專利名稱：一種工程化子宮組織片層的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種工程化子宮組織片層，屬于組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物的
正常及病理兩種狀態(tài)下結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開(kāi)發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各 種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)生物替代物的科學(xué)。子宮作為雌性哺乳動(dòng)物的重要生殖器 官，在孕育胎兒和各種病理與生殖機(jī)制研究中占有重要地位。體外構(gòu)建出子宮組織具有重要 的理論和現(xiàn)實(shí)意義，除子宮組織修復(fù)外，還可作為子宮肌瘤和內(nèi)膜異位癥等病理機(jī)制的體外 研究和胚胎植入機(jī)制研究提供理想的體外研究模型。鑒于子宮在生殖生理研究中的重要性， 2001年美國(guó)華裔科學(xué)家劉宏清教授在體外構(gòu)建子宮內(nèi)膜并在其上進(jìn)行人胚胎的培養(yǎng)引起了 世界的關(guān)注。但是因?yàn)閭惱韱?wèn)題沒(méi)有報(bào)道具體的實(shí)施方案，工作也未能進(jìn)行下去。2003年 Park進(jìn)行了體外子宮內(nèi)膜腫瘤侵襲模型的研究，為體外進(jìn)行相關(guān)疾病研究提供了一個(gè)借鑒。 但是這些研究都只是構(gòu)建了子宮內(nèi)膜組織，沒(méi)有平滑肌層，并非完整子宮壁結(jié)構(gòu)，未能完全 再現(xiàn)體內(nèi)子宮的生理狀態(tài)。本發(fā)明提供的一種工程化子宮組織片層提供了完整的子宮壁結(jié)構(gòu) 并能有效再現(xiàn)子宮的生理狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是一種工程化子宮組織片層，由子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞，子 宮平滑肌細(xì)胞與凝膠材料復(fù)合而成。細(xì)胞與材料復(fù)合后孵箱內(nèi)放置一定時(shí)間，使凝膠凝固并 穩(wěn)定，再加培養(yǎng)液培養(yǎng)。本發(fā)明提供的一種工程化子宮組織片層可以用于臨床上子宮內(nèi)膜的 損傷修復(fù)，或體內(nèi)移植替代缺損子宮組織，也可以用于子宮肌瘤和內(nèi)膜異位癥等病理機(jī)制的 體外研究和胚胎植入機(jī)制研究提供理想的體外研究模型。
以下是本發(fā)明的完整描述
1、 I型膠原的制備I型膠原參照文獻(xiàn)制備。從大鼠尾跟部切斷鼠尾，置于酒精中沒(méi) 泡30-60min:無(wú)菌條件下撕下尾腱，剪碎。取尾腱碎片浸入0.1-0.5%的醋酸中，置4"C冰 箱，并用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌。24-72h后離心收集上清即可得膠原溶液。制備的膠原溶液用 電子天平稱出其中的膠原含量約為1. 0-2. 5g/ml.
