專利名稱：一種可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是涉及將來自不同組織的干細(xì)胞在體外分別向表皮和向真皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，并將誘導(dǎo)分化的細(xì)胞群和分離培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞以一定的比例與生物材料相結(jié)合，共同構(gòu)建可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的方法，利用此方法可制備用于臨床燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷、畸形、術(shù)后缺損、疤痕等皮膚組織修復(fù)和愈合的具有特定形狀、厚度、可調(diào)節(jié)膚色的皮膚組織替代物。
背景技術(shù)：
皮膚作為人體的最大器官，具有屏障、保護(hù)、調(diào)節(jié)體溫和感覺的功能。由于炎癥、潰瘍、燙傷、燒傷等因素造成的皮膚缺損，嚴(yán)重的可危及生命。目前臨床通常采用自體皮瓣或皮膚移植的方法治療缺損創(chuàng)面，但面臨供皮區(qū)新的創(chuàng)傷缺陷，以及供皮區(qū)來源的不足。此外移植物與移植部位臨近的皮膚存在顏色、質(zhì)地、功能上的差異。
組織工程學(xué)是應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，構(gòu)建生物性替代物，以恢復(fù)、維持或增進(jìn)受損器官或組織功能的一門科學(xué)(Nerem RM.Tissue engineeringin the USA.Med Biol Eng Comput，1992，30(4)CE8)。組織工程學(xué)的建立和發(fā)展為皮膚缺損治療開創(chuàng)了嶄新的途徑。
目前應(yīng)用于臨床的組織工程產(chǎn)品主要有合成性敷料、人工皮片、人工真皮替代物和人工復(fù)合全層皮膚。IntegraTM是由美國Integra Life Sciences公司生產(chǎn)的雙層基質(zhì)的人工真皮。其真皮是由牛肌腱的膠原蛋白及硫酸軟骨素制成具有一定孔洞大小的支架，利于血管內(nèi)皮細(xì)胞通過和纖維細(xì)胞長入，表皮是由硅膠膜組成，可在真皮層愈合后除去，再進(jìn)行人工表皮的移植。美國FDA于1996年核準(zhǔn)IntegraTM用于燒燙傷的治療。然而，IntegraTM由于缺乏活的細(xì)胞成分，可能延緩真皮的重建。
還有一類是含有單一細(xì)胞的皮膚，如人工表皮和人工真皮。
EpicelTM是由美國Genzyme組織修復(fù)公司生產(chǎn)的人工表皮，主要用于治療大面積燒燙傷病人。它是將病人自體的角質(zhì)細(xì)胞在體外放大培養(yǎng)，移植到潰瘍、痔、大皰性表皮松懈癥部位。雖然它們在殘留的真皮部位黏附得很好，但它們不黏附脂肪、慢性創(chuàng)面或感染性創(chuàng)面；而且移植部位容易剝離，或者形成水皰，對機(jī)械損傷高度敏感；缺乏真皮成分；移植成功率主要與創(chuàng)面細(xì)菌污染程度有關(guān)；費(fèi)用昂貴。DermagraftTM是由Advanced Tissue Sciences公司生產(chǎn)的人工真皮。是將新生兒包皮中獲取的成纖維細(xì)胞接種于生物可降解的聚乳酸纖維網(wǎng)上，移植后14天，成纖維細(xì)胞大量增殖并分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞因子，3～4周聚乳酸纖維網(wǎng)因生物降解而消失，用于治療糖尿病引起的足部潰瘍。但生產(chǎn)這種合成網(wǎng)膜真皮替代物需要大量成纖維細(xì)胞；難以改變網(wǎng)膜的厚度；市售產(chǎn)品只達(dá)到真皮重建。
ApligraftTM是第一種商業(yè)化的既含有表皮層又含有真皮層的組織工程化皮膚，由美國Organogenesis公司生產(chǎn)。它是將新生兒包皮中獲取的成纖維細(xì)胞接種于牛的I膠原蛋白中，6天后細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，形成類似真皮層的組織，再種植上新生兒包皮的角質(zhì)細(xì)胞。角質(zhì)細(xì)胞附著在真皮上開始分裂分化形成表皮層。再將整個復(fù)合物置于氣-液界面繼續(xù)培養(yǎng)，促使角質(zhì)細(xì)胞成熟。雖然ApligraftTM實(shí)現(xiàn)了一次外科手術(shù)同時重建真皮和表皮的目的，但由于采用同種異體細(xì)胞作為種子細(xì)胞來源，因而存在著不可避免的免疫排斥反應(yīng)，以及潛在的病源微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)；而且所用的種子細(xì)胞均為終末分化的成熟細(xì)胞，沒有自我增殖分化的能力。
成體干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，國內(nèi)外已有大量關(guān)于成體干細(xì)胞向骨、軟骨、脂肪、肝臟和神經(jīng)等誘導(dǎo)分化的離體實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，并且當(dāng)其移植到體內(nèi)，具有向病變部位遷移并分化成機(jī)體所需要的相應(yīng)細(xì)胞的能力(Mackenzie TC，F(xiàn)lake AW.Blood Cells Mol Dis，2001，27(3)601.)，利用成體干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，將為皮膚缺損的治療開辟新的途徑。
