專利名稱：一種脫鈣骨支架材料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于骨損傷修復的支架材料及其制備方法，特別是涉及一種脫鈣骨支架材料及其制備方法。
背景技術：
骨缺損的治療是骨科面臨的難題之一，其療效以自體骨移植為佳，但因骨源不足，臨床應用受到限制，因此尋找自體骨理想的替代材料一直是研究人員進行骨組織工程研究的方向(Kokubo，S.，F(xiàn)ujimoto，R.，Yokota，S.，F(xiàn)ukushima，S.，Nozaki，K.，Takahashi，K.，and Miyata，K.(2003).Bone regeneration by recombinant humanbone morphogenetic protein-2 and a novel biodegradable carrier in a rabbitulnar defect model.Biomaterials 24，1643-1651.；Shors，E.C.(1999).Corallinebone graft substitutes.Orthop Clin North Am 30，599-613.)。研究表明，一種適于骨修復的支架材料應具備以下特點(1)一定的機械強度以保持特定形態(tài)，(2)良好的細胞和組織相容性，(3)合適的孔徑大小以利于骨細胞生長，(4)合適的降解率等(Damien，C.J.，and Parsons，J.R.(1991).Bone graft and bone graftsubstitutesa review of current technology and applications.J Appl Biomater2，187-208.)。目前，常用的骨支架材料包括骨水泥，聚合材料(如PLGA，鈦合金等)等，但上述材料都或多或少地存在細胞相容性差及因降解造成局部炎癥等問題(Mastrogiacomo，M.，Scaglione，S.，Martinetti，R.，Dolcini，L.，Beltrame，F(xiàn).，Cancedda，R.，and Quarto，R.(2006).Role of scaffold internal structureon in vivo bone formation in macroporous calcium phosphate bioceramics.Biomaterials 27，3230-3237.)。
脫鈣骨基質(zhì)是目前臨床及科研中常用的一種支架材料(Chakkalakal，D.A.，Strates，B.S.，Garvin，K.L.，Novak，J.R.，F(xiàn)ritz，E.D.，Mollner，T.J.，and McGuire，M.H.(2001).Demineralized bone matrix as a biological scaffoldfor bone repair.Tissue Eng 7，161-177.)。該材料保持了天然骨的小梁結構與有機成分，因而是一種很好的骨填充材料。目前常用的脫鈣骨基質(zhì)材料多采用顆?；蚰z的形式，這樣的形態(tài)雖然能夠很好的填充不規(guī)則的骨缺損，但由于其沒有機械強度，不能保持一個固定的形態(tài)，因而常會造成材料的移動和散失，導致骨修復的不均一性和不可預測性，而且現(xiàn)有的處理方法無法有效控制免疫原，給移植帶來風險，這些缺陷極大地限制了現(xiàn)有脫鈣骨基質(zhì)材料在治療較大骨缺損中的應用。因此，迫切需要一種具有良好的細胞和組織相容性，合適的孔徑及一定機械強度的脫鈣骨支架材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有良好的細胞和組織相容性，合適孔徑及一定機械強度的脫鈣骨支架材料。
本發(fā)明所提供的脫鈣骨支架材料，是將動物松質(zhì)骨依次用丙酮、鹽酸、雙氧水和胰酶進行處理后得到的產(chǎn)品。
所述鹽酸的濃度為0.5-0.7M；雙氧水的質(zhì)量百分濃度為10-15％；胰酶的質(zhì)量百分濃度為0.4-0.6％。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種脫鈣骨支架材料的制備方法。
本發(fā)明所提供的脫鈣骨支架材料的制備方法，包括以下步驟1)取動物松質(zhì)骨，去除軟骨及脂肪等附著組織；2)清洗松質(zhì)骨；3)將松質(zhì)骨用丙酮處理48-72小時；4)將松質(zhì)骨置于0.5-0.7M的鹽酸中脫鈣24-48小時，直至松質(zhì)骨材料出現(xiàn)多孔結構，并且再無明顯的無機成分被洗出；5)將脫鈣松質(zhì)骨用質(zhì)量百分濃度為10-15％的雙氧水漂白10-30分鐘；6)清洗松質(zhì)骨，平衡12-24小時；7)室溫下，將松質(zhì)骨用質(zhì)量百分濃度為0.4-0.6％的胰酶處理6-8小時；8)清洗松質(zhì)骨，平衡12-24小時；9)將脫鈣松質(zhì)骨凍干、滅菌后，得到可用于骨損傷修復的脫鈣骨支架材料。
