii)線粒體引入蛋白的信號(疏水和親核氨基酸的混合物)可能對抗細胞核引入信號，具有兩種類型信號的蛋白可能易位到線粒體和細胞核；(viii)蛋白與大細胞質結構(膜蛋白，中間絲狀體)的強烈結合使得這種蛋白不能引入，盡管它們具有NLS樣肽(Boulikas，1994)；(ix)轉錄因子和其它細胞核蛋白具有大量不同的推定的NLS段。十六個可能形式的推定NLS結構中，最豐富的類型是θθxθθ，θθθxθ，θθθθ和θθxθxθ，其中θ是R或K，總計占在轉錄因子上全部親核簇的大約70％(Boulikas，1994)；(x)少量細胞核蛋白看來缺乏典型的親核NLS。非親核肽既不起它們細胞核引入的作用，因為這種分子具有二分NLSs，引入也不絕對依賴于這些缺少NLS的蛋白在細胞質中與待引入的細胞核蛋白伙伴的強烈復合作用(Boulikas，1994)。這個機制可能確保細胞核中兩種分子的某一化學計算比，且可能具有生理意義；和(xi)大量蛋白可能通過其它機制被引入，不依賴于經典的NLS。已經發(fā)現很多過程受細胞核引入的調節(jié)，包括轉錄因子NF-κB，rNFIL-6，ISGF3，SRF，c-Fos，GR以及人細胞周期蛋白A和B1，酪蛋白激酶II，cAMP依賴性蛋白激酶II，蛋白激酶C，ERK1和ERK2的細胞核易位。細胞不能將特定蛋白引入細胞核可導致癌發(fā)生。例如，BRCA1主要位于乳房和卵巢癌細胞的細胞質中，而在正常細胞中蛋白位于細胞核中。mRNA通過與具有細胞核輸出信號(NES)的細胞核蛋白的復合體相同的途徑輸出。大量含NES的蛋白是結合并護送RNAs到細胞質的RNA結合蛋白。然而，其它含NES的蛋白在輸出蛋白中起作用；與其它蛋白上的NRS序列結合并與細胞核孔復合體相互作用的CRM1是真核細胞中NES依賴性細胞核輸出蛋白的必需中介物。細胞核定位和輸出信號(NLS和NES)在很多重要分子中發(fā)現，包括p53，v-Rel，轉錄因子NF-Atc，c-Ab1非受體酪氨酸激酶，和脆弱的X綜合癥精神遲緩基因產物。它們正常引入/輸出流通的解控是人類疾病的重要暗示。細胞核引入和輸出過程可受蛋白與NLS或NES肽綴合的操縱?；蛑委熯^程中，外來DNA需要進入細胞核進行轉錄。提出途徑包括質粒和寡核苷酸與開始存在的具有NLSs的細胞核蛋白的復合作用作為它們細胞核引入的必要條件。(Boulikas，1998b)提出NLS肽與寡核苷酸和質粒的共價連接或質粒與具有多個NLS肽的蛋白形成復合體可增加它們的引入速度和基因表達效率。預計癌細胞與最終分化的細胞相比，可更有效地將外來DNA引入細胞核，因為它們增殖和蛋白引入的速度增加?？鼓[瘤藥物在另外的實施方案中，這里描述的脂質體包封的質?；蚬押塑账酓NA進一步包括其與包封或游離抗腫瘤劑組合用于降低腫瘤大小或限制其生長。優(yōu)選抗腫瘤劑是(i)具有雙-(2-氯乙基)-胺基的烷基化劑，如氮芥，苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，嘧啶苯芥，甘露醇氮芥，extramustinephosphat，氧氮芥，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，或trifosfamide；(ii)具有取代環(huán)乙亞胺基的烷基化劑，例如三銨嗪，噻替派，三亞胺苯醌或絲裂霉素；(iii)甲磺酸酯型的烷基化劑如白消安；(iv)烷基化N-烷基-N-亞硝基脲衍生物，例如卡莫司汀，羅氮芥，司莫司汀，或鏈脲霉素；(v)二溴甘露醇，達卡巴嗪或丙卡巴肼型的烷基化劑；(vi)絡合劑如順鉑；(vii)葉酸型抗代謝藥，例如氨甲喋呤；(viii)嘌呤衍生物如巰基嘌呤，硫鳥嘌呤，硫唑嘌呤，硫米嘌呤，阿糖腺苷，或嘌呤霉素和嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑；(ix)嘧啶衍生物，例如氟尿嘧啶，氟尿苷，呋氟尿嘧啶，阿糖胞苷，碘苷，氟胞嘧啶；(x)抗生素如更生霉素，柔紅霉素，阿霉素，普卡霉素，博萊霉素或依托泊苷；(xi)長春堿；(xii)蛋白在癌細胞中過度表達的抑制劑如端粒酶抑制劑，谷胱苷肽抑制劑，蛋白酶體抑制劑；(xiii)信號傳導途徑調節(jié)物或抑制劑如磷酸酶抑制劑，蛋白激酶C抑制劑，酪蛋白激酶抑制劑，胰島素樣生長因子-1受體抑制劑，ras抑制劑，ras-GAP抑制劑，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑；(xiv)腫瘤血管生成抑制劑如制管張素，制瘤素，內皮他丁，沙利度胺；(xv)免疫反應調節(jié)物和細胞因子，如干擾素，白介素，TNF-α；(xvi)胞外間質調節(jié)物如介質金屬蛋白酶抑制劑，stromelysin抑制劑，纖溶酶原激活抑制劑；(xvii)激素依賴性癌癥的激素調節(jié)物(乳腺癌，前列腺癌)，如抗雄激素，雌激素；(xviii)編程性細胞死亡調節(jié)物；(xix)bFGF抑制劑；(xx)多藥物耐受性基因抑制劑；(xxi)對抗在癌癥細胞中過度表達的抗原的單克隆抗體或抗體片段(對于乳腺癌的抗Her2/neu)；(xxii)表達將引起編程性細胞死亡，終止細胞周期，誘發(fā)對抗癌細胞的免疫反應，抑制腫瘤血管生成，即血管系統(tǒng)形成的抗癌基因，腫瘤抑制基因(p53，RB，BRCA1，E1A，bcl-2，MDR-1，p21，p16，bax，bcl-xs，E2F，IGF-IVEGF，制管張素，制瘤素，內皮他丁，GM-CSF，IL-12，IL-2，IL-4，IL-7，IFN-γ和TNF-α)；和(xxiii)反義寡核苷酸(反義c-fos，c-myc，K-ras)。任選這些藥物與chlormethamine，強地松龍，強的松，或丙卡巴肼組合或與放療聯合給藥。添加到廠中的未來的新抗癌藥物可望是核酶，形成三聯體的寡核苷酸，基因滅活寡核苷酸，針對控制細胞增殖或信號傳導途徑的基因的很多新基因，和阻斷信號傳導的化合物。抗癌藥物包括阿西維辛，阿柔比星，鹽酸阿考達唑，阿克羅寧，阿多來新，阿霉素，aldesleukin，六甲蜜胺，安波霉素，阿美蒽醌甲地孕酮，氨魯米特，安丫啶，anastrozole，安曲霉素，天冬酰胺酶，曲林菌素，氮胞苷，阿扎替派，含氮霉素，巴馬司他，苯佐替派，bicalutamide，鹽酸比生群，bisnafidedimesylate，bizelesin，博萊霉素硫酸鹽，brequinarsodium，溴匹立明，白消安，放線菌素C，7β17α二甲睪酮，卡醋胺，卡貝替姆，卡鉑，卡莫司汀，鹽酸洋紅霉素，carzelesin，cedefingol，苯丁酸氮芥，西羅霉素，順鉑，克拉立平，crisnatolmesylate，環(huán)磷酰胺，阿糖胞苷，達卡巴嗪，更生霉素，鹽酸柔紅霉素，decitabine，dexormaplatin，地扎呱寧，dezaguaninemesylate，地吖醌，docetaxel，阿霉素，鹽酸阿霉素，屈洛昔芬，屈洛昔芬citrate，丙酸甲雄烷酮，偶氮霉素，edatrexate，鹽酸依氟鳥氨酸，elsamitrucin，enloplatin，恩普氨酯，雙環(huán)氧派啶，鹽酸表柔比星，erbulozole，鹽酸依索比星，雌二醇氮芥，雌二醇氮芥磷酸鈉，依他硝唑，依托泊苷，磷酸依托泊苷，氯苯乙嘧胺，鹽酸法唑，法扎拉濱，芬維A胺，氟尿苷，磷酸氟達拉濱，氟尿嘧啶，氟環(huán)胞苷，fosquidone，磷曲星sodium，gemcitabine，gemcitabinehydrochloride，羥基脲，鹽酸伊達比星，異環(huán)磷酰胺，伊莫福斯，干擾素α-2a，干擾素α-2b，干擾素α-n1，干擾素α-n3，干擾素β-ia，干擾素γ-ib，異丙鉑，irinotecanhydrochloride，lanreotideacetate，letrozole，醋酸亮丙瑞林，liarozolehydrochloride，lometrexolsodium，羅氮芥，losoxantronehydrochloride，馬索丙考，美坦素，鹽酸氮芥，醋酸甲地孕酮，醋酸美侖孕酮，美法侖，美諾立爾，巰基嘌呤，氨甲喋呤，氨甲喋呤鈉，氯苯氨啶，美妥替派，米丁度胺，mitocarcin，絲裂紅素，米托菌素，米托馬星，絲裂霉素，米托司培，米托坦，鹽酸米托蒽醌，霉酚酸，諾考達唑，諾加霉素，ormaplatin，奧昔舒侖，紫杉醇，天門冬酰胺酶，佩里霉素，溴新斯的明，硫酸培洛霉素，過磷酰胺，哌泊溴烷，哌泊舒凡，piroxantronehydrochloride，普卡霉素，plomestane，卟菲爾鈉sodium，泊非霉素，潑尼莫斯汀，潑尼松，鹽酸丙卡巴肼，嘌呤霉素，鹽酸嘌呤霉素，吡唑霉素，利波腺苷，洛太米特，safingol，safingolhydrochloride，司莫司汀，辛曲秦，sparfosatesodium，司帕霉素，鹽酸螺旋鍺，螺莫司汀，螺鉑，鏈黑霉素，鏈脲霉素，sulofenur，他利霉素，紫杉酚，tecogalansodium，呋氟尿嘧啶，teloxantronehydrochloride，temoporfin，替尼泊苷，替羅昔隆，睪內酯，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤，噻替派，噻唑呋林，tirapazamine，鹽酸托泊替堪，托瑞米芬citrate，醋酸曲托龍，曲西立濱phosphate，三甲曲沙，曲美沙特gluGuronate，曲普瑞林，鹽酸妥布氯唑，尿嘧啶芥末，烏瑞替哌，vapreotide，verteporfin，硫酸長春堿，硫酸長春新堿，長春地辛，硫酸長春地辛，硫酸長春匹定，硫酸長春甘酯，硫酸環(huán)氧長春堿，長春瑞賓tartrate，硫酸異長春堿，硫酸長春利定，伏羅唑，折尼拉汀，凈司他丁，鹽酸佐柔比星。其它抗癌藥物包括20-表-1，25二羥基維生素D3，5-ethynyluracil，abiraterone，阿柔比星，acylfulvene，adecypenol，阿多來新，aldesleukin，ALL-TK拮抗劑，六甲蜜胺，安巴司丁，amidox，氨磷汀，aminolevulinicacid，amrubicin，安丫啶，阿那格雷，anastrozole，穿心蓮內酯，血管生成抑制劑，拮抗劑D，拮抗劑G，安雷利克斯，anti-dorsalizing形態(tài)發(fā)生蛋白-1，抗雄激素，抗雌激素，抗瘤酮，反義寡核苷酸，甘氨酸阿飛迪霉素，編程性細胞死亡基因調節(jié)物，編程性細胞死亡調節(jié)物，脫嘌呤核酸，ara-CDP-DL-PTBA，精氨酸脫氨酶，asulacrine，阿他關坦，阿曲氮芥，axinastatin1，axinastatin2，axinastatin3，阿扎西隆，azatoxin，azatyrosine，漿果赤霉素III衍生物，balanol，巴馬司他，BCR/ABL拮抗劑，benzochlorins，benzoylstaurosporine，β內酰胺衍生物，beta-alethine，betaclamycinB，樺木酸，bFGF抑制劑，bicalutamide，比生群，bisaziridinylspermine，bisnafide，bistrateneA，bizelesin，breflate，溴匹立明，布多替鈦，buthioninesulfoximine，鈣泊三醇，calphostinC，喜樹堿衍生物，canarypoxIL-2，capecitabine，carboxamide-氨基-三唑，carboxyamidotriazole，CaRestM3，CARN700，來自軟骨的衍生物，carzelesin，酪蛋白激酶抑制劑(ICOS)，粟精胺，殺菌肽B，西曲瑞利克斯，chlorlns，chloroquinoxalinesulfonamide，西卡前列素，順卟啉，克拉立平，氯米芬類似物，克霉唑，collismycinA，collismycinB，combretastatinA4，combretastatin類似物，conagenin，crambescidin816，crisnatol，cryptophycin8，cryptophycinA衍生物，curacinA，cyclopentanthraquinones，cycloplatam，cypemycin，阿糖胞苷ocfosfate，細胞溶解因子，磷酸己烷雌酚，dacliximab，decitabine，dehydrodidemninB，deslorelin，dexifosfamide，地拉佐生，dexverapamil，地吖醌，didemninB，didox，diethylnorspermine，二氫-5-氮胞苷，dihydrotaxol，9-dioxamycin，diphenylspiromustine，二十二醇，dolasetron，去氧氟尿苷，屈洛昔芬，屈大麻酚，duocarmycinSA，依布硒啉，ecomustine，edelfosine，edrecolomab，依氟鳥氨酸，欖香烯，emitefur，表柔比星，epristeride，雌二醇氮芥類似物，雌激素激動劑，雌激素拮抗劑，依他硝唑，磷酸依托泊苷，依西美坦，法唑，法扎拉濱，芬維A胺，非爾司亭，finasteride，flavopiridol，flezelastine，fluasterone，氟達拉濱，fluorodaunorunicinhydrochloride，福酚美克，福麥斯坦，磷曲星，福莫司汀，gadolinium，枸櫞酸鎵texaphyrin，galocitabine，ganirelix，明膠酶抑制劑，gemcitabine，谷胱苷肽抑制劑，hepsulfam，heregulin，環(huán)己烷bisacetamide，金絲桃素，ibandronicacid，伊達比星，idoxifene，idramantone，伊莫福新，ilomastat，imidazoacridones，imiquimod，免疫刺激肽，胰島素樣生長因子1受體，抑制劑，干擾素激動劑，干擾素，白介素，碘芐胍，碘阿霉素，ipomeanol，4-，irinotecan，iroplact，伊索格拉定，isobengazole，isohomohalicondrinB，itasetron，jasplakinolide，kahalalideF，lamellarin-Ntriacetate，lanreotide，leinamycin，來諾拉提，硫酸香菇多糖，leptolstatin，letrozole，白血病抑制因子，白細胞α干擾素，leuprolide+雌激素+孕激素，亮丙瑞林，左旋咪唑，liarozole，線性聚胺類似物，親脂二糖肽，親脂鉑化合物，lissoclinamide7，lobaplatin，蚯蚓磷脂，lometrexol，氯尼達明，losoxantrone，洛伐他汀，羅唑利賓，lurtotecan，lutetiumtexaphyrin，lysofylline，溶解肽，美坦新，mannostatinA，marimastat，馬索丙考，maspin，matrilysin抑制劑，間質金屬蛋白酶抑制劑，美諾立爾，merbarone，meterelin，methioninase，胃復安，MIF抑制劑，米非司酮，米爾佛森，mirimostim，錯配雙鏈RNA，米托胍腙，二溴衛(wèi)矛醇，絲裂霉素類似物，米托萘胺，mitotoxin成纖維細胞生長因子-saporin，米托蒽醌，mofarotene，莫拉司丁，單克隆抗體，人絨毛膜促性腺激素，單磷脂酰脂質A+分枝桿菌細胞壁sk，單哌潘生丁，多藥物耐性基因抑制劑，基于多腫瘤抑制劑1的治療，芥末抗癌劑，mycaperoxideB，分枝桿菌細胞壁提取物，myriaporone，Nacetyldinaline，N-取代苯甲酰胺，那法瑞林，nagrestip，納洛酮+鎮(zhèn)痛新，napavin，naphterpin，nartograstim，nedaplatin，nemorubicin，neridronicacid，中性內肽酶，尼魯米特，nisamycin，一氧化氮調節(jié)物，硝基氧抗氧化劑，nitrullyn，06-benzylguanine，奧曲肽，okicenone，寡核苷酸，onapristone，奧丹亞龍，奧丹亞龍，oracin，口服細胞因子誘導劑，ormaplatin，osaterone，奧沙利鉑，oxaunomycin，紫杉醇類似物，紫杉醇衍生物，palauamine，palmitoylrhizoxin，pamidronicacid，panaxytriol，panomifene，parabactin，帕折普汀，天門冬酰胺酶，peldesine，戊聚糖聚硫酸鈉，噴司他丁，pentrozole，perflubron，過磷酰胺，perillylalcohol，phenazinomycin，乙酸苯酯，磷酸酶抑制劑，溶鏈菌，鹽酸毛果蕓香堿，吡柔比星，吡曲克辛，placetinA，placetinB，纖溶酶原激活抑制劑，鉑復合體，鉑化合物，鉑三胺復合體，卟菲爾鈉sodium，甲基絲裂霉素，丙基雙丫啶酮，前列腺素J2，蛋白酶體抑制劑，基于蛋白A的免疫調節(jié)物，蛋白激酶C抑制劑，microalgal.，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑，嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑，紅紫素，pyrazoloacridine，吡醇羥乙酯血紅蛋白聚氧化乙烯綴合物，raf拮抗劑，raltitrexed，ramosetron，ras法尼蛋白轉移酶抑制劑，ras抑制劑，ras-GAP抑制劑，脫甲基retelliptine，錸Re186羥乙磷酸鹽，rhizoxin，核酶，RIIretinamide，洛太米特，rohitukine，羅莫肽，羅喹美克，rubihinoneB1，ruboxyl，safingol，saintopin，SarCNU，sarcophytolA，沙莫司亭，Sdi1模擬物，司莫司汀，變老衍生抑制劑1，正義寡核苷酸，信號傳導抑制劑，信號傳導調節(jié)物，單鏈抗原結合蛋白，西佐喃，sobuzoxane，sodiumborocaptate，乙酸苯酯鈉，solverol，促生長因子結合蛋白，sonermin，sparfosicacid，spicamycinD，螺莫司汀，splenopentin，spongistatin1，squalamine，干細胞抑制劑，干細胞分裂抑制劑，stipiamide，stromelysin抑制劑，sulfinosine，超活性血管腸肽拮抗劑，suradista，蘇拉明，八氫吲嗪三醇，合成糖胺聚糖，tallimustine，甲碘化三苯氧胺，?；悄就?，tazarotene，tecogalansodium，呋氟尿嘧啶，tellurapyrylium，端粒酶抑制劑，temoporfin，替莫唑胺，替尼泊苷，tetrachlorodecaoxide，tetrazomine，thaliblastine，沙利度胺，thiocoraline，thrombopoietin，thrombopoietin模擬物，thymalfasin，胸腺生成素受體激動劑，thymotrinan，甲狀腺刺激激素，tinethyletiopurpurin，tirapazamine，二氯環(huán)戊二烯鈦，托泊替堪，topsentin，托瑞米芬，totipotent干細胞因子，翻譯抑制劑，維A酸，三乙酰尿苷，曲西立濱，三甲曲沙，曲普瑞林，托比色創(chuàng)，turosteride，酪氨酸激酶抑制劑，tyrphostins，UBC抑制劑，烏苯美司，泌尿生殖竇衍生生長抑制因子，尿激酶受體拮抗劑，vapreotide，variolinB，velaresol，veramine，verdins，verteporfin，長春瑞賓，vinxaliine，vitaxin，伏羅唑，zanoterone，折尼拉汀，zilascorb，凈司他丁stimalamer。pH敏感性肽-DNA復合體在本發(fā)明的另外的實施方案中，提出質粒DNA中的基因與促融合肽/NLS綴合物相互作用。在另外的實施方案中，NLS部分是在大約5至6的pH時能夠呈現凈正電荷和在pH7以上時顯示降低或完全釋放這個電荷的一段組氨酰殘基。這些正電荷肽與負電荷質粒DNA分子間在pH5-6建立的靜電相互作用，在生理pH時變弱(pH敏感性肽-DNA復合體)。本發(fā)明的第一步包括帶組氨酰/促融合肽綴合物的質?；蚬押塑账酓NA和脂質成分之間在10-90％乙醇中，pH5.0至6.0形成復合體。條件應該是組氨酰殘基具有凈正電荷和可建立與質粒，寡核苷酸或負電荷藥物間的靜電相互作用。同時，正電荷脂質分子存在可促進微膠粒形成。第二步中，用水稀釋并與預先制備的脂質體或脂質在pH5-6混合使得微膠粒轉換到脂質體中。之后在pH7下透析并通過膜擠出，包入和包封質?；蚬押塑账岬礁弋a量。然而，第一步中肽和陽離子脂質的成分提供了內雙層的脂質，添加到第2步中的脂質體或脂質類型提供了最終脂質體制劑的外包被層(圖1)。肽制劑的實例包括HHHHHSPSL16(SEQIDNO623)和HHHHHSPS(LAI)5(SEQIDNO624)。以1∶0.5∶0.5摩爾比(DNA上的負電荷陽離子脂質體組氨酸肽)添加。肽以α螺旋構象插入脂質雙層內側且不僅進行DNA凝聚，也賦予復合體膜融合性能以改善通過細胞膜的入口。肽鏈中疏水氨基酸的類型(例如，芳香氨基酸的含量)非常重要如同肽鏈長度確保復合體的整體性和剛性。用與脂質綴合的聚乙二醇、透明質酸和其它聚合物包裹復合體的外表面使得顆粒具有在體液中長時間循環(huán)的性能和在靜脈內注射后導向實體腫瘤和它們的轉移灶的能力，以及穿過腫瘤細胞膜能力的顆粒。肽中NLS和促融合部分之間的蛋白酶敏感性連接微膠粒轉換到脂質體中本發(fā)明一個重要的問題是在乙醇存在下，DNA和陽離子脂質間形成的微膠粒轉換到脂質體中。這是將微膠粒復合體直接添加到預先形成的脂質體含水溶液中完成的。脂質體具有80-160nm的平均大小或反之亦然，使得最終乙醇溶液濃度低于10％。適合藥物用途和注射給人和動物的制劑將需要脂質體是PEG包裹的中性成分(如膽固醇，PE，PC)。然而，另一個重要的方面是本發(fā)明的研究應用，如轉染培養(yǎng)物中的細胞。脂質體含水溶液的成分是含陽離子脂質和因此適合轉染培養(yǎng)物中的細胞的任何類型脂質體，如DDABDOPE1∶1。這些脂質體是預先形成的且用超聲處理或擠出通過膜小型化至直徑80-160nm。乙醇微膠粒制劑接著添加到脂質體含水溶液中，伴隨乙醇溶液稀釋到低于10％。這一步將使DNA進一步凝聚或DNA上的負電荷磷酸基與脂質上的正電荷基團間的相互作用。必須注意應只有部分DNA上的負電荷被微膠粒中的脂質所中和。剩余的DNA電荷中和由在第二步中預先形成的脂質體的陽離子成分來提供。調控DNA和細胞核間質附著的DNA本發(fā)明另外的實施方案中，質粒DNA中的基因由使用鳥槍選擇方法從細胞核間質附著的DNA中分離的調控DNA序列來驅動。染色質的致密結構組織和各個染色體在細胞內的適當空間取向部分是由細胞核間質提供的。細胞核間質由DNA，RNA和蛋白組成，是細胞核中DNA復制，基因轉錄，DNA修復和染色體附著的部位。已經發(fā)現多樣的DNA序列組與細胞核間質關聯并稱作間質附著區(qū)域或MARs。MARs執(zhí)行很多功能，作為基因轉錄的激活劑，基因表達的沉默子，轉錄活性的隔離物，細胞核保留信號和DNA復制起點。當前的研究表明在不同組織類型中發(fā)現不同亞組MARs并可能協助調節(jié)細胞的特殊功能。間質中這種結構和調控分子的復合體分類的存在，以及DNA復制和轉錄復合體原位定位在間質中強烈表明細胞核間質在細胞核過程中起著基礎的獨特的作用?；蚪M結構化為結構域具有功能意義?；騻鬟f載體中包括特殊MAR元件在很多實驗和基因治療應用中可具有實用性。很多基因治療應用需要一個或多個基因在目的細胞類型中特異性表達延長的一段時間。載體內的MARs可增強導入的轉基因的轉錄，延長那個序列在細胞核內的保留或將那個轉基因的表達與共同轉導的基因表達相隔離(綜述見Boulikas，1995；Bodeetal，1996)。已經使用各種生物化學步驟鑒定基因內的調控區(qū)域。傳統(tǒng)地，調控DNA序列的鑒定和選擇依賴于冗長步驟如體外或體內轉錄因子足跡法，或從報道基因上游的較大基因組DNA序列亞克隆較小片段。這些方法最初已經用于鑒定最接近基因5’末端的區(qū)域。然而，在很多情況下，發(fā)現調控區(qū)域在與基因最接近的5’末端有相當大距離的地方，并提供細胞類型或發(fā)育階段的特異性。例如，Grosveld和Engel(Lakshmanan等人，1999)組的研究表明GATA-3基因位周圍的625kb以上的基因組序列是轉基因小鼠中基因正確發(fā)育表達所需要的。發(fā)現基因上游5-20kb距離的延伸DNA序列段負責表達的中樞神經系統(tǒng)特異性。基因上游20至130kb間的區(qū)域含有GATA-3泌尿生殖系特異性表達的調控區(qū)域，而基因下游90-180kb的序列提供心內特異性表達。目前公開的方法具有快速鑒定調控區(qū)域的潛力。在細胞中，染色質環(huán)形成，不同的附著區(qū)域用于不同的細胞類型或發(fā)育階段以調節(jié)基因表達。目前公開的基于它們與細胞核間質的附著而分離調控區(qū)域的方法可鑒定調控區(qū)域而不考慮它們與基因的距離。盡管人類基因組計劃預期到2000年基本完成，但不能得到有關估計的500,000個調控區(qū)域的絕大多數的位置和性質的信息。實施例1質粒DNA與各種試劑，以及各種陽離子脂質體制劑凝聚。凝聚影響轉染K562人紅白血病細胞培養(yǎng)物后β-半乳糖苷酶報道基因的表達水平。脂質體成分在下表和圖2中顯示。所有脂質來自AvantiPolarLipids(700IndustrialParkDrive，Alabaster，AL35007)。脂質與DNA的最佳比例是7nmol總脂質/μgDNA。將轉染試劑(10μgDNA與70nmol總脂質混合)轉移到小培養(yǎng)瓶中，隨后添加10mlK562細胞培養(yǎng)物(總細胞大約2百萬)；在DNA與脂質體混合后5-10分鐘，細胞與轉染試劑混合。在轉染后1-30天，檢測幾次細胞的β-半乳糖苷酶活性。轉染細胞作為正常細胞培養(yǎng)物維持在細胞培養(yǎng)物中。當用于轉染的細胞數量低，不接近融合時，得到最好結果。在所有實驗中，在血清和抗生素存在下，不去除轉染試劑或洗滌細胞，直接加入轉染材料。這簡化了轉染步驟并適合淋巴樣細胞和不貼附平皿但在懸液中生長的其它類型細胞培養(yǎng)物。所有DNA凝聚劑購自Sigma。它們以0.1mg/ml懸浮于水中。質粒pCMVβ購自Clontech并使用AltheaTechnologies的Anaconda試劑盒(SanDiego，CA)純化。聚K是聚賴氨酸，分子量9400。聚R是聚精氨酸。聚H是聚組氨酸。向100μl質粒溶液(10μg總質粒DNA)中加入20μl或50μl聚K，聚R，聚H；用水將體積調節(jié)到250μl，隨后加入大約70μl脂質體(7nmol/μgDNA)。在20℃溫育10分鐘至1小時后，使轉染混合物接觸細胞培養(yǎng)物。與普及的聚賴氨酸相比，最好的DNA凝聚劑是聚組氨酸。最好的陽離子脂質是DC-膽固醇(DC-CHOL3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)甲氨酰]膽固醇)。SFV是表達β-半乳糖苷酶的賽姆利基森林病毒。結果在圖2中顯示。實施例2使用基因載體(Lipogenes)將基因導向腫瘤如圖3所示，將人MCF-7乳腺癌細胞，在兩個部位皮下植入SCID(嚴重組合免疫缺陷)小鼠。在接種后大約30天，允許細胞發(fā)育到大的可測量的實體腫瘤。每只攜帶細菌β-半乳糖苷酶報道基因的小鼠腹膜內注射0.2mg質粒pCMVβDNA(質粒大小是～4kb)。質粒DNA(200μg，2.0mg/ml，0.1ml)與200μl由40％膽固醇，20％二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，12％棕櫚酰油酰卵磷脂(POPC)，10％氫化大豆卵磷脂(HSPC)，10％二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，5％鞘磷脂(SM)和3％衍生的形成囊泡的脂質M-PEG-DSPE組成的中性脂質體溫育5分鐘。在這個階段，質粒DNA與中性(兩性離子)脂質體發(fā)生弱復合。這確保了添加陽離子脂質體的隨后步驟中，質粒DNA均勻分布到脂質體中。質粒DNA與兩性離子脂質體復合后，加入50μl陽離子脂質體(DC-Chol1μmole/mlDOPE1.4μmole/ml)并在室溫溫育10分鐘。在這個階段，存在混合脂質體群體，最可能是形成了一種類型含來自兩性離子和陽離子脂質的脂質的脂質體-DNA復合體。將材料注射(0.35ml總體積)到動物的腹膜內腔。注射后5天，殺死動物，去除皮膚，尸體在X-gal染色溶液中37℃溫育大約30分鐘。動物在定影液X-gal染色溶液中溫育大約30分鐘(100μl濃縮的戊二醛添加到30mlX-gal染色溶液中)并在染色溶液中繼續(xù)溫育。在溫育期間經過一定的時間照像顯示β-半乳糖苷酶表達發(fā)生的優(yōu)選器官。由于圖3E顯示了腫瘤血管系統(tǒng)導向，所以數據暗示制管張素，內皮他丁或制瘤素基因轉移到腫瘤(它們的基因產物限制血管生長和抑制給腫瘤供血)可望成為癌癥治療的合理方法。而且，使用抗癌lipogenes與包封的藥物裝入導向腫瘤的脂質體的組合治療看來是合理的癌癥療法。應該理解的是盡管已經結合上面的實施方案描述了本發(fā)明，但是前述說明書和下列實施例旨在闡述而非限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明范圍內的其它方面，優(yōu)點和改進對本發(fā)明所屬領域的技術人員來說是顯而易見的。