目前應(yīng)用于臨床的組織工程化皮膚尚不能根據(jù)患者膚色的不同進(jìn)行相應(yīng)的皮膚移植修復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為表皮和真皮細(xì)胞，再與分離培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞及生物材料一起構(gòu)建可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的方法。其特征是將體外誘導(dǎo)成皮膚的表皮細(xì)胞群、真皮細(xì)胞群和分離培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞用組織工程方法按比例混合，通過調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞的加入比例構(gòu)建含有黑色素細(xì)胞的人工皮膚。通過這種方法可制備用于臨床燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷、畸形、術(shù)后缺損、疤痕等皮膚組織修復(fù)和愈合的具有特定形狀、厚度的、可調(diào)節(jié)膚色的皮膚組織替代物。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(1)體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化將骨髓、脂肪、胚胎、臍帶血、外周血等組織來源的MSC或其它成體干細(xì)胞種植于在預(yù)先鋪有明膠(Sigma公司，貨號G-1890)、膠原、纖維蛋白凝膠、Matrigel膠(BD公司，貨號354240)或其它生物活性膠的孔板上，加入含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，貨號D-5523)或者其它成體干細(xì)胞相應(yīng)的基本培養(yǎng)基，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到30％～50％的融合，遂改用表皮誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液低糖DMEM/DF12(1∶1)培養(yǎng)基(DF12培養(yǎng)基，Sigma公司，貨號D-0547)中含有下列成分10～20ng/ml EGF(R&D公司，貨號236-EG)，10～20ng/ml bFGF(R&D公司，貨號234-FSE)，5～20ng/ml PDGF(R&D公司，貨號222-AB)，1％ITS(Sigma公司，貨號I-3146)，5～15mmol/L地塞米松(Sigma公司，貨號D-1756)，100IU/ml青霉素，100IU/ml鏈霉素中的兩種或兩種以上的組合物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，10～14天后即可得到表皮細(xì)胞。
(2)體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向真皮細(xì)胞分化將骨髓、脂肪、胚胎、臍帶血、外周血等組織來源的MSC或其它成體干細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，貨號D-5523)或者其它成體干細(xì)胞相應(yīng)的基本培養(yǎng)基中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到30％～50％的融合，遂改用真皮誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液高糖DMEM(Sigma公司，貨號D-5648)中含有下列成分2～10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)，5～15ng/mlTGF-β1(R&D公司，貨號240-B)，10～20ng/ml bFGF(R&D公司，貨號234-FSE)，1％ITS(Sigma公司，貨號I-3146)，5～15mmol/L地塞米松(Sigma公司，貨號D-1756)，100IU/ml青霉素，100IU/ml鏈霉素中的兩種或兩種以上的組合物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，10～14天后即可得到真皮細(xì)胞。
(3)黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)取部分皮膚組織，去除皮下組織及肉膜，然后置于75％乙醇中消毒1min，生理鹽水漂洗數(shù)遍，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用眼科剪將組織切為2mm×10mm細(xì)條狀，2.5g/L的Dispase酶(Gibco公司，貨號17105-041)消化過夜。用小鑷子輕輕將表皮與真皮分離，收集表皮，用0.25％胰酶消化10min，反復(fù)吹打獲得單細(xì)胞懸液，加入適量血清終止消化，400目篩網(wǎng)過濾，細(xì)胞懸液于離心管中1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，沉淀中加入含有100μg/ml遺傳霉素(Gibco公司，貨號11811-023)的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液(melanocyte growth medium M2，c-24110，PromoCell公司)于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。36h后換液，去除未貼壁的細(xì)胞，隔日換一次液。原代細(xì)胞70％～80％融合時，常規(guī)胰酶消化傳代。