在上述制備方法中，所述步驟1)中松質(zhì)骨的來源是廣泛的，如牛、羊、馬或豬等大型哺乳動物。
步驟2)、步驟6)和步驟8)中可用去離子水對松質(zhì)骨進行清洗；步驟步驟6)和步驟8)中平衡用水為去離子水。
步驟3)中可根據(jù)實際需要，先將松質(zhì)骨分割成合適的大小，再用丙酮進行處理。
步驟7)中胰酶的濃度優(yōu)選為0.5％。
步驟9)中可用射線照射法對脫鈣松質(zhì)骨進行滅菌，如用鈷60(Co60)進行照射。
本發(fā)明提供了一種脫鈣骨支架材料及其制備方法。經(jīng)檢測，本發(fā)明的脫鈣骨支架材料具有適合骨細胞生長的孔徑，良好的物理特性及細胞和組織相容性，且無免疫原性，總蛋白含量為93-94％，水份含量為6-7％，膠原蛋白含量為85-92％，灼燒殘渣為0.4-0.5％，有效地去除了無機成分。在該脫鈣骨支架材料的制備方法中，采用丙酮對其進行處理的目的是去除脂肪組織；使用鹽酸的目的是脫鈣；使用雙氧水的目的是漂白；使用胰酶的目的是盡可能的去除非膠原類蛋白。該制備方法簡單、對設備要求低、成本低廉，可應用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，從而滿足骨組織工程研究和臨床治療(特別是治療骨缺損和骨不連)中對骨損傷修復材料的需求。本發(fā)明在醫(yī)學領域具有較高的實際應用價值。
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。


圖1A為脫鈣骨支架材料的表觀形態(tài)觀察結果圖1B為脫鈣骨支架材料的掃描電鏡觀察結果圖2為人原代成纖維細胞在脫鈣骨支架材料上的生長情況圖3A為皮下包埋四周后脫鈣骨支架材料的宏觀照片圖3B為放大10倍的皮下包埋四周后脫鈣骨支架材料的切片3C為放大20倍的皮下包埋四周后脫鈣骨支架材料的切片圖具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述百分比濃度均為質(zhì)量百分濃度。
實施例1、脫鈣骨支架材料的制備及其鑒定一、制備脫鈣骨支架材料以牛的松質(zhì)骨為原材料制備脫鈣骨支架材料，具體制備過程包括如下步驟1)取牛松質(zhì)骨，去除軟骨及脂肪等附著組織；2)用去離子水將松質(zhì)骨清洗干凈；3)將松質(zhì)骨按每塊約0.5-5cm3的大小進行分割，并在丙酮中處理48小時；4)將松質(zhì)骨置于0.5M的鹽酸中脫鈣24小時，可看到松質(zhì)骨材料出現(xiàn)多孔結構，并且再無明顯的無機成分被洗出；5)將經(jīng)脫鈣處理的松質(zhì)骨用10％雙氧水漂白30分鐘；6)用去離子水沖洗，平衡12-24小時；7)室溫下，用0.4％胰酶處理8小時；8)用去離子水沖洗，平衡12-24小時；9)將脫鈣松質(zhì)骨凍干，分裝，用Co60照射滅菌，得到脫鈣骨支架材料。
二、鑒定
1、表觀形態(tài)及掃描電鏡觀察首先對步驟一獲得的脫鈣骨支架材料進行表觀形態(tài)觀察，如圖1A所示，該材料多孔，且具有親水性。在凍干狀態(tài)下，該材料具有較好的機械強度；在潤濕的情況下，該材料則具有較高的彈性，因此將其移植到體內(nèi)時能夠保持一定的形態(tài)。然后用掃描電鏡對其形態(tài)結構進行進一步地觀測，掃描電鏡觀測結果如圖1B所示，從微觀角度顯示了該材料的多孔結構及孔徑大小，孔徑介于400-600μm之間，適于骨細胞的生長。上述觀測結果表明本發(fā)明的脫鈣骨支架材料具有合適的孔徑和良好的物理特性。
2、膠原含量測定測定步驟一獲得的脫鈣骨支架材料的膠原含量，結果該材料中總蛋白含量為94％，水份含量為7％，膠原蛋白含量為92％，灼燒殘渣為0.5％，表明本發(fā)明的脫鈣骨支架材料中無機成分的去除十分有效。
3、細胞相容性檢測為驗證本發(fā)明的脫鈣骨支架材料是否適合細胞的生長，現(xiàn)將原代人成纖維細胞與脫鈣骨支架材料進行共培養(yǎng)，結果如圖2所示(標尺＝100μm)，材料的內(nèi)部和外部均有大量細胞的生長，沿著材料支架，細胞貼附在表面成簇生長，沒有明顯的排異反應，表明本發(fā)明的脫鈣骨支架材料具有良好的細胞相容性。
4、免疫原性檢測免疫原性評價是檢測移植材料的一個重要指標。現(xiàn)用皮下包埋法檢測本發(fā)明脫鈣骨支架材料的免疫原性，具體方法為將材料移植到大鼠皮下，觀察組織對于該材料的反應。包埋四周后該材料的宏觀照片如圖3A所示，沒有明顯的免疫排斥的跡象，周圍組織向內(nèi)生長，材料邊緣開始降解。皮下包埋四周后的切片圖如圖3B(放大倍數(shù)10×)和圖3C(放大倍數(shù)20×)所示，大量的纖維樣組織填充在材料的空隙之中，以成纖維細胞和血細胞為主，在材料周圍沒有過度增殖的免疫細胞，而且材料開始變的松散，降解。上述檢測結果表明本發(fā)明的脫鈣骨支架材料沒有引起組織明顯的反應，證明該骨材料具有良好的組織相容性，且無免疫原性，可用于骨損傷修復。