表3簡單NLS表4“二分”或“斷裂”NLS表5缺乏精氨酸/賴氨酸簇的“非正NLS”表6核仁定位信號(NoLS)表7非膜蛋白激酶上的親核簇表8DNA修復蛋白上的細胞核定位信號表9轉錄因子中的NLS表10其它細胞核蛋白中的NLS參考資料U.S.PatentDocuments4,394,448July，1983Szoka，Jr.etal.4,598,051July，1986Papahadjopoulosetal.5,013,556May，1991Woodleetal.JournalArticlesAllen，T.M.andChonn，A.(1987)“Largeunilamellarliposomeswithlowuptakeintothereticuloendothelialsystem”FEBSLett.22342-46.Allen，T.M.etal.(1991)“Liposomescontainingsyntheticlipidderivativmofpolyethyleneglycolshowprolongedcirculationhalf-livesinvivo”Biochim.Biophys.Acta106629-36.Anderson，W.F.(1992)“Humangenetherapy”Science256808-813.Aoki，K.etal.(1995)“Liposome-mediatedinvivogenetransferofantisenseK-rasconstructinhibitspancreatictumordisseminationinthemurineperitonealcavity”CancerRes.553810-3816.Arcasoy，S.M.etal.(1997)“Polycationsincreasetheefficiencyofadenovirus-mediatedgenetransfertoepithelialandendothelialcellsinvitro”GeneTher.432-38.Beauchamp，C.O.etal.(1983)“Anewprocedureforthesynthesisofpolyethyleneglycol-proteinadducts；effectsonfunction，receptorrecognition，andclearanceofsuperoxidedismutase，lactoferrin，andalpha2-macroglobulin”Anal.Biochem.13125-33.Bongartz，J.-P.etal.(1994)“Improvedbiologicalactivityofantisenseoligonucleotidesconjugatedtoafusogenicpeptide”Nucl.AcidsRes.224681-4688.Boulikas，T.(1993)“Nuclearlocalizationsignals(NLS)”Crit.Rev.Eukar.GeneExpression3193-227.Boulikas，T.(1994)“Putativenuclearlocalizationsignals(NLS)inproteintranscriptionfactors”J.Cell.Biochem.5532-58.Boulikas，T.(1996a)“Cancergenetherapyandimmunotherapy“Intl.J.Oncol.9941-954.Boulikas，T.(1996b)“Genetherapytohumandiseasesexvivoandinvivostudies”Intl.J.Oncol.91239-1251.Boulikas，T.(1996c)“LiposomeDNAdeliveryanduptakebycells”O(jiān)ncol.Rep.3989-995.Boulikas，T.(1996d)“Nuclearimportofproteinkinasesandcyclins”J.Cell.Biochem.6061-82.Boulikas，T.(1997a)“Genetherapyofprostatecancerp53，suicidalgenes，andothertargets”AnticancerRes.171471-1506.Boulikas，T.(1997b)“NuclearimportofDNArepairproteins”AnticancerRes.17843-864.Boulikas，T.(1997c)“NuclearlocalizationsignalpeptidesfortheimportofplasmidDNAingenetherapy”Int.J.Oncol.10301-309.Boulikas，T.(1998a)“Statusofgenetherapyin1997Molecularmechanisms，diseasetargets，andclinicalapplications”GeneTher.Mol.Biol.11-172.Boulikas，T.(1998b)“NucleocytoplasmictraffickingimplicationsforthenuclearimportofplasmidDNAduringgenetherapy”GeneTher.Mol.Biol.1713-740.Boulikas，T.andMartin，F.(1997)“Histones，protamine，andpolylysinebutnotpoly(EK)enhancetransfectionefficiency”Int.J.Oncol.10317-322.Capaccioli，S.etal.(1993)“Cationiclipidsimproveantisenseoligonucleotideuptakeandpreventdegradationinculturedcellsandinhumanserum”Biochem.Biophys.Res.Comm.197818-825.Creuzenet，C.etal.(1997)“Interactionofalphas2-andbeta-caseinsignalpeptideswithDMPCandDMPGliposomes”Peptides18463-472.Culver，K.W.(1996)inGeneTherapyAprimerforphysicians，SecondEdition.MaryAnnLiebert，Inc.Publications，NY，pp.1-198.Curtain，C.etal.(1999)“TheinteractionsoftheN-terminalfusogenicpeptideofHIV-1gp41withneutralphospholipids”Eur.Biophys.J.28427-436.delaMaza，A.etal.(1998)“Solubilizationofphosphatidylcholineliposomesbytheamphotericsurfactantdodecylbetaine”Chem.Phys.Lipids9471-79.Decout，A.etal.(1999)“Contributionofthehydrophobicitygradienttothesecondarystructureandactivityoffusogenicpeptides”Mol.Membr.Biol.16237-246.Duguid，J.G.etal.(1998)“Aphysicochemicalapproachforpredictingtheeffectivenessofpeptide-basedgenedeliverysystemsforuseinplasmid-basedgenetherapy”Biophys.J.742802-2814.Filion，M.C.andPhillips，N.C.(1997)“Toxicityandimmunomodulatoryactivityofliposomalvectorsformulatedwithcationiclipidstowardimmuneeffectorcells”Biochim.Biophys.Acta1329345-356.Fresta，M.etal.(1998)“Liposomaldeliveryofa30-merantisenseoligodeoxynucleotidetoinhibitproopiomelanocortinexpression”J.Pharm.Sci.87616-625.Gabizon，A.andPapahadjopoulos，D.(1988)“Liposomeformulationswithprolongedcirculationtimeinbloodandenhanceduptakebytumors”Proc.Natl.Acad.Sci.USA856949-6953.Gabizon，A.etal.(1989)“Pharmacokineticsandtissuelocalizationofdoxorubicinencapsulatedinstableliposomeswithlongcirculationtimes”J.Natl.CancerInst.811484-1488.Ghosh，J.K.andShai，Y.(1999)“DirectEvidencethattheN-TerminalHeptadRepeatofSendaiVirusFusionProteinParticipatesinMembraneFusion”J.Mol.Biol.292531-546.Green，M.andLoewenstein，P.M.(1988)“Autonomousfunctionaldomainsofchemicallysynthesizedhumanimmunodeficiencyvirustattransactivatorprotein”Cell551179-1188.Gupta，D.andKothekar，V.(1997)“500picosecondmoleculardynamicssimulationofamphiphilicpolypeptideAc(LKKL)4NHEtwith1，2di-mysristoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine(DMPC)molecules”IndianJ.Biochem.Biophys.34501-511.Hofiaud，H.E.J.etal.(1996)“Formationofstablecationiclipid/DNAcomplexesforgenetransfer”Proc.Natl.Acad.Sci.USA937305-7309.Jaaskelainen，I.etal.(1994)“Oligonucleotide-cationicliposomeinteractions.Aphysicochemicalstudy”Biochim.Biophys.Acta1195115-123.Judice，J.K.etal.(1997)“InhibitionofHIVtype1infectivitybyconstrainedalpha-helicalpsptidesimplicationsfortheviralfusionmechanism”Proc.Natl.Acad.Sci.USA9413426-13430.Kono，K.etal.(1993)“Fusionactivityofanamphiphilicpolypeptidehavingacidicaminoacidresiduesgenerationoffusionactivitybyalpha-helixformationandchargeneutralization”Biochim.Biophys.Acta116481-90.Lambert，G.etal.(1998)“TheC-terminalhelixofhumanapolipoproteinAIIpromotesthefusionofunilamellarliposomesanddisplacesapolipoproteinAIfromhigh-densitylipoproteins”Eur.J.Biochem.253328-338.Lambert，O.etal.(1998)“Anew“gel-like”phaseindodecylmaltoside-lipidmixturesimplicationsinsolubilizationandreconstitutionstudies”Biophys.J.74918-930.Lappalainen，K.etal.(1997)“Intracellulardistributionofoligonucleotidesdeliveredbycationicliposomeslightandelectronmicroscopicstudy”Histochem.Cytochem.45265-274.Lasic，D.(1997)inLiposomesinGeneDelivery，CRCPress，pp.1-295.Lee，S.etal.(1992)“Effectofamphipathicpeptideswithdifferentalpha-helicalcontentsonliposome-fusion”Biochim.Biophys.Acta1103157-162.Lelkes，P.I.andLazarovici，P.(1988)“Pardaxininducesaggregationbutnotfusionofphosphatidylserinevesicles”FEBSLett.230131-136.Leonard，A.N.andCohen，D.E.(1998)“Submicellarbilesaltsstimulatephosphatidylcholinetransferactivityofsterolcarderprotein2”J.LipidRes.391981-1988.Lewis，J.G.etal.(1996)“Aserum-resistantcytofectinforcellulardeliveryofantisenseoligodeoxynucleotidesandplasmidDNA”Proc.Natl.Acad.Sci.USA933176-3181.Li，S.andHuang，L.(1997)“Invivogenetransferviaintravenousadministrationofcationiclipid-protamine-DNA(LPD)complexes”GeneTher.4891-900.Lins，L.etal.(1999)“MoleculardeterminantsoftheinteractionbetweentheC-terminaldomainofAlzheimer′sbeta-amyloidpeptideandapolipoproteinEalpha-helices”J.Neurochem.73758-769.Litzinger，D.C.etal.(1996)“Fateofcationicliposomesandtheircomplexwitholigonucleotideinvivo”Biochim.Biophys.Acta1281139-149.Lopez，O.etal.(1998)“DirectformationofmixedmicellesinthesolubilizationofphospholipidliposomesbyTritonX-100”FEBSLett.426314-318.Lusa，S.etal.(1998)“Directobservationoflipoproteincholesterolesterdegradationinlysosomes”Biochem.J.332451-457.Macosko，J.C.etal.(1997)“Themembranetopologyofthefusionpeptideregionofinfluenzahemagglutinindeterminedbyspin-labelingEPR”J.Mol.Biol.2671139-1148.Macreadie，I.G.etal.(1997)“CytotoxicityresultingfromadditionofHIV-1NefN-terminalpeptidestoyeastandbacterialcells”Biochem.Biophys.Res.Commun.232707-711.Martin，F.andBoulikas，T.(1998)“Thechallengeofliposomesingenetherapy”GeneTher.Mol.Biol.1173-214.Martin，I.etal.(1999)“Membranefusioninducedbyashortfusogenicpeptideisassessedbyitsinsertionandorientationintotargetbilayers”Biochemistry389337-9347.Martin，I.andRuysschaert，J.M.(1997)“Comparisonoflipidvesiclefusioninducedbytheputativefusionpeptideoffertilin(aproteinactiveinsperm-eggfusion)andtheNH2-terminaldomainoftheHIV2gp41”FEBSLett.405351-355.Massari，S.andColonna，R.(1986)“Gramicidininducedaggregationandsizeincreaseofphosphatidylcholinevesicles”Chem.Phys.Lipids39203-220.Melino，S.etal.(1999)“Zn(2+)ionsselectivelyinduceantimicrobialsalivarypeptidehistatin-5tofusenegativelychargedvesicles.Identificationandcharacterizationofazinc-bindingmotifpresentinthefunctionaldomain”Biochemistry389626-9633.Midoux，P.andMonsigny，M.(1999)“Efficientgenetransferbyhistidylatedpolylysine/pDNAcomplexes”Bioeonjug.Chem.10406-411.Murata，M.etal.(1991)“ModificationoftheN-terminusofmembranefusion-activepeptidesblocksthefusionactivity”Biochem.Biophys.Res.Commun.1791050-1055.Niidome，T.etal.(1997)“MembraneinteractionofsyntheticpeptidesrelatedtotheputativefusogenicregionofPH-30alpha，aproteininsperm-eggfusion”J.PeptideRes.49563-569.Pak，C.C.etal.(1999)“Elastaseactivatedliposomaldeliverytonucleatedcells”Biochim.Biophys.Acta1419111-126.Papahadjopoulos，D.etal.(1991)“StericallystabilizedliposomesImprovementsinpharmacokineticsandantitumortherapeuticefficacy”Proc.Natl.Acad.Sci.USA8811460-11464.Parente，R.A.etal.(1988)“pH-dependentfusionofphosphatidylcholinesmallvesicles.Inductionbyasyntheticamphipathicpeptide”J.Biol.Chem.2634724-4730.Partidos，C.D.etal.(1996)“Primingofmeaslesvirus-specificCTLresponsesafterimmunizationwithaCTLepitopelinkedtoafusogenicpeptide”Virology215107-110.Pecheur，E.I.etal.(1997)“Membraneanchoragebringsaboutfusogenicpropertiesinashortsyntheticpeptide”Biochemistry363773-3781.Peelman，F.etal.(1999)“Characterizationoffunctionalresiduesintheinterfacialrecognitiondomainoflecithincholesterolacyltransferase(LCAT)”ProteinEng.1271-78.Pereira，F.B.etal.(1997)“PermeabilizationandfusionofunchargedlipidvesiclesinducedbytheHIV-1fusionpeptideadoptinganextendedconformationdoseandsequenceeffects”Biophys.J.731977-1986.Pillot，T.etal.(1999)“Thenonfibrillaramyloidbeta-peptideinducesapoptoticneuronalcelldeathinvolvementofitsC-terminalfusogenicdomain”J.Neurochem.731626-1634.Pillot，T.etal.(1997)“SpecificmodulationofthefusogenicpropertiesoftheAlzheimerbeta-amyloidpeptidebyapolipoproteinEisoforms”Eur.J.Biochem.243650-659.Pillot，T.etal.(1997)“The118-135peptideofthehumanprionproteinformsamyloidfibrilsandinducesliposomefusion”J.Mol.Biol.274381-393.Plank，C.etal.(1996)“ActivationofthecomplementsystembysyntheticDNAcomplexesapotentialbarrierforintravenousgenedelivery”Hum.GeneTher.71437-1446.Rodriguez-Crespo，I.etal.(1994)“PredictionofaputativefusionpeptideintheSproteinofhepatitisBvirus”J.Gen.Virol.75637-639.Rodriguez-Crespo，I.etal.(1999)“Fusogenicactivityofhepadenaviruspeptidescorrespondingtosequencesdownstreamoftheputativecleavagesite”Virology261133-142.Ross，G.etal.(1996)“GenetherapyintheUnitedStatesafive-yearstatusreport”Hum.GeneTher.71781-1790.Schroeder，F.etal.(1990)“Intermembranecholesteroltransferroleofsterolcarrierproteinsandphosphatidylserine”Lipids25669-674.Schroth-Diez，B.etal.(1998)“Fusionactivityoftransmembraneandcytoplasmicdomainchimerasoftheinfluenzavirusglycoproteinhemagglutinin”J.Virol.72133-141.Schutze，W.andMuller-Goymann，C.C.(1998)“Phasetransformationofaliposomaldispersionintoamicellarsolutioninducedbydrug-loading”Pharm.Res.15538-543.Song，Y.K.etal.(1997)“Characterizationofcationicliposome-mediatedgenetransferinvivobyintravenousadministration”Hum.GeneTher.81585-1594.Sorgi，F.L.etal.(1997)“Protaminesulfateenhanceslipid-mediatedgenetransfer”GeneTher.4961-968.Suenaga，M.etal.(1989)“Basieamphipathiehelicalpeptidesinducedestabilizationandfusionofacidicandneutralliposomes”Biochim.Biophys.Acta981143-150.Takle，G.B.etal.(1997)“DeliveryofoligoribonucleotidestohumanhepatomacellsusingcationiclipidparticlesconjugatedtoferricprotoporphyrinIX(heme)”AntisenseNucleicAcidDrugDev.7177-185.Templeton，N.S.etal.(1997)“ImprovedDNAliposomecomplexesforincreasedsystemicdeliveryandgeneexpression”NatureBiotechnol.15647-652.Thierry，A.R.andDritschilo，A.(1992)“Intracellularavailabilityofunmodified，phosphorothioatedandliposomallyencapsulatedoligodeoxynucleotidesforantisenseactivity”Nucl.AcidsRes.205691-5698.Tirosh，O.etal.(1998)“Hydrationofpolyethyleneglycol-graftedliposomes”Biophys.J.741371-1379.Torchilin，V.P.(1998)“Polymer-coatedlong-circulatingmicroparticulatepharmaceuticals”J.Microencapsul.151-19.Torchilin，V.P.etal.(1992)“Targetedaccumulationofpolyethyleneglycol-coatedimmunoliposomesininfarctedrabbitmyocardium”FASEBJ.62716-2719.Toumois，H.etal.(1990)“GramicidinAinducedfusionoflargeunilamellardioleoylphosphatidylcholinevesiclesanditsrelationtotheinductionoftypeIInonbilayerstructures”Biochemistry298297-8307.Ulrich，A.S.etal.(1999)Ultrastmeturalcharacterizationofpeptide-inducedmembranefusionandpeptideself-assemblyinthelipidbilayer”Biophys.J.77829-841.Voneche，V.etal.(1992)“The19-27aminoacidsegmentofgp51adoptsanamphiphilicstructureandplaysakeyroleinthefusioneventsinducedbybovineleukemiavirus”J.Biol.Chem.26715193-15197.Wattiaux，R.etal.(1997)“Cationiclipidsdestabilizelysosomalmembraneinvitro”FEBSLett.417199-202.Weissig，V.etal.(1998)“Accumulationofprotein-loadedlong-circulatingmicellesandliposomesinsubcutaneousLewislungcarcinomainmice”Pharm.Res.151552-1556.Zelphati，O.andSzoka，Jr.，F.C.(1997)“Intracellulardistributionandmechanismofdeliveryofoligonucleotidesmediatedbycationiclipids”Pharm.Res.131367-1372.Zuidam，N.J.andBarenholz，Y.(1997)“Electrostaticparametersofcationicliposomescommonlyusedforgenedeliveryasdeterminedby4-heptadecyl-7-hydroxycoumarin”Biochim.Biophys.Acta1329211-222.