2、 子宮片層模具的準(zhǔn)備將無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿置于超靜工作臺(tái)內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)皿直徑可以
是35咖，60卿或IOO咖，在培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂糖凝膠，厚度為1-4鵬。靜置10-30min后， 將自制長(zhǎng)方體形小槽置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中部瓊脂糖凝膠層上，再在細(xì)胞培養(yǎng)皿中鋪第二層瓊脂 糖凝膠，厚度為3-5mm，靜置10-30min后，取出長(zhǎng)方體后，在四角距邊沿1-3咖處插入四根 無(wú)菌玻璃支柱，玻璃支柱的長(zhǎng)度為5-8mm,直徑為1-2mm，子宮片層模具準(zhǔn)備完成。
3、 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)取處在增生期的子宮組 織，置入無(wú)菌PBS中，再用無(wú)菌PBS充分淸洗以去除血污和紅細(xì)胞；放入無(wú)血淸DMEM培養(yǎng) 液中，用手術(shù)刀輕輕刮取內(nèi)膜，加0.01-0. 25%胰酶37TC消化2-5min,用含血清的咖EM培 養(yǎng)液終止消化，離心，用10ml含血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，再以低速離心5-10min,離 心管內(nèi)上層為富含基質(zhì)細(xì)胞組分，余下的為上皮細(xì)胞組分，分別培養(yǎng)在5 tC"， 371C孵箱內(nèi) 培養(yǎng)，12-36h后用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液清洗兩遍去除血細(xì)胞，加入新的含血清的DMEM培養(yǎng)液 繼續(xù)培養(yǎng)。充分刮除內(nèi)膜并用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液清洗后，子宮肌層用眼科剪充分剪碎，新 鮮的O.Ol-0.25%胰酶3710消化2-5min，吸取消化液加入血清中終止消化，再用0.01-0.25% 膚酶37"消化2-5min,再終止，直到消化完全，離心，用含血淸的DMEM培養(yǎng)液重息細(xì)胞， 在5%002， 37r孵箱內(nèi)培養(yǎng)，12-36h后用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液清洗兩遍去除血細(xì)胞，加入新含 血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。5-10d后基質(zhì)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞傳2-5 代時(shí)狀態(tài)最好可用于工程化子宮的構(gòu)建。
4、 體外構(gòu)建組織工程化子宮將I型液態(tài)膠原與DMEM培養(yǎng)液混合，用0.1-0. 5mol/L NaOH調(diào)為中性，將培養(yǎng)到第三代子宮平滑肌細(xì)胞與混合物混合，使其終濃度達(dá)到1X105- 1 X107ml，接種于自制片層組織構(gòu)建模具中。5-20min后再將第三代基質(zhì)細(xì)胞與混合物混合, 使其終濃度達(dá)到1X105- 1X 107ml接種于混合物上。24h后將獲得的原代子宮內(nèi)腆上皮細(xì)胞 以終濃度為1X10'-1X10S個(gè)腺體/ cn^接種于混合物C上。30min后加入含10%胎牛血淸的 DMEM/F12培養(yǎng)基，37"C， 5%(:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5、 組織工程化子宮應(yīng)用于體外支持胚胎的培養(yǎng)將組織工程化子宮在5%C0， 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間后，即可用于胚胎的培養(yǎng)。取1-細(xì)胞期或2-細(xì)胞期的正常胚胎，在 組織工程化子宮片層上培養(yǎng)。小鼠胚胎用CZB培養(yǎng)基培養(yǎng)，兔胚胎則用M199培養(yǎng)基培養(yǎng). 每天統(tǒng)計(jì)發(fā)育率。
具體實(shí)施方式
1 子宮片層組織的構(gòu)建
將培養(yǎng)到l-5代子宮平滑肌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分別與凝膠材料,如液態(tài)I型膠原和ECM-gel 混合，終濃度達(dá)到lX10'Vml -lX107ml，依次接種于自制片層組織構(gòu)建模具中。形成下層 為平滑肌層，上層為基質(zhì)層的雙層子宮壁結(jié)構(gòu)。膠原凝固后將原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)腆腺上皮細(xì) 胞以終濃度為IX 107ml- 1X107 ml接種于雙層結(jié)構(gòu)上，形成三層子宮結(jié)構(gòu)。30"60min后 加入10%胎牛血清的DMEM/F12條件培養(yǎng)基，其中含有10-100nM雌激素和l(MOOnM孕激素， 37"C， 5MC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。