(4)膠原溶液制備和支持材料的準(zhǔn)備新鮮牛尾浸于75％酒精中，無菌條件下剝離牛肌腱，生理鹽水洗滌，剪碎，加入0.03～0.05M冰醋酸4℃反復(fù)振搖溶解，制備膠原溶液。加入1/10體積的10×低糖DMEM(Sigma公司，貨號D-5523)，適量的胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)，用1N的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4。使用前將所需的膠原溶液注入培養(yǎng)皿中，置于冰上，紫外燈下照射30min～60min。
將豬、牛、羊等各種哺乳動物或其它來源的皮膚脫細(xì)胞基質(zhì)或其它商業(yè)脫細(xì)胞基質(zhì)或者諸如膠原海綿、蠶絲蛋白、PLA、PGA、PLGA等可降解、疏松多孔的生物或者聚合物材料進(jìn)行鈷60照射滅菌，用低糖DMEM培養(yǎng)基洗3次，之后置于4℃存放，待用。
(5)組織工程全層皮膚的制備將脫細(xì)胞基質(zhì)或其它生物支架材料或聚合物材料(如家蠶絲或柞蠶絲溶解提純得到的絲膠、絲素及甲殼素、纖維素、聚氨基酸、PLGA、PGA、PLA、聚酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙稀、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝化纖維等)放在硅化處理過的培養(yǎng)板(或其它培養(yǎng)皿)中。將向真皮細(xì)胞誘導(dǎo)10～14天的細(xì)胞群消化，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，貨號D-5523)重懸，計(jì)數(shù)，和膠原溶液混合均勻，按1×103～5×104個/cm2的密度種進(jìn)支持材料中。加入適量含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，靜置10分鐘，隨后放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后將培養(yǎng)基吸去，換成真皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。4天后將向表皮細(xì)胞和黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)10～14天的細(xì)胞群分別消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，按3～30∶1的比例，以2×103～2×105個/cm2的密度均勻種植于含有真皮細(xì)胞的材料表面。2h后將培養(yǎng)基吸去，換成表皮細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，3天后換成氣-液界面培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)7天后組織工程化皮膚即可用于移植。
本發(fā)明是將不同組織來源的干細(xì)胞在體外分別向表皮和向真皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，然后與分離培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞以一定比例混合，再與豬、牛、羊等各種哺乳動物或其它來源的皮膚脫細(xì)胞基質(zhì)或其它商業(yè)脫細(xì)胞基質(zhì)或者諸如膠原海綿、蠶絲蛋白、PLA、PGA、PLGA等可降解、疏松多孔的生物或者聚合物材料結(jié)合起來，共同構(gòu)成可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚，可制備用于臨床燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷、畸形、術(shù)后缺損、疤痕等皮膚組織修復(fù)和愈合的具有特定形狀、厚度、可調(diào)節(jié)膚色的皮膚組織替代物。由于干細(xì)胞具有多向分化潛能，能夠在誘導(dǎo)條件下分化為表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞，通過誘導(dǎo)分化的細(xì)胞及其分泌的可溶性細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)等活性成分的共同作用，能夠加速缺損創(chuàng)面的愈合，同時根據(jù)加入黑色素細(xì)胞比例的不同還能夠滿足不同個體膚色的需要，因此，市場價(jià)值潛力巨大，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1干細(xì)胞向表皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化a誘導(dǎo)分化后5天，細(xì)胞呈表皮細(xì)胞典型的“鋪路石狀”(×200)b誘導(dǎo)分化后10天透射電鏡觀察，胞漿中出現(xiàn)大量張力細(xì)絲和黑色素小體(×60000)c免疫熒光鑒定，誘導(dǎo)分化的細(xì)胞表達(dá)CK19(×100)d免疫組織化學(xué)鑒定，誘導(dǎo)分化的部分細(xì)胞表達(dá)CK10(×200)圖2干細(xì)胞向真皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化a誘導(dǎo)分化后10天透射電鏡觀察，細(xì)胞外出現(xiàn)少量膠原微纖維(×60000)b免疫組織化學(xué)鑒定，誘導(dǎo)分化部分細(xì)胞表達(dá)I型膠原圖3組織工程化皮膚裸鼠移植試驗(yàn)及體內(nèi)免疫熒光檢測a覆蓋組織工程化皮膚的裸鼠移植試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚥免疫熒光鑒定，組織工程化皮膚移植后3天，裸鼠皮膚缺損創(chuàng)面細(xì)胞表達(dá)CK10c免疫熒光鑒定，組織工程化皮膚移植后7天，細(xì)胞向皮膚缺損創(chuàng)面遷移d組織工程化皮膚移植后7天，組織工程化皮膚創(chuàng)面愈合率達(dá)到50％e組織工程化皮膚裸鼠移植試驗(yàn)21天后，缺損創(chuàng)面完全愈合具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、以骨髓MSC為例，體外分離不同組織來源的干細(xì)胞無菌條件下直接抽取患者骨髓，加等量生理鹽水稀釋，200目篩網(wǎng)過濾，加入6％HES(B.Braun公司)沉降紅細(xì)胞，吸取上層細(xì)胞懸液，離心去上清，加生理鹽水制成細(xì)胞懸液，用比重1.073g/ml的Percoll分離液(AmershamBiosciences公司，貨號17-0891-01)分離(1000g×20min)，小心吸出中間層細(xì)胞，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，貨號D-5523)重懸，接種于T-25培養(yǎng)瓶中。置CO2培養(yǎng)箱(溫度設(shè)定為37℃，CO2濃度為5％)內(nèi)培養(yǎng)；培養(yǎng)72h后換液，此后依細(xì)胞生長速度對培養(yǎng)體系進(jìn)行換液，待培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞長至80％以上融合時，用0.25％的胰蛋白酶37℃消化細(xì)胞，分別按5.5～7.0×103個/cm2接種于培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
實(shí)施例2、體外誘導(dǎo)MSC向表皮細(xì)胞分化將骨髓來源的MSC種植于預(yù)先鋪有Matrigel膠(BD公司，貨號354240)的孔板上，加入含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，貨號D-5523)，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到50％的融合，遂改用表皮誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液低糖DMEM/DF12(1∶1)培養(yǎng)基(Sigma公司，貨號D-0547)，15ng/ml EGF(R&D公司，貨號236-EG)，15ng/ml bFGF(R&D公司，貨號234-FSE)，5ng/ml PDGF(R&D公司，貨號222-AB)，1％ITS(Sigma公司，貨號I-3146)，10mmol/L地塞米松(Sigma公司，貨號D-1756)，100IU/ml青霉素，100IU/ml鏈霉素進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，10～14天后即可得到表皮細(xì)胞。結(jié)果顯示，干細(xì)胞向表皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化后5天，細(xì)胞呈表皮細(xì)胞典型的“鋪路石狀”。誘導(dǎo)分化后10天，胞漿中出現(xiàn)大量張力細(xì)絲和黑色素小體，免疫熒光檢測細(xì)胞表達(dá)CK19，免疫組化檢測部分細(xì)胞表達(dá)CK10(圖1)。
實(shí)施例3、體外誘導(dǎo)MSC向真皮細(xì)胞分化將骨髓來源的MSC種植于預(yù)先鋪有Matrigel膠的孔板上，加入含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司，貨號D-5523)，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到50％的融合，遂改用真皮誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液高糖DMEM(Sigma公司，貨號D-5648)，5％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)，15ng/mlTGF-β1(R&D公司，貨號240-B)，15g/ml bFGF(R&D公司，貨號234-FSE)，1％ITS(Sigma公司，貨號I-3146)，10mmol/L地塞米松(Sigma公司，貨號D-1756)，100IU/ml青霉素，100IU/ml鏈霉素進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，10～14天后即可得到真皮細(xì)胞。結(jié)果顯示，干細(xì)胞向真皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化后10天，細(xì)胞外出現(xiàn)少量膠原微纖維，免疫組化檢測，部分細(xì)胞表達(dá)I型膠原(圖2)。
實(shí)施例4、黑色素細(xì)胞的分離及體外培養(yǎng)取部分皮膚組織，去除皮下組織及肉膜，然后置于75％乙醇中消毒1min，生理鹽水漂洗數(shù)遍，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，用眼科剪將組織切為2mm×10mm細(xì)條狀，2.5g/L的Dispase酶(Gibco公司，貨號17105-041)消化過夜。用小鑷子輕輕將表皮與真皮分離，收集表皮，用0.25％胰酶消化10min，反復(fù)吹打獲得單細(xì)胞懸液，加入適量血清終止消化，400目篩網(wǎng)過濾，細(xì)胞懸液于離心管中1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，沉淀中加入含有100μg/ml遺傳霉素(Gibco公司，貨號11811-023)的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)液(melanocyte growth medium M2，c-24110，PromoCell公司)于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。36h后換液，去除未貼壁的細(xì)胞，隔日換一次液。原代細(xì)胞70％～80％融合時，常規(guī)胰酶消化傳代。