序列表<110>Boulikas，Teni<120>質粒DNA(LIPOGENESTM)和含細胞核定位信號/促融合肽綴合物的治療劑包封到定向脂質體復合體中<130>TB2002.40<140>PCT/US08/18657<141>2001-06-08<150>US09/876,904<151>2001-06-08<150>US60/210,925<151>2000-06-09<160>624<170>FastSEQforWindows版本4.0<210>1<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>促融合/NLS肽綴合物<400>1LysAlaTrpLeuLysAlaPheLysAlaTrpLeuLysAlaPheLysAla151015TrpLeuLysAlaPhe20<210>2<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>促融合/NLS肽綴合物<400>2GlyLeuPheLysAlaAlaAlaLysLeuLeuLysSerLeuTrpLysLeu151015LeuLeuLysAla20<210>3<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>促融合/NLS肽綴合物<400>3LeuLeuLeuLysAlaPheAlaLysLeuLeuLysSerLeuTrpLysLeu151015LeuLeuLysAla20<210>4<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>來自流感病毒血細胞凝集素HA-2的促融合/NLS肽綴合物<400>4GlyLeuPheLysAlaIleAlaGlyPheIleLysAsnGlyTrpLysGly151015MetIleAspGlyGlyGlyTyrCys20<210>5<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>來自HIV的TAT的促融合/NLS肽綴合物<400>5TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg1510<210>6<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>鴨乙型肝炎病毒S蛋白的N末端區(qū)域<223>Xaa＝質粒或寡核苷酸DNA的正電荷賴氨酸、精氨酸或組氨酸基<221>變異體<222>17<223>Xaa＝任何氨基酸<400>6MetSerGlyThrPheGlyGlyIleLeuAlaGlyLeuIleGlyLeuLeu151015Xaa<210>7<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>埃博拉病毒跨膜蛋白促融合肽<400>7GlyAlaAlaIleGlyLeuAlaTrpIleProTyrPheGlyProAlaAla151015<210>8<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>促融合/NLS肽綴合物<223>Xaa＝12-20個含有A、L、I、W、F的疏水性氨基酸和其它疏水性氨基酸的序列段<400>8ProLysLysArgArgGlyProSerProXaa1510<210>9<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>來自流感病毒血細胞凝集素HA-2的促融合肽<400>9GlyLeuPheGluAlaIleAlaGlyPheIleGluAshGlyTrpGluGly151015MetIleAspGlyGlyGlyTyrCys20<210>10<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>TAT促融合肽<400>10TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg1510<210>11<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>唾液抗微生物肽的結構域，位于histatin-5的c末端功能域<221>變異體<222>3，4<223>Xaa＝任何氨基酸<400>11HisGluXaaXaaHis15<210>12<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>促融合肽<400>12TyrLysAlaLysTrpLys15<210>13<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>兩親肽<400>13GlyLeuPheGluAlaLeuLeuGluLeuLeuGluSerLeuTrpGluLeu151015LeuLeuGluAla20<210>14<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>土撥鼠乙型肝炎病毒的S蛋白<400>14MetSerProSerSerLeuLeuGlyLeuLeuAlaGlyLeuGlnValVal151015<210>15<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>兩親促融合肽<400>15LeuLysLysLeuLeuLysLysLeuLeuLysLysLeuLeuLysLysLeu151015<210>16<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>堿性兩親肽<400>16LeuAlaArgLeuLeuAlaArgLeuLeuAlaArgLeu1510<210>17<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>含主要重復單位Glu-Ala-Leu-Ala的30-氨基酸肽<400>17GluAlaLeuAlaGlyAlaLeuAlaGlyAlaLeuAlaGlyAlaLeuAla151015GlyAlaLeuAlaGlyAlaLeuAlaGlyAlaLeuAla2025<210>18<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>形成a螺旋的兩親結構<221>MODRES<222>(1)...(4)<223>Xaa＝Aib(2-氨基異丁酸)<400>18GluXaaLeuXaa1<210>19<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>促融合肽<223>Xaa＝DOPE<400>19AlaAlaProXaaXaaXaa15<210>20<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>野生型SV40大T蛋白<400>20ProLysLysLysArgLysVal15<210>21<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>K變?yōu)镸的SV40大T<223>Xaa＝Kx11<400>21ProLysLysLysArgMetVal15<210>22<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>與BSA或IgG交聯的來自SV40大T抗原的合成NLS肽在微量注射于非洲爪蟾卵母細胞后介導其細胞核定位<400>22ProLysLysLysArgLysValGluAspPro1510<210>23<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>SV40大T抗原的合成肽<400>23CysGlyTyrGlyProLysLysLysArgLysValGlyGly1510<210>24<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>SV40大T蛋白長NLS<400>24CysTyrAspAspGluAlaThrAlaAspSerGlnHisSerThrProPro151015LysLysLysArgLysValGluAspProLysAspPheGluSerGluLeu202530LeuSer<210>25<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>SV40大T蛋白<400>25CysGlyGlyProLysLysLysArgLysValGly1510<210>26<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>SV40大TNLS的突變(R變?yōu)門)形式<400>26ProLysLysLysIleLysVal15<210>27<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>酵母GAL4(99KD)<223>Xaa＝Kx11<400>27MetLysXaaCysArgLeuLysLysLeuLysCysSerLysGluLysPro151015LysCysAlaLysCysLeuLysArgLysThrLysArg2025<210>28<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>酵母GAL4<400>28MetLysCysArgLeuLysLysLeuLysCysSerLysGluLysProLys151015CysAla<210>29<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>多形瘤大T蛋白<400>29ProLysLysAlaArgGluAsp15<210>30<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>多形瘤大T蛋白<400>30ValSerArgLysArgProArg15<210>31<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>多形瘤病毒大T蛋白<400>31CysGlyTyrGlyValSerArgLysArgProArgProGly1510<210>32<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>SV40VP1衣殼多肽(46KD)<400>32AlaProThrLysArgLysGlySer15<210>33<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>多形瘤病毒主要衣殼蛋白VP1<400>33AlaProLysArgLysSerGlyValSerLysCys1510<210>34<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>SV40VP2衣殼蛋白(39KD)<400>34ProAsnLysLysLysArgLys15<210>35<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>多形瘤病毒衣殼蛋白VP2<400>35GluGluAspGlyProGlnLysLysLysArgArgLeu1510<210>36<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>酵母組蛋白H2B<400>36GlyLysLysArgSerLysAla15<210>37<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>腺病毒Ela<400>37LysArgProArgPro15<210>38<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>腺病毒型2/5Ela<400>38CysGlyGlyLeuSerSerLysArgProArgPro1510<210>39<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>非洲爪蟾N1(590氨基酸)<400>39LeuValArgLysLysArgLysThrGluGluGluSerPro1510<210>40<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>非洲爪蟾N1(590氨基酸)<400>40LeuLysAspLysAspAlaLysLysSerLysGlnGlu1510<210>41<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>v-Rel或p59v-rel轉化蛋白<400>41GlyAsnLysAlaLysArgGlnArgSerThr1510<210>42<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>流感病毒A的NS1蛋白<400>42ProPheLeuAspArgLeuArgArgAspGlnLys1510<210>43<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>流感病毒A的NS1蛋白<400>43ProLysGlnLysArgLysMetAlaArg15<210>44<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人核纖層蛋白A<400>44SerValThrLysLysArgLysLeuGlu15<210>45<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>非洲爪蟾核纖層蛋白A<400>45SerAlaSerLysArgArgArgLeuGlu15<210>46<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>非洲爪蟾核纖層蛋白L1<400>46ThrLysGlyLysArgLysArgIleAsp15<210>47<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>非洲爪蟾核纖層蛋白L1<400>47CysValArgThrThrLysGlyLysArgLysArgIleAspVal1510<210>48<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人c-myc癌蛋白<400>48AlaCysIleAspLysArgValLysLeuAsp1510<210>49<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人c-myc癌蛋白<400>49AlaCysIleAspLysArgValLysLeuAsp1510<210>50<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人c-myc癌蛋白<400>50ArgGlnArgArgAsnGluLeuLysArgSerPro1510<210>51<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>小鼠c-ab1(IV)基因產物<400>51SerAlaLeuIleLysLysLysLysLysMetAlaPro1510<210>52<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>腺病毒5DBP(DNA結合蛋白)<400>52ProProLysLysArgMetArgArgArgIleGlu1510<210>53<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>腺病毒5DBP(DNA結合蛋白)<400>53ProLysLysLysLysLysArgPro15<210>54<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>大鼠GR，糖皮質激素受體<400>54TyrArgLysCysLeuGlnAlaGlyMetAsnLeuGluAlaArgLysThr151015LysLysLysIleLysGlyIleGlnGlnAlaThrAla2025<210>55<211>53<212>PRT<213>人工序列<220><223>人ERNLS<400>55ArgLysAspArgArgGlyGlyArgMetLeuLysHisLysArgGlnArg151015AspAspGlyGluGlyArgGlyGluValGlySerAlaGlyAspMetArg202530AlaMetIleAsnCysIleAspAsnLeuTrpProSerProLeuMetIle354045LysArgSerLysLys50<210>56<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>兔PG，孕激素受體<400>56ArgLysPheLysLysPheAsnLys15<210>57<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>雞Etsl核心NLS<400>57GlyLysArgLysAsnLysProLys15<210>58<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>c-myb基因產物<400>58ProLeuLeuLysLysIleLysGln15<210>59<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>N-myc基因產物<400>59ProProGlnLysLysIleLysSer15<210>60<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>p53<400>60ProGlnProLysLysLysPro15<210>61<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>c-erb-A基因產物<400>61SerLysArgValAlaLysArgLysLeu15<210>62<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>腺病毒型2/5型Ela<400>62CysGlyGlyLeuSerSerLysArgProArgPro1510<210>63<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>酵母核糖體蛋白L29<400>63MetThrGlySerLysThrArgLysHisArgGlySerGlyAla1510<210>64<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>酵母核糖體蛋白L29<400>64MetThrGlySerLysHisArgLysHisProGlySerGlyAla1510<210>65<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>從酵母L29核糖體蛋白NLS衍生的突變肽<400>65ArgHisArgLysHisPro15<210>66<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>從酵母L29核糖體蛋白NLS衍生的突變肽<400>66LysArgArgLysHisPro15<210>67<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>從酵母L29核糖體蛋白NLS衍生的突變肽<400>67LysTyrArgLysHisPro15<210>68<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>從酵母L29核糖體蛋白NLS衍生的突變肽<400>68LysHisArgArgHisPro15<210>69<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>從酵母L29核糖體蛋白NLS衍生的突變肽<40O>69LysHisLysLysHisPro15<210>70<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>從酵母L29核糖體蛋白NLS衍生的突變肽<400>70ArgHisLeuLysHisPro15<210>71<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>從酵母L29核糖體蛋白NLS衍生的突變肽<400>71LysHisArgLysTyrPro15<210>72<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>從酵母L29核糖體蛋白NLS衍生的突變肽<400>72LysHisArgGlnHisPro15<210>73<211>33<212>PRT<213>人工序列<220><223>乙型肝炎病毒核心抗原的雙NLS<400>73ProGluThrThrValValArgArgArgGlyArgSerProArgArgArg151015ThrProSerProArgArgArgArgSerProArgArgArgArgSerGln202530Ser<210>74<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>病毒Jun，AP-1復合體的轉錄因子<400>74AlaSerLysSerArgLysArgLysLeu15<210>75<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>人T細胞白血病病毒Tax反式激活蛋白<400>75GlyGlyLeuCysSerAlaArgLeuHisArgHisAlaLeuLeuAlaThr151015<210>76<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>小鼠核Mx1蛋白<400>76AspThrArgGluLysLysLysPheLeuLysArgArgLeuLeuArgLeu151015AspGlu<210>77<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>與牛血清蛋白交聯的合成肽<400>77CysGlyTyrGlyProLysLysLysArgLysVal1510<210>78<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>與牛血清蛋白交聯的合成肽<400>78CysGlyTyrGlyAspArgAsnLysLysLysLysGlu1510<210>79<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>與牛血清蛋白交聯的合成肽<400>79CysGlyTyrGlyAlaArgLysThrLysLysLysIleLys1510<210>80<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>與牛血清蛋白交聯的合成肽<400>80CysGlyTyrGlyIleArgLysAspArgArgGlyGlyArg1510<210>81<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>與牛血清蛋白交聯的合成肽<400>81CysGlyTyrGlyAlaArgLysLeuLysLysLeuGlyAsn1510<210>82<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人著色性干皮病A組互補蛋白<400>82ArgLysArgGlnArgAlaLeuMetLeuArgGlnAlaArg1510<210>83<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>根癌土壤桿菌根瘤誘導質粒的T-DNA-連接的virD2內切核酸酶<400>83GluTyrLeuSerArgLysGlyLysLeuGluLeu1510<210>84<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>酵母TRMI的推定的核心NLS<400>84LysLysSerLysLysLysArgCys15<210>85<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>Max蛋白<400>85ProGlnSerArgLysLysLeuArg15<210>86<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人泡沫逆轉錄病毒的Gag蛋白<400>86GlnProGlnArgTyrGlyGlyGlyArgGlyArgArgTrp1510<210>87<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>非洲爪蟾核質蛋白<400>87ThrLysLysAlaGlyGlnAlaLysLysLys1510<210>88<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>非洲爪蟾核質蛋白<400>88ThrLysLysAlaGlyGlnAlaLysLysLysLysLeuAsp1510<210>89<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>非洲爪蟾核質蛋白<400>89ThrLysLysAlaGlyGlnAlaLysLysLysLysLeuAsp1510<210>90<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>非洲爪蟾核質蛋白衍生的合成肽<400>90CysGlyGlnAlaLysLysLysLysLeuAsp1510<210>91<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>非洲爪蟾核質蛋白二分NLS<400>91LysArgProThrLysLysAlaGlyGlnAlaLysLysLysLys1510<210>92<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>酵母L3核糖體蛋白<400>92HisArgLysTyrGluAlaProArgHisProArgLysArg1510<210>93<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>SV40Bp3結構蛋白<400>93AsnLysLysLysArgLysLeuSerArgGlySerSerGlnLysThrLys151015GlyThrSerAlaSerAlaLysAlaArgHisLysArgArgAsnArgSer202530SerArgSer35<210>94<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>猿肉瘤病毒v-sis基因產物<400>94ArgValThrIleArgThrValArgValArgArgProProLysGlyLys151015HisArgLys<210>95<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>X.Laevis蛋白因子的推定的二分NLS<400>95LysArgLysIleGluGluProGluProGluProLysLysAlaLys151015<210>96<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>酵母SW15基因產物<400>96LysLysTyrGluAsnValVallleLysArgSerProArgLysArgGly151015ArgProArgLysAsp20<210>97<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>流感病毒聚合酶堿性蛋白2的二分NLS<400>97MetLysArgLysArgAsnSer15<210>98<211>46<212>PRT<213>人工序列<220><223>流感病毒聚合酶堿性蛋白2的二分NLS<400>98GlyIleGluSerIleAspAsnValMetGlyMetIleGlyIleLeuPro151015AspMetThrProSerThrGluMetSerMetArgGlyValArgIleSer202530LysMetGlyValAspGluThrSerSerAlaGluLysIleVal354045<210>99<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>腺病毒DNA聚合酶的“三分”或“雙二分”NLS<400>99AlaHisArgAlaArgArgLeuHis15<210>100<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>腺病毒DNA聚合物的“三分”或“雙二分”NLS<400>100ProProArgArgArgValArgGlnGlnProPro1510<210>101<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>腺病毒DNA聚合物的“三分”或“雙二分”NLS<400>101ProAlaArgAlaArgArgArgArgAlaPro1510<210>102<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人聚(ADP-核糖)聚合物<400>102LysArgLysLysLysLysSerLysLys15<210>103<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>單純皰疹病毒ICP8蛋白<400>103GlyArgLysArgAlaPheHisGlyAspAspProPheGlyGluGlyPro151015ProAspLysLysGlyAsp20<210>104<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>根癌土壤桿菌生根菌株的virD2內切核酸酶的二分NLS<400>104LysArgProArgGluAspAspAspGlyGluProSerGluArgLysArg151015AlaArgAspAspArg20<210>105<211>36<212>PRT<213>人工序列<220><223>流感病毒核蛋白<400>105GlnLeuValTrpMetAlaCysAsnSerAlaMetIleAsnAlaCysIle151015AspPheGluAspLeuArgValLeuSerPheIleArgGlyThrLysVal202530SerProArgGly35<210>106<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>酵母MATa2阻遏蛋白<400>106MetAsnLysIleProIleLysAspLeuLeuAsnProGln1510<210>107<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>酵母MATa2阻遏蛋白<400>107ValArgIleLeuGluSerTrpPheAlaLysAsnIleGluAsnProTyr151015LeuAspThr<210>108<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>果蠅HP1<400>108ArgLysLysIleProArgHisPheTyrGluGluArgLeuSerTrpTyr151015SerAspAsnGluAsp20<210>109<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>人p27XIII蛋白氨基末端的細胞核定位信號<400>109MetProLysThrArgArgArgProArgArgSerGlnArgLysArgPro151015ProThrPro<210>110<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>腺病毒pTP1和pTP2<400>110ArgLeuProValArgArgArgArgArgArgValPro1510<210>111<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>HIVTat蛋白<400>111GlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArgPro1510<210>112<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>HIV-1的Tat陽性反式激活蛋白<400>112ArgLysLysArgArgGlnArgArgArgAlaHisGln1510<210>113<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>c-myc和HivTatNLS<400>113LysArgValLysLeuAspGlnArgArgArgPro1510<210>114<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>70kD的人熱休克蛋白<400>114PheLysArgLysHisLysLysAspIleSerGlnAsnLysArgAlaVal151015ArgArg<210>115<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>HIV-1Rev蛋白<400>115ArgGlnAlaArgArgAsnArgArgArgArgTrpArgGluArgGlnArg151015<210>116<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>HIV-1Rev蛋白<400>116ArgGlnAlaArgArgAsnArgArgArgArgTrpArgGluArgGlnArg151015Gln<210>117<211>9<212>PRT<213>牛、人g型<220><223>蛋白激酶<400>117PheValValHisLysArgCysHisGlu15<210>118<211>12<212>PRT<213>牛、人g型<220><223>蛋白激酶C<400>118AspAspProArgSerLysHisLysPheLysIleHis1510<210>119<211>9<212>PRT<213>牛、人g型<220><223>親核肽<400>119ThrLysHisProGlyLysArgLeuGly15<210>120<211>10<212>PRT<213>牛、人g型<220><223>親核肽<400>120PheValValHisArgArgCysHisGluPhe1510<210>121<211>12<212>PRT<213>牛、人g型<220><223>親核肽<400>121AspAspProArgAsnLysHisLysPheArgLeuHis1510<210>122<211>9<212>PRT<213>牛、人g型<220><223>親核肽<400>122ThrLysHisProAlaLysArgLeuGly15<210>123<211>9<212>PRT<213>野兔a和b型<220><223>親核肽<400>123PheValValHisLysArgCysHisGlu15<210>124<211>12<212>PRT<213>野兔a和b型<220><223>親核肽<400>124AspAspProArgSerLysHisLysPheLysIleHis1510<210>125<211>9<212>PRT<213>野兔a和b型<220><223>親核肽<400>125ThrLysHisProGlyLysArgLeuGly15<210>126<211>9<212>PRT<213>大鼠腦<220><223>親核肽<400>126PheValValHisArgArgCysHisGlu15<210>127<211>12<212>PRT<213>大鼠腦<220><223>親核肽<400>127AspAspProArgAsnLysHisLysPheArgLeuHis1510<210>128<211>9<212>PRT<213>大鼠腦<220><223>親核肽<400>128ThrLysHisProGlyLysArgLeuGly15<210>129<211>12<212>PRT<213>果蠅<220><223>親核肽<400>129GlyGluAsnLysMetLysSerArgLeuArgLysGly1510<210>130<211>13<212>PRT<213>果蠅<220><223>親核肽<400>130SerTyrValValHisLysArgCysHisGluTyrValThr1510<210>131<211>15<212>PRT<213>果蠅<220><223>親核肽<400>131ProAspAspLysAspGlnSerLysLysLysThrArgThrIleLys151015<210>132<211>14<212>PRT<213>果蠅<220><223>親核肽<400>132ProProPheLysProLysIleLysHisArgLysMetCysPro1510<210>133<211>8<212>PRT<213>果蠅<220><223>親核肽<400>133ValValHisLysArgCysHisGlu15<210>134<211>8<212>PRT<213>果蠅<220><223>親核肽<400>134ValValHisArgArgCysHisGlu15<210>135<211>21<212>PRT<213>大鼠腦<220><223>親核肽<400>135LysLysValLeuGlnAspLysArgPheLysAshArgGluLeuGlnIle151015MetArgLysLeuAsp20<210>136<211>12<212>PRT<213>果蠅<220><223>親核肽<400>136LeuGlnAspArgArgPheLysAsnArgGluLeuGln1510<210>137<211>17<212>PRT<213>大鼠腦<220><223>親核肽<400>137GluCysLeuLysLysPheAsnAlaArgArgLysLeuLysGlyAlaIle151015Leu<210>138<211>18<212>PRT<213>大鼠腦<220><223>親核肽<400>138LeuLysLysPheAsnAlaArgArgLysLeuLysGlyAlaIleLeuThr151015ThrMet<210>139<211>12<212>PRT<213>大鼠腦<220><223>親核肽<400>139GluGluThrArgValTrpHisArgArgAspGlyLys1510<210>140<211>15<212>PRT<213>牛(心肌)<220><223>親核肽<400>140GlyPheAlaLysArgValLysGlyArgThrTrpThrLeuCysGly151015<210>141<211>15<212>PRT<213>牛<220><223>親核肽<400>141GlyPheAlaLysArgValLysGlyArgThrTrpThrLeuCysGly151015<210>142<211>19<212>PRT<213>牛肺<220><223>親核肽<400>142GluGluGluIleGlnGluLeuLysArgLysLeuHisLysCysGlnSer151015ValLeuPro<210>143<211>12<212>PRT<213>牛肺<220><223>親核肽<400>143LysIleLeuLysLysArgHisIleValAspThrArg1510<210>144<211>5<212>PRT<213>牛肺<220><223>親核肽<400>144CysGlyAspProLys15<210>145<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>145LysThrLeuLysLysHisThrIleValLys1510<210>146<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>146GluTyrCysHisArgHisLysIleValHisArgAspLeuLysPro151015<210>147<211>14<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>147ProLeuValThrLysLysSerLysThrArgTrpHisPheGly1510<210>148<211>12<212>PRT<213>黑猩猩果蠅<220><223>親核肽<400>148ProValLysLysLysLysIleLysArgGluIleLys1510<210>149<211>14<212>PRT<213>黑猩猩果蠅<220><223>親核肽<400>149AspIleLeuGlnArgHisSerArgLysArgTrpGluArgPhe1510<210>150<211>11<212>PRT<213>黑猩猩果蠅<220><223>親核肽<400>150ProLysSerSerArgHisHisHisThrAspGly1510<210>151<211>11<212>PRT<213>牛(肺><220><223>親核肽<400>151ProLysSerSerArgHisHisHisThrAspGly1510<210>152<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>152ProLysGlnArgHisArgLysSerLeuGly1510<210>153<211>16<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>153GlySerMetCysLysValLysLeuAlaLysHisArgTyrThrAsnGlu151015<210>154<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>154AspArgLysHisAlaLysIleArgAsnGln1510<210>155<211>17<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>155GlyAsnIlePheArgLysLeuSerGlnArgArgLysLysThrIleGlu151015Gln<210>156<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>156ProProLeuAsnValAlaLysGlyArgLysLeuHisPro1510<210>157<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>157GluLeuArgGlnPheHisArgArgSerLeuGly1510<210>158<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>158GlyLysValLysLeuValLysHisArgGlnThrLysGlu1510<210>159<211>14<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>159GlySerLeuLysGluHisHisAlaArgLysPheAlaArgGly1510<210>160<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>160LeuSerValProLysGlyArgLysLeuHisPro1510<210>161<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>161PheLeuArgArgGlyIleLysLysLysLeuThrLeuAsp1510<210>162<211>27<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>162ProSerLysAspAspLysPheArgHisTrpCysArgLysIleLysSer151015LysIleLysGluAspLysArgIleLysArgGlu2025<210>163<211>12<212>PRT<213>非洲爪蟾<220><223>親核肽<400>163GlnArgArgValLysLysLeuProSerThrThrLeu1510<210>164<211>12<212>PRT<213>非洲爪蟾<220><223>親核肽<400>164GlnArgArgValLysLysLeuProSerIleThrLeu1510<210>165<211>12<212>PRT<213>鳥<220><223>親核肽<400>165GlnArgArgValLysLysLeuProSerThrThrLeu1510<210>166<211>12<212>PRT<213>小鼠<220><223>親核肽<400>166GlnArgArgValArgLysLeuProSerThrThrLeu1510<210>167<211>12<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>167GlyValValTyrLysGlyArgHisLysThrThrGly1510<210>168<211>14<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>168PheCysHisSerArgArgValLeuHisArgAspLeuLysPro1510<210>169<211>13<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母<220><223>親核肽<400>169GlyValValTyrLysAlaArgHisLysLeuSerGlyArg1510<210>170<211>12<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>170HisSerHisArgValLeuHisArgAspLeuLysPro1510<210>171<211>14<212>PRT<213>非洲爪蟾<220><223>親核肽<400>171PheCysHisSerHisArgValLeuHisArgAspLeuLysPro1510<210>172<211>17<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>172GlyIleAlaTyrCysHisSerHisArgIleLeuHisArgAspLeuLys151015Pro<210>173<211>12<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>173HisSerHisArgValIleHisArgAspLeuLysPro1510<210>174<211>10<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>174LysGluLeuLysHisLysAsnIleValArg1510<210>175<211>7<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>175ProSerSerAlaLeuArgGlu15<210>176<211>10<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>176MetAspArgMetLysLysIleLysArgGln1510<210>177<211>11<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>177AspLysProLeuSerArgArgLeuArgArgVal1510<210>178<211>7<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>178MetLysLysPheLysArgArg15<210>179<211>9<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>179ArgAsnArgIleHisArgArgIleSer15<210>180<211>8<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>180SerArgArgSerArgArgAlaSer15<210>181<211>8<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>181HisArgArgLysValLeuHisArg15<210>182<211>12<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>182GlyHisGlyLysAsnArgArgGlnSerMetLeuPhe1510<210>183<211>8<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>183HisThrArgLysIleLeuHisArg15<210>184<211>12<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>184ProGlyArgGlyLysAsnArgArgGlnSerIlePhe1510<210>185<211>10<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>185GluValPheArgArgLysArgArgLeuHis1510<210>186<211>15<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>186AspLysProThrArgLysThrLeuArgLysSerArgLysHisHis151015<210>187<211>7<212>PRT<213>人類<220><223>親核肽<400>187LysLysIleAlaLeuArgGlu15<210>188<211>8<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母<220><223>親核肽<400>188MetValLysArgHisLysAsnThr15<210>189<211>13<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母<220><223>親核肽<400>189AspGlyGluLeuPheHisTyrIleArgLysHisGlyPro1510<210>190<211>15<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母<220><223>親核肽<400>190AspAlaValAlaHisCysHisArgPheArgPheArgHisArgAsp151015<210>191<211>17<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母<220><223>親核肽<400>191LysLysSerSerSerLysLysValValArgArgLeuGlnGlnArgAsp151015Asp<210>192<211>12<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母<220><223>親核肽<400>192ProAlaGlnLysLeuArgLysLysAsnAsnPheAsp1510<210>193<211>16<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母<220><223>親核肽<400>193LysGlnHisArgProArgLysAsnThrAsnPheThrProLeuProPro151015<210>194<211>14<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母<220><223>親核肽<400>194LysTyrAlaValLysLysLeuLysValLysPheSerGlyPro1510<210>195<211>14<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>195ProAsnGluThrArgArgIleLysArgAlaAsnArgAlaGly1510<210>196<211>13<212>PRT<213>大鼠<220><223>親核肽<400>196TyrAspHisValArgLysThrArgValAlaIleLysLys1510<210>197<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>197IleLeuLysHisPheLysHisGlu15<210>198<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>198GlnIleLysSerLysArgAlaLysGluTyr1510<210>199<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>199GluLeuValLysHisLeuValLysHisGlySerAsn1510<210>200<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>200GlyLysAlaLysLysIleArgSerGlnLeuLeu1510<210>201<211>15<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母<220><223>親核肽<400>201GluGlnArgLeuLysArgHisArgIleAspValSerAspGluAsp151015<210>202<211>11<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母<220><223>親核肽<400>202SerAsnIleLysSerLysCysArgArgValVal1510<210>203<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>203ProProLysArgIleArgThrAsp15<210>204<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>親核肽<400>204LysLeuAlaArgLysGlnLysArgPro15<210>205<211>13<212>PRT<213>野兔(骨胳肌)<220><223>親核肽<400>205GlyValSerSerValValArgArgCysIleHisLysPro1510<210>206<211>16<212>PRT<213>鳥胃<220><223>親核肽<400>206LysLysTyrMetAlaArgArgLysTrpGlnLysThrGlyHisAlaVal151015<210>207<211>20<212>PRT<213>野兔(骨胳肌)<220><223>親核肽<400>207ProTrpLeuAsnAsnLeuAlaGluLysAlaLysArgCysAsnArgArg151015LeuLysSerGln20<210>208<211>20<212>PRT<213>野兔(骨胳肌)<220><223>親核肽<400>208IleLeuLeuLysLysTyrLeuMetLysArgArgTrpLysLysAsnPhel51015IleAlaValSer20<210>209<211>13<212>PRT<213>小鼠<220><223>親核肽<400>209GlyValSerSerValValArgArgCysIleHisLysPro1510<210>210<211>13<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>DBD<400>210MetAspProGlyLysAspLysGluGlyArgLysLysPhe1510<210>211<211>15<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>TFIIH的DNA解旋酶成分<400>211AspLysArgPheAlaArgGlyAspLysArgGlyLysLeuProArg151015<210>212<211>16<212>PRT<213>未知<220><223>解旋酶，TFIIIH的成分<400>212AspArgAspLysLysLysSerArgLysArgHisTyrGluAspGluGlu151015<210>213<211>15<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>解旋酶，TFIIH的成分<400>213TyrValAlaIleLysThrLysLysArgIleLeuLeuTyrThrMet151015<210>214<211>14<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>解旋酶，TFIIH的成分<400>214ProSerLysHisValHisProLeuPheLysArgPheArgLys1510<210>215<211>13<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>光滑的<400>215LysLysGlnThrLeuValLysArgArgGlnArgLysAsp1510<210>216<211>9<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>光滑的<400>216GluPheThrLysArgArgArgThrLeu15<210>217<211>13<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>光滑的<400>217AspGluSerMetIleLysAspArgLysAspArgLeuPro1510<210>218<211>17<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>光滑的<400>218GlyLysLysArgArgLysLeuArgArgAlaArgGlyArgLysArgLys151015Thr<210>219<211>18<212>PRT<213>高等真核生物<400>219ProGlnLysGlnGluLysLysProArgLysIleMetLeuAsnGluAla151015SerGly<210>220<211>25<212>PRT<213>高等真核生物<400>220ProAsnLysLysAlaArgValLeuSerLysLysGluGluArgLeuLys151015LysHisIleLysLysLeuGlnLysArg2025<210>221<211>13<212>PRT<213>高等真核生物<400>221ProLeuProLysGlyGlyLysArgGlnLysLysValPro1510<210>222<211>36<212>PRT<213>高等真核生物<400>222AspGlyAspGluAspTyrTyrLysGlnArgLeuArgArgTrpAsnLys151015LeuArgLeuGlnAspLysGluLysArgLeuLysLeuGluAspAspSer202530GluGluSerAsp35<210>223<211>30<212>PRT<213>高等真核生物<220><221>變異體<222>16，17，18，19，20，21，22，23<223>Xaa＝任何氨基酸<400>223AspValGlnThrProLysCysHisLeuLysArgArgIleGlnProXaa151015XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaProLysArgLysLysPhePro202530<210>224<211>52<212>PRT<213>高等真核生物<220><221>變異體<222>29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43<223>Xaa＝任何氨基酸<400>224LysHisLysSerLysThrLysHisHisSerValAlaGluGluGluThr151015LeuGluLysHisLeuArgProLysGlnLysProLysXaaXaaXaaXaa202530XaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaProHisLeuValLys354045LysArgArgTyr50<210>225<211>13<212>PRT<213>高等真核生物<400>225ProAlaGlyLysLysSerArgPheGlyLysLysArgAsn1510<210>226<211>22<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>鋅指結構域<400>226ProAlaSerValArgAlaSerIleGluArgLysArgGlnArgAlaLeu151015MetLeuArgGlyAlaArg20<210>227<211>18<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>鋅指結構域<400>227ProProLeuLysPheIleValLysLysAsnProHisHisSerGlnTrp151015GlyAsp<210>228<211>16<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>鋅指結構域<400>228AsnArgGluLysMetLysGlnLysLysPheAspLysLysValLysGlu151015<210>229<211>10<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>親水性蛋白<400>229TyrLeuArgArgAlaMetLysArgPheAsn1510<210>230<211>28<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>親水性蛋白<400>230ProSerAlaLysGlyLysArgAsnLysGlyGlyArgLysLysArgSer151015LysProSerSerSerGluGluAspGluGlyProGly2025<210>231<211>10<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>親水性蛋白<400>231GlnArgArgProHisGlyArgGluArgArg1510<210>232<211>11<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>親水性蛋白<400>232ArgThrHisArgGlySerHisArgLysAspPro1510<210>233<211>17<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>親水性蛋白<400>233SerSerSerSerSerSerSerLysArgGlyLysLysMetCysSerAsp151015Gly<210>234<211>10<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>親水性蛋白<400>234AlaLeuLysArgHisLeuLeuLysTyrGlu1510<210>235<211>12<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>親水性蛋白<400>235SerAsnArgAlaArgLysAlaArgLeuAlaGluPro1510<210>236<211>11<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>親水性蛋白<400>236ProAsnLeuHisArgValAlaArgLysLeuAsp1510<210>237<211>11<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>親水性蛋白<400>237GluArgLysGluLysGluLysLysGluLysArg1510<210>238<211>10<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>親水性蛋白<400>238IleArgGluArgLeuLysArgArgTyrGly1510<210>239<211>11<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>親水性蛋白<400>239GlyGlyProLysLysThrLysArgGluArgLys1510<210>240<211>16<212>PRT<213>高等真核生物<400>240LysSerLysAlaLysSerLysAlaArgArgGluGluGluGluGluAsp151015<210>241<211>6<212>PRT<213>高等真核生物<400>241GlyLysArgLysArgGly15<210>242<211>13<212>PRT<213>高等真核生物<400>242GlyProAlaLysLysLysValAlaLysValThrValLys1510<210>243<211>13<212>PRT<213>高等真核生物<400>243ProSerAspLeuLysLysAlaHisHisLeuLysArgGly1510<210>244<211>27<212>PRT<213>高等真核生物<400>244GluIleAspArgArgLysLysArgProLeuGluAsnAspGlyProVal151015LysLysLysValLysLysValGlnGlnLysGlu2025<210>245<211>10<212>PRT<213>高等真核生物<400>245LysGluAsnValArgAspLysLysLysGly1510<210>246<211>11<212>PRT<213>高等真核生物<400>246PheGlyArgArgLysLeuLysLysTrpValThr1510<210>247<211>12<212>PRT<213>高等真核生物<400>247ProLeuIleLysLysArgLysAspGluIleGlnGly1510<210>248<211>21<212>PRT<213>高等真核生物<400>248LysGluLeuGluGlyLeuIleAsnThrLysArgLysArgLeuLysTyr151015PheAlaLysLeuTrp20<210>249<211>11<212>PRT<213>高等真核生物<400>249GluLysHisGluGlyLysHisGlnLysLeuLeu1510<210>250<211>14<212>PRT<213>高等真核生物<400>250ProAspIleArgArgLeuThrLysLysLeuAsnLysArgGly1510<210>251<211>13<212>PRT<213>高等真核生物<400>251AspAlaLysGluLeuArgLysHisLysLysTyrIleGlu1510<210>252<211>10<212>PRT<213>高等真核生物<400>252ValLysMetAlaLysArgLysAlaAsnGlu1510<210>253<211>14<212>PRT<213>高等真核生物<400>253GlyGluLeuAlaLysArgSerGluArgArgAlaGluAlaGlu1510<210>254<211>18<212>PRT<213>高等真核生物<400>254LysArgLysGluProGluProLysGlySerThrLysLysLysAlaLys151015ThrGly<210>255<211>7<212>PRT<213>高等真核生物<400>255GlyLysPheLysArgGlyLys15<210>256<211>13<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>RPA<400>256ProSerGlnAlaGluLysLysSerArgAlaArgAlaGln1510<210>257<211>10<212>PRT<213>高等真核生物<400>257GlyAlaLysLysArgLysIleAspAspAla1510<210>258<211>8<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>小牛胸腺HMG1<400>258ProLysLysProArgGlyLysMet15<210>259<211>7<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>小牛胸腺HMG1<400>259GluHisLysLysLysHisPro15<210>260<211>9<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>小牛胸腺HMG1<400>260GluThrLysLysLysPheLysAspPro15<210>261<211>9<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>小牛胸腺HMG1<223>Xaa＝Glu或AspXaa＝41(x)<400>261GluLysSerLysLysLysLysGluXaa15<210>262<211>13<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>小牛胸腺HMG1<400>262GluGluGluGlyGlyLysLysLysLysLysPheAlaLys1510<210>263<211>26<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>結構特異性識別蛋白<400>263ArgAspGluLysLysArgLysGlnLeuLysLysAlaLysAlaLysMet151015AlaLysAspArgLysSerArgLysLysPro2025<210>264<211>22<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>結構特異性識別蛋白<400>264GlyGluSerSerLysArgAspLysSerLysLysLysLysLysValLys151015ValLysMetGluLysLys20<210>265<211>19<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>結構特異性識別蛋白<400>265GlyGluAsnLysSerLysLysLysArgArgArgSerGluAspSerGlu151015GluGluGlu<210>266<211>8<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>來自HeLa細胞的氧化還原因子1<400>266MetProLysArgGlyLysLysGly15<210>267<211>8<212>PRT<213>高等真核生物<220><223>脫嘌呤脫嘧啶(AP)核酸內切酶<400>267MetProLysArgGlyLysLysGly15<210>268<211>26<212>PRT<213>果蠅<220><223>與人ERCC3具有66％等同性的解旋酶<400>268MetGlyProProLysLysSerArgLysAspArgSerGlyGlyAspLys151015PheGlyLysLysArgArgGlyGlnAspGlu2025<210>269<211>16<212>PRT<213>果蠅<220><223>與人ERCC3具有66％等同性的解旋酶<400>269GluMetSerTyrSerArgLysArgGlnArgPheLeuValAsnGlnGly151015<210>270<211>21<212>PRT<213>果蠅<220><223>與人ERCC3具有66％等同性的解旋酶<400>270TyrTyrGluHisArgLysLysAsnIleGlySerValHisProLeuPhe151015LysLysPheArgGly20<210>271<211>9<212>PRT<213>果蠅<220><223>重組修復蛋白1<400>271AlaArgGlyLysLysLysGlnProLys15<210>272<211>9<212>PRT<213>果蠅<220><223>重組修復蛋白1<400>272LysProLysGlyArgAlaLysLysAla15<210>273<211>11<212>PRT<213>果蠅<220><223>重組修復蛋白1<400>273GlnAlaLysGlyArgLysLysLysGluLeuPro1510<210>274<211>10<212>PRT<213>果蠅<220><223>重組修復蛋白1<400>274GluProProLysGlnArgAlaArgLysGlu1510<210>275<211>13<212>PRT<213>果蠅<220><223>重組修復蛋白1<400>275ProProLysAlaAlaSerLysArgAlaLysLysGlyLys1510<210>276<211>9<212>PRT<213>果蠅<220><223>重組修復蛋白1<400>276ProLysLysArgAlaLysLysThrThr15<210>277<211>13<212>PRT<213>果蠅<220><223>重組修復蛋白1<400>277GluProAlaProGlyLysLysGlnLysLysSerAlaAsp1510<210>278<211>20<212>PRT<213>果蠅<220><223>重組修復蛋白1<400>278GluGluGluAlaLysProSerThrGluThrLysProAlaLysGlyArg151015LysLysAlaPro20<210>279<211>9<212>PRT<213>果蠅<220><223>重組修復蛋白1<400>279LysProAlaArgGlyArgLysLysAla15<210>280<211>12<212>PRT<213>果蠅<220><223>重組修復蛋白1<400>280GlySerLysThrThrLysLysAlaLysLysAlaGlu1510<210>281<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與Rad16有30％的序列等同性<400>281IleGluLysArgArgLysLeuTyrIleSerGlyGly1510<210>282<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與Rad16有30％的序列等同性<400>282AsnLysLysArgGlyValArgGlnValLeuLeuAsn1510<210>283<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與Rad16有30％的序列等同性<400>283LysGluGlnValThrThrLysArgArgArgThrArgGly1510<210>284<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與Rad16有30％的序列等同性<400>284AsnLeuArgLysLysIleLysSerPheAsnLysLeuGln1510<210>285<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>285ArgGlnArgLysGluArgArgGlnGlyLysArgGlu1510<210>286<211>16<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>286GluAsnLysPheGluLysAspLeuArgLysLysLeuValAsnAsnGlu151015<210>287<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>287ArgAspValAsnLysArgLysLysLysGlyLysGlnLysArgIle151015<210>288<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>288LysArgIleSerThrAlaThrGlyLysLeuLysLysArgLysMet151015<210>289<211>23<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與Rad16有30％的序列等同性<400>289GlyLysAspAspTyrGlyValMetValLeuAlaAspArgArgPheSer151015ArgLysArgSerGlnLeuPro20<210>290<211>25<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>290ProLeuSerArgArgArgArgValArgArgLysAsnGlnProLeuPro151015AspAlaLysLysLysPheLysThrGly2025<210>291<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>291AsnGluGluArgLysArgArgLysTyrPheHisMetLeuTyrLeu151015<210>292<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>292GluTrpIleAsnSerLysArgLeuSerArgLysLeuSerAsnLeu151015<210>293<211>17<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>293GluMetSerAlaAsnAsnLysArgLysPheLysThrLeuLysArgSer151015Asp<210>294<211>19<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>294TrpMetAsnSerLysValArgLysArgArgIleThrLysAspAspPhe151015GlyGluLys<210>295<211>20<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>295ArgLysValIleThrAlaLeuHisHisArgLysArgThrLysIleAsp151015AspTyrGluAsp20<210>296<211>17<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>296LysThrGlySerArgCysLysLysValIleLysArgThrValGlyArg151015Pro<210>297<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與復制后修復的解旋酶<400>297PheHisProLysArgArgArglleTyrGlyPheArg1510<210>298<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與復制后修復的解旋酶<400>298AspSerArgGlyArgLysLysAlaSerMet1510<210>299<211>19<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與復制后修復的解旋酶<400>299AspGlyGluSerLeuMetLysArgArgArgThrGluGlyGlyAsnLys151015ArgGluLys<210>300<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>300AspGluAspGluArgArgLysArgArgIleGluGlu1510<210>301<211>22<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>301MetSerThrProAlaArgArgArgLeuMetArgAspPheLysArgMet151015LysGluAspAlaProPro20<210>302<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>302GlyValAlaLysLeuArgLysGluLysSerGlyAlaAsp1510<210>303<211>16<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>303AspAspTyrAsnArgLysArgProPheArgSerThrArgProGlyLys151015<210>304<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>鋅指<400>304GluGlyLysAlaHisArgArgGluLysLysTyrGlu1510<210>305<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>鋅指<400>305AsnArgLeuArgGluLysLysHisGlyLysAlaHisIleHisHis151015<210>306<211>14<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>HMG盒<400>306GluArgArgLysGlnLeuLysLysGlnGlyProLysArgPro1510<210>307<211>17<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>HMG盒<400>307GluThrTyrLysLysArgIleLysGluTrpGluSerCysTyrProAsp151015Glu<210>308<211>16<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>308LeuThrCysLysLysLeuLysThrHisAsnArgIleIleLeuSerGly151015<210>309<211>36<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><221>變異體<222>20，21，22，23，24，25，26，27，28<223>Xaa＝任何氨基酸<400>309AsnAlaLeuArgLysSerArgLysLysIleThrLysGlnTyrGluIle151015GlyThrProXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlyGluIleArg202530LysArgAspPro35<210>310<211>18<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>減數分裂重組蛋白<400>310LysProThrSerLysProLysArgValArgThrAlaThrLysLysLys151015IlePro<210>311<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>減數分裂重組蛋白<400>311PheTyrLysLysArgSerProValThrArgSerLysLysSerGly151015<210>312<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>312GlyPheLysLysGlyLysGlyCysGlnArg1510<210>313<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>313GlyPheLysLysGlyLysGlyCysGlnArg1510<210>314<211>45<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><221>變異體<222>21，22，23，24，25，26，27，28<223>Xaa＝任何氨基酸<400>314GluArgAlaLysLysSerAlaValThrAspAlaLeuLysArgSerLeu151015ArgGlyPheGlyXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaAspLysAspPhe202530LeuAlaLysIleAspLysValLysPheAspProProAsp354045<210>315<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>重組修復蛋白<400>315MetAlaArgArgArgLeuProAspArgProPro1510<210>316<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>重組修復蛋白<400>316GlyGlyArgSerLeuArgLysArgSerAla1510<210>317<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>重組修復蛋白<400>317GlnLeuThrLysArgArgLysAsp15<210>318<211>16<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>啤酒糖酵母<400>318AspGluThrValPheValLysSerLysArgValLysAlaSerSerSer151015<210>319<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>319GlyGluAspArgLysArgGluGlyArgAsnLeuLysArg1510<210>320<211>16<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>核苷酸結合域<400>320ProIleSerArgGlnSerLysLysArgLysPheAspTyrArgValPro151015<210>321<211>14<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>推定的解旋酶<400>321GlyLeuLysLysProArgLysLysThrLysSerSerArgHis1510<210