專利名稱：具有抗新生血管生成活性和抗腫瘤作用的玻璃海鞘多肽及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由玻璃海鞘(Ciona intestinalis)中分離純化的一組抗新生血管生成多肽，以及該多肽的提取方法和在預(yù)防和/或治療由新生血管生成引起的疾病等領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病，因而也是當(dāng)前全球研究的熱點。目前臨床上應(yīng)用的抗腫瘤藥物仍以細(xì)胞毒類藥物為主，這類藥物對腫瘤雖然具有一定的療效，但存在選擇性差、毒副作用大等缺點。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的了解不斷深入，為腫瘤的治療提供了新的模式。
現(xiàn)在已知，新生血管生成是腫瘤生長、發(fā)展的必經(jīng)之路，且與實體瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，許多腫瘤僅在新的血管生成之后才出現(xiàn)臨床癥狀，抑制腫瘤新生血管生成具有特異性高、療效好、不易產(chǎn)生耐藥性以及毒副作用低等特點，因此抑制血管形成可望成為治療癌癥的一個突破點。
以新生血管生成為靶點的抗腫瘤藥物具有較好的專一性，近年來受到廣泛關(guān)注，人們發(fā)現(xiàn)抑制新生血管生成過程可以有效抑制腫瘤生長，許多新生血管生成抑制劑在多種動物模型中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗腫瘤活性。與常用的細(xì)胞毒性藥物相比，由于內(nèi)皮細(xì)胞具有遺傳學(xué)的穩(wěn)定性，以其作為生物靶點的抗腫瘤藥物不易產(chǎn)生抗藥性，其意義特別重大。
近年來國際上已報道約500個新生血管生成抑制劑，目前已有60多個新生血管生成抑制劑臨床試驗階段，近10種已進(jìn)入II-III期臨床研究并取得了令人鼓舞的實驗結(jié)果。其中，蛋白多肽類藥物Avastin和Endostatin已于2005年、2006年分別在國外和國內(nèi)上市。
海鞘(Ascidian)屬于脊索動物門(Chordates)，尾索動物亞門(Urochordata)，海鞘綱(Ascidiacea)，全世界大約有1600種。從中發(fā)現(xiàn)了許多具有新的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的環(huán)肽、線性肽及desipeptides。Didemnins(膜海鞘素)最早是從加勒比海鞘中分離的，是desipeptides的家族，具有抗腫瘤，抗病毒和免疫抑制作用，其中Didemnins B是抗腫瘤活性最強(qiáng)的環(huán)肽(體外對L1210的IC50為2.5ng/ml)，也是第一種進(jìn)入臨床試驗的海洋天然產(chǎn)物。由兩種海鞘Didemnum cuculiferum和Polysyncranton lithostrotum中發(fā)現(xiàn)的一種13個氨基酸的環(huán)肽可顯著抑制微管聚合，并能延長小鼠p388淋巴細(xì)胞白血病的生存期；但由玻璃海鞘(Cionaintestinalis)中分離出抗腫瘤蛋白一直未見報道。本發(fā)明從玻璃海鞘中分離到一組新的具有抗新生血管生成活性的多肽。實驗證實，該多肽對斑馬魚胚胎血管生成有顯著的抑制作用，對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管狀形成有顯著的抑制活性。與現(xiàn)有的抗腫瘤藥物相比，以血管生成為靶點的抗腫瘤藥物具有毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，有希望發(fā)展成為新型的抗腫瘤藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一組具有抗新生血管生成活性并對腫瘤細(xì)胞系有直接抑制作用的多肽，該組多肽是玻璃海鞘(Ciona intestinalis)來源的。以凝膠過濾法測定其分子量約為1-3kDa。
本發(fā)明還涉及獲得該多肽的方法。它主要包含下述步驟，新鮮海鞘粉碎勻漿后，水浴處理，高濃度有機(jī)溶劑沉淀，上清液去掉有機(jī)溶劑凍干濃縮，SephadexG-25凝膠過濾層析，Superdex75快速蛋白質(zhì)液相色譜層析(FPLC)。
最后本發(fā)明還涉及診斷治療與新生血管生成異常相關(guān)疾病的方法。本發(fā)明的蛋白多肽或其一部分可以治療和/或預(yù)防新生血管生成方面引起的疾病。
本發(fā)明涉及一種用于分離純化抗新生血管生成蛋白多肽的方法，包括如下步驟[1]取新鮮的玻璃海鞘，粉碎勻漿，水浴處理，有機(jī)溶劑沉淀；[2]上清液去掉有機(jī)溶劑后凍干，緩沖液重新溶解，SephadexG-25凝膠過濾層析，得到活性峰3；[3]峰3部位再經(jīng)過Superdex75 FPLC后得到活性峰F-2；命名為BLF-2；[4]通過凝膠過濾法測定其分子量約為1-3KD；[5]BLF-2對斑馬魚胚胎新生血管生成有顯著的抑制活性，對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管狀形成有明顯的抑制作用；下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)力要求書所界定的本發(fā)明