實施例2、脫鈣骨支架材料的制備及其鑒定一、制備脫鈣骨支架材料以豬的松質(zhì)骨為原材料制備脫鈣骨支架材料，具體制備過程包括如下步驟1)取豬松質(zhì)骨，去除軟骨及脂肪等附著組織；2)用去離子水將松質(zhì)骨清洗干凈；3)將松質(zhì)骨按每塊約0.5-5cm3的大小進行分割，并在丙酮中處理72小時；
4)將松質(zhì)骨置于0.7M的鹽酸中脫鈣48小時，可看到松質(zhì)骨材料出現(xiàn)多孔結構，并且再無明顯的無機成分被洗出；5)將經(jīng)脫鈣處理的松質(zhì)骨用15％雙氧水漂白10分鐘；6)用去離子水沖洗，平衡12-24小時；7)室溫下，用0.5％胰酶處理6小時；8)用去離子水沖洗，平衡12-24小時；9)將脫鈣松質(zhì)骨凍干，分裝，用Co60照射滅菌，得到脫鈣骨支架材料。
用與實施例1相同的方法對制備的脫鈣骨支架材料進行檢測，檢測結果表明本發(fā)明的脫鈣骨支架材料具有合適的孔徑，良好的物理特性及細胞和組織相容性，且無免疫原性，總蛋白含量為93％，水份含量為6％，膠原蛋白含量為87％，灼燒殘渣為0.4％，無機成分的去除十分有效，可用于骨損傷修復。
權利要求
1.一種脫鈣骨支架材料，是將動物松質(zhì)骨依次用丙酮、鹽酸、雙氧水和胰酶進行處理后得到的產(chǎn)品。
2.根據(jù)權利要求1所述的脫鈣骨支架材料，其特征在于所述鹽酸的濃度為0.5-0.7M。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的脫鈣骨支架材料，其特征在于所述雙氧水的質(zhì)量百分濃度為10-15％。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的脫鈣骨支架材料，其特征在于所述胰酶的質(zhì)量百分濃度為0.4-0.6％。
5.一種脫鈣骨支架材料的制備方法，包括以下步驟1)取動物松質(zhì)骨，去除軟骨及附著組織；2)清洗松質(zhì)骨；3)將松質(zhì)骨用丙酮處理48-72小時；4)將松質(zhì)骨置于0.5-0.7M的鹽酸中脫鈣24-48小時；5)將松質(zhì)骨用質(zhì)量百分濃度為10-15％的雙氧水漂白10-30分鐘；6)清洗松質(zhì)骨，平衡12-24小時；7)室溫下，將松質(zhì)骨用質(zhì)量百分濃度為0.4-0.6％的胰酶處理6-8小時；8)清洗松質(zhì)骨，平衡12-24小時；9)將脫鈣松質(zhì)骨凍干、滅菌后，得到脫鈣骨支架材料。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中的松質(zhì)骨來源于牛、羊、馬或豬。
7.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)、步驟6)和步驟8)中用去離子水對松質(zhì)骨進行清洗；步驟步驟6)和步驟8)中平衡用水為去離子水。
8.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中先將松質(zhì)骨進行分割，再用丙酮進行處理。
9.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟7)中胰酶的濃度為0.5％。
10.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟9)中用鈷60對脫鈣松質(zhì)骨進行照射滅菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脫鈣骨支架材料及其制備方法。該脫鈣骨支架材料是將動物松質(zhì)骨依次用丙酮、鹽酸、雙氧水和胰酶進行處理后得到的產(chǎn)品。其制備方法包括以下步驟1)取動物松質(zhì)骨，去除軟骨及附著組織；2)清洗；3)用丙酮處理48－72小時；4)置于0.5－0.7M的鹽酸中脫鈣24－48小時；5)用質(zhì)量百分濃度為10－15％的雙氧水漂白10－30分鐘；6)清洗，平衡12－24小時；7)室溫下，用質(zhì)量百分濃度為0.4－0.6％的胰酶處理6－8小時；8)清洗，平衡12－24小時；9)凍干、滅菌后，得到脫鈣骨支架材料。本發(fā)明在醫(yī)學領域具有較高的實際應用價值。
文檔編號A61L27/00GK1850295SQ200610080609
公開日2006年10月25日 申請日期2006年5月19日 優(yōu)先權日2006年5月19日
發(fā)明者林航, 戴建武 申請人:煙臺正海生物技術有限公司, 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所