>322<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>推定的解旋酶<400>322GlyArgIleLeuArgAlaLysArgArgAsnAspGluGly1510<210>323<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>推定的解旋酶<400>323GlyArgGlySerAsnGlyHisLysArgPheLysSer1510<210>324<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>RecA的酵母同系物，減數分裂特異性的<400>324ThrArgArgHisLeuCysLysIleLysGlyLeuSerGlu1510<210>325<211>29<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>RecA的酵母同系物<221>變異體<222>10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21<223>Xaa＝任何氨基酸<400>325AspGlyArgLysProIleGlyGlyHisXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa151015XaaXaaXaaXaaXaaArgLysGlyArgGlyAspGluArg2025<210>326<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>錯配修復蛋白<400>326GluThrGluLysArgCysLysGlnLysGluGlnArgTyr1510<210>327<211>16<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>327MetAspLeuArgValGlyArgLysPheArgIleGlyArgLysIleGly151015<210>328<211>28<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><221>變異體<222>5，6，7，8，9，10，11，12<223>Xaa＝任何氨基酸<400>328GlyArgArgGlyXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlyLeuSerLys151015LysTyrArgAspPheAsnThrHisArgHisIlePro2025<210>329<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>結構特異性核酸內切酶<400>329HisGluLeuThrLysArgSerSerArgArgValGluThrGluLys151015<210>330<211>14<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>轉錄1調節(jié)物<400>330MetLeuAlaMetAlaArgArgLysLysLysMetSerAlaLys1510<210>331<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>轉錄1調節(jié)物<400>331GluHisTyrLysValLysHisThrGluLys1510<210>332<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>轉錄1調節(jié)物<400>332LeuHisProGluLysLysArgSerlleSerGlu1510<210>333<211>14<212>PRT<213>粟酒裂殖糖酵母<220><223>Xaa＝5x<400>333SerSerlleAspGluXaaSerIleLysArgLysArgArgIle1510<210>334<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>334GlyGluLeuAlaLysArgValAlaArgHisGlnLysAlaArgGlu151015<210>335<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>335GlySerAlaLysArgLysArgAspSer15<210>336<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>336LysGlyGlyGluSerLysLysLysArg15<210>337<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>DNA解旋酶<400>337AspLysArgTyrGlyArgSerAspLysArgThrLysLeuProLys151015<210>338<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>338ProProSerLysArgArgArgValArgGlyGly1510<210>339<211>20<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酸性蛋白<400>339AspPheLysGlnAlaIleLeuArgLysArgLysAsnGluSerProGlu151015GluValGluPro20<210>340<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<400>340AspLysLysAlaLysLysGly15<210>341<211>19<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>減數分裂重組蛋白<400>341AspValValGlnPheTyrLeuLysLysLysTyrThrArgSerLysArg151015AsnAspGly<210>342<211>16<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>減數分裂重組蛋白<400>342ProSerProAlaLeuLeuLysLysThrAsnLysArgArgGluLeuPro151015<210>343<211>16<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Ser/Thr蛋白激酶<400>343GlyLeuAlaLysLysTyrArgAspHisLysThrHisLeuHisIlePro151015<210>344<211>16<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人GCF(GC因子)<400>344GlyLeuAlaLysLysTyrArgAspPheLysThrHisValHisIlePro151015<210>345<211>17<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人GCF(GC因子)<400>345HisArgArgArgArgGlnArgThrArgLysLysLysLysLysLysLys151015Arg<210>346<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人GCF(GC因子)<400>346LeuArgArgLysSerArgPro15<210>347<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>來自小鼠細胞的oct-6蛋白轉錄因子<400>347SerArgArgThrLysArgArgGln15<210>348<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠oct-2蛋白轉錄因子(oct-2.6同種型的oct-2.1)<400>348GlyArgLysArgLysLysArgThr15<210>349<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>來自小鼠p-19癌胚細胞oct-3<400>349GlyArgArgArgLysLysArgThr15<210>350<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>來自小鼠p-19癌胚細胞oct-3<400>350AlaArgLysArgLysArgThr15<210>351<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人ATF-1。在堿性區(qū)域/亮氨酸拉鏈中<400>351AsnArgArgGlnLysGlyLysArgSer15<210>352<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人ATF-3(在結合DNA的堿性區(qū)域)<400>352GluCysArgArgLysLysLysGlu15<210>353<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人ATF-1。在堿性區(qū)域/亮氨酸拉鏈中<400>353GluArgLysLysArgArgArgGlu15<210>354<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與ets致癌基因相關的小鼠Pu.1(Friend紅白血病細胞)<400>354AlaLysCysArgAsnLysLysLysGluLysThr1510<210>355<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與ets致癌基因相關的小鼠Pu.1(Friend紅白血病細胞)<400>355SerLysLysLysIleArgLeu15<210>356<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與ets致癌基因相關的小鼠Pu.1(Friend紅白血病細胞)<400>356GlnLysGlyAsnArgLysLysMet15<210>357<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>與IFN-b基因啟動子結合的人PRDII-BF1<400>357ValLysLysValLysLysLysLeu15<210>358<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與IFN-b基因啟動子結合的人PRDII-BF1<400>358ValLysArgLysLysIle15<210>359<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與IFN-b基因啟動子結合的人PRDII-BF1<400>359CysArgAsnArgTyrArgLysLeuGlu15<210>360<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與IFN-b基因啟動子結合的人PRDII-BF1<400>360IleArgLysArgArgLysMetLys15<210>361<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠LEF-1<400>361ProLysLysLysArgLeuArgLeu15<210>362<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TCF-1a<400>362GlyLysLysLysLysArgLysArgGluLysLeu1510<210>363<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TCF-1<400>363GlyLysLysLysLysArgLysArgGluLysLeu1510<210>364<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TCF-1<400>364GlyLysLysLysArgArgSerArgGluLysHis1510<210>365<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>X.LaevisOct-1(在POU結構域內)<400>365ProLysLysCysArgAlaArgPhe15<210>366<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>X.LaevisOct-1(在POU結構域內)<400>366PheLysGlnArgArgIleLysLeu15<210>367<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>X.LaevisOct-1(在POU結構域內)<400>367AsnArgArgArgLysLysArgThr15<210>368<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與彩斑位置效應的蘇瓦果蠅(3)7基因產物(932個氨基酸)<400>368AsnArgArgGlnLysGluLysArgIle15<210>369<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與彩斑位置效應的蘇瓦果蠅(3)7基因產物(932個氨基酸)<400>369AspLysArgSerArgLysArgLysArgSerLys1510<210>370<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與彩斑位置效應的蘇瓦果蠅(3)7基因產物(932個氨基酸)<400>370ArgLeuArgIleAspArgLysArgAsn15<210>371<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人MBP-1(I型MHC增強結合蛋白1)分子量200kD。作者認為不是NLS<400>371AlaLysArgSerArgArgSer15<210>372<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人MBP-1(I型MHC增強結合蛋白1)分子量200kD<400>372IleArgLysArgArgLysMetLysSerValGlyAspAspGluGlu151015<210>373<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人MBP-1(I型MHC增強結合蛋白1)分子量200kD<400>373ProProLysLysLysArgLeuArgLeuAlaGlu1510<210>374<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠TTF-1<400>374CysArgAsnArgTyrArgLysLeuGlu15<210>375<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠TTF-1<400>375ProArgArgLysArgArgVal15<210>376<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人甲狀腺激素受體a(c-erbA-1基因)<400>376HisArgTyrLysMetLysArgGln15<210>377<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人甲狀腺激素受體a(c-erbA-1基因)<400>377AspGlyLysArgLysArgLysAsn15<210>378<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人甲狀腺激素受體a(c-erbA-1基因)<400>378AspAspSerLysArgValAlaLysArgLysLeu1510<210>379<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人甲狀腺激素受體a(c-erbA-1基因)<400>379AsnArgGluArgArgArgLysGluGlu15<210>380<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>果蠅gcl(無生殖細胞的)基因產物(569個氨基酸，65kD)，位于核中，種系形成所需<400>380TrpLysGlnArgArgLysPhe15<210>381<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>果蠅gcl(無生殖細胞的)基因產物(569個氨基酸，65kD)，位于核中，種系形成所需<400>381AsnArgArgLysArgLysArgSer15<210>382<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲Sdc-3蛋白(性別決定蛋白)<400>382ProLysLysLysLysLeu15<210>383<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲Sdc-3蛋白(性別決定蛋白)<400>383AlaArgArgLysArgArgArgLeu15<210>384<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲Sdc-3蛋白(性別決定蛋白)<400>384LeuLysPheLysLysValArgAsp15<210>385<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲Sdc-3蛋白(性別決定蛋白)<400>385PheLysLysPheArgLysPhe15<210>386<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲Sdc-3蛋白(性別決定蛋白)<400>386GlyLysGlnLysArgArgPhe15<210>387<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲Sdc-3蛋白(性別決定蛋白)<400>387GluArgLeuLysArgAspLysGluLysArgGluLysGlu1510<210>388<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲Sdc-3蛋白(性別決定蛋白)<400>388ThrArgGlyArgProLysLysValLysGlu1510<210>389<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲Sdc-3蛋白(性別決定蛋白)<400>389SerLysLysArgGlyArgArgArgLysLysThr1510<210>390<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲Sdc-3蛋白(性別決定蛋白)<400>390ThrArgArgGlnLysArgAlaLysVal15<210>391<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>果蠅BBF-2(與CREB/ATF相關)<400>391SerArgLysSerLysLysArgLeuArgAla1510<210>392<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>果蠅BBF-2(與CREB/ATF相關)<400>392LeuLysLysIleArgArgLysIleLysAshLysIle1510<210>393<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>非洲爪蟾RAR(視黃酸受體)<400>393GluSerArgArgLysLysLysGlu15<210>394<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>非洲爪蟾RAR(視黃酸受體)<400>394AspArgAsnLysLysLysLysGlu15<210>395<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人ATF-2<400>395AlaArgArgArgArgPro15<210>396<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人ATF-2<400>396GlyArgArgArgArgAla15<210>397<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人ATF-2<400>397AspGluLysArgArgLysVal15<210>398<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Myn(Max的小鼠同系物)<400>398CysArgGlnLysArgLysVal15<210>399<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Myn(Max的小鼠同系物)<400>399GluArgLysArgArgAsp15<210>400<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人NFKappap65(55個氨基酸)<400>400SerArgLysLysLeuArgMetGlu15<210>401<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人HB16，cAMP反應元件結合蛋白<400>401GluGluLysArgLysArgThrTyrGlu15<210>402<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人HB16，cAMP反應元件結合蛋白<400>402GlyArgArgArgArgAla15<210>403<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人HB16，cAMP反應元件結合蛋白<400>403AspGluLysArgArgLysPhe15<210>404<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TFIIE-b(通用轉錄啟動蛋白因子；與TFIIE-a形成a2b2四聚體)<400>404SerArgCysArgGlnLysArgLysVal15<210>405<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TFIIE-b(通用轉錄啟動蛋白因子；與TFIIE-a形成a2b2四聚體)<400>405SerLysLysLysLysThrLysVal15<210>406<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TFIIE-b(通用轉錄啟動蛋白因子；與TFIIE-a形成a2b2四聚體)<400>406AsnArgProAspLysLysLysIle15<210>407<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TFIIE-b(通用轉錄啟動蛋白因子；與TFIIE-a形成a2b2四聚體)<400>407GlnArgArgLysLysPro15<210>408<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人kup轉錄激活劑(433個氨基酸)<400>408GlnLysLysArgArgPheLysThr15<210>409<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>鳥肉瘤病毒17癌基因v-jun產物同系的小鼠Jun-Boncogenev-junproduct.<400>409SerArgLysArgLysMet15<210>410<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>鳥肉瘤病毒17癌基因v-jun產物同系的小鼠Jun-B<400>410GluArgLysArgLeuArgAsnArgLeuAla1510<210>411<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Max(特異性關聯c-Myc，N-Myc，L-Myc)<400>411AlaThrLysCysArgLysArgLysLeu15<210>412<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Max(特異性關聯c-Myc，N-Myc，L-Myc)<223>Xaa＝Rx6<400>412AspLysArgXaaGluArgLysArgArgAsp1510<210>413<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>雞VBP(卵黃生成素基因結合蛋白)<400>413GlnSerArgLysLysLeuArgMetGlu15<210>414<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>雞VBP(卵黃生成素基因結合蛋白)<400>414AspLysGluLysLysIleLysLeuGluGluAspGlu1510<210>415<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>雞VBP(卵黃生成素基因結合蛋白)<400>415IleLysLysAlaLysLysVal15<210>416<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>北非蟾蜍B1因子<400>416ThrArgArgLysLysAsn15<210>417<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>北非蟾蜍B1因子<400>417ThrArgAspAspLysArgArgAla15<210>418<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>激活主要晚期腺病毒啟動子的人USF(上游刺激因子)<400>418GluValGluArgArgArgArgAspLys15<210>419<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>激活主要晚期腺病毒啟動子的人USF(上游刺激因子)<400>419ThrArgAspGluLysArgArgAla15<210>420<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>YB-1，與MHCII類Y盒結合的蛋白<400>420GluValGluArgArgArgArgAspLys15<210>421<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>YB-1，與MHCII類Y盒結合的蛋白<400>421TyrArgArgTyrProArgArgArgGly15<210>422<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>YB-1，與MHCII類Y盒結合的蛋白<400>422GlnArgArgProTyrArgArgArgArgPhe1510<210>423<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>YB-1，與MHCII類Y盒結合的蛋白<400>423TyrArgProArgPheArgArgGly15<210>424<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>YB-1，與MHCII類Y盒結合的蛋白<400>424GlnArgArgTyrArgArgAsn15<210>425<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>結合IgH增強子的人TFEB<400>425TyrArgArgArgArgPro15<210>426<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>結合IgH增強子的人TFEB<400>426AlaLysGluArgGlnLysLysAsp15<210>427<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