圖1為玻璃海鞘有機(jī)溶劑沉淀后的上清液sephadex G-25凝膠過濾層析圖活性峰為峰3圖2為峰3部分Superdex75 FPLC的層析圖活性峰為峰F-2即BLF-2。
圖3為BLF-2對斑馬魚胚胎血管生成的抑制作用，呈劑量依賴關(guān)系。
圖4為BLF-2對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用，呈劑量依賴關(guān)系。
圖5為BLF-2對內(nèi)皮細(xì)胞管狀形成的抑制作用，呈劑量依賴關(guān)系。
具體實施例方式
實施例1BLF-2的制備丙酮分級沉淀，凝膠層析等技術(shù)制備玻璃海鞘多肽。其操作步驟如下
(1)取新鮮玻璃海鞘，采集于青島膠南，粉碎勻漿，60-80℃水浴加熱10-30min，離心取上清；(2)上清用70％冷丙酮沉淀，棄沉淀得上清；(3)上清液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在29℃，抽真空去掉丙酮；(4)去掉丙酮的上清液凍干后用少量緩沖液重新溶解，SephadexG-25凝膠過濾層析，得到5個峰，取第3個活性峰，收集活性組分，凍干，如圖1所示。
(5)峰3用少量純水重新溶解再經(jīng)Superdex75 FPLC，得到3個峰，取第二個峰，收集活性組分，如圖2所示。
實施例2BLF-2的體內(nèi)抗血管生成活性(1)取健康的斑馬魚胚胎，在受精后24小時去膜，在胎水中加入不同濃度的BLF-2；(2)作用到受精后72小時，固定，脫水，染色，脫色；(3)在顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎腸下靜脈的發(fā)育情況，隨著BLF-2濃度的升高，腸下靜脈的網(wǎng)狀面積減小甚至消失，呈劑量依賴關(guān)系；不同濃度的BLF-2(20μg/ml-80μg/ml)對斑馬魚胚胎腸下靜脈有明顯的抑制活性；由圖2可見，用20μg/ml的BLF-2處理受精后24小時的斑馬魚胚胎作用到受精后72小時，50％的腸下靜脈(SIVs)被抑制；在40μg/ml時，SIVs幾乎完全被抑制；并呈劑量依賴關(guān)系。
實施例3BLF-2的體外抗血管生成活性(1)低濃度的BLF-2(0.5μg/ml-10μg/ml)對Be17402肝癌細(xì)胞及MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖有明顯的作用，此數(shù)據(jù)未給出；(2)不同濃度的BLF-2(5μg/ml-20μg/ml)對人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞的遷移有明顯的抑制活性，并呈劑量依賴關(guān)系；由說明書附圖，圖4可見，12μg/ml的BLF-2與沒有加BLF-2的對照相比較從上室遷移到下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少；隨著BLF-2濃度的升高，遷移的細(xì)胞數(shù)依次減少；(3)不同濃度的BLF-2(5μg/ml-20μg/ml)對人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞的管狀形成有明顯的抑制活性，并呈劑量依賴關(guān)系；由圖5可見，12μg/ml的BLF-2與沒有加BLF-2的相比較會抑制內(nèi)皮細(xì)胞的管狀形成；在以上濃度范圍內(nèi)，隨著BLF-2濃度的升高，形成的管狀的面積減少，甚至不形成管狀。
權(quán)利要求
1.一組玻璃海鞘多肽，它由玻璃海鞘經(jīng)多種分離手段得到的組分，分子量為1-3kDa，所述多肽具有體內(nèi)外抗血管生成活性，體外抗腫瘤活性；
2.一種獲得權(quán)利要求1所述的玻璃海鞘多肽的方法，它包括以下步驟，所有的操作均在4℃下進(jìn)行-取新鮮的玻璃海鞘，粉碎勻漿，有機(jī)溶劑沉淀；-上清液去掉有機(jī)溶劑后凍干，緩沖液重新溶解，SephadexG-25凝膠過濾層析，得到活性峰3；-峰3部位再經(jīng)過Superdex75 FPLC后得到活性峰F-2，命名為BLF-2，即具有抗新生血管生成活性和抗腫瘤作用的玻璃海鞘多肽。
全文摘要
本發(fā)明公布了由玻璃海鞘提取分離，具有抗新生血管生成作用的有效部位及有效成分，玻璃海鞘經(jīng)高濃度有機(jī)溶劑沉淀，上清部分除去有機(jī)溶劑后經(jīng)凝膠過濾，根據(jù)保留時間計算出分子量為1－3kDa的玻璃海鞘多肽。本發(fā)明還涉及此多肽用于治療和/或預(yù)防癌癥的用途。具體地說，就是通過多種的分離純化手段從玻璃海鞘中分離純化出一組新的蛋白多肽，并通過體內(nèi)、體外活性實驗確定此多肽在新生血管生成疾病的預(yù)防和治療用途。
文檔編號A61K38/02GK1962689SQ20061007055
公開日2007年5月16日 申請日期2006年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月23日
發(fā)明者董平原, 林秀坤, 魏寧, 牛榮麗, 王征 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所