本發(fā)明中的自制片層組織構(gòu)建模具設(shè)計(jì)了靜態(tài)力學(xué)拉伸效果，更進(jìn)一步地模仿了正常子 宮自然條件下的狀態(tài)。通過(guò)力學(xué)刺激，工程化子宮組織片層具有典型的子宮壁三層結(jié)構(gòu)，在 形態(tài)學(xué)上更類似于正常子宮，內(nèi)部平滑肌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞排列有序，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。功能分 析顯示工程化子宮組織片層具有正常子宮組織對(duì)激素的反應(yīng)和表達(dá)胚胎植入相關(guān)分子的功 能。
具體實(shí)施方式
2
組織工程化子宮應(yīng)用于體外支持小鼠胚胎和兔胚胎的培養(yǎng)
將工程化子宮組織片層在37*C， 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-36h后，即可用于胚胎的培養(yǎng)。 用經(jīng)過(guò)澉素超排處理后受孕的雌性小鼠或兔取1-細(xì)胞期或2-細(xì)胞期的正常胚胎，在組織工 程化子宮片層上培養(yǎng)。小鼠胚胎用CZB培養(yǎng)基培養(yǎng)，兔胚胎則用M199培養(yǎng)基培養(yǎng)。每天統(tǒng)
計(jì)發(fā)育率。結(jié)果表明工程化子宮組織片層能夠明顯地提高胚胎體外發(fā)育率及胚胎質(zhì)l:,囊胚
發(fā)育率可達(dá)85%以上。


圖l組織工程化子宮片層模具示意圖。圖中l(wèi)為瓊脂糖凝膠；2為玻璃支柱；3為培養(yǎng)皿。 圖2模具中構(gòu)建的組織工程化子宮片層示意圖。圖中1為體外構(gòu)建的工程化子宮片層。 圖3構(gòu)建的組織工程化子宮片層示意圖。圖中l(wèi)為上皮層；2為基質(zhì)層3為平滑肌層。
權(quán)利要求
1. 一種工程化子宮組織片層，其特點(diǎn)是蟲(chóng)子宮平滑肌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分別與凝膠材料混合 后按順序疊加而成雙層結(jié)構(gòu)，再在其上疊加上皮細(xì)胞，進(jìn)一步形成具有類似于正常子宮 壁的組織結(jié)構(gòu)，包括平滑肌層、SJt層和上皮層。
2. 權(quán)利要求1所述的細(xì)胞包括子宮平滑肌細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞，可以是來(lái)源于正常 和病理缺損的兔子宮組織，也可以是正常和病理缺損的人子宮組織，也可以是來(lái)源于其 他哺乳動(dòng)物子宮組織。
3. 權(quán)利要求1所述的支架材料可以是I型膠原凝膠，ECM-gel，也可以是硫酸軟骨素和殼聚 糖凝膠，其中最優(yōu)選的是I型膠原凝膠和ECM-gd。
4. 權(quán)利要求1所述的一種工程化子宮組織片層，其底層是平滑肌層，中間層是基質(zhì)層，表 層是上皮層。
5. 權(quán)利要求1所述的工程化子宮組織片層，在含血清的DMEM/F12條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)， DMEM/F12條件培養(yǎng)基中含有10-100nM雌激素和10-100nM孕激素。
6. 權(quán)利要求1所述的工程化子宮組織片層可以用于臨床上子宮內(nèi)膜的損傷修復(fù)，或體內(nèi)移 植替代缺損子宮組織，也可以作為支持胚胎體外發(fā)育及發(fā)育生物學(xué)機(jī)制研究的體外模型, 用于小鼠或兔或其它哺乳動(dòng)物的正常胚胎或核移植重構(gòu)胚胎或單精子注射胚胎的支持培 養(yǎng)，提高胚胎的體外發(fā)育率和發(fā)育質(zhì)量。
全文摘要
一種工程化子宮組織片層，其特點(diǎn)是由子宮平滑肌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分別與凝膠材料混合后按順序疊加而成雙層結(jié)構(gòu)，再在其上疊加上皮細(xì)胞，進(jìn)一步形成具有類似于正常子宮壁的組織結(jié)構(gòu)，包括平滑肌層、基質(zhì)層和上皮層。本發(fā)明可用于子宮組織的修復(fù)，作為子宮內(nèi)膜異位癥的研究模型和子宮腫瘤的研究模型，同時(shí)也可以作為支持胚胎體外發(fā)育及發(fā)育生物學(xué)機(jī)制研究的體外模型。
文檔編號(hào)A61L27/00GK101121043SQ20061007221
公開(kāi)日2008年2月13日 申請(qǐng)日期2006年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月10日
發(fā)明者宋宇軒, 段翠密, 紅 江, 王和平, 王常勇, 王海濱, 郭希民 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所