TFE3(536個氨基酸)<400>427GluArgArgArgArgPhe15<210>428<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TFE3(536個氨基酸)<400>428LeuLysGluArgGlnLysLysAsp15<210>429<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TFE3(536個氨基酸)<400>429IleGluArgArgArgArgPheAsn15<210>430<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人Drl(176個氨基酸，19kD)<400>430TyrPheArgArgArgArgLeuGluLysAsp1510<210>431<211>14<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>超雙胸果蠅蛋白(僅來自保守的61個氨基酸的發(fā)育同源結構域片段)<400>431LysThrValAlaLeuLysArgArgLysAlaSerSerArgLeu1510<210>432<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>超雙胸果蠅蛋白(僅來自保守的61個氨基酸的發(fā)育同源結構域片段)<400>432LeuArgArgArgGlyArgGlnThrTyr15<210>433<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>超雙胸果蠅蛋白(僅來自保守的61個氨基酸的發(fā)育同源結構域片段)<400>433LeuThrArgArgArgArgIleGluMet15<210>434<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲特別決定Tra-1蛋白<400>434GlnAsnArgArgMetLysLeuLysLysGluIle1510<210>435<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲特別決定Tra-1蛋白<400>435SerAsnArgArgArgProAspHisArg15<210>436<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲特別決定Tra-1蛋白<400>436ValTyrArgGlyArgArgArgValArgArgGlu1510<210>437<211>21<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>美麗小桿線蟲特別決定Tra-1蛋白<400>437ProProProProProProProAlaProProArgArgArgArgSerAla151015AspAsnLysAspAsp20<210>438<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與G2期細胞生長控制的酵母NPS1轉錄蛋白因子(1359個氨基酸)<400>438ProLysLysProArgHisGlnPhe15<210>439<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與G2期細胞生長控制的酵母NPS1轉錄蛋白因子(1359個氨基酸)<400>439GluLysArgLysLysGluArgAsn15<210>440<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與G2期細胞生長控制的酵母NPS1轉錄蛋白因子(1359個氨基酸)<400>440LeuLeuArgArgLeuLysLysGluValGlu1510<210>441<211>16<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與G2期細胞生長控制的酵母NPS1轉錄蛋白因子(1359個氨基酸)<400>441GluProLeuGlyArgIleArgGlnLysLysArgValTyrTyrAspAsp151015<210>442<211>18<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與G2期細胞生長控制的酵母NPS1轉錄蛋白因子(1359個氨基酸)<400>442GluAspAlaIleLysLysArgArgGluAlaArgGluArgArgArgLeu151015ArgGln<210>443<211>19<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與G2期細胞生長控制的酵母NPS1轉錄蛋白因子(1359個氨基酸)<400>443AspLysGluThrThrAlaSerArgSerLysArgArgSerSerArgLys151015LysArgThr<210>444<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>參與G2期細胞生長控制的酵母NPS1轉錄蛋白因子(1359個氨基酸)<400>444GluSerLysLysLysLysProLysLeu15<210>445<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>T細胞中促細胞分裂劑誘導的人243轉錄激活劑(968個氨基酸)<400>445LysLysThrAlaAlaLysLysThrLysThrLysSer1510<210>446<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>T細胞中促細胞分裂劑誘導的人243轉錄激活劑(968個氨基酸)<400>446GlnArgLysArgGlnLysLeu15<210>447<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>T細胞中促細胞分裂劑誘導的人243轉錄激活劑(968個氨基酸)<400>447LysAlaLysLysGlnLys15<210>448<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠NF-E2(45kD)，來自小鼠血友病(MEL)細胞的紅色轉錄因子<400>448LeuArgArgLysArgGlnLys15<210>449<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠NF-E2(45kD)，來自小鼠血友病(MEL)細胞的紅色轉錄因子<400>449ArgAspIleArgArgArgGlyLysAsnLysVal1510<210>450<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人糖皮質激素受體<400>450GlnAshCysArgLysArgLysLeuGlu15<210>451<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人糖皮質激素受體<400>451AspLysIleArgArgLysAsn15<210>452<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠和人GR(糖皮質激素受體)<400>452AlaArgLysThrLysLysLysIle15<210>453<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠和人GR(糖皮質激素受體)<400>453AspLysIleArgArgLysAsnCysPro15<210>454<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>C/EBP(CCAAT/增強子結合蛋白)<400>454GluAlaArgLysThrLysLysLysIleLysGlyIleGln1510<210>455<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>C/EBP(CCAAT/增強子結合蛋白)<400>455TyrArgValArgArgGluArgAsn15<210>456<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>C/EBP(CCAAT/增強子結合蛋白)<400>456ValArgLysSerArgAspLysAla15<210>457<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人鹽皮質激素受體<400>457AspArgLeuArgLysArgValGlu15<210>458<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人鹽皮質激素受體<400>458AspLysIleArgArgLysAsn15<210>459<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人PR(孕激素受體)<400>459AlaArgLysSerLysLysLeu15<210>460<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人PR(孕激素受體)<400>460AspLysIleArgArgLysAsn15<210>461<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人和小鼠NF-kappaBp50(DNA結合亞單位)<400>461GlyArgLysPheLysLysPhe15<210>462<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人NF-KappaBp50(DNA結合亞單位)<400>462GluGluValGlnArgLysArgGlnLysLeuMetPro1510<210>463<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TEF-1(SV40轉錄增強子因子)<400>463GluGluValGlnArgLysArgGlnLysLeu1510<210>464<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人TEF-1(SV40轉錄增強子因子)<400>464GlyLysThrArgThrArgLysGln15<210>465<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠、小鼠、人IRF-1(干擾素調節(jié)因子-1)<400>465AlaArgArgLysSerArgAsp15<210>466<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠、小鼠、人IRF-1(干擾素調節(jié)因子-1)<400>466GlnArgLysGluArgLysSerLysSer15<210>467<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>艾氏腹水S-II轉錄因子<400>467ThrLysSerLysThrLysArgLysLeu15<210>468<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>煙草TAF-1轉錄激活劑<400>468GlyLysCysLysLysLysAsn15<210>469<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>煙草TAF-1轉錄激活劑<400>469GluArgSerLysLysArgSerArgGlu15<210>470<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>煙草TAF-1轉錄激活劑<400>470GluArgGluLeuLysArgGluLysArgLysGln1510<210>471<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>果蠅TFIIEa(433個氨基酸)，RNA聚合酶II的通用轉錄因子<400>471AlaArgArgSerArgLeuArgLysGln15<210>472<211>14<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人ER(雌激素受體)<400>472TyrLysLeuAspHisMetArgArgArgIleGluThrAspGlu1510<210>473<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人ER(雌激素受體)<400>473AspLysAsnArgArgLysSer15<210>474<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人ER(雌激素受體)<400>474IleArgLysAspArgArgGly15<210>475<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母ADA2(434個氨基酸)，某些酸性活化結構域的功能所需的潛在轉錄連接物<400>475IleLysArgSerLysLysAsn15<210>476<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母ADA2(434個氨基酸)，某些酸性活化結構域的功能所需的潛在轉錄連接物<400>476GluGlnArgArgHisArgIleGlu15<210>477<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母ADA2(434個氨基酸)，某些酸性活化結構域的功能所需的潛在轉錄連接物<400>477ThrThrArgAlaGluLysLysArgLeuLeu1510<210>478<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母GCN5基因產物(439個氨基酸)，GCN4轉錄激活劑功能和HAP-2-3-4復合體活性所需<400>478IleAspLysLysArgSerLysGluAlaLysGlu1510<210>479<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠LFB3<400>479GluAlaAlaLeuArgArgLysIleArgThrIleSerLys1510<210>480<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠LFB3.<400>480AsnLysLysMetArgArgAsnArgPhe15<210>481<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠LFB1<400>481AsnArgArgLysArgGlnLys15<210>482<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠LFB1<400>482ThrLysLysGlyArgArgAsnArgPhe15<210>483<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠VHNF1-A<400>483AsnArgArgLysArgHisLys15<210>484<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠HNF-1b<400>484AsnLysLysMetArgArgAsnArgPheLys1510<210>485<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠肝HNF-1<400>485AsnLysLysMetArgArgAsnArg15<210>486<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人VHNF1<400>486ThrLysLysGlyArgArgAsnArgPhe15<210>487<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠HNF-1<400>487AsnLysLysMetArgArgAsnArgPhe15<210>488<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠HNF-3b<400>488ThrLysLysGlyArgArgAsnArgPhe15<210>489<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠HNF-3b<400>489LeuArgArgGlnLysArgPheLys15<210>490<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠HNF-3g<400>490GlnGlnHisHisHisSerHisHisHisHisGln1510<210>491<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠HNF-3a<400>491LeuArgArgGlnLysArgPheLys15<210>492<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠DBP，與白蛋白基因啟動子D位點結合的蛋白因子<400>492LeuArgArgGlnLysArgPheLys15<210>493<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠DBP，與白蛋白基因啟動子D位點結合的蛋白因子<400>493LeuLysGluLysGluArgLysAla15<210>494<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠AT-BP1<400>494MetLysLysAlaArgLysVal15<210>495<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與異染色質關聯的19kD的果蠅非組蛋白<400>495ProArgArgGluArgArgTyr15<210>496<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>519個氨基酸的小鼠EBF(早期B細胞因子)<400>496AspArgArgValArgLysGlyLysVal15<210>497<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人Sp1<400>497SerLysHisGlyArgArgAlaArgArgLeuAspPro1510<210>498<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母SNF2，許多基因的轉錄調節(jié)物<400>498GlyArgArgThrArgArgGlu15<210>499<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母SNF2，許多基因的轉錄調節(jié)物<400>499AspGluGlnLysArgAlaGluLysLysAlaLysGlu1510<210>500<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母SNF2，許多基因的轉錄調節(jié)物<400>500IleArgArgIleHisLysValIleArgPro1510<210>501<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠AGP/EBP<400>501LeuLeuArgArgLeuLysLysAspValGlu1510<210>502<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠AGP/EBP<400>502AlaLysAlaLysAlaLysLysAla15<210>503<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠AGP/EBP<400>503TyrLysMetArgArgGluArgAsn15<210>504<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠LAP，32kD的肝臟富含的轉錄激活劑，也存在于肺中，與C/EBP有71％的序列相似性<400>504ValArgLysSerArgAspLysAla15<210>505<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠LAP，32kD的肝臟富含的轉錄激活劑，也存在于肺中，與C/EBP有71％的序列相似性<400>505AlaLysAlaLysAlaLysLysAla15<210>506<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠LAP，32kD的肝臟富含的轉錄激活劑，也存在于肺中，與C/EBP有71％的序列相似性<400>506TyrLysMetArgArgGluArgAsn15<210>507<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Ig/EBP-1(免疫球蛋白基因增強子結合蛋白)<400>507ValArgLysSerArgAspLysAla15<210>508<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Ig/EBP-1(免疫球蛋白基因增強子結合蛋白)<400>508TyrArgGlnArgArgGluArg15<210>509<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠c-Myb<400>509ValLysLysSerArgLeuLysSerLysGlnLys1510<210>510<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠c-Myb<400>510GluAspProGluLysGluLysArgIleLysGluLeuGlu1510<210>511<211>5<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>果蠅無眼蛋白(760個氨基酸)<400>511MetArgArgLysVal15<210>512<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>果蠅無眼蛋白(760個氨基酸)<400>512AspTyrTyrLysValLysArgProLysThrAsp1510<210>513<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>果蠅無眼蛋白(760個氨基酸)<400>513GlyArgAlaArgGlyArgArgHisGln15<210>514<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>與白介素-6反應元件相互作用的大鼠IL-6DBP<400>514PheArgTyrArgLysIleLysAspIleTyr1510<210>515<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠H-2RBP<400>515AlaLysAlaLysAlaLysLysAla15<210>516<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>雞RXR<400>516AspLysArgGlnArgAsnArgCys15<210>517<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人NF-IL5(345個氨基酸)<400>517AspLysArgGlnArgAsnArgCys15<210>518<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人NF-IL6(345個氨基酸)<400>518ValLysSerLysAlaLysLysThr15<210>519<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人NF-IL6(345個氨基酸)<400>519TyrLysIleArgArgGluArgAsn15<210>520<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠PPAR<400>520ValArgLysSerArgAspLysAla15<210>521<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母RAP1<400>521GlnLysLysAsnArgAsnLysCys15<210>522<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人維生素D受體(427個氨基酸)<400>522GluGlnIleArgLysLeuValLysLysHisGly1510<210>523<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小鼠WT1(人腎胚胎瘤易感基因WT1的小鼠同系物)<400>523PheArgArgSerMetLysArgLysAla15<210>524<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人WT33(腎胚胎瘤易感)<400>524LeuLysArgHisGlnArgArgHis15<210>525<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母SWI399kD，強酸性蛋白<400>525LeuLysArgHisGlnArgArgHis15<210>526<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人RBAP-1(視網膜神經膠質瘤關聯蛋白1)因子(412個氨基酸)<400>526LeuLysGluSerLysArgLysTyrAspGlu1510<210>527<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母L3<400>527GluValLeuLysValGlnLysArgArgIleTyrAsp1510<210>528<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母L3<400>528TyrLysSerLysLysLysAla15<210>529<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母59核糖體蛋白<400>529ThrLysLysLeuProArgLysThr15<210>530<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母L16核糖體蛋白<400>530ThrArgLysLysGlyGlyArgArgGlyArgArgLeu1510<210>531<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母L2核糖體蛋白(與非洲爪蟾L1同源)<400>531AlaArgAlaThrArgArgLysArgCysLysGly1510<210>532<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>X.LaevisL1核糖體蛋白(與酵母L2同源)<400>532GlyLysGlyLysTyrArgAsnArgArgTrp1510<210>533<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>X.LaevisL1核糖體蛋白(與酵母L2同源)<400>533GlyLysGlyLysMetArgAsnArgArgArgIleGlnArgArgGly151015<210>534<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>X.LaevisL1核糖體蛋白(與酵母L2同源)<400>534AsnLysLysValLysArgArgGluLeuLysLysAsn1510<210>535<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