實(shí)施例5、膠原溶液準(zhǔn)備新鮮牛尾浸于75％酒精中，無菌條件下剝離牛肌腱，生理鹽水洗滌，剪碎，加入0.05M冰醋酸4℃反復(fù)振搖溶解，制備膠原溶液。加入1/10體積的10×低糖DMEM，適量的胎牛血清，用1N的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4。使用前將所需的膠原溶液注入培養(yǎng)皿中，置于冰上，紫外燈下照射40min。
實(shí)施例6、以皮膚脫細(xì)胞基質(zhì)為例，制備可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚將牛來源的皮膚脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行鈷60照射滅菌，用低糖DMEM培養(yǎng)基洗3次，之后置于硅化處理過的培養(yǎng)板(或其它培養(yǎng)皿)中。將向真皮細(xì)胞誘導(dǎo)10～14天的細(xì)胞群消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，和膠原溶液混合均勻，按5×104個/cm2的密度種進(jìn)支持材料中。加入適量含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，靜置10分鐘，隨后放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后將培養(yǎng)基吸去，換成真皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。4天后將向表皮細(xì)胞和黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)10～14天的細(xì)胞群分別消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，按30∶1的比例，以2×105個/cm2的密度均勻種植于含有真皮細(xì)胞的材料表面。2h后將培養(yǎng)基吸去，換成表皮細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，3天后換成氣-液界面培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)7天后組織工程化皮膚即可用于移植。
實(shí)施例7、組織工程皮膚修復(fù)裸鼠創(chuàng)面實(shí)驗(yàn)用3.5％水合氯醛麻醉裸鼠后，于背部尾側(cè)切取全層皮膚作直徑1.5cm的圓形缺損創(chuàng)面，移植組織工程皮膚替代物；術(shù)后3天去除包扎敷料，皮膚與創(chuàng)面貼合較緊，成活，第7天，創(chuàng)面愈合率達(dá)到50％，第21天創(chuàng)面已完全愈合，創(chuàng)面修復(fù)良好(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種能夠調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的構(gòu)建方法，其特征在于由向表皮細(xì)胞和向真皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞群、分離培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞與生物材料共同構(gòu)建而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的構(gòu)建方法，其特征在于所述的向表皮細(xì)胞或向真皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞包括從臍帶血、外周血、骨髓、脂肪、胎盤、臍帶等組織分離的干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化而獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的構(gòu)建方法，其特征在于所述的生物材料包括可降解生物材料包括家蠶絲或柞蠶絲溶解提純得到的絲膠、絲素及膠原、甲殼素、纖維素、聚氨基酸、PLGA、PGA、PLA；還包括脫細(xì)胞真皮基質(zhì)；非降解型生物材料如聚酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙稀、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝化纖維。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的構(gòu)建方法，其特征在于所述的黑色素細(xì)胞分離自皮膚，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的構(gòu)建方法，包括有干細(xì)胞的分離、干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化、誘導(dǎo)分化的細(xì)胞和分離培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞與生物材料的共培養(yǎng)，其特征在于，本發(fā)明方法包括以下步驟(1)不同組織來源干細(xì)胞的分離培養(yǎng)；(2)黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)；(3)不同組織來源干細(xì)胞向表皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化；(4)不同組織來源干細(xì)胞向真皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化；(5)膠原溶液制備和支持材料的準(zhǔn)備；(6)含有誘導(dǎo)分化的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞以及黑色素細(xì)胞的可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的構(gòu)建1)將脫細(xì)胞基質(zhì)或者其它生物或者聚合物材料放在硅化處理過的培養(yǎng)板(或其它培養(yǎng)皿)中，將向真皮細(xì)胞誘導(dǎo)10～14天的細(xì)胞群消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，和膠原溶液混合均勻，按1×103～5×104個/cm2的密度種進(jìn)支持材料中，加入適量含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，靜置10分鐘，隨后放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后將培養(yǎng)基吸去，換成真皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；2)4天后將向表皮細(xì)胞誘導(dǎo)10～14天的細(xì)胞群和培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞分別消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，按3～30∶1的比例，以2×103～2×105個/cm2的密度均勻種植于含有真皮細(xì)胞的材料表面；3)2h后將培養(yǎng)基吸去，換成表皮細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，3天后換成氣-液界面培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)7天后組織工程化皮膚即可用于移植。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的構(gòu)建方法，其特征在于用于誘導(dǎo)不同組織來源干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化的培養(yǎng)基是在低糖DMEM/DF12(1∶1)培養(yǎng)基中含有下列成分EGF、bFGF、PDGF，ITS，地塞米松，青霉素，鏈霉素中的兩種或兩種以上的組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的構(gòu)建方法，其特征在于用于誘導(dǎo)干細(xì)胞向真皮細(xì)胞分化的培養(yǎng)基是在高糖DMEM培養(yǎng)基中含有下列成分胎牛血清，TGF-β1，bFGF，ITS，地塞米松，青霉素，鏈霉素中的兩種或兩種以上的組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的構(gòu)建方法，其特征在于用于干細(xì)胞向表皮細(xì)胞分化的一種誘導(dǎo)方案可以是低糖DMEM/DF12(1∶1)培養(yǎng)基，15ng/ml EGF，15ng/ml bFGF，5ng/ml PDGF，1％ITS，10mmol/L地塞米松，100IU/ml青霉素，100IU/ml鏈霉素。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的構(gòu)建方法，其特征在于用于干細(xì)胞向真皮細(xì)胞分化的一種誘導(dǎo)方案可以是高糖DMEM，5％胎牛血清，15ng/mlTGF-β1，15g/ml bFGF，1％ITS，10mmol/L地塞米松，100IU/ml青霉素，100IU/ml鏈霉素。
10.可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚可制備應(yīng)用于臨床燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷、畸形、術(shù)后缺損、疤痕等皮膚組織修復(fù)和愈合的皮膚組織替代物。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是將不同組織的干細(xì)胞體外分別向表皮和真皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，并將誘導(dǎo)分化的細(xì)胞群和培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞以一定比例與生物材料相結(jié)合，共同構(gòu)建可調(diào)節(jié)膚色的組織工程化皮膚的方法。利用此方法可在支架材料上制備用于臨床燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷、畸形、術(shù)后缺損、疤痕等皮膚組織修復(fù)和愈合的具有特定形狀、厚度、可調(diào)節(jié)膚色的皮膚組織替代物。由于干細(xì)胞具有多向分化潛能，能夠在誘導(dǎo)條件下分化為表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞，通過誘導(dǎo)分化的細(xì)胞及其分泌的可溶性細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)等活性成分的共同作用，能夠加速缺損創(chuàng)面的愈合，根據(jù)加入黑色素細(xì)胞比例的不同能夠滿足不同個體膚色的需要，市場價(jià)值潛力巨大，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61F2/10GK101063109SQ20061007636
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月24日
發(fā)明者裴雪濤, 何麗娟, 陳琳, 南雪, 王韞芳, 管利東, 劉大慶, 白慈賢 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所