>X.LaevisL1核糖體蛋白(與酵母L2同源)<400>535AlaLysThrAlaArgArgLysAla15<210>536<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>X.LaevisL1核糖體蛋白(與酵母L2同源)<400>536IleLysAlaLysGluLysLysPro15<210>537<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>X.LaevisL1核糖體蛋白(與酵母L2同源)<400>537GlyLysProLysAlaLysLysPro15<210>538<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人S6核糖體蛋白(與酵母S10同源)<400>538AlaLysAlaLysLysArgGln15<210>539<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人S6核糖體蛋白(與酵母S10同源)<400>539GluArgLysArgLysSer15<210>540<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人S6核糖體蛋白(與酵母S10同源)<400>540GlyLysArgProArgThrLysAla15<210>541<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人S6核糖體蛋白(與酵母S10同源)<400>541HisLysArgArgArgIle15<210>542<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠L17核糖體蛋白(與酵母S10同源)<400>542LeuLysLysGlnArgThrLysLysAsnLysGlu1510<210>543<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠L17核糖體蛋白(184個氨基酸)<400>543ProLysMetArgArgArgThrTyrArg15<210>544<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>介穗水母(水螅蟲綱，腔腸動物門)L17核糖體蛋白(184個氨基酸)<400>544LysLysLysIleSerGlnLysLysLeuLysLys1510<210>545<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>介穗水母(水螅蟲綱，腔腸動物門)L17核糖體蛋白(184個氨基酸)<400>545TyrMetArgArgArgThrTyrArgAla15<210>546<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人，大鼠核糖體S13蛋白<400>546GluValLysLysValSerLysLysLysLeu1510<210>547<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母S10核糖體蛋白(與人S6同源)<400>547GluArgAsnArgLysAspLysAspAlaLysPheArg1510<210>548<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母S10核糖體蛋白(與人S6同源)<400>548GluArgLysArgLysSer15<210>549<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母S10核糖體蛋白(與人S6同源)<400>549GlnArgLeuGlnArgLysArgHis15<210>550<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>U2核內小核糖核蛋白輔助因子(UsAF)的35kD亞單位，哺乳動物的必需剪接因子<400>550IleArgLysArgArgAla15<210>551<211>51<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>在富含Arg/Ser區(qū)磷酸化的人UsnRNP關聯的70k蛋白(437個氨基酸)<400>551GlyArgArgArgLysLysHisArgSerArgSerArgSerArgGluArg151015ArgSerArgSerArgAspArgGlyArgGlyGlyGlyGlyGlyGlyGly202530GlyGlyGlyGlyGlyGlyArgGluArgAspArgArgArgSerArgAsp354045ArgGluArg50<210>552<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>在富含Arg/Ser區(qū)磷酸化的人UsnRNP關聯的70k蛋白(437個氨基酸)<400>552GluPheGluAspProArgAsp15<210>553<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>在富含Arg/Ser區(qū)磷酸化的人UsnRNP關聯的70k蛋白(437個氨基酸)<400>553GluThrArgGluGluArgMetGlu15<210>554<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>在富含Arg/Ser區(qū)磷酸化的人UsnRNP關聯的70k蛋白(437個氨基酸)<400>554GluAlaGlyAspAlaProProAspPro15<210>555<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>在富含Arg/Ser區(qū)磷酸化的人UsnRNP關聯的70k蛋白(437個氨基酸)<400>555GluGluArgMetGluArgLysArgArgGluLys1510<210>556<211>78<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>在富含Arg/Ser區(qū)磷酸化的人UsnRNP關聯的70k蛋白(437個氨基酸)<400>556HisArgAspArgAspArgAspArgGluArgGluArgArgGluSerArg151015GluArgAspLysGluArgGluArgArgArgSerArgSerArgAspArg202530ArgArgArgSerArgSerArgAspLysGluGluArgArgArgSerArg354045GluArgSerLysAspLysAspArgAspArgLysArgArgSerSerArg505560SerArgGluArgAlaArgArgGluArgGluArgLysGluGlu657075<210>557<211>36<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>用于線粒體和細胞質tRNA的n2，n2-二甲基鳥苷修飾的酵母TRM1酶<400>557ArgAspArgAspArgGluArgArgArgSerHisArgSerGluArgGlu151015ArgArgArgAspArgAspArgAspArgAspArgAspArgGluHisLys202530ArgGlyGluArg35<210>558<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>用于線粒體和細胞質tRNA的n2，n2-二甲基鳥苷修飾的酵母TRM1酶<400>558GlnLysArgAsnAsnLysLysSerLysLysLysArgCysAlaGlu151015<210>559<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母核孔蛋白NUP1(1076個氨基酸，113kD)<400>559GluLysLeuArgLysLeuLysIle15<210>560<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母核孔蛋白NUP1(1076個氨基酸，113kD)<400>560AsnLysArgLysArgVal15<210>561<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母核孔蛋白NUP1(1076個氨基酸，113kD)<400>561SerLeuLysAsnArgSerAsnArgLysArgGlu1510<210>562<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母核孔蛋白NUP1(1076個氨基酸，113kD)<400>562GluProLysArgLysArgArgLeuPro15<210>563<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>雞，非洲爪蟾NO.38核仁(38kD)<400>563AlaArgMetArgHisSerLysArg15<210>564<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>雞，非洲爪蟾N0.38核仁(38kD)<400>564LysAlaGluLysGluLysValAspAspGluGlu1510<210>565<211>4<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>雞，倉鼠，核仁蛋白(92kD)<400>565LysLysLysArg1<210>566<211>14<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>雞，倉鼠，核仁蛋白(92kD)<400>566LysThrGluArgGluAlaGluLysAlaLeuGluGluLysArg1510<210>567<211>14<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>雞，倉鼠，核仁蛋白(92kD)<221>變異體<222>5<223>Xaa＝任何氨基酸<400>567LysLysLysArgXaaGluAspThrThrGluGluThrLeuArg1510<210>568<211>50<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>人SATB1(763個氨基酸)<400>568ArgGlyGlyArgGlyGlyArgGlyGlyGlyArgGlyGlyPheGlyGly151015ArgGlyGlyGlyArgGlyPheGlyGlyArgGlyGlyGlyPheArgGly202530GlyArgGlyGlyGlyGlyAspHisLysProGlnGlyLysLysIleLys354045PheGlu50<210>569<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母CBF5p<400>569TrpTyrLysHisPheLysLysThrLysAsp1510<210>570<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母CBF5p<400>570GlnLysLysLysGlnMetLysAlaAsp15<210>571<211>30<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母CBF5p<400>571LysLysGluLysLysGluLysLysGluLysLysGluLysLysGluLys151015LysGluLysLysGluLysLysGluLysLysGluLysLysGlu202530<210>572<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母CBF5p<400>572LysLysGluLysLysArgLysSerGluAsp1510<210>573<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>酵母CCE1<400>573GluGluLysLysSerLysLysSerLysLys1510<210>574<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>大鼠核孔蛋白155或Nup155(1390個氨基酸，155kDa)<400>574ThrLysLysLysSerPheLysLeu15<210>575<211>19<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>細胞周期期間差異表達的人H2B變異體<400>575LysSerGluArgGluArgMetLeuArgGluSerLeuLysGluGluArg151015ArgArgPhe<210>576<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>細胞周期期間差異表達的人H2B變異體<400>576ProLysLysGlySerLysLysAla15<210>577<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺組蛋白H4(102個氨基酸)<400>577AspGlyLysLysArgLysArgSerArgLysGluSer1510<210>578<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺組蛋白H4(102個氨基酸)<400>578GlyAlaLysArgHisArgLysValLeuArgAsp1510<210>579<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺組蛋白H4(102個氨基酸)<400>579ProAlaIleArgArgLeuAlaArgArgGly1510<210>580<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺H3(135個氨基酸)<400>580GluHisAlaArgArgLysThr15<210>581<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺H2A(129個氨基酸)<400>581AlaArgArgIleArgGlyGluArgAla15<210>582<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Psammechinusmiliaris海膽的H2A(123個氨基酸)<400>582GlySerHisHisLysAlaLysGlyLys15<210>583<211>17<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺H2B(125個氨基酸)<400>583ArgGlyLysSerGlyLysAlaArgThrLysAlaLysSerArgSerSer151015Arg<210>584<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺H2B(125個氨基酸)<400>584ProLysLysGlySerLysLysAla15<210>585<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Psammechinusmiliaris海膽的H2B(122個氨基酸)<400>585GlnLysLysAspGlyLysLysArgLysArgSerArgLysGluSer151015<210>586<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>海星H2B(121個氨基酸)<400>586GlyGlyLysLysArgHisArgLysArgLysGlySerTyr1510<210>587<211>14<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>鮭魚睪丸H1(194個氨基酸)<400>587ProArgThrAspLysLysArgArgArgLysArgLysGluSer1510<210>588<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>鮭魚睪丸H1(194個氨基酸)<400>588ProAlaLysAlaProLysLysLysAla15<210>589<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>鮭魚睪丸H1(194個氨基酸)<400>589GluAlaLysLysProAlaLysLysAla15<210>590<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>鮭魚睪丸H1(194個氨基酸)<400>590AlaLysLysProLysLysVal15<210>591<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>鮭魚睪丸H1(194個氨基酸)<400>591AlaLysLysSerProLysLysAlaLysLysPro1510<210>592<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Parechinusangulosus海膽精子H1(248個氨基酸)<400>592ProLysLysValLysLysPro15<210>593<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Parechinusangulosus海膽精子H1(248個氨基酸)<400>593ProArgArgLysAlaLysArgAla15<210>594<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Parechinusangulosus海膽精子H1(248個氨基酸)<400>594ProLysLysAlaLysLysThr15<210>595<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Parechinusangulosus海膽精子H1(248個氨基酸)<400>595AlaLysAlaLysLysAlaLysAla15<210>596<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Parechinusangulosus海膽精子H1(248個氨基酸)<400>596AlaLysLysAlaArgLysAlaLysAla15<210>597<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Parechinusangulosus海膽精子H1(248個氨基酸)<400>597AlaLysLysAlaLysLysProLysLysLysAla1510<210>598<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Parechinusangulosus海膽精子H1(248個氨基酸)<400>598AlaLysLysAlaLysLysProAlaLysLys1510<210>599<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Parechinusangulosus海膽精子H1(248個氨基酸)<400>599SerProLysLysAlaLysLysPro15<210>600<211>13<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Parechinusangulosus海膽精子H1(248個氨基酸)<400>600AlaLysLysSerProLysLysLysLysAlaLysArgSer1510<210>601<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Parechinusangulosus海膽精子H1(248個氨基酸)<400>601ProLysLysAlaLysLysAla15<210>602<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>Parechinusangulosus海膽精子H1(248個氨基酸)<400>602AlaLysLysAlaLysLysSer15<210>603<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>環(huán)節(jié)動物精子Hla(119個氨基酸)<400>603ProArgLysAlaGlyLysArgArgSerProLysLysAlaArgLys151015<210>604<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>環(huán)節(jié)動物精子Hla(119個氨基酸)<400>604AlaArgArgArgLysThrAla15<210>605<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>環(huán)節(jié)動物精子Hla(119個氨基酸)<400>605IleArgLysPheIleArgLysAla15<210>606<211>6<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>環(huán)節(jié)動物精子Hla(119個氨基酸)<400>606ProLysLysLysLysAla15<210>607<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>環(huán)節(jié)動物精子Hla(119個氨基酸)<400>607AlaLysLysProLysAlaLysLysValLysLysPro1510<210>608<211>17<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG14(100個氨基酸)<400>608AlaLysLysLysThrAsnArgAlaArgLysProLysThrLysLysAsn151015Arg<210>609<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG14(100個氨基酸)<400>609ProLysArgLysValSerSer15<210>610<211>11<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG17(89個氨基酸；9,248D)<400>610GluGluProLysArgArgSerAlaArgLeuSer1510<210>611<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG17(89個氨基酸；9,247D)<400>611ProLysArgLysAlaGluGlyAspAlaLys1510<210>612<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG17(259個氨基酸)<400>612ProLysGlyLysLysGlyLysAla15<210>613<211>8<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG1(259個氨基酸)<400>613ProLysLysProArgGlyLysMet15<210>614<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG1(259個氨基酸)<400>614GluHisLysLysLysHisPro15<210>615<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG1(259個氨基酸)<400>615GluThrLysLysLysPheLysAspPro15<210>616<211>9<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG1(259個氨基酸)<400>616GluLysSerLysLysLysLysGluAsp15<210>617<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG2(256個氨基酸)<400>617GluGlyLysLysLysLysLysPheAlaLys1510<210>618<211>7<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG2(256個氨基酸)<400>618GluHisLysLysLysHisPro15<210>619<211>12<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>小牛胸腺HMG2(256個氨基酸)<400>619ProLysGlyAspLysLysGlyLysLysLysAspPro1510<210>620<211>10<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>鮭魚睪丸H6(60個氨基酸)<400>620GluGlyLysLysLysLysLysPheAlaLys1510<210>621<211>15<212>PRT<213>啤酒糖酵母<220><223>鮭魚睪丸H6(60個氨基酸)<400>621ProLysArgLysSerAlaThrLysGlyAspGluProAlaArgArg151015<210>622<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>最終脂質體制劑的外包被層<400>622LysProLysLysAlaAlaAlaProLysLysAla1510<210>623<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>最終脂質體制劑的外包被層<400>623HisHisHisHisHisSerProSerLeuLeuLeuLeuLeuLeuLeuLeu151015LeuLeuLeuLeuLeuLeuLeuLeu20<210>624<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223>[插入]<400>624HisHisHisHisHisSerProSerLeuAlaIleLeuAlaIleLeuAla151015IleLeuAlaIleLeuAlaIle20權利要求1.制備含包入治療劑的微膠粒的方法，包括(a)有效量負電荷治療劑與有效量陽離子脂質在大約20％至大約80％乙醇中，按大約30％至大約90％負電荷原子被脂質分子上的正電荷中和而形成靜電微膠粒復合體的比例組合；和(b)步驟a)的微膠粒復合體與有效量促融合-親核肽綴合物按大約0.0至大約0.3的比例范圍組合，由此制備含包入治療劑的微膠粒。2.權利要求1的方法，其中負電荷治療劑是選自多核苷酸和負電荷藥物的治療劑。3.權利要求1或2的方法，進一步包括在步驟a)中組合有效量的陰離子脂質。4.權利要求1或2的方法，其中陽離子脂質與促融合脂質DOPE以從約1∶1至約2∶1的摩爾比例組合。5.權利要求4的方法，其中促融合-親核肽是NLS肽。6.權利要求1或2的方法，進一步包括向步驟b)中組合有效量的包封脂質溶液。7.用權利要求1至5任一項的方法制備的含包入治療劑的微膠粒。8.用權利要求6的方法制備的包封治療劑的脂質體。9.將治療劑傳遞給受治療者的方法，包括給予受治療者有效量的權利要求7或8的微膠粒。10.用權利要求1至6任一項的方法可獲得的包封治療劑的微膠粒在制備用于治療給藥的藥物中的應用。全文摘要公開了一種將質粒，寡核苷酸或負電荷藥物包封到其內和外膜雙層之間具有不同脂質成分且在靜脈內注射給動物和人后能夠到達原發(fā)腫瘤及其轉移灶的脂質體中的方法。配制方法包括含陽離子脂質分子的DNA與由大約10－20個氨基酸的疏水鏈組成的和在其一個末端也包括四個或更多組氨酸殘基或NLS的促融合/NLS肽綴合物之間形成復合體。包封的分子在根除各種固體人類腫瘤中顯示治療功效，包括但不限于乳腺癌和前列腺癌。質粒，寡核苷酸或負電荷藥物與其它抗腫瘤藥物(正電荷順鉑，阿霉素)組合包封入脂質體中具有治療價值。在癌癥根除中也具有治療價值的是包封的質粒，寡核苷酸或負電荷藥物與HSV－tk加包封的9－[1，3－二羥－2－丙氧甲基]鳥嘌呤的組合。文檔編號A61K9/127GK1981873SQ20061006780公開日2007年6月20日申請日期2001年6月8日優(yōu)先權日2000年6月9日發(fā)明者泰尼·布利卡斯申請人